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Physical
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3 percent
(3)
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30 minutes
(2)
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0,02 percent
(2)
[9][_]
0,15 percent
(1)
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2 percent
(1)
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260 nm
(1)
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de 5 mm
(1)
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5 minutes
(1)
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2 pg/ml
(1)
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2 mg
(1)
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0,5 ml
(1)
[17][_]
9,5 ml
(1)
[18][_]
0,05 M
(1)
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100 ng
(1)
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1 ng
(1)
[21][_]
100 pg
(1)
[22][_]
0,02 percent de
(1)
[23][_]
1 ng/ml
(1)
[24][_]
90 nanogrammes
(1)
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Molecule
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ACETYLAMINOFLUORENE
(5)
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DES
(4)
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N-acetoxy-N-2-acetylaminofluorene
(4)
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N-2-ACETYLAMINOFLUORENE
(2)
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N-2-(GUANOSINE-8-YL)-ACETYLAMINOFLUORENE
(2)
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guanosine
(1)
[32][_]
depo
(1)
[33][_]
3-amino-9-ethylcarbazol
(1)
[34][_]
N-N'-dimethyl-formamide
(1)
[35][_]
acetate
(1)
[36][_]
iodine 125
(1)
[37][_]
Generic
(5/ 20)
[38][_]
NUCLEic acid
(16)
[39][_]
guanines
(1)
[40][_]
radioactive
(1)
[41][_]
nucleotides
(1)
[42][_]
acid
(1)
[43][_]
Polymer
(4/ 16)
[44][_]
DNA
(13)
[45][_]
Nitrocellulose
(1)
[46][_]
Polyvinyl Pyrrolidone
(1)
[47][_]
Agarose
(1)
[48][_]
Gene Or Protein
(3/ 9)
[49][_]
Etre
(5)
[50][_]
DANS
(2)
[51][_]
Protein A
(2)
[52][_]
Organism
(3/ 5)
[53][_]
bovine
(3)
[54][_]
sable
(1)
[55][_]
phage X
(1)
[56][_]
Substituent
(1/ 1)
[57][_]
N-acetoxy
(1)
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Publication
_________________________________________________________________
Number FR2518755A1
Family ID 4966040
Probable Assignee Pasteur Inst
Publication Year 1983
Title
_________________________________________________________________
FR Title SONDE CONTENANT UN NUCLEic acid MODIFIE ET RECONNAISSABLE PAR
DES ANTICORPS SPECIFIQUES ET UTILISATION DE CETTE SONDE POUR DETECTER
ET CARACTERISER UNE SEQUENCE D'ADN HOMOLOGUE
Abstract
_________________________________________________________________
L'INVENTION CONCERNE UN PROCEDE DE DETECTION DE LA PRESENCE D'UNE
SEQUENCE D'NUCLEic acid TELLE QU'UN GENE OU FRAGMENT DE GENE DANS UNE
COMPOSITION OU ECHANTILLON PRESUME LA CONTENIR.
ELLE EST CARACTERISEE EN CE QUE L'ON MET EN CONTACT CETTE COMPOSITION
AVEC UNE SONDE CONTENANT UN NUCLEic acid COMPLEMENTAIRE DE LA SEQUENCE
D'NUCLEic acid OU DU GENE RECHERCHE DANS DES CONDITIONS PERMETTANT,
NOTAMMENT CETTE HYBRIDATION, LADITE SONDE PORTANT AU MOINS UN GROUPE
N-2-ACETYLAMINOFLUORENE FIXE DE FACON COVALENTE A AU MOINS L'UNE DES
BASES DE CETTE SONDE, L'EVENTUELLE PRESENCE DE LA SEQUENCE D'NUCLEic
acid OU DE GENE RECHERCHE ETANT ENSUITE REVELABLE PAR ACTION
D'ANTICORPS EFFICACES VIS-A-VIS DE LA
N-2-(GUANOSINE-8-YL)-ACETYLAMINOFLUORENE OU PREALABLEMENT PREPARES
VIS-A-VIS DE LA SONDE PORTANT DES RESIDUS D'ACETYLAMINOFLUORENE.
Description
_________________________________________________________________
Sonde contenant un nucleic acid modifie et reconnais- sable par des
anticorps specifiques et utilisation de cette sonde pour detecter et
caracteriser une sequence d'ADN homologue
___________________________________________________________
L'invention est relative a une sonde contenant un nucleic acid modifie
et reconnaissable par des anticorps specifiques et a l'utilisation de
cette sonde pour detecter et caracteriser une sequence d'ADN homo-
logue dans un echantillon susceptible de le contenir. Plus
particulierement l'invention concerne une sonde modifiee chimiquement
de telle sorte qu'elle puisse, apres hybridation avec la sequence
d'ADN homologue recherchee, etre detectee par des anticorps
specifiques a l'egard de la sonde elle meme.
Il est connu que des ADN sont susceptibles de reagir dans des
conditions appropriees avec des substances carcinogenes, tlles que le
N-acetoxy-N-2-acetylaminofluo- renepour former un produit susceptible
d'etre reconnu par des anticorps formes,d'une part,contre le N-2
(guanosine-
8-yl)-acetylaminofluorene et,d'autre part contre les m and mes
ADN modifies par le N-acetoxy-N-2-acetylaminofluorene.
Ces techniques ont notamment ete decrites dans un article de Gilbert
de MURCIA et collaborateurs intitule "Visuali- sation par microscopie
electronique des sites de fixation du N-acetoxy-N2-acetylaminofluorene
sur un ADN de Col E 1 au moyen d'anticorps specifiques"(Proc Natl Acad
Sci USA, tome 76,N 12, 6 076 6 080 Dec 1979) ' Dans les conditions
decrites par ces auteurs il est possible de modifier de 0,07 A 0,15
percent des bases de 1 'ADN traite par le
N-acetoxy-N-2-acetylaminofluorene, les points de fixation de cette
derniere substance chimique sur l'ADN pouvant ensuite etre reperes par
microcospie electronique, apres reactdion prealable de l'ADN ainsi
modi- fie avec des anticorps du genre sus-indique prealablement formes
chez le lapin, puis avec des anti-immunoglobulines de lapins marques a
la ferritine La technique decrite permet par consequent de distinguer
des ADN natifs sains 2 - et des ADN ayant ete soumis a l'action de
substances carcinogenes. L'invention repose sur la decouverte que la
modification d'une sequence d'ADN par le
N-acetoxy-N-2-acetylaminofluorene n'alterait pas, apres denaturation
pre- alable de cet ADN modifie, sa capacite de s'hybrider avec une
sequence complementaire d'ADN ne portant pas de tels groupes de
modification, lorsque ces sequences sont pla- cees dans des conditions
permettant une telle hybridation.
L'invention tire profit de cette decouverte pour proposer un procede
perfectionne de detection de la presence even- tuelle et de la
caracterisation d'une sequence ou d'un fragment determine d'nucleic
acid, notamment-d'un gene au sein d'une composition susceptible de le
contenir.
Le procede selon l'invention est caracterise en ce que l'on met en
contact avec la composition presumee contenir une sequence ou un
fzagment determine d'nucleic acid, une sonde contenant un nucleic acid
comple- mentaire susceptible de s'hybrider avec la sequence d'nucleic
acid ou le gene recherche, la sonde etant plus parti- culierement
caracterisee en ce qu'elle porte au moins un croupe N-2
acetylamninofluorene fixe de facon covalente a au moins l'une des
bases de cette sonde, l'eventuelle presence de la sequence d'nucleic
acid ou de gene recherche etant ensuite revelable par action
d'anticorps efficace vis-a- vis de la N-2-(g quanosine -8-yl 4
acetylaminofluorene ou prea- lablement preparesvis-a-vis de la sonde
portant des residus- d'acetylaminofluorene (ci-apres denommes
DNA-AAF).
Il va de soi que le procede revendique dans le cadre de la presente
demande s'etend a l'utilisation de tout autre groupe chimique fixable
sur un ADN dans les conditions decrites par de MURCIA et coll.
Naturellement, il va de soi que le DNA-AAF utilise comme sonde est mis
en presencede l'ADN a etudier dans des conditions permettant le
reappariment de sequences complementaires, ce qui implique
naturellement une denatura-
-3- tion prealable dans des conditions bien connues des ADN sus-
ceptibles de s'hybrider mutuellement.
Apres hybridation, l'ADN-AAF non hybride- de facon specifique est de
preference elimine par rincage avant que l'on ne procede a la
detection des hybrides formes, notamment par leur mise en presence
avec des anti- corps anti-DNA-AAF,cui peuvent alors se fixer sur la
sonde a la fois modifiee et hybridee avec la sequence de ADN
rechercheelorsque celle-ci etait presente dans la composition
utilisee.
Apres rincage des anticorps excedentaires encore presents, les
anticorps fixes peuvent etre, soit precipites, soit reveles.
De preference, la revelation est faite au moyen d'un anticorps anti
DNAAAF, avantageusement marque par une enzyme dont on peut ensuite
detecter ou doser l'activite vis-a-vis d'un aibstrat specifique
Avantageusement on utilisera celles des enzymes qui sont susceptibles
d'in- duire une reaction coloree au niveau des substrats corres-
pondants.
La revelation a l'aide d'enzymes donnant des reactions colorees est
tres rapide.
La methode est tres sensible, surtout si on utilise des systemes
amplificateurs (chapelets, arbres ou boules d'anticorps associes a des
enzymes)-, de sorte qu'elle permette de localiser des genes apres
hybridation in situ sur des chromosomes, par exemple dans le cas'de
diagnostics prenatals La methode peut etre quantitative, par mesure de
l'intensite de la coloration.
Des caracteristiques supplementaires de l'invention apparaitront
encore au cours de la descrip- tion qui suit d'un exemple type de mise
en oeuvre du procede selon l'invention.
-4- On a fait usage des matieres et methodes suivantes: Les A D N: ADN
de phage p BR 322 portant une sequence de gene de ribosome de
hamsterde 6,6: kb inseree au site Eco RI (clone PWE 6)
ADN distinct de phage X 57 comme temoin negatif.
L'A D N traite a l'A A F (DNA-AAF)
De l'ADN du clone PWE 6 a ete linearise (par l'en- zyme de restriction
Sal I) et traite a l'AAF selon la technique decrite par G de MURCIA et
al (PNAS vol 76
N 12 p 6 076 6 080 1979) Le nombre des guanines mo- difiees a ete
estime a 2 percent du nombre de paires de bases par mesure de la
densite optique a 305 rinm et 260 nm.
Les anticorps serum DNA-AAF obtenu par -immunisation d'un lapin
anticorps anti Guo-AAF de lapin purifie sur colonne d'affinite,
anticorps de chevre anti Ig G de lapin lies a de la peroxydase Les
anticorps ont ete obtenus dans les conditions decrites dans l'article
susdit.
Essai de detection du DNA-AAF
Des quantites variables de DNA-AAF ont ete depo- sees sur des filtres
de nitrocellulose (Schleicher et
Sch Ull, type BA 85) de 5 mm de diametre.
L'ADN a prealablement ete dilue dans une solution
2 x SSC et denature a 100 C, pendant 5 minutes.
Apres depot,les membranes ont ete mises au four a
C pendant 2 heures.
-Les membranes ont ensuite ete traitees avec une solution 3 percent
albumine bovine (SIGMA ref A 7888), 1 SSC, A 40 C pendant une heure,
puis incubees 30 minutes a temperature ambiante dans la meme solution
en presence d'anticorps anti-DNA-AAF ou anti-Guo-AAF de l Xapin a
2 ageml final.
Apres incubation, les membranes ont ete lavees - 7 fois avec du PBS, a
temperature ambiante, puis mises a incuber 30 minutes dans une
solution 3 percent albumine bovine, 1 SSC contenant des anticorps de
chevre anti Ig G de lapin lies a de la peroxydase a 2 pg/ml final.
Apres lavage 7 fois avec du PBS, la reaction coloree a ete faite par
addition de la solution suivante, preparee extemporanement:
2 mg de 3-amino-9-ethylcarbazol (SIGMA ref.
A 5754) dissous dans 0,5 ml de N-N'-dimethyl-formamide, 9,5 ml de
tampon acetate acetique 0,05 M p H 5,1, pl d'H 202 (Merk ref 7209)
Test d'hybridation avec du DNA-AAF utilisecomrme sonde Depot de
quantites variables de DNA PWE 6: 1) 100 ng 2) 10 nq 3) 1 ng 4) 100 pg
Apres depot, les filtres sont mis a 80 C pendant 2 heures, puis
Drehybrides 4 heures a 68 C dans une solution 6 x SSC et 10 x
Denhardt.
(1 x Denhardt contenant: 0,02 percent de Polyvinyl pyrrolidone,, 0,02
percent du reactif commercialise sous la designation FICOLLE 400 par
la
Societe"Pharmacia fine Chemicals".
0,02 percent d'albumine bovine) Ils sont ensuite hybrides dans une
solution 2 x SSC 1 x Denhardt en presence de 200/ul par membrane de
solution de ENAAAF prealablement denature contenant respectivement:
ng/ml final 1 ng/ml final et pg/ml final Apres hybridation, les
filtres ont ete iaves minutes dans 2 x SSC 1 Denhardt " " N 1 x SSC 1
Denhardt t " "O 0,5 x SSC 1 Denhardt " " " 0,2 x SSC 1 Denhardt
l'heure 0,1 x SSC 1 Denhardt puis incubes pendant 1 heure a 400 C dans
une solution contenant 3 percent d'albumine a 1 x SSC La suite des
operations a ete faite comme precedemment (mise en presence avec des
anticorps anti-DNA-AAF ou anti Guo-AAF, lavage PBS, anticorps +
peroxydase, lavage PBS et revelation). Apres revelation on observe des
taches colorees dont l'intensite (plus forte pour les concentrations
elevees, plus faible pour des concentrations basses d;ADN) depend de
la quantite d'ADN hybride.
La methode de detection sus-indiquee a conduit a des resultats
entierement negatifs au terme d'essais d'hybridation realises-entre le
temoin negatif (utilise en des quantites atteignant jusqu'a 90
nanogrammes) et le DNA-AAF.
L'invention ne se limite evidemment pas aux modes de realisation
decrits ci-dessus a titre d'exemples et l'homme de l'art peut y
apporter des modifications sans- pour autant sortir du cadre des
revendications ci-apres.
Au titre des variantes utilisables au niveau de laa detection des
hybrides formes avec la sonde selon l'in- vention, on citera la
revelation des hybrides formes par la radio- activite, par exemple
grace a l'utilisation d'anticorps anti-DNA-AAF rendus radioactifs par
de l'iodine 125 ou 131 ou de protein A radioactive, qui va se fixer
sur les anticorps
Enfin, au titre des variantes d'applications - possibles, on citera
l'application de la sonde selon l'invention a la purification d'un ADN
complementaire contenu dans une composition initiale, notamment au
moyen de protein A-associee a un support solide (par exemple constitue
de billes d'agarose), d'anticorps precipitants associes ou non a un
support-solide (billes d'agar ose, -de latex, etc), pour assurer la
precipitation selective de l'hybride forme. Enfin fait partie des
modifications restant dans le cadre des revendications la substitution
possible de
1 'AAF par toute molecule equivalente carcinogene ou ana-
7 - logue susceptible de se fixer dans les memes conditions sur
certaines au moins des bases des nucleotides dont est constituee la
sonde.
8-
Claims
_________________________________________________________________
REVENDICATIONS
1 Procede de detection de la presence d'une sequence
d'acidnucleiquetelle qu'un gene ou fragment de gene dans une
composition ou echantillon presume la contenir, caracterise en ce que
l'on met en contact cette composi- tion avec ure sonde contenant un
nucleic acid complemen- taire de la sequence d'nucleic acid ou du gene
recher- che dans des-conditions permettant notamment cette hybri-
dation, ladite sonde portant au moins un groupe
N-2-acetylaminofluorene-fixe de facon covalente a au moins l 0 l'une
des bases de cette sonde, l'eventuelle presence de la sequence
d'nucleic acid ou de gene recherche etant ensuite revelable par'action
d'anticorps efficaces vis- a-vis de la
N-2-(guanosine-8-yl)-acetylaminofluorene ou prealablement prepara
vis-a-vis de-la sonde portant des residus d'acetylaminofluorene.
2 Procede selon la revendication 1 comprenant en outre la separation
de l'hybride forme, en vue de la pu- rification de ladite sequen Qe
d'nucleic acid, notam- ment par precipitation.
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