close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

uploaded 0B3050303C

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Попова
Елена Викторовна
РАЗРАБОТКА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТНЫХ СИСТЕМ ДОСТАВКИ БЕЛКОВ И
ПЕПТИДОВ
Специальность: 02.00.04 – физическая химия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Санкт-Петербург
2017
2
Работа выполнена в федеральном государственном автономном образовательном учреждении
высшего образования «Санкт-Петербургский национальный исследовательский университет
информационных технологий, механики и оптики» (Университет ИТМО) и федеральном
государственном унитарном предприятии «Научно-исследовательский институт гигиены,
профпатологии и экологии человека» федерального медико-биологического агентства
Научный руководитель:
Неелов Игорь Михайлович
доктор
физико-математических
наук,
профессор
кафедры
информационных технологий топливно-энергетического комплекса
федерального
государственного
автономного
образовательного
учреждения высшего образования «Санкт-Петербургский национальный
исследовательский университет информационных технологий, механики и
оптики»
Официальные оппоненты:
Голубева Ольга Юрьевна
доктор химических наук, руководитель группы синтеза силикатных
сорбентов и биокомпозитов, ведущий научный сотрудник федерального
государственного бюджетного учреждения науки Ордена Трудового
Красного Знамени Института химии силикатов им. И.В. Гребенщикова
Российской академии наук
Михельсон Константин Николаевич
доктор химических наук, профессор, профессор кафедры физической
химии Института химии федерального государственного бюджетного
образовательного
учреждения
высшего
образования
«СанктПетербургский государственный университет»
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт
химической физики им. Н.Н. Семенова Российской академии наук,
г.Москва
Защита состоится «27» декабря 2017 г. в 10.00 часов на заседании совета по защите диссертаций на
соискание ученой степени кандидата наук, на соискание ученой степени доктора наук Д 212.230.07 в
федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего образования
«Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет)» по
адресу: 190013, Санкт-Петербург, Московский пр., 26, Белоколонный зал.
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке СПбГТИ(ТУ) и на сайте
организации по следующей ссылке:
http://technolog.edu.ru/university/dissovet/autoreferats/file/4802-...html
Замечания и отзывы в двух экземплярах, заверенные печатью, просим направлять на имя ученого
секретаря по адресу: 190013, Санкт-Петербург, Московский пр., 26, Санкт-Петербургский
государственный технологический институт (технический университет). Справки по тел.: (812) 49493-75; факс: (812) 712-77-91; e-mail: [email protected]
Автореферат разослан «___» ноября 2017 г.
Ученый секретарь совета по защите диссертаций на
соискание ученой степени кандидата наук,
на соискание ученой степени доктора наук Д 212.230.07
доктор технических наук
И.Б.
Пантелеев
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы исследования
Разработка и усовершенствование технологий выделения и очистки белков и пептидов
привело к тому, что интерес к их терапевтическому применению существенно вырос. На
данный момент для некоторых промышленно получаемых белков и пептидов, разработаны
различные лекарственные формы, которые уже нашли свое применение в медицине. К таким
белкам
и
пептидам
можно
отнести
гранулоцитарный-макрофагальный
колониестимулирующий фактор, супероксиддисмутазу, пептид Семакс и многие другие.
Практически все известные в настоящее время белковые и пептидные лекарственные
препараты имеют ряд побочных эффектов и низкую биодоступность. Большое значение эта
проблема приобретает при лечении таких болезней, как рак, различные нейродегенеративные
заболевания, ВИЧ и др. Например, при парентеральном способе введения пептида Семакс
большая часть его молекул быстро разрушается ферментами крови и не достигает мозга, что
приводит к необходимости постоянного контроля реальной концентрации препарата. При
других способах его введении в организм пациента в мозг также попадает лишь его малая
часть в результате того, что пептид не способен преодолеть гематоэнцефалический барьер.
Это ведет к усложнению и удорожанию лечения как для самого пациента, так и для
медицинского учреждения. В связи с этим актуальной проблемой является разработка новых
лекарственных
форм для
повышения
эффективности
доставки
уже
известных
и
применяемых в терапии субстанций.
Выбор способа доставки белковых и пептидных препаратов определяется в первую
очередь предполагаемым путем их введения. Физико-химические свойства некоторых систем
доставок часто ограничивают проникновение препарата через физиологические барьеры.
При разработке системы доставки необходимо помнить, что использование входящих в нее
чужеродных молекул способно оказать дополнительное токсическое действие и вызвать
целый ряд побочных эффектов. Идеальным решением проблемы биосовместимости является
разработка систем доставки защищающих (например, с помощью экранирующей оболочки)
здоровые клетки организма от препарата в процессе его доставки и использование в качестве
таких защитных оболочек молекул, состоящих из природных или биосовместимых
мономеров
максимально
приближенных
по
структурным
и
функциональным
характеристикам к организму пациента.
Актуальность данной работы обусловлена необходимостью разработки систем
доставки, обладающих достаточной биосовместимостью, снижающих контакт действующего
вещества с организмом в процессе адресной доставки, имеющих способность преодолевать
4
биологические барьеры, а также позволяющих контролировать процесс высвобождения
препарата.
В работе исследованы системы доставки на основе кальций-карбонатных ядер и
оболочек, состоящих из большого числа чередующихся слоев, образованных различными
противоположно заряженными полиэлектролитами и впервые предложены способы
уменьшения разрушения доставляемых белков за счет введения в формируемые капсулы
молекул ингибиторов.
В работе былa впервые исследована возможность применения комплексов на основе
разветвленных полиэлектролитов (дендримеров и дендриграфтов) для связывания молекул
ноотропных пептидов. Полученные или аналогичные комплексы доставки лекарственных
препаратов могут быть использованы в будущем не только для лечения инсультов и
серьезных черепно-мозговых травм, но также в терапии нейродегенеративных и
аутоиммунных заболеваний и различных форм рака.
Степень разработанности
Теоретической
и
методологической
основой
исследования
являются
работы
зарубежных и отечественных групп ученых в области разработки и исследования физикохимических свойств систем доставки для белков и пептидов. Созданием систем
инкапсулирования и доставки белков и пептидов, а также исследованием их физикохимических свойств занимается большое количество различных групп ученых, наиболее
известными из которых являются группы по руководством М. Roberts, М. Bently, D. Harris, S.
Hamad, V. Torchillin, и др. Особый вклад в конструирование полимерных микро- и нанокапсул внесли такие зарубежные и отечественные ученые, как R. Costa, F. Caruzo, B. de Gist,
H. Möhwald, G. Sukhorukov, M. Antipova и др. Одним из новых направлений доставки
лекарственных пептидов является их доставка с помощью нового класса разветвленных
полимерных молекул - дендримеров. Синтез и ислледование свойств дендримеров различной
химической структуры проводился в работах Vögtle, Tomalia, Newkome, Frechet, J.P.Tam и
др. Систематическое моделирование дендримеров проводилось в работах Н.К. Балабаева,
М.А.Мазо, И.М.Неелова, А.Даринского, А.Люлина, С.Люлина и др. Однако моделирование
комплексов дендримеров с терапевтическими пептидами практически не проводилось.
Проведение такого моделирования является одной из задач данной работы.
Цели и задачи
Целью исследования является разработка систем доставки для терапевтических белков и
пептидов на основе натуральных биодеградируемых и синтетических биосовместимых
полиэлектролитов и исследование их физико-химических свойств.
Для достижения цели были поставлены следующие задачи:
5
- разработать систему доставки, состоящую из ядра и оболочки, позволяющую
удерживать
модельные
белки
и
защищать
их
от
воздействия
разрушающих
биологических сред желудочно-кишечного тракта;
- исследовать условия, влияющие на то, какое количество действующего вещества будет
адсорбироваться на ядре;
- исследовать кинетику высвобождения модельных объектов из системы доставки при
условиях, имитирующих условия желудочно-кишечного тракта (ЖКТ);
- продемонстрировать возможность клеточного захвата полученных систем доставки;
- разработать компьютерную модель взаимодействия лизинового дендримера и пептидов
(Семакс, Эпиталон),
- исследовать процесс образования пептидного комплекса, его равновесную структуру и
процесс высвобождение действующего вещества при изменении внешних условий.
Научная новизна
Научная новизна исследования состоит в разработке новых систем доставки
лекарственных
белков и
пептидов, обладающих необходимой биосовместимостью,
контролируемостью высвобождения препарата, и исследовании их физико-химических и
биологических свойств.
Для полимерных микрокапсул впервые предложена и разработана технология
ферментативного
управления
проницаемости
оболочки
путем
включения
в
полиэлектролитные слои белковых молекул и введения ингибиторов ферментов.
Экспериментальные подходы, разработанные для оптимизации методов получения
полимерных нано- и микрокапсул, могут быть использованы при создании систем доставки
различных лекарственных веществ.
Впервые
экспериментально
смоделирован
захват
полимерных
микрокапсул
мезенхимальными стволовыми клетками.
Впервые методом компьютерного моделирования для пептидов Семакс и Эпиталон
рассчитаны комплексы с лизиновыми дендримерами разных поколений, охарактеризована их
структура и определены условия их существования.
Теоретическая и практическая значимость работы
Теоретическая значимость работы состоит в расширении и углубление подходов,
используемых в химических, фармацевтических и технических науках для разработки новых
систем доставки белков и пептидов в организм пациентов, а также в систематическом
исследовании физико-химических и биологических свойств этих систем.
Разработка новых более эффективных форм лекарственных препаратов и средств их
доставки является приоритетным направлением развития науки Российской Федерации.
6
Практическая значимость работы определяется тем, что разработанные технологии могут в
будущем быть внедрены в клиническую практику и применяться в ходе производства
различных лекарственных форм на основе микро- и макрокапсул.
Положения, выносимые на защиту
1. Влияние времени и скорости перемешивания растворов, соотношение концентраций
используемых солей и введение в их состав органических растворителей на размеры
формируемых ядер.
2. Исследование методик включение модельных белков в микрокапсулы: соосаждения и
диффузии этих белков в поры.
3. Влияние вязкости полимеров при формировании оболочки на ядрах как на степень
агрегации полученных капсул, так и на скорость высвобождения из них белков в среды,
имитирующие ЖКТ.
4. Зависимость высвобождения модельных пептидов и белков из микрокапсул от
молекулярной массы полиэлектролитных молекул оболочки.
5. Влияние введения в оболочку микрокапсул из бычьего сывороточного альбумина и
дубильной кислоты овомукоида на скорость их разрушение в среде, содержащей
трипсин.
6. Исследование
процессов
комплексообразования
дендримеров
2-5
поколений
с
терапевтическими пептидами Семакс и Эпиталон.
7. Исследование стабильности комплексов лизиновых дендримеров с пептидами.
8. В полученных дендример-пептидных комплексах дендример находится внутри в то
время, как большая часть пептидов – на поверхности комплекса.
9. Исследование условий высвобождения модельных пептидов из дендримеров.
Степень достоверности и апробация результатов
Достоверность полученных результатов обеспечивается применением совокупности
взаимодополняющих
микроскопии,
электронной
физико–химических
энерго-дисперсионной
микроскопии,
методов
рентгеновской
спектрофотометрии,
исследования
(конфокальной
спектрометрии,
флуориметрии),
сканирующей
хорошей
воспроизводимостью результатов, а также внутренней непротиворечивостью полученных
данных и согласием с результатами других авторов, работающих в данной области
исследований.
Основные положения диссертационной работы докладывались на 6-й конференции
молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах», в Санкт-Петербурге 18-21
октября 2010 года (стендовый доклад); 7-й конференции молодых ученых «Современные
проблемы науки о полимерах», в Санкт-Петербурге с 17-20 октября 2011 года (секционный и
7
стендовый доклады); 8-й конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о
полимерах», в Санкт-Петербурге (стендовый доклад); 9-й конференции молодых ученых
«Современные проблемы науки о полимерах», в Санкт-Петербурге (стендовый доклад);
международном симпозиуме «Molecular Mobility and Order in Polymer Systems», в СанктПетербурге с 6-10 июня 2011 года (стендовый доклад); международном симпозиуме
«Molecular Order and Mobility in Polymer Systems», в Санкт-Петербурге с 2-6 июня 2014 года
(стендовый доклад); международной конференции “6th
International
"Nanoparticles,
nanostructured coatings and microcontainers: technology, properties, applications " workshop”, в
Саратове с 18-24 мая 2015 года (устный доклад); на «IX международный симпозиум памяти
Р. Горбачевой «Трансплантация гемопоэтических стволовых клеток. Генная и клеточная
терапия», в Сочи 18-20 сентября 2015 года; на International conference on nanomedicine and
nanobiotechnology ICONAN 2016, в Париже с 28-30 сентября 2016 года (стендовый доклад);
на 3rd International Conference on Mathematics and Computers in Sciences and Industry MCSI
2016, на Крите 27-29 августа 2016 года (приглашенный доклад); на 5th International
Symposium on Biomedical Applications of Dendrimers, 2016, в Копенгагине; на XXIV
Международной конференции «Математика. Компьютер. Образование», 23-28 января 2017, в
Дубне; на International Conference on Biochemistry and Molecular Biology – ICBMB 2017, 3-5
апреля 2017, в Мюнхене (стендовый доклад), на «Mathematical Methods and Computational
Techniques in Science and Engineering», 24-26 февраля 2017, в Кембридже (приглашенный
доклад), на 9-м Международном симпозиуме «Molecular Mobility and Order in Polymer
Systems» MMOPS2017, 19-23 июня 2017, в Санкт-Петербурге; на 3-м Междисциплинарном
симпозиуме по медицинской, органической, биологической химии и фармацевтике МОБИХимФарма2017, 28-31 мая 2017, в Севастополе; на International Conference on Control,
Artificial
Intelligence,
Robotics
and
Optimization
ICCAIRO
2017, 20-22 мая
2017
(приглашенный доклад), в Праге; на 4th International Conference on Mathematics and Computers
in Sciences and Industry, 24-26 августа 2017, Корфу (приглашенный доклад).
Список работ, опубликованных автором по материалам диссертации
По результатам работы опубликовано 33 научных работы, в том числе 6 в изданиях,
рекомендованных ВАК, 1 глава в книге «Dendrimers» и 19 тезисов международных и
российских конференций. По результатам работы оформлена заявка на патент.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обосновывается актуальность выбранной темы и степень ее изученности;
определены цель, задачи, объект и предмет исследования; раскрыты научная новизна,
теоретическая и практическая значимость и изложены результаты апробации диссертации.
8
Глава 1. В первой части особое место отведено изучению физико-химических свойств
полимеров как синтетического, так и природного происхождения. Вторая часть обзора
посвящена изложению работ по системам доставки для белков и пептидов – дендримерам и
полиэлектролитным капсулам.
Глава 2. Первый раздел подробно описывает технологию формирования полимерных микрои нанокапсул, а также методы исследования их свойств. Во втором разделе описывается
методика компьютерного моделирования систем, состоящих из полиэлектролитных
лизиновых дендримеров и слабо заряженных модельных пептидов, методом молекулярной
динамики.
Глава 3. В главе «Полимерные микро- и нано- капсулы, сформированные методом
полиэлектролитной адсорбции» описываются следующие проведенные исследования и
полученные в них экспериментальные результаты:
 результаты исследования влияния различных параметров (время и скорость
перемешивания
растворов
при
осаждении,
ультразвуковое
воздействие,
температурное воздействие) формирования ядер из карбоната кальция микронного и
субмикронного размеров на их морфологию;
 результаты исследования включения модельных белков в ядра из карбоната кальция,
учета потерь модельного белка в ходе включения,
 выбор наиболее оптимальной методики включения белка в ядра;

результаты формирования полимерных капсул и изучения кинетики высвобождения
из них модельных белков в среды, имитирующие желудочно-кишечный тракт;

возможность контроля над высвобождением целевого объекта из капсулы под
воздействием ферментов желудочно-кишечного тракта путем введения в оболочку
капсулы ингибитора пептидаз (овомукоида);
 высокая эффективность захвата используемых капсул мезинхимальными стволовыми
клетками, их низкая цитотоксичность.
Поскольку кальций-карбонатное (CaCO3) ядро является основой представленных в
данном исследовании микрокапсул, то размеры и форма, изначально заложенные в ядро,
будут во многом определять в дальнейшем морфологию капсулы. Ватериты СаСО 3
формируются при осаждении в ходе реакции CaCl2 и Na2CO3. Для того, чтобы получить
частицы карбоната кальция различных размеров, необходимо скорректировать некоторые
параметры процесса их синтеза, в частности: время и интенсивность перемешивания
растворов, способы сушки ядер, наличие/отсутствие этиленгликоля в исходных растворах
(СаСl2 и Na2CO3), изменение температуры, соотношение солей CaCl2 и Na2CO3. В данной
9
работе было получено, что увеличение интенсивности и времени перемешивания приводит к
формированию ядер меньшего размера. Размеры CaCO3 зависят также от состава смесей,
участвующих в реакции (например, от введения этиленгликоля). Увеличение времени
перемешивания растворов с добавлением этиленгликоля с 30 секунд (базовая методика для
формирования ядер размер 3-5 мкм) до 30 минут привело к образованию ядер, имеющих
размеры порядка 2 мкм. При увеличении времени перемешивания до 2 часов, размер частиц
удалось снизить в среднем до 1 мкм, а при увеличении времени перемешивания до 4 часов
средний размер составил 600-800 нм.
Включение белка в ядра можно осуществлять несколькими способами (Рисунок 1):
соосаждением, диффузией в поры и включением в оболочку капсулы. При методе
соосаждения в случае с наноразмерными карбонатными ядрами размер белковой молекулы
оказывает существенное влияние на размер ватерита. Ядра без белка, полученные при
аналогичной методике имели средний радиус порядка 400 нм. Однако, включение в такие
ядра бычьего сывороточного альбумина методом соосаждения вызвал существенное
увеличение размеров до 1 мкм. Диффузионный метод включения белка в ядра позволяет
регулировать загрузку, варьируя рН раствора. Величина рН раствора и значение изоточки
(pI) белка определяют знак и величину избыточного заряда на поверхности белковых глобул.
Из проведенных исследований следует, что поверхностный ξ- потенциал карбонатных ядер
зависит от рН, изменяясь от отрицательных до положительных значений в диапазоне рН
между 8 и 9.
При методе диффузии в поры загрузка белков ограничена сорбционной способностью
ватерита, что приводит к перенасыщению ядра белком и его дальнейшей диффузией обратно
в раствор. Был сделан вывод о том, что методика соосаждения является более эффективной с
точки зрения загрузки целевого объекта, чем методика адсорбции в поры. Однако, в случае
необходимости получения капсул меньшего размера (нанокапсул) было рекомендовано
включение целевого объекта методами диффузии в поры или включением в структуру
оболочки. Анализ данных о потерях белка при его введении в ядра показал, что в первую
очередь потери определяются свойствами белка (ММ, рI) и условиями его включения в ядра.
Для получения капсул ватериты последовательно помещаются в растворы поликатионов
и полианионов. В результате электростатического связывания эти полимеры осаждаются на
ядро или на предыдущий противоположно заряженный слой, тем самым каждый раз меняя
поверхностный заряд капсулы. После нанесении очередного слоя капсулы троекратно
промываются водой от не присоединенных полимеров, что позволяет избежать агрегации
капсул и в дальнейшем их повреждения.
10
Рисунок 1 - Зависимость загрузки белков в ядра от их исходной концентрации: а – метод
соосаждения, б – метод диффузии в поры
Для исследования кинетики высвобождения белка из капсул особое внимание уделялось
подбору
сред,
имитирующих
кишечник.
Среды
кишечника
можно
моделировать
слабощелочными растворами (рН от 7,5 до 8,0) различного ионного состава, такими как:
фосфатный буфер, тетраборатный буфер, трис(гидроксиметил)аминометан (ТРИС), и т.д.
Профили высвобождения модельного белка (БСА) из ядер в различных средах,
имитирующих кишечник сильно отличаются. В фосфатном буфере почти 100 % белка
покидает капсулу уже в течение 2 часов, в то время как в ТРИС за это же время выходит
всего 8 % белка. Карбонатные ядра претерпевают в средах определенную морфологическую
и химическую трансформацию. В фосфатном буфере структура карбонатного ядра
становится более пористой и перекристализовывается в CaHPO4, что позволяет белку без
особых
препятствий
диффундировать
в
среду.
В
случае
с
ТРИС,
ядро
перекристаллизовывается в кальцит (непористая структура).
В исследовании высвобождения бычьего сывороточного альбумина (БСА) из различных
полимерных капсул в качестве модельной кишечной среды был взят многокомпонентный
буфер, по составу максимально приближенный к среде кишечника человека. При этом
влияние ферментов кишечника (трипсина, химотрипсина) на капсулы на данном этапе не
рассматривалось. Методом полиэлектролитной сборки на ватеритах микронного и
субмикронного размера были сформированы полиэлектролитные капсулы, состоящие из пар:
желатин – альгинат натрия, полистирол сульфонат – поли(аллил)амин гидрохлорид, декстран
сульфат – поли-L-аргинин гидрохлорид, альгинат натрия – поли-L-орнитин гидробромид.
В среде с pH, имитирующей кишечник, скорость высвобождения белка определялась
скоростью растворения полимеров и их молекулярной массой. Изменение молекулярной
11
массы в случае альгината натрия существенно влияло на плотность оболочки. Формирование
оболочки альгината низкой вязкости на ватеритах ведет к формированию оболочки большей
плотности. В этом случае выход БСА в среду, моделирующую кишечник, значительно
меньше, чем в случае с альгинатом высокой и средней молекулярной массой. В ходе работы
было показано, что результаты высвобождения БСА из микрокапсул (рисунок 2), в
кишечный буфер существенно различаются в зависимости от молекулярной массы и типа
полимеров, входящих в их состав.
Рисунок 2 - Высвобождение модельного белка (БСА) из полимерных микрокапсул в
имитатор среды кишечника: 1 - желатин – альгинат натрия (низкая ММ); 2 - желатин –
альгинат натрия (высокая ММ); 3 – декстран сульфат - поли-L-аргинин гидрохлорид; 4 альгинат натрия (низкая ММ) - поли-L-орнитин гидробромид; 5 – полистирол сульфонат –
поли(аллил)амин гидрохлорид
В ходе работы была также исследована кинетика высвобождения белка из капсулы за
счет растворения оболочки капсулы под действием следующих факторов:
1. щелочной pH среды;
2. растворения оболочки капсулы под воздействием ферментов (а именно, трипсина).
На данном этапе работы для формирования оболочки микрокапсулы были выбраны не
линейные полиэлектролиты, а биосовместимые природные органические соединения – белок
бычий сывороточный альбумин (БСА) и полифенол дубильная кислота. Целью настоящей
этапа работы было продемонстрировать возможность управления растворением оболочки
капсул, состоящих из бычьего сывороточного альбумина и дубильной кислоты, под
воздействием ферментов, путем введения в их оболочку овомукоида. Овомукоид (ОМ) – это
гликопротеин
с
молекулярной
массой
около
30
кДа.
Аминогруппы
трипсина
12
взаимодействуют с кислотными функциональными группами овомукоида, образуя с ним
комплекс и ингибируя активность трипсина.
Исследования по высвобождению включенного объекта из капсул без и с овомукоидом
проводили через 1, 2, 3 и 6 часов после контакта со средой. В отсутствии овомукоида
наблюдался существенный выход (порядка 15 %) уже в первый час взаимодействия со
средой. Существенная степень высвобождения (порядка 60 %) достигается уже после 6 часов
контакта. В то же время включение в оболочку овомукоида позволяет снизить скорость
высвобождения включенного объекта почти вдвое. После 24 часов контакта, высвобождение
целевого объекта доходит до 80% для капсул без овомукоида и 60 % для капсул с
овомукоидом.
После формирования микрокапсул была исследована возможность их применения в
качестве потенциальных систем доставки на основе оценки возможности захвата
полимерных микрокапсул клеточной популяцией. В качестве носителей частиц были
выбраны мезенхимные стволовые клетки, которые способны к направленной миграции в
подвергшуюся воспалению и/или ишемии ткань. В работе показано, что мезинхимальные
стволовые клетки
человека способны захватить микрокапсулы из полиаллиламин
гидрохлорида и полистирол сульфоната (PAH/PSS). На основании полученных данных был
сделан вывод о том, что одна клетка способна захватить до 30 микрокапсул. Оценка
жизнеспособности
клеток
показала,
что
микрокапсулы
были
малотоксичны
при
соотношении клетки/капсула, не превышающем 20/1.
Глава
4
«Молекулярно-динамическое
моделирование
взаимодействия
лизинового
дендримера и модельных пептидов» посвящена исследованию возможности образования
комплексов между положительно заряженными дендримерами различных поколений и
некоторыми терапевтическими пептидами, имеющими небольшой отрицательный заряд, с
помощью молекулярно-динамического моделирования этих систем в водных растворах с
явным учетом контрионов.
В этой главе были проведены следующие исследования:

влияния размеров (числа поколений) дендримера на его взаимодействие с
модельными пептидами;

влияния размеров (числа поколений) дендримера на структуру дендример-пептидных
комплексов,

влияния концентрации пептидов на их взаимодействие с дендримерами,

влияния концентрации пептидов на структуру дендример-пептидных комплексов.
В качестве модельных объектов были выбраны терапевтические регуляторные пептиды
Семакс (863 Да) и Эпиталон (390 Да). В данной работе моделирование проводилось методом
13
молекулярной динамики c использованием пакета программ GROMACS 4.5.6 и одного из
наиболее современных силовых полей AMBER_99SB-ildn. Во всех расчетах были выбраны
следующие условия: температура 300 К, давление 1 атм, растворитель - вода, содержащая
противоионы для компенсации избыточного заряда системы дендример-пептиды.
В процессе моделирования делались мгновенные снимки системы, состоящей из
дендримера, пептидов, ионов и воды, которые приведены на рисунке 3 (в качестве примера
представлен дендример 2-ого поколения). Из рисунка хорошо видно, что в начале расчета
молекулы пептидов находятся далеко от дендримера. Через 20 нс большая часть молекул
пептидов находятся уже вблизи поверхности дендримера, а в конце расчета все молекулы
пептидов в обеих системах находятся на его поверхности.
Рисунок 3 - Стадии формирования комплекса дендримера (начальная, промежуточная
и конечная) и 8 пептидов Семакс
В процесс формирования комплексов дендримеров/дендриграфтов с пептидами
возможны следующие виды взаимодействий:
 электростатические
взаимодействия
между
конечными
группами
дендримера
и
заряженными белковыми аминокислотными группами;
 водородные связи между внутренними группами дендримера и аминокислотными
остатками;
 гидрофобные взаимодействия между неполярными группами.
Кинетика образования комплекса может быть охарактеризована изменением расстояния
между дендримером и пептидами, а также изменением числа водородных связей между
ними, которые непосредственно отражают скорость формирования комплекса.
Средние размеры Rg для дендримера 2-ого поколения, дендриграфта 2-ого поколения и их
комплексов с модельными пептидами в равновесном состоянии (после образования комплекса)
приведены в таблице 1.
14
Таблица 1 - Собственные значения тензоров инерции цепей Rg11, Rg22, Rg33 для комплексов и их
средние размеры
Система
Rg11, нм
Дендример (G2)
0,64
Дендриграфт (DG2)
G2 и 16 Семакс
DG2 и 16 Семакс
G2 и 16 Эпиталонов
Rg33, нм
Rg, нм
0,97
1,08
1,12
1,12
1,45
1,51
1,67
1,36
1,88
1,97
2,30
1,29
1,75
1,84
2,03
1,76
2,08
2,26
2,44
Rg22
, нм
Информация о внутренней структуре равновесного комплекса была получена на
основании функций радиального распределения числа атомов относительно центра масс как
для самого комплекса, так и для его отдельных компонент. Одной из важнейших
характеристик взаимодействия между дендримером и пептидами в комплексе является
распределение числа ионных пар между ними. Из полученных данных можно сделать вывод
о том, что исследованные пептиды могут образовывать дендример-пептидные комплексы с
лизиновыми дендримерами и дендриграфтами разных поколений. Было показано, что
основной вклад в устойчивость полученных комплексов дают электростатические
взаимодействия положительно заряженных групп NH3+ дендримера и карбоксильных групп
пептидов. При этом было получено, что пептиды в основном находятся на поверхности
дендримеров, мало проникая вглубь комплексов
Изучение изменения расстояния между центрами дендримеров и пептидов со временем
после выключения положительных зарядов дендримеров позволило продемонстрировать
возможность разрушения полученных комплексов при изменении условий внешней среды
(например, pH).
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В результате проведенного исследования автором сделаны следующие теоретикометодические выводы и даны следующие рекомендации:
1. Предложена и разработана методика формирования новых высокомолекулярных
систем доставки белков (как микронного, так и субмикронного размеров), состоящих
из внутреннего CaCO3 ядра, и внешней оболочки (капсулы), состоящей из
чередующихся слоев противоположно заряженных полимеров.
15
2. Для модельных белков определены параметры их включения в систему доставки и
изучены условия их высвобождения в модельных средах, имитирующих желудочнокишечный тракт.
3. Для систем доставки белков предложена и разработана технология защиты целевого
объекта в процессе его доставки и высвобождения путем включения ингибиторов
ферментов (овомукоида) в оболочку системы доставки.
4. Предложена и разработана технология ферментативного управления проницаемостью
оболочки путем включения в полиэлектролитные слои белковых молекул и введения
ингибиторов ферментов.
5. Экспериментально
смоделирован
эффект
захвата
полученных
капсул
с
полиэлектролитными оболочками мезинхимальными стволовыми клетками.
6. Методом компьютерного моделирования для пептидов Семакс и Эпиталон была
продемонстрирована возможность образования их комплексов с дендримерами и
исследованы равновесные характеристики полученных комплексов.
7. Методом компьютерного моделирования была продемонстрирована возможность
разрушения дендример-пептидных комплексов и высвобождения из них пептидов
после уменьшения положительного заряда дендримера, которое может быть вызвано,
например, изменением pH среды.
Список работ, опубликованных автором по теме диссертации
1.
Сударева, Н.Н. Оптимизация процесса инкапсулирования. Формирование
карбонатных ядер / Н.Н. Сударева, Е.В. Попова, Н.Н. Сапрыкина, С.В. Бронников // Физикохимия полимеров. Синтез,свойства и применение. Сборник научных трудов, 2013. - Вып. 19.
- С. 185-190.
2.
Сударева, Н.Н. Оптимизация процесса инкапсулирования. Загрузка белков в
карбонатные ядра / Н.Н. Сударева, Е.В. Попова, Н.Н. Сапрыкина // Физико-химия
полимеров. Синтез, свойства и применение. Сборник научных трудов, 2014. - Вып. 20. - C.
139-144.
3.
Sudareva, N. Structural optimization of calcium carbonate cores as templates for
protein encapsulation / N. Sudareva, H. Popova, N. Saprykina, S. Bronnikov // J.
Microencapsulation, 2014. - V. 31. - I. 4. - P. 333–343.
4.
Сударева, Н.Н. Оптимизация процесса инкапсулирования. Регулирование
профилей высвобождения белков в имитаторных средах / Н.Н. Сударева, Е.В. Попова, А.Д.
Вилесов, Н.Н. Сапрыкина // Физико-химия полимеров. Синтез, свойства и применение.
Сборник научных трудов, 2015. - Вып. 21. - С. 132-138.
16
5.
Lepic,
K.
Mesenchymal
Stem
Cell
Magnetization:
Magnetic
Multilayer
Microcapsule Uptake, Toxicity, Impact on Functional Properties, and Perspectives for Magnetic
Delivery / K. Lepic, A. Muslimov, A. Timin, E. Popova, et. al. // Advanced Healthcare Materials,
2016. - V. 5. - I. 24. - P. 3182–3190.
6.
Попова, Е. В. Особенности ферментативного релиза из полимерных
микрокапсул со встроенным в оболочку ингибитором пептидазы / Е. В. Попова, П.П.
Бельтюков, С. Г. Петунов, В. А. Кузнецов, А. С. Радилов // Разработка и регистрация
лекарственных средств, 2017. - Т. 18. - №1. - С. 52-57.
7.
Попова, Е. В. Молекулярно-динамическое моделирование взаимодействия
лизинового дендримера и пептидов Семакс / Е.В. Попова, О.В. Шавыкин, И.М. Неелов, Ф.
Лирмэйкерс // Научно-технический вестник информационных технологий, механики и
оптики, 2016. - Т. 16. - № 4. - С. 716–724.
8.
Шавыкин, О.В. Компьютерное моделирование методом броуновской динамики
локальной подвижности в дендримерах с ассиметричным ветвлением / О.В. Шавыкин, Е.В.
Попова, А.А. Даринский, И.М. Неелов, Ф. Лирмэйкерс // Научно-технический вестник
информационных технологий, механики и оптики, 2016. - Т. 16. - № 5. - С. 893–902.
9.
Popova, E. Specificity of release from biocompatible microcapsules with ovomucoid
integrated into the shell / E. Popova, P. Beltyukov, V. Kuznetsov, S. Petunov, A. Radilov //
International Scientific Journal. Journal of Medical and Biological Sciences, 2017. - V. 4. - Iss. 1.
10.
Popova, E. Molecular Dynamics Simulation of Interaction of Short Lysine Brush and
Oppositely Charged Semax Peptides / E. Popova, B. Okrugin, I. Neelov // Natural Science, 2016. V. 8. - P. 499-510.
11.
Neelov, I. Complexes of Lysine Dendrimer of 2nd/3rd Generations and Semax
peptides. Molecular dynamics simulation / I. Neelov, E. Popova // WSEAS Transactions on biology
and biomedicine, 2017. - V. 14. - P.75-82.
12.
Neelov, I. Molecular Dynamics Simulation of Complex Formation by Lysine
Dendrigraft of Second Generation and Semax Peptide / I. Neelov, E. Popova // International J. of
Materials, 2017. - V. 4. - P. 16-21.
13.
Popova, E. Dendrimers and their interactions with therapeutic and amyloid peptides.
Computer simulation / E. Popova, D. Khamidova, I. Neelov, F. Komilov // Dendrimers: Intech
Publ., 2017. (принята в печать)
14.
Сударева, Н.Н. Карбонатные ядра – матрицы для инкапсулирования белков
методом полиэлектролитной сборки / Н.Н. Сударева, Е.В. Попова, Н.Н. Сапрыкина, Т.Д.
Ананьева, Л.С. Литвинова // Программа и тезисы докладов «Современные проблемы науки о
полимерах», 2010. - С. 104.
17
15.
Sudareva, N.N. The tuning of carbonate templates – matrices for biopolymers
encapsulation by means of polyelectrolyte coating / N.N. Sudareva, N.N. Saprykina, E.V. Popova,
T.D. Ananjeva, A.D. Vilesov, O.M. Suvorova // Book of abstracts “Molecular Mobility and Order
in Polymer Systems”, 2011.
16.
Сударева, Н.Н. Оптимизация структуры матриц для инкапсулирования белков /
Н.Н. Сударева, Е.В. Попова, Н.Н. Сапрыкина // Программа и тезисы докладов «Современные
проблемы науки о полимерах», 2010. - С. 90.
17.
Литвинова, Л.С. Проблемы инкапсулирования. Новые ТСХ пластины на основе
пористых карбонатных ядер / Л.С. Литвинова, Е.В. Попова, Н.Н. Сударева, Е.М. Иванькова //
Программа и тезисы докладов «Современные проблемы науки о полимерах», 2012. -С. 118.
18.
Сударева, Н.Н. Проблемы инкапсулирования. Корреляция гидродинамических
характеристик полиэлектролитных смесей и структуры оболочек карбонатных ядер / Н.Н.
Сударева, Е.В. Попова, В.Ю. Елоховский, Н. Н. Сапрыкина // Программа и тезисы докладов
«Современные проблемы науки о полимерах», 2012. - С. 119.
19.
Сударева,
Н.Н.
Проблемы
инкапсулирования.
Контроль
размера
синтезированных карбонатных ядер в зависимости от условий их получения / Н.Н. Сударева,
Е. В. Попова, Н.Н. Сапрыкина, С.В. Бронников // Программа и тезисы докладов
«Современные проблемы науки о полимерах», 2012. - С. 119.
20.
Сударева, Н.Н. Использование метода ЭДРС для определения состава
белоксодержащих карбонатных ядер в полиэлектролитных оболочках / Н.Н. Сударева, Е.В.
Попова, Н.Н. Сапрыкина // Программа и тезисы докладов «Современные проблемы науки о
полимерах», 2013. - С. 64.
21.
Сударева, Н.Н. Влияние условий синтеза карбонатных ядер с белком на их
технологические характеристики (морфологию и включение белка) / Н.Н. Сударева, Е.В.
Попова, Н.Н. Сапрыкина // Программа и тезисы докладов «Современные проблемы науки о
полимерах», 2013. - С. 66.
22.
Сударева, Н.Н. Проблемы инкапсулирования. Потери целевых объектов / Н.Н.
Сударева, Е.В. Попова, Т.Д. Ананьева // Программа и тезисы докладов «Современные
проблемы науки о полимерах», 2013. - С. 64.
23.
Popova, E.V. Peroral systems for delivery of therapeutic proteins. Comparison of
behavior of multicomponent systems in simulating media / E.V. Popova, N.N. Sudareva, O.M.
Suvorova, N.N. Saprykina // Book of abstracts “Molecular Order and Mobility in Polymer
Systems”, 2014. - P. 181.
18
24.
Popova, E.V. Application of energy-dispersive spectroscopy to studies of drug
delivery systems / E.V. Popova, N.N. Sudareva, N.N. Saprykina // Book of abstracts “Molecular
Order and Mobility in Polymer Systems”, 2014. - P. 182.
25.
Lepik, K.V. Mesenchymal stem cells: multilayer polyelectrolyte microcapsules
uptake, toxicity and influence on functional properties / K.V. Lepik, V.S. Sergeev, A.R. Muslimov,
D.S. Romanyuk, I.S. Moiseev, E.V. Popova, I.L. Radchenko, A.D. Vilesov, O.V. Galibin, G.B.
Sukhorukov, B.V. Afanasyev // Cellular therapy and transplantation, 2016. - V. 5. - Iss. 1. - P. 5658.
26.
Neelov, I. Molecular Dynamics Simulation of Lysine Dendrimer and Oppositely
Charged Semax Peptides / I. Neelov, E. Popova // Proceedings of the 3rd International Conference
on Mathematics and Computers in Sciences and Industry (MCSI 2016), IEEE Conference
Publishing Services (CPS), 2016. - P. 66-71.
27.
Neelov, I. Molecular dynamics simulation of dendrimer as a carrier of bioactive
peptides / I. Neelov, E. Popova // 5th International Symposium on Biomedical Applications of
Dendrimers, 2016.
28.
Popova, E. Molecular simulation of interaction of lysine dendrimer and Semax
peptide / E. Popova, I. Neelov, V. Kuznetsov, S. Petunov, A. Radilov // Proceedings of
International Conference on Nanomedicine and Nanobiotechnology, 2016. - P. 107.
29.
Попова, Е.В. Молекулярно-динамическое моделирование взаимодействия
лизинового дендримера 2-го поколения и пептида Семакс / Е.В. Попова, И.М. Неелов //
Книга тезисов «Математика. Компьютеры. Образование», 2017. - С. 48.
30.
Попова, Е.В. Матричные системы для инкапсулирования лекарственных
соединений с низкой биодоступностью / Е.В. Попова, В.А. Кузнецов, С.Г. Петунов // Книга
тезисов Третьего Междисциплинарного Симпозиума по медицинской, органической и
биологической химии и фармацевтике, 2017. - С. 56.
31.
Popova, E. Microcapsule drug delivery systems based on enzyme inhibitor controlled
release / E. Popova, P. Beltyukov, V. Kuznetsov, S. Petunov, A. Radilov // Proceedings of
International Conference on Biochemistry and Molecular Biology, 2017. - P. 48.
32.
Neelov, I. Interaction of lysine dendrimer and Semax peptides. Molecular dynamics
simulation / I. Neelov, E. Popova // Proceedings of the Mathematical Methods and Computational
Techniques in Science and Engineering, 2017.
33.
Neelov, I.M. Molecular dynamics simulation of complex formation by lysine
dendrimers of 2nd and 3rd generations and Semax peptides / I.M. Neelov, E.V. Popova // Book of
abstracts “Molecular Mobility and Order in Polymer Systems”, 2017.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
12
Размер файла
552 Кб
Теги
0b3050303c, uploaded
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа