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Gene Or Protein
(32/ 130)
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Etre
(29)
[7][_]
HCH
(19)
[8][_]
Proteins
(17)
[9][_]
Ligase
(9)
[10][_]
Polymerase
(6)
[11][_]
La Protein
(5)
[12][_]
Fragment A
(5)
[13][_]
Endonucleases
(4)
[14][_]
Nuclease
(4)
[15][_]
Est-a
(3)
[16][_]
Proinsulin
(3)
[17][_]
RR 1
(3)
[18][_]
Transferase
(2)
[19][_]
Exonuclease
(2)
[20][_]
Interferon
(2)
[21][_]
Transcriptase
(1)
[22][_]
Penicillinase
(1)
[23][_]
Beta-lactamase
(1)
[24][_]
Hpa
(1)
[25][_]
GATC
(1)
[26][_]
Hha
(1)
[27][_]
Proteases
(1)
[28][_]
Chymotrypsin
(1)
[29][_]
Adrenocorticotropin
(1)
[30][_]
Uvr
(1)
[31][_]
Nal
(1)
[32][_]
Cyc B
(1)
[33][_]
Hsd
(1)
[34][_]
Kinase
(1)
[35][_]
Hsr
(1)
[36][_]
Galactosidase
(1)
[37][_]
Phosphatase
(1)
[38][_]
Molecule
(38/ 60)
[39][_]
tetracycline
(7)
[40][_]
thymidine
(4)
[41][_]
DES
(3)
[42][_]
methionine
(3)
[43][_]
ampicillin
(3)
[44][_]
thymine
(3)
[45][_]
hydrogen
(2)
[46][_]
Tris
(2)
[47][_]
ATP
(2)
[48][_]
-OH
(2)
[49][_]
ammonium sulfate
(2)
[50][_]
adenosine
(1)
[51][_]
cytidine
(1)
[52][_]
guanine
(1)
[53][_]
somatostatin
(1)
[54][_]
GTP
(1)
[55][_]
arg-arg
(1)
[56][_]
lys-lys
(1)
[57][_]
glucagon
(1)
[58][_]
EDTA
(1)
[59][_]
colanic acid
(1)
[60][_]
nalidixic acid
(1)
[61][_]
cycloserine
(1)
[62][_]
trimethoprim
(1)
[63][_]
dithiothreitol
(1)
[64][_]
ethanol
(1)
[65][_]
PRIST
(1)
[66][_]
IPTG
(1)
[67][_]
arabinose
(1)
[68][_]
galactose
(1)
[69][_]
tryptophane
(1)
[70][_]
Leu
(1)
[71][_]
Thi
(1)
[72][_]
glycerol
(1)
[73][_]
nitrogen
(1)
[74][_]
potassium
(1)
[75][_]
potassium phosphate
(1)
[76][_]
magnesium sulfate
(1)
[77][_]
Generic
(10/ 37)
[78][_]
polypeptides
(15)
[79][_]
nucleotides
(5)
[80][_]
amino acid
(4)
[81][_]
acid
(3)
[82][_]
oligonucleotides
(3)
[83][_]
phosphodiester
(2)
[84][_]
peptide
(2)
[85][_]
desoxynucleotide triphosphates
(1)
[86][_]
tri-ester
(1)
[87][_]
saccharide
(1)
[88][_]
Chemical Role
(3/ 36)
[89][_]
hormone
(32)
[90][_]
antibiotic
(3)
[91][_]
detergents
(1)
[92][_]
Physical
(25/ 29)
[93][_]
10 pg
(3)
[94][_]
8 percent
(2)
[95][_]
6 percent
(2)
[96][_]
1,5 pg
(1)
[97][_]
de 5 pg
(1)
[98][_]
90 ng
(1)
[99][_]
1 ng
(1)
[100][_]
60 ng
(1)
[101][_]
0,25 m
(1)
[102][_]
8 min
(1)
[103][_]
50 minutes
(1)
[104][_]
de 4 pg
(1)
[105][_]
100 percent
(1)
[106][_]
300 pl
(1)
[107][_]
1 m
(1)
[108][_]
10 m
(1)
[109][_]
0,5 m
(1)
[110][_]
10 percent
(1)
[111][_]
1 pg
(1)
[112][_]
0,3 pg
(1)
[113][_]
30 ng
(1)
[114][_]
50 ng
(1)
[115][_]
10 ng
(1)
[116][_]
12,5 pg/ml
(1)
[117][_]
80 d
(1)
[118][_]
Organism
(10/ 28)
[119][_]
E Coli
(13)
[120][_]
rat
(4)
[121][_]
E Coli K-12
(4)
[122][_]
virus
(1)
[123][_]
eucaryotes
(1)
[124][_]
Bolivar
(1)
[125][_]
Salmonella
(1)
[126][_]
Bacillus subtilis
(1)
[127][_]
Streptococcus
(1)
[128][_]
Haemophilus influenzae
(1)
[129][_]
Substituent
(3/ 17)
[130][_]
amino
(15)
[131][_]
diamino
(1)
[132][_]
phosphoryl
(1)
[133][_]
Polymer
(7/ 13)
[134][_]
Polyacrylamide
(5)
[135][_]
DNA
(3)
[136][_]
Ribonucleic Acid
(1)
[137][_]
Mucopolysaccharide
(1)
[138][_]
Polynucleotide
(1)
[139][_]
Polyethyleneimine
(1)
[140][_]
Sephadex
(1)
[141][_]
Company Reg No.
(3/ 3)
[142][_]
Cl 10 m
(1)
[143][_]
Cl 100 m
(1)
[144][_]
Cl 20 m
(1)
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Publication
_________________________________________________________________
Number FR2518572A1
Family ID 33495655
Probable Assignee Genentech Inc
Publication Year 1983
Title
_________________________________________________________________
FR Title PLASMIDE D'EXPRESSION PERMETTANT L'INSERTION APPROPRIEE D'ADN
HETEROLOGUE
Abstract
_________________________________________________________________
L'INVENTION CONCERNE DES PLASMIDES D'EXPRESSION CONTENANT DES GENES
FONCTIONNELS ET UN SYSTEME DE PROMOTEURS LAC EN TANDEM, PLUSIEURS
SITES DE RESTRICTION ETANT PLACES EN AVAL DU SYSTEME DE PROMOTEUR POUR
FOURNIR DES EXTREMITES COHESIVES PAR COUPURES, PERMETTANT L'INSERTION
APPROPRIEE D'ADN HETEROLOGUE.
UN EXEMPLE D'UN TEL PLASMIDE EST LE PGH6 DEPOSE LE 3 JUILLET 1979 SOUS
LE N ATCC40012.
Description
_________________________________________________________________
18572
L'ADN (acide desoxyribonucleiquacid) dont sont formes les genes
comprend a la fois des genes codant les proteins ou "genes de
structure" et des regions de commande qui medient l'expression de leur
information par l'intermediaire de la fourniture de sites pour la
liaison de l'ARNpolymerase, l'information concernant les sites de
liaison ribosomique, etc La protein codee est "exprimee" de son ADN
correspondant par un procede en plusieurs etapes dans un organisme,
grace auquel: 1 L'enzyme, l'ARN polymerase, est activee dans la region
de commande (appelee ci- apres "promoteur") et voyage le long du gene
de structure, en transcrivant son information codee dans l'ribonucleic
acid messager (ARN m) jusqu'a ce que la transcription se termine a un
ou plusieurs codons
"stop".
2 Le message de l'ARN m est traduit au niveau des ribosomes en une
protein dont le gene code la sequence des amino-acides, en commencant
a un signal de "depart" de traduction, le plus couramment ATG (qui est
traduit "f- methionine").
Selon le code genetique, l'ADN decrit chaque amino acidpar un
triplet-ou "codon" de trois nucleotides adjacents choisis parmi
l'adenosine, la thymidine, la cytidine et la guanine, appeles ci-apres
A, T, C et G respectivement Ceux- ci apparaissent dans la chaine de
codage ou la sequence de codage de 1 'ADN a double chaine, dont la
chaine restante ou "complementaire" est formee de nucleotides
("bases") qui sont lies par liaison hydrogen a leurs complements dans
la chaine de codage La base A est le complement de la base T, et la
base C est le complement de la base G Tout ceci concernant
l'arriere-plan technologique de l'invention est decrit en detail dans
Benjamin Lewin, Gene Expression 1, 2 (1974) et 3 (1977), John Wiley
and Sons, N Y Cette publication et les autres publications auxquelles
il est fait reference ici sont incorporees ici par voie de reference.
Coupure et ligature de l'ADN Diverses techniques sont disponibles pour
la recombinaison de l'ADN, selon lesquelles les extremites contigues
de fragments d'ADN separes sont adaptees d'une facon ou d'une autre
pour faciliter la ligature Ce dernier terme se refere a la formation
de liaisons phosphodiester entre les nucleotides contigus, le plus
souvent par l'intermediaire d'une enzyme, la T 4 ADN ligase Ainsi, les
extremites inertes peuvent etre directement ligaturees Ou bien, des
fragments contenant des chaines uniques complementaires a leurs
extremites contigues sont avantages par une liaison hydrogen qui
positionne les extremites correspondantes pour une ligature ulterieure
De telles chaines uniques, appelees "extremites cohesives", peuvent
etre formees par l'addition de nucleotides a des extremites inertes en
utilisant la transferase terminale, et parfois simplement en
detruisant une chaine d'une extremite inerte par une enzyme comme la
X-exonuclease Egalement, et le plus souvent, on a recours a des
endonucleases de restriction (appelees ci-apres "enzymes de
restriction"), qui coupent les liaisons phosphodiester dans et autour
de sequences uniques de nucleotides d'une longueur d'environ 4 a 6
paires de bases ("sites de restriction") On connait de nombreuses
enzymes de restriction et leurs sites de reconnaissance Voir, par
exemple, R J Roberts, CRC Critical Reviews in Biochemistry, 123 (Nov
1976) Un grand nombre fournissent des coupures etagees qui forment de
courtes sequences complemehtaires a une seule chaine aux extremites
des fragments a double chaine.
En tant que sequences complementaires, les extremites en saillie ou
cohesives" peuvent se recombiner par appariement de bases Quand on
coupe avec cette enzyme deux molecules differentes, un appariement
croise des chaines uniques complementaires forme une nouvelle molecule
d'ADN, a laquelle on peut donner une integrite de covalence en
utilisant la ligase pour fermer les extremites a une seule chaine qui
restent au point de fermeture Les enzymes de restriction qui laissent
des extremites "inertes" sur l'ADN a double chaine qui a ete coupe,
permettent la recombinaison par l'intermediaire de la T 4 ligase, par
exemple, avec d'autres sequences a extremites inertes.
Vecteurs de clonage et ADN recombinant Pour les besoins de la presente
invention, un "vecteur de clonage" est une longueur non chromosomique
d'ADN a double chaine comprenant un duplicon intact de sorte que le
vecteur peut etre duplique quand il est place dans un organisme
unicellulaire("microbe")par transformation Un organisme ainsi
transforme est appele un "transformant" A l'heure actuelle, les
vecteurs de clonage couramment utilises proviennent de virus et de
bacteries et, le plus souvent, sont des boucles d'ADN bacterien
appelees "plasmides".
Les progres effectues en biochimie au cours des dernieres annees ont
conduit a la construction de vecteurs de clonage "recombinants" dans'
lesquels, par exemple, les plasmides sont fabriques pour contenir de
l'ADN exogene Dans des cas particuliers, le recombinant peut comporter
de l'ADN "heterologue', c'est-a-dire de l'ADN qui code des
polypeptides qui ne sont habituellement pas produits par l'organisme
susceptible de transformation dans le vecteur recombinant.
Ainsi, des plasmides sont coupes par des enzymes de restriction pour
former de l'ADN lineaire ayant des extremites ligaturables Celles-ci
sont liees a un gene exogene ayant des extremites ligaturables pour
former un element fonctionnel sur le plan biologique ayant un duplicon
intact et une propriete phenotype utilisable pour choisir des
transformants L'element recombinant est insere dans un micro-organisme
par transformation et le transformant est isole et clone, dans le but
d'obtenir de larges populations qui comprennent des copies du gene
exogene et, dans des cas particuliers, dans le but d'exprimer la
protein que le gene code La technologie associee et ses applications
potentielles sont decrites en -detail dans Miles International
Symposium Series 10 Recombinant Molecules: Impact on Science and
Society, Beers anc
Bosseff, eds, Raven Press, N Y (1977).
Expression de l'ADN recombinant A cote de l'utilisation des vecteurs
de clonage pour augmenter la fourniture de genes par duplication, il y
a eu plusieurs essais, dont plusieurs avec succes, pour exprimer
reellement les proteins que les genes codent Dans un premier cas, le
gene de la somatostatin, une hormone du cerveau, sous l'influence du
promoteur lac, a ete exprime dans des bacteries E Coli K Itakura et
al, Science 1984 1056 (1977) Plus recemment, les chaines A et B de
l'insuline humaine ont ete exprimees de la meme facon et combinees
pour former l'hormone.
D.V Goeddel et al, Proc -Nat'l Acad Sci, USA 76, 106 (1979) Dans
chaque cas, les genes ont totalement ete construits par synthese Dans
chaque cas, les enzymes proteolytiques presentes dans la cellule
degraderaient apparemment le produit desire, ce qui necessite sa
production sous forme conjuguee, c'est-a-dire en tandem avec une autre
protein qui le protege par compartimentalisation et qui doit etre
coupee de facon extracellulaire pour former le produit recherche Ce
travail est decrit dans les publications de demandes de brevets
britanniques suivantes: N' 2 007 675, 2 007 670, 2 007 676 et-
2.008 123.
Bien que la solution des genes synthetiques se soit revelee utilisable
dans les plusieurs cas decrits precedemment, des difficultes reelles
se posent dans le cas de proteins beaucoup plus importantes, par
exemple l'hormone de croissance, l'interferon, etc, dont les genes
sont evidemment plus complexes et moins sujets a une facile synthese
Simultanement, il serait indique d'exprimer ces produits non
accompagnes d'une protein conjuguee, la necessite de cette expression
demandant -e recours a d'autres ressources, dans l'organisme, qui sont
mieux appropriees a la construction du produit recherche.
D'autres chercheurs ont essaye d'exprimer des genes obtenus non par
synthese organique mais plutot par transcription inverse a partir de
l'ARN messager correspondant purifie a partir de tissu Deux problemes
se sont' poses dans cette solution Pour commencer, la transcriptase
inverse peut arreter la transcription de l'ARN m peu avant d'achever
l'ADN c pour toute la sequence d'amino-acides 'desiree Ainsi, par
exemple, Villa- Komaroff et al ont obtenu de l'ADN c pour la
proinsulin de rat qui ne posslede pas les codons pour les trois
premiers amino-acides du precurseur de l'insuline Proc. Nat'l Acad
Sci, USA 75 3727 (1978) En outre, la transcription inverse de l'ARN m
pour les polypeptides qui sont exprimes sous forme precurseur a fourni
de l'ADN c pour la forme precurseur au lieu de la protein active sur
le plan
2 518572 biologique, ce qui fait que, dans une cellule eucaryote, les
sequences meneuses sont eliminees par voie enzymatique.
Jusqu'a present, on n'a trouve aucune cellule bacterienne partageant
cette aptitude, de sorte que les produits transcrits d'ARN m
fournissent des produits d'expression contenant les sequences meneuses
de la forme precurseur au lieu de la protein biologiquement active
elle-meme VillaKomaroff, voir ci-dessus (proinsulin de rat); P H
Seeburg et al, Nature
276, 795 (1978) (prehormone de croissance du rat).
Enfin, des essais passes effectues par d'autres pour exprimer par voie
bacterienne des hormones humaines (ou leurs precurseurs) a partir de
produits transcrits d'ARN m ont a l'occasion conduit seulement a la
production de proteins conjuguees sur lesquelles on ne peut
apparemment pas effectuer une coupure extracellulaire, par exemple,
Villa-Komaroff, voir ci-dessus (penicillinase-proinsulin); Seeburg,
voir ci-dessus
(beta-lactamase-prehormone de croissance).
Hormone de croissance humaine L'hormone de croissance humaine ("HCH")
est secretee dans l'hypophyse humaine Elle comprend 191 amino-acides
et, avec son poids moleculaire d'environ 21 500, est plus de trois
fois plus grosse que l'insuline Jusqu'a la presente invention,
l'hormone de croissance humaine ne pouvait etre obtenue que par une
extraction laborieuse a partir d'une source limitee, les hypophyses de
cadavres humains La rarete consequente de la substance a limite ses
applications au traitement du nanisme hypopituitaire, et meme alors
des estimations fiables suggerent que la HCH d'origine humaine est
disponible en quantite ne permettant de traiter qu'environ la moitie
des sujets atteints.
On a donc besoin de nouveaux procedes de production de l'hormone de
croissance humaine et d'autres polypeptides en quantite, et ce besoin
est particulierement aigu dans le cas de polypeptides trop importants
pour permettre une synthese organique ou, pour cette raison, une
expression microbienne a partir de genes totalement synthetiques
L'expression d'hormones mammiferes a partir de produits transcrits
d'ARN m offrait la promesse d'eviter les difficultes de la solution
synthetique, mais jusqu'a present elle n'avait permis que la
production microbienne de produits conjugues inactifs sur le plan
biologique d'o l'hormone desiree ne pouvait en pratique pas etre
coupee.
La presente invention fournit des procedes et des moyens d'expression
de genes quasi-synthetiques o la transcription inverse fournit une
partie substantielle, de preference la majeure partie, de la sequence
de codage sans recourir a une construction totalement synthetique qui
est laborieuse, tandis que la synthese du reste de la sequence de 1 o
codage fournit un gene complet pouvant exprimer le polypeptide desire
non accompagne de sequences meneuses inactivantes sur le plan
biologique ou d'une autre protein etrangere Ou bien, le reste
synthetique peut fournir un produit conjugue resistant a la
proteolyse,concu de facon a permettre une coupure extra-cellulaire de
la protein etrangere, ce qui fournit la forme active sur le plan
biologique L'invention fournit en consequence des procedes et des
moyens de -production microbienne de nombreuses substances qui
n'etaient produites jusqu'a present qu'en quantites limitees par une
extraction co Qteuse a partir de tissu, et d'encore d'autres dont la
fabrication industrielle etait jusqu'a present impossible Dans son
mode de realisation nettement prefere, cette invention constitue le
premier cas dans lequel une hormone polypeptidique importante sur le
plan medical (l'hormone de croissance humaine) a ete exprimee par voie
bacterienne tout en evitant a la fois la proteolyse intra- cellulaire
et la necessite de compartimentaliser la forme biologiquement active
dans une protein etrangere necessitant une coupure extracellulaire Les
sources microbiennes de l'hormone de croissance humaine que fournit
l'invention offrent, pour la premiere fois, des approvisionnements
importants en hormone pour le traitement du nanisme hypopituitaire,
ainsi que pour d'autres applications qui etaient jusqu'a present
en-deca des possibilites des sources d'hormone obtenue a partir des
tissus, comprenant le saignement gastrique diffus, la pseudo-arthrose,
la therapie des brulures, la cicatrisation des plaies, la dystrophie
et la consolidation des os.
La maniere par laquelle on peut obtenir ces buts et autres avantages
de l'invention apparaitra plus completement d'apres la description
detaillee suivante et d'apres les dessins annexes concernant un mode
de realisation prefere de l'invention, dans lesquels: La Figure 1
represente le schema synthetique pour la construction d'un fragment de
gene codant pour les 24 premiers aminoacides de l'hormone de
croissance-humaine, ainsi que le signal de depart ATG et les elements
de liaison utilises dans le clonage Les fleches dans la chaine de
codage ou superieure ("U") et dans la chaine complementaire ou
inferieure ("L") indiquent les oliconucleotides reunis pour former le
fragment decrit; La Figure 2 decrit la reunion des oligonucleotides
"U" et "L" pour former le fragment de gene de la Figure 1, et son
insertion dans un vecteur de clonage de type plasmide La Figure 3
represente la sequence d'ADN (chaine de codage seulement) du fragment
obtenu par l'enzyme de restriction Hae III d'un produit de
transcription d'ARN m pituitaire, ainsi que les amino-acides numerotes
de l'hormone de croissance humaine qu'il code Les sites de restriction
cles sont indiques, ainsi que l'ADN (apres "stop") pour l'ARN non
traduit La Figure 4 illustre la construction d'un vecteur de clonage
pour un fragment de gene codant les amino-acides de L'hormone de
croissance humaine qui ne sont pas obtenus par synthese, et la
construction de ce fragment de gene en tant qu'ADN complementaire par
transcription inverse a partir d'AR Nm isole d'une source pituitaire
humaine; et La Figure 5 illustre la construction d'un plasmide
pouvant, dans des bacteries, exprimer l'hormone de croissance humaine,
en partant des plasmides des Figures 2 et 3.
La technique generale de l'invention implique la combinaison, dans un
seul vecteur de clonage, de plusieurs fragments de gene qui, en
combinaison, codent pour l'expressio du produit desire Parmi ceux-ci,
au moins l'un est un fragment d'ADN c obtenu par transcription inverse
d'ARN m isole d'un tissu, comme par le procede de A Ullrich et al,
Science 196, 1313 (1977) L'ADN c fournit une partie substantielle, et
de preference au moins la majeure partie, tandis que les portions
restantes du gene sont fournies par synthese Les- fragments
synthetiques et les fragments-transcrits d'ARN m-' sont clones
separement pour obtenir d'amples quantites que l'on utilise dans
l'etape de combinaison ulterieure.
Diverses considerations influencent la distribution des codons pour le
produit final entre partie synthetique et partie ADN-c, plus
particulierement la sequence ADN de l'ADN complementaire determine par
exemple par le procede de Maxam and Gilbert, Proc Nat'l Acad Sci U S A
74, 560 (1977) L'ADN complementaire obtenu par transcription inverse
contiendra invariablement des codons pour au moins une partie
terminale carboxylique du produit desire, ains-i que d'autres codons
pour l'ARN in non traduit en aval du ou des signaux d'arret de
traduction proches de l'extremite carboxylique La presence d'ADN pour
l ARN non traduit est sans grande importance, bien que des sequences
trop longues de cette sorte puissent etre enlevees, par exemple par
coupure par des enzymes de restriction, pour conserver les ressources
cellulaires utilisees dans la duplication et l'expression de l'ADN
pour le produit recherche Dans des cas particuliers, l'ADN c
contiendra des codons pour la sequence globale d'amino-acides
desiree,-ainsi que des codons etrangers en amont de l'extremite aminee
du produit recherche Par exemple, la plupart si ce n'est la totalite
des hormones polypeptidiques sont exprimees sous la forme d'un
precurseur avec des sequences meneuses ou signalitiques de proteins
utilisees, par exemple, dans le transport jusqu'a la membrane
cellulaire.
Dans l'expression a partir de cellules eucaryotes, ces sequences sont
eliminees par voie enzymatique, de sorte que l'hormone penetre dans
l'espace cytoplasmique sous sa forme libre active sur le plan
biologique Cependant, on ne peut pas se fier aux cellules microbiennes
pour effectuer ce role, et il est donc indique d'enlever, du produit
transcrit d'ARN m, les sequences codant de telles sequences meneuses
ou signalitiques Au cours de cette elimination, le signal de depart de
la traduction est egalement perdu, et presque invariablement quelques
codons du produit recherche seront egalement enleves Le composant
synthetique du gene quasi synthetique de l'invention fournit ces
derniers codons, et fournit egalement un nouveau signal de depart de
traduction quand le vecteur dans lequel le gene hybride sera
finalement introduit manque lui- meme d'un codon depart place de facon
appropriee. L'elimination de la sequence meneuse pour l'ADN c de la
prehormone de croissance est facilitee par la disponibilite d'un site
de restriction dans la partie du gene codant l'hormone de croissance
L'invention peut neanmoins etre mise en pratique independamment de la
disponibilite d'un tel site, ou dans un quelconque cas independamment
de la disponibilite d'un site de restriction suffisamment proche de
l'extremite aminee du polypeptide desire, en ce qui concerne
l'elimination du besoin d'effectuer une synthese importante du
composant du gene qui n'est pas obtenu de l'ARN m Ainsi, dans un
quelconque ADN c codant le polypeptide desire et une sequence meneuse
ou une autre sequence inactivante sur le plan biologique, la frontiere
entre les codons de cette derniere et ceux du polypeptide complet
apparaitront d'apres la sequence des amino-acides du polypeptide
complet On peut simplement digerer dans le gene codant le peptide de
choix, en enlevant la sequence meneuse ou autre indesiree Ainsi, par
exemple, etant donne un-ADN c comme ' h I
TTAAGCCCTGATC G etc.
KATTCGGG' CTAGCA o le point final de la digestion est indique par une
fleche, on peut choisir les conditions de reaction pour la digestion
par une exonuclease de facon a enlever les sequences superieures "a"
et "b", et par la suite une digestion par la nuclease Si eliminera
automatiquement les sequences inferieures "c" et "d" Ou bien et de
facon plus precise, on peut utiliser la digestion par l'ADN polymerase
en presence de desoxynucleotide triphosphates ("d(A, T, C, G)TP")
Ainsi, dans l'exemple precedent, 1 'ADN polymerase, en presence de d
GTP eliminera la sequence "c" (puis s'arretera a "G"), la nuclease 51
digerera ensuite "a"; l'ADN polymerase en presence de d TTP eliminera
"d", (en s'arretant a "T") et la nuclease Sl excisera ensuite "b", etc
Voir de facon generale A Kornberg, DNA Synthesis, pp 87-88, W H
Freeman an-d Co,
San Francisco (1974).
De preference on peut simplement construire un site de restriction en
un point commode dans la partie de l'ADN c codant le produit desire,
en appliquant la technique de synthese de reparation d'erreurs de A
Razin et al, Proc. Nat'l Acad Sci USA 75, 4268 (1978) Par cette
technique, une ou plusieurs bases peuvent etre introduites dans une
sequence d'ADN existante, en utilisant des produits de depart
contenant le substituant errone Au moins sept sequences de-paires de
quatre bases de type palindrome sont reconnues de facon unique par des
enzymes de restriction connues, c'est-a-dire AGCT (Alu I), CCGG (Hpa
II), CGCG (Tha I), GATC (S au 3 A), GCGC (Hha), GGCC (Hae III) et TCGA
(Taq I) Quand la sequence d'ADN c contient une sequence differant d'un
tel site par une seule base, comme cela est tres probable
statistiquement, la synthese de reparation fournira l'ADN c duplique
contenant la base substituante appropriee et donc le site de
restriction desire La coupure enlevera l'ADN codant la sequence
meneuse indesiree, apres quoi la synthese remplacera les codons
necessaires pour l'expression du polypeptide complet Par exemple: il
codons du produit sequence desire meneuse
CACG synthese de reparation d'erreurs
I CCGG I na I Il "A' ADN c -a S ycelu i
ADN quasi-
A¦ synthetique codons du produit H -ddesire On verra evidemment que
des sites de restriction plus longs peuvent de meme etre inseres la o
on le desires ou que des reparations successives peuvent creer des
sites de restriction de paires de quatre bases o seulement deux bases
communes au site apparaissent au point desire, etc. Il existera des
applications dans lesquelles il est indique d'exprimer non seulement
la sequence d'aminoacides du produit recherche, mais egalement une
protein etrangere mais concue de facon specifique On peut mentionner a
titre d'exemple quatre applications de ce genre Premierement, le gene
quasi-synthetique peut representer un haptene ou un autre determinant
immunologique, auquel est confere un caractere immunogene par
conjugaison a une protein supplementaire, de sorte que des vaccins
sont produits Voir de facon generale, la publication de la demande
britannique N O 2 008 123 A. Deuxiemement, il peut etre desirable pour
des raisons de securite biologique d'exprimer le produit recherche
sous forme d'un produit conjugue avec une autre protein inactivante
sur le plan biologiqueconcue de facon a permettre une coupure
extra-cellulaire pour former la forme active Troisiemement, il
existera des applications dans lesquelles des polypeptides
signalitiques de transport precederont le produit desire, pour
permettre la production de celui-ci par excretion a travers la
membrane cellulaire, pourvu que le peptide signalitique puisse ensuite
etre coupe Enfin, un produit conjugue etranger, concu pour permettre
une coupure specifique de facon extra-cellulaire, peut etre utilise
pour compartimentaliser les produits recherches qui seraient sinon
susceptibles de degradation en raison des proteases endogenes a l'hote
microbien Au moins dans les trois dernieres applications, la molecule
de prolongateur synthetique utilisee pour completer la sequence de
codage du produit transcrit d'ARN m peut incorporer en outre des
codons pour des sequences d'amino-acides pouvant etre coupees de facon
- specifique, par exemple par action enzymatique Par exemple, la
trypsine ou la chymotrypsin effectueront une coupure specifique au
niveau arg-arg ou lys-lys, etc Voir la publication de demande
britannique N 2 008 123 A ci-dessus.
D'apres ce qui precede, on voit que dans son aspect le plus large,
l'invention permet de nombreuses applications, ayant chacune en commun
les caracteristiques suivantes: on utilise un produit transcrit d'ARN
m qui code pour une partie substantielle de la sequence d'amino
acidsdu polypeptide desire mais qui, s'il etait exprime- seul,
produirait un polypeptide different plus petit ou - plus grand que le
produit recherche; les codons de codage de protein pour des sequences
d'amino-acides autres que celles contenues-dans le produit desire,
s'il y en a, sont enleves; une synthese organique fournit le ou les.
fragments codant le reste de la sequence desiree; et le produit
transcrit d'ARN m et le ou les fragments synthetiques sont combines et
places dans un vecteur de clonage contenant un promoteur pour la -
duplication et l'expression du produit recherche en l'absence de
proteins conjuguees etrangeres, ou du - produit recherche conjugue a
une protein etrangere pouvant etre coupee de facon specifique.
35.Evidemment, le produit d'expression commencera dans chaque cas par
l'amino-acide code par le signal de depart de traduction (dans le cas
de ATG, la f-methionine) On peut s'attendre a ce que celle-ci soit
eliminee de facon intracellulaire, ou dans tous les cas qu'elle ne
modifie pratiquement pas l'activite biologique du produit final.
Bien que l'invention fournisse un procede ayant des possibilites
d'application generale pour la production de proteins utiles, y
compris les anticorps, les enzymes, etc, l'invention convient
particulierement a l'expression d'hormones polypeptidiques mammiferes
et d'autres substances ayant des applications medicales, par exemple
le glucagon, le polypeptide inhibiteur gastro-intestinal, le
polypeptide pancreatique, l'adrenocorticotropin, les beta-endorphines,
l'interferon, l'urokinase, les facteurs de coagulation du sang,
l'albumine humaine, etc Un mode de realisation prefere representatif
de l'invention est decrit ci-apres, dans lequel on construit, on clone
et on exprime par voie microbienne un gene quasi-synthetique codant
l'hormone de croissance humaine.
CONSTRUCTION ET EXPRESSION D'UN VECTEUR DE CLONAGE POUR
L'HORMONE DE CROISSANCE HUMAINE
1 Clonage du fragment Hae III du produit transcrit d'ARN m (Figures 3
et 4) On prepare de l'ARN m polyadenyle pour l'hormone de croissance
humaine (HCH) a partir de tumeurs productrices d'hormone de croissance
pituitaire, par le mode operatoire de A Ullrich et al, Science 196,
1313 (1977) On prepare 1,5 pg d'ADN c a double chaine ("dc") a partir
de 5 pg de cet ARN essentiellement comme decrit par Wickens et al J.
Biol Chem 253 2483 (1978), mais on utilise le "fragment de
Klenow" de 'ARN polymrerase lH Klenow, Proc Nat'l Aci USA.
, 168 (1970)l, a la place de l'ADN polymerase I dans la synthese de la
seconde chaine Le schema de restriction de HCH est tel que des sites
de restriction Ilae III sont presents dans la region de non-codage 3 '
et dans la sequence codant les amino-acides 23 et 24 de HCH, comme
indique sur la Figure 3 Le traitement de l'ADN c de HCH dc par Hae III
donne un fragment d'ADN de 551 paires de bases codant les amino-acides
24 a 191 de HCH On traite ainsi 90 ng de l'ADN c par Hae III, on
effectue une electrophorese sur un gel de polyacrylamide a 8 percent
et on elue la region a 551 paires de bases On obtient environ 1 ng de
ADN c.
On choisit comme vecteur de clonage pour l'ADN c - le p BR 322 prepare
comme dans-F Bolivar et ai, Gene 2 (1977) -113 p BR 322 a ete
totalement caracterise, J G Sutcliffe; Cold Spring Harbor Symposium
43, 70 (1978), et est un plasmide de duplication de multicopie qui
presente une resistance a l'ampicillin et une resistance a la
tetracycline, en raison de l'inclusion des genes correspondants ("Ap
R" et "Tc R" respectivement, voir la Figure 4), et il contient des
sites de reconnaissance pour les enzymes de restriction Pst I,
Eco RI et Hind III, comme indique sur la figure.
Les produits de coupure de Hae III et Pst I sont tous deux a
extremiteinerte La methode d'adaptation GC de Chang A C Y et ai Nature
275 617 (1978) doit donc etre utilisee pour combiner les produits a
extremite inerte du produit de coupure par Pst I de p BR 322 et de la
digestion par Hae III du produit transcrit d'ARN m, en inserant le
fragment d'ADN c dans le site Pst I de p BR 322 de maniere a restaurer
les sites de restriction Hae III (GG;CC) sur l'ADN c tout en
restaurant les sites de restriction de Pst I (CTGCA 4 G) A chaque
extremite du produit insere.
On utilise ainsi de la desoxynucleotidyl transferase terminale (Td T)
pour ajouter environ 20 restes d C par extremite 3 ', comme decrit
precedemment, Chang, A Y C, voir ci-dessus On adapte de facon
similaire 60 ng de p BR 322 traites par Pst I, avec environ 10 restes
d G par extremite 3 '.
On effectue la cyclisation de l'ADN c dc comportant une extremite d C
avec l'ADN vecteur a extremite d G, dans 130 pi de Tris-H Cl 10 m M (p
H 7,5), Na Cl 100 m M, EDTA 0,25 m M On chauffe le melange a 70 C, on
le laisse refroidir lentement jusqu'a 37 C (12 heures) puis jusqu'a 20
C (6 heures) avant de l'utiliser pour transformer E Coli x 1776
L'analyse de la sequence d'ADN pour le plasmide p GH 31 clone dans x
1776 par le procede de Maxam and Gilbert, Proc Nat'l Acad Sci USA 74,
560 (1977) confirme la presence des codons des amino-acides 24-191 de
HCH, comme represente sur la Figure 3 (Dans certains cas, et en
particulier dans le nom du plasmide, on a utilise les initiales
anglo-saxonnes HGH de l'hormone de croissance humaine). i ' La souche
x 1776 de E Coli K-12 a le genotype F ton A 53 dap D 8 min Al sup E 42
A 40 ligal-uvr Bl > min B 2 rfb-2 nal A 25 oms-2 thy A 57::met C 65
oms l A 29 lbio H-asdl cyc B 2 cyc Al hsd R 2 x 1776 a ete certifie
par le National Institutes of Health comme un systeme vecteur hote EK
2. x 1776 a un besoin obligatoire d'aciddiamino- pimelique (DAP) et ne
peut pas synthetiser le mucopolysaccharide qu'est l'colanic acid Il
subit donc une mort par defaut de DAP dans tous les milieux o DAP est
limitatif mais o suffisamment de produits nutritifs existent pour
supporter le metabolisme et la croissance cellulaires Il a besoin de
thymine ou de thymidine et subit une mort par defaut de thymine avec
degradation de l'ADN quand la thymine et la thymidine sont absentes du
milieu mais quand suffisamment d'agents nutritifs sont presents pour
soutenir l'activite metabolique x 1776 est extremement sensible a la
bile et est donc incapable de survivre a un passage dans l'appareil
intestinal des rats x 1776 est extremement sensible aux detergents,
aux antibiotic, aux drogues et aux produits chimiques x 1776 est
incapable d'effectuer la reparation a l'obscurite ou photochimique des
dommages induits par les rayons ultra-violets et est donc-de plusieurs
ordres de grandeur plus sensible a la lumiere solaire que les souches
naturelles de E Coli x 1776 est resistant a de nombreux phages
transducteurs et est deficient en conjugaison pour l'heritage de
nombreux types differents de plasmides conjugatifs en raison de la
presence de diverses mutations. x 1776 est resistant a l'nalidixic
acid, a la cycloserine et au trimethoprim Ces drogues peuvent donc
etre ajoutees a des milieux pour permettre de controler la souche et
pour empecher la transformation des contaminants, au cours de la
transformation. x 1776 se developpe avec un temnps pour une generation
d'environ 50 minutes dans le bouillon L ou le bouillon de Penassay
quand ils sont additionnes de 100 lig de DAP/ml et de 4 pg de
thymidine/ml et atteint des densites finales de 8-10 x 108 cellules/ml
a la phase stationnaire Une agitation moderee par remuage et agitation
d'avant en arriere pendant une periode de une a deux minutes met les
cellules en suspension suffisante avec le maintien d'une viabilite a
100 percent.
On trouvera des details supplementaires concernant la souche x 1776
dans R Curtis et al, Molecutlar Cloning of Recombinant DNA, 99-177,
Scott and Werner, eds, Academic Press (N Y 1977). x 1776 a ete depose
a la American Type Culture Collection (3 juillet 1979, numero d'acces
ATCC n 31537, sans restriction). 2 Construction et clonage du fragment
de gene synthetique (Figures 1 et 2)
La strategie de construction du gene quasi- synthetique de HCH
comprend la construction d'un fragment synthetique comportant un site
de coupure de restriction a extremite inerte, proche du point auquel
le fragment doit etre reuni au produit transcrit d'ARN m Ainsi, comme
represente sur la Figure 1, le gene synthetique pour les 24 premiers
amino acidsde HCH contient un site de coupure Hae III apres
l'amino-acide n 23 L'extremite eloignee du fragment synthetique
comporte un "element de liaison" qui permet la cyclisation a une
extremite a une seule chaine resultant de la coupure par restriction
dans le plasmide dans lequel le produit transcrit d'ARN m-et le
fragment synthetique doivent finalement etre reunis.
Comme represente sur la Figure 1, les extremites 5 ' du fragment a
double chaine ont des extremites cohesives a une seule chaine pour les
endonucleases de restriction Eco RI et Hind III pour faciliter la
construction du plasmide Le codon methionine a l'extremite gauche
fournit un site pour le debut de la traduction Douze oligonucleotides
differents, dont la dimension varie de l'undecamere a l'hexadecamere,
ont ete synthetises par le procede ameliore par la voie tri-esterde
Crea, R Proc Nat'l Acad Sci USA 75,-5765 (1978).
Ces oligonucleotides, U 1 A U 6 et L 1 a L 6, sont indiques par des
fleches.
-On phosphoryl des quantites de 10 pg de U 2 a U 6 et de L 2 a L 6, en
utilisant la polynucleotide kinase T 4 et (132 P)ATP, selon un mode
operatoire publie, Goeddel, D V et al Proc Nat'l Acad Sci USA 76, 106
(1979).
On effectue trois reactions separees catalysees par la T 4 ligase: on
combine 10 pg du fragment U 1 a extremite '-OH avec les fragments U 2,
L 5 et L 6 phosphoryles; on combine les fragments U 3, U 4, L 3 et L 4
phosphoryles; et on combine 10 pg du fragment L 1 a extremite 5 '-OH
avec les fragments L 2, U 5 et U 6 phosphoryles On effectue ces
ligatures a 4 C pendant 6 heures dans 300 pl de tampon Tris-H Cl 20 m
M (p H 7,5), Mg C 12 1 m M, dithiothreitol 10 m M, ATP 0,5 m M, en
utilisant 100 unites de T 4 ligase On reunit ces trois melanges de
ligature, on ajoute 100 unites de T 4 ligase et on laisse la reaction
se faire pendant 12 heures a 20 C On precipite le melange par
l'ethanol et on effectue une electrophorese sur un gellde
polyacrylamide a 10 percent On decoupe du gel la bande migrant au
niveau de 84 paires de bases et on l'elue On traite p BR 322 (1 pg)
par Eco RI et Hind III, on isole le grand fragment par electrophorese
sur gel et on le ligature a l'ADN synthetique On utilise ce melange
pour transformer la souche 294 de E Coli K-12 (extremite A, thi, hsr,
hsmk +) La souche 294 a ete deposee le 30 octobre 1978 a la American
Type Culture Collection (ATCC N 31446), sans restriction L'analyse de
la sequence par la technique de Maxam et Gilbert, voir ci- dessus, sur
le produit insere Eco RI Hind III provenant d'un plasmide p HGH 3 d'un
transformant confirme celle decrite sur la Figure 1.
3 Construction du plasmide pour l'expression bacterienne de HCH
(Figure 5) Avec le fragment synthetique dans p HGH 3 et le produit
transcrit d'ARN m dans p HGH 31 i, on construit un plasmide pouvant
etre duplique contenant les deux fragments, en utilisant le plasmide
d'expression p GH 6, comme represente sur la Figure 5 Le plasmide
d'expression, qui contient les promoteurs lac en tandem, a d'abord ete
construit comme suit.
On isole a partir du plasmide p KB 268, K Backman, et al, Cell, Vol
13, 65-71 (1978), un fragment Eco RI a 285 paires de bases contenant
deux fragments a promoteur lac UV 5 et 95 paires de bases, separes par
un fragment d'ADN heterologue a paires de bases Le fragment a 285
paires de bases est insere dans le site Eco RI de p BR 322 et un clone
p GH 1 est isole, les promoteurs etant orientes vers le gene de
resistance a la tetracycline et dans une phase de lecture appropriee
avec ce gene Le site Eco RI eloigne de ce dernier gene est detruit par
digestion partielle par Eco RI, reparation des extremites Eco RI a une
seule chaine resultante avec l'ADN polymerase I et recyclisation du
plasmide par ligature des extremites inertes Le plasmide resultant, p
GH 6, contient un seul site Eco RI place de facon appropriee par
rapport au systeme promoteur dans lequel le gene complete pour HCH
doit etre insere.
Pour preparer le fragment synthetique pour la combinaison avec le
produit transcrit d'ARN, on coupe 10 pg de p HGH 3 avec des
endonucleases de restriction Eco RI et Hae III, et on isole sur un gel
de polyacrylamide a 8 percent le fragment a 77 paires de bases
contenant les sequences de codage pour les amino acids1-23 de HCH.
Puis on coupe avec Hae III 5 ig du plasmide p HGH 31.
On purifie par electrophorese sur gel la sequence HCH a 551 paires de
bases et un fragment de p BR 322 Hae III migrant simultanement et
contenant 540 paires de bases Un traitement ulterieur par Xma I coupe
seulement la sequence HCH, en enlevant 39 paires de bases de la region
de non codage en 3 ' On separe le fragment a 512 paires de bases
resultant de l'element Hae III de p BR 322 A 540 paires de bases, par
electrophorese sur un gel de polyacrylamide a 6 percent On polymerise
0,3 pg du fragment Eco RI Hae III a 77 paires de bases avec de la T 4
ligase dans 16 Pl d'un milieu de reaction pendant 14 heures a 40 C On
chauffe le melange a 70 C pendant minutes pour inactiver la ligase,
puis on le traite par Eco RI (pour couper les fragments qui se sont
dimerises par l'intermediaire de leurs sites Eco RI) et par Sma I
(pour couper les dimeres Xma I), ce qui donne un fragment a 591 paires
de bases avec une extremite "cohesive" Eco RI et une extremite
"inerte" Sma I Apres purification sur un gel de polyacrylamide a 6
percent, on obtient environ 30 ng de ce fragment.
On notera que le plasmide d'expression p GH 6 ne contient pas de site
de reconnaissance Xma I Cependant, Sma I reconnait le meme site que
Xma I, mais le coupe par son milieu, en -19 donnant des extremites
inertes L'extremite coupee par Sma du fragment derive de p HGH 31 peut
donc etre ligaturee par extremites inertes dans p GH 6.
On traite le plasmide d'exprcsion p GH 6, contenant les promoteurs lac
UV 5 en tandem, successivement par Ilind III, ia nuclease SI et Eco
RI, et on le purifie par electrophorese sur gel On ligature 50 ng du
vecteur resultant, qui a une extremite cohesive Eco RI et une
extremite inerte, a 10 ng d'ADN de HCH a 591 paires de bases On
utilise le melange de ligature pour transformer E Coli x 1776 On
choisit des colonies pour la culture sur tetracycline (12,5 pg/ml) Il
est interessant de noter que l'insertion du gene de HGH hybride dans p
GH 6 detruit le promoteur pour le gene de la resistance a la
tetracycline, mais que le promoteur lac en tandem permet la lecture du
gene de structure pour la resistance a tet, conservant cette
caracteristique de selection On obtient environ 400 transformants
L'hybridation sur filtre par le mode operatoire de Grunstein Hogness,
Proc Nat'l Acad. Sci USA, 72, 3961 (1975) permet l'identification de
12 colonies ne contenant pas de sequence HCH Les plasmides isoles de
trois de ces colonies donnent les schemas de restriction attendus
quand on les coupe par Hae III, Pvu II et Pst I La sequence d'ADN d'un
clone, p HGH 107, a ete determinee. L'hormone de croissance humaine
exprimee par les transformants estfacilement detectee par des dosages
radio- immunologiques directs effectues sur des dilutions en serie de
liqueur surnageante de cellules lysees en utilisant le coffret
Phadebas HGH PRIST (Farmacia).
Pour demontrer que l'expression de HCH est sous la commande du
promoteur lac, on transforme p GHG 107 dans la souche de E Coli D 1210
a lac+ (i Q O +zty+), un surproducteur de represseur lac On ne peut
pas detecter de niveau significatif de l'expression de HGH jusqu'a
addition de l'inducteur IPTG
(isopropylthiogalactoside).
L'enlevement du site Eco RI dans p GH 107 devrait laisser le signal de
depart ATG a la meme distance par rapport aux codons du site de
fixation du ribosome du promoteur lac que celle qui se produit dans la
nature entre ces codons et le signal de depart pour la
3-galactosidase.
Pour determiner si l'expression serait accrue en reproduisant cet
espacement naturel, on a transforme p GH 107 en p GH 107-1- en ouvrant
le premier avec Eco RI, en digerant les extremites a une seule chaine
resultante avec l'endonuclease Sl et en refermant par ligature par
extremites inertes avec la T 4 ligase Bien que le plasmide resultant
se revele pouvoir de meme exprimer HCH, 1 il le fait de facon
surprenante a un degre- inferieur a celui de p GH-107, comme le montre
un dosage radio- immunologique direct.
L'homme de l'art verra que la presente invention n'est pas limitee au
mode de realisation que l'on vient de decrire et qu'elle n'est limitee
que par l'etendue juridique des revendications annexees Des variantes
autres que celles decrites precedemment seront-evidentes, que ce soit
dans le choix du systeme promoteur, du plasmide parental, du produit
polypeptidique recherche, ou de tout autre parametre t Par exemple,
d'autres systemes promoteurs que l'on peut utiliser dans la presente
invention comprennent le promoteur lambda, l'operon arabinose (phi 80
d ara) ou les systemes promoteurs colicine El, galactose, phosphatase
alcaline ou tryptophane.
Les organismes hotes pour l'expression bacterienne peuvent etre
choisis, par exemple, parmi les Enterobacteriacees,comme les souches
d'Escherichia coli et de Salmonella; les Bacillaces, comme Bacillus
subtilis; Pneumococcus; Streptococcus; et Haemophilus influenzae
Evidemment, le choix de l'organisme commandera les degres de
limitation materielle du clonage et de l'expression qui doivent etre
mis en oeuvre pour satisfaire les exigences legales (par exemple
National Institutes of Health Guidelines for
Recombinant DNA, 43 Fed Reg 60,080 (1978).
Bien que prefere pour la mise en oeuvre a l'echelle du laboratoire-de
la presente invention, E Coli x 1776 peut se reveler d'un caractere
pratique limite dans une fabrication industrielle a grande echelle en
raison des caracteres debilitants qui lui ont ete incorpores
volontairement pour des raisons de securite biologique Avec les degres
appropries de restrictions physiques, plutot que biologiques, on peut
utiliser dans une operation a grande echelle des organismes comme E
Coli K-12 souche 294, voir cidessus, et E Coli souche RR 1, genotype:
Pro Leu Thi RB rec A+Strr Lac y E. B_ Coli RR 1 est derive de E Coli
HB 101 (E W Boyer, et al, J. Mol Bio (1969) 41 459-472) par
accouplement avec la souche E Coli K-12 KL 16 comme donneur Hfr Voir J
E Miller, Experiments in Molecular Genetics (Cold Spring Harbor, New
York, 1972) Une culture de E Coli RR 1 a ete deposee le 30 octobre
1978 a la American Type Culture Collection, sans limitation
d'accessibilite (ATCC N 31343) Une culture de x 1776 a egalement ete
deposee le 3 juillet 1979 a cette meme collection de culture (ATCC N
31537) Les organismes suivants ont egalement ete deposes a cette meme
collection de culture le 3 juillet 1979: plasmide p HGH 107 (ATCC N
40011); plasmide p GH 6 (ATCC N 40012); souche x 1776 transformee par
p HGH 107 (ATCC N 31538) et souche 294 de E Coli K 12 transformee par
p GH 6 (ATCC N 31539).
Les organismes produits selon l'invention peuvent etre utilises dans
la production par fermentation a echelle industrielle de l'hormone de
croissance humaine, en donnant le produit en quantite et pour des
applications qui n'etaient pas realisables jusqu'a present Par
exemple, les cultures de transformant de E Coli peuvent etre cultivees
dans des milieux aqueux dans un recipient de fermentation en acier ou
dans tout autre recipient de fermentation, aere et agite de facon
classique, dans des milieux aqueux a une temperature d'environ 37 C,
par exemple, et a un p H voisin de la neutralite (par exemple p H 7 +
0,3) dans lequel on a introduit les agents nutritifs appropries comme
un saccharide ou du glycerol, des sources d'nitrogen comme le ammonium
sulfate, des sources de potassium comme le potassium phosphate, des
oligo-elements, du magnesium sulfate, etc Les organismes transformants
presentent de preference une ou plusieurs caracteristiques de
selection, comme une resistance aux antibiotic, de sorte que des
contraintes de selection peuvent etre imposees pour decourager la
croissance concurrente de E. Coli de type naturel Par exemple, dans le
cas d'un organisme resistant a l'ampicillin ou a la tetracycline,
l'antibiotic peut etre ajoute au milieu de fermentation pour eliminer
les organismes de type naturel qui ne presentent pas la
caracteristique de resistance.
A la fin de la fermentation, on centrifuge la suspension bacterienne
ou bien on recueille de toute autre facon les matieres solides
cellulaires du bouillon puis on les lyse par des moyens physiques ou
chimiques Les debris cellulaires sont enleves de la liqueur
surnageante et l'hormone de croissance soluble est isolee et purifiee.
L'hormone de croissance humaine peut etre purifiee a-partir d'extraits
bacteriens en utilisant un ou une combinaison des moyens suivants:'(1)
fractionnement par la polyethyleneimine; (2) chromatographie par
filtration sur gel de Sephacryl S-200; (3) chromatographie d'echange
d'ions, sur une resine Biorex 70 ou Sephadex CM; (4) fractionnement
par le ammonium sulfate et/ou le p H; et (5) chromatographie
d'affinite en utilisant des resines de type anticorps preparees a
partir d'anti-HGH Ig G isolee a partir d'animaux immuno-sensibilises
ou d'hybridomes; et desorbee dans des conditions acidsou legerement
denaturantes.
Claims
_________________________________________________________________
REVENDICATIONS
1 Plasmide d'expression comprenant des genes fonctionnels pour la
resistance a l'ampicillin et la tetracycline et, entre lesdits genes,
un systeme de promoteurs lac en tandem orientes de facon a promouvoir
l'expression dans la direction du gene pour la resistance a la
tetracycline, plusieurs sites de restriction etant places en aval
dudit systeme promoteur qui founrissent respectivement des extremites
cohesives et inertes par coupure, en permettant l'insertion appropriee
d'ADN heterologue entre les sites pour qu'ils viennent sous la
commande dudit systeme promo- teur.
2 Plasmide p GH 6.
? ?
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3. Click the Minesoft logo at any time to reset TextMine to it's
initial (start) state.
4. You can select which part of the document you'd like to view by
using the pull down menu here.
You can select "Full Text" to view the entire document.
5. For non-latin languages, (in most cases) full text translations
are available, you can toggle them on and off here.
You can also toggle the inline discovery translations between
English and their original language.
6. The pie chart icon will open a basic statistical breakdown of the
publication.
7. The sort icon allows you to sort the listed categories based on
the number of instances found.
Click to toggle between ascending and descending.
8. You can use the refine box to refine the discovered items in the
sections below.
Simply type what you are looking for, any items that do not match
will be temporarily hidden.
9. The publication has been analysed and we have identified items
within it that fit into these categories.
The specific items found are listed within the category headings.
Click the section header to open that section and view all the
identitfied items in that section.
If you click the checkbox all items in that section will be
highlighted in the publication (to the right).
The best thing to do is to experiment by opening the sections and
selecting and unselecting checkboxes.
10. The main output window contains the publication full text (or part
thereof if selected).
11. The Tools section contains tools to help you navigate the
"discovered" (highlighted) items of interest.
The arrows and counter let you move through the highlighted items
in order.
12. Other tools include a "Preview" option [ [preview.png] ] and the
ability to mark the relative locations of highlighted items by
using the "Marker" option [ [marker.png] ].
Try these out to best understand how they work, and to discover if
they are of use to you.
13. Items selected from the menu on the left will be highlighted in
the main publication section (here in the middle of the screen).
Click them for further information and insights (including
chemical structure diagrams where available).
14. Please experiment with TextMine - you cannot make any permanent
changes or break anything and once your session is closed (you've
log out) all your activity is destroyed.
Please contact Minesoft Customer Support if you have any questions
or queries at: [email protected]
[149]____________________
[150]____________________
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implemented)_____
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