close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000102203

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Усачбв Евгений Валерьевич
ГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММОВ ВИРУСА БОЛЕЗНИ НЬЮКАСЛА,
ВЫДЕЛЕННЫХ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИИ И СОПРЕДЕЛЬНЫХ ГОСУДАРСТВ.
03.00.03 .-молекулярная биология
ОЗ.ОО.Об.-вирусология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва-2005
Работа выполнена в НИИ Вирусологии имени Д.И. Ивановского
Российской Академии Медицинских наук
Научные руководители:
Кандидат биологических наук
Алексей Геннадьевич Прилипов
Доктор биологических наук,
профессор
Светлана Сергеевна Ямникова
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук,
профессор
Гараев Мансур Мухамедович
Доктор ветеринарных наук,
профессор
Владимир Иванович Смоленский
Ведущая организация:
НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН
Защита состоится « 5
» декабря 2005 г.
в 1^
часов на заседании
диссертационного Совета Д.001.020.01 при ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского
РАМН (адрес: 123098 Москва, ул. Гамалеи, 16).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ НИИ вирусологии им. Д. И.
Ивановского РАМН
Автореферат разослан « J
» ^<OiS,0^
Ученый секретч)ь диссертационного Совета
Доктор медицинских наук
2005 г.
Н. П. Косякова
г
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы.
Вирус болезни Ньюкасла (ВБН) широко распространен в различных
регионах мира, поражает многие виды диких и домашних птиц и внесён в
список наиболее важных патогенов. Несмотря на проведение повсеместной
вакцинопрофилактики, болезнь Ньюкасла до последнего времени остается
массовой инфекцией птиц, трудно поддающейся контролю. С развитием
промышленного птицеводства это заболевание приобрело панзоотический
характер, нанося огромный экономический ущерб отрасли. Немаловажную
роль
в
этом
процессе
сьпрал
широкий
международный
обмен
высокопродуктивными породами домашних птиц, часто проводимый без учета
эпизоотической ситуации в конкретных странах (Sonoda et al., 2000, Yu et a l ,
2001).
Вирус болезни Ньюкасла является оболочечньш со спиральным строением
нуклеокапсида.
Геном
вируса
представляет
собой
однонитевую
РНК
негативной полярности протяжённостью более 1,5x10* н.о. и содержит шесть
последовательно
расположенных
генов,
кодирующих
белки
NP
(нуклеопротеин), Р (фосфопротеин), М (матриксный белок), F (белок слияния),
HN (гемагглютинин-нейраминидазу) и L (Р1Ж-зависимую РНК-полимеразу).
СтремЕггельное
накопление
экспериментальных
данных
показывает
огромное генетическое разнообразие вируса БН. К сожалению, в настоящий
момент не существует общепринятой системы классификации вируса в
пределах рода Avulavirus (Mayo, 2002). Среди наиболее известных систем
классификации В Б Н выделяются две, основанные на анализе участка гена F. По
классификации, предложенной авторами Lomniczi et al. (1998), Alexander et al.
(1999), Herczeg et al. (1999, 2001), Ke et al. (2001), Yu et al. (2001), Liang et al.
(2002) существует
восемь
основных
линий (I-VIII).
Другая система,
предложенная Aldous et al. (2003, 2004), предполагает наличие всего шести
основных линий 1-6. В
данной работе__^для_ус1ановления - генотиповой
РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ j
БИБЛИОТЕКА
I
^"■3^5
II—»<»
. '
2
принадлежности исследованных штаммов В Б Н мы основывались на второй
системе классификации.
Несмотря на то, что филогенетический анализ выполнен для огромного
числа штаммов В Б Н по всему миру и определены основные генотипы, остаётся
неясным вопрос - какие генотипы ВБН представлены на территории России и
сопредельных государств. Из известных "российских" изолятов ВБН к моменту
написания работы в базе данных GenBank были представлены частичные
нуклеотидные последовательности гена F только четьфёх представителей
субтипов За, ЗЬ и 4а, выделенньгх с 1947 по 1974 гг. от домашней птицы
(Грибанов с соавт., 1999; Манин с соавт., 2002). Однако совершенно не изучено
разнообразие вариантов штаммов БН, циркулирующих в популяциях диких
птиц.
Для детекции вируса болезни Ньюкасла в образцах органов птиц, а также
аллантоисной жидкости куриных эмбрионов в настоящее время разработаны
несколько ОТ-ПЦР систем. В основном, все они основаны на амплификации
участка гена F или М. Как правило, они адаптированы к штаммам, выделенным
на определённой территории, а постоянное накопление фактического материала
(в данном случае речь идёт о первичных нуклеотидных последовательностях
генов штаммов ВБН) сужает область применения данной системы. Поэтому, изза недостатка данных по распространению генотипов В Б Н на территории
России и сопредельных государств, необходимо создать ОТ-ПЦР систему для
детекции
РНК
вируса
БН,
адаптированную
к
вариантам
вируса,
циркулирующего на территории нашей страны. Для оптимизации ранее
предложенных методов детекции мы считали целесообразным создать систему
вьивления вирусного генома на основе ОТ-ПЦР анализа с последующим
использованием амплифицированных фрагментов ДНК для секвенирования и
выяснения филогенетических взаимоотношений исследуемых вариантов ВБН с
ранее известными.
Для наиболее полной характеристики штамма вируса, необходимо знать
полную нуклеотидную последовательность его генома. К настоящему моменту
3
такие данные о штаммах, выделенных на территории России и сопредельных
государств, отсутствуют.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящего исследования явилась генетическая характеристика
вариантов вируса болезни Ньюкасла (ВБН), циркулирующих на территории
России и сопредельных государств в популяциях домашних и диких птиц, а
также определение первичной структуры генома варианта вируса БН, наиболее
распространённого на территории России. Для достижения поставленной цели
было необходимо решить следующие задачи:
1. Провести определение первичной структуры гена F или его участка
"культуральных" штаммов вируса Б Н (всего 59), выделенных на территории
России (11), Украины (3), Белоруссии (1) и Казахстана (44) от диких и
домашних птиц в период с 1983 по 2004 г.
2. Разработать лабораторный вариант детекционной ОТ-ПЦР системы на
основе анализа нуклеотидных последовательностей известных штаммов ВБН,
депонированных в базе данных GenBank,
3. Испытать разработанную детекционную систему на образцах полевого
материала (182), собранного от диких птиц на территории Приморского края в
2004 г.
4. Провести генотипирование исследуемых штаммов вируса и вариантов из
полевого материала, а также сравнить их мевду
собой и с ранее
охарактеризованными штаммами, представленными в базе данных GenBank, с
помощью филогенетического анализа.
5. Определить первичную структуру полную генома российского штамма
Stema/Astrakhan/2755/2001 вируса БН субтипа 5Ь.
6. Провести
корреляционный
анализ
соответствия
результатов
генотипирования по фрагменту гена F (374 и.о.) и результатов генотипирования
по практически полному геному.
4
Научная новизна и практическая значимость.
1. Создан и апробирован лабораторный вариант ОТ-ПЦР тест-системы для
детекции вируса БН.
2. Установлено, что на территориях Астраханской области (2002 г.) и
Приморского края России (2001-2004 гг.) в популяциях диких птиц
циркулировали варианты вируса БН генотипа 1, а также субтипов За и 5Ь.
3. Установлено, что выделенные от домашней птицы штаммы ВБН на
территории Казахстана в эпизоотический и межэпизоотический периоды с 1988
по 2004 гг. принадлежат к генотипам 1,2, а также субтипам За, 5Ь и 5d.
4. Установлено, на основании анализа аминокислотной последовательности
сайта протеолитической активации белка слияния, что все изученные штаммы
и изоляты, отнесённые к субтипам За, 5Ь и 5d, соответствуют велогенному
характеру патогенности, в то время как варианты вируса БН генотипов 1 и 2 лентогенному характеру патогенности.
5. Продемонстрировано,
что
за
эпизоотическую
ситуацию
в
обследованных регионах отвечает циркуляция штаммов ВБН, принадлежащих
субтипам 5Ь, 5d и За. Учитывая, что последние эпизоотии в Казахстане были
вызваны вирусами в основном субтипа 5Ь, а также то, что именно этот субтип
преобладает в популяциях диких птиц, обитаюпщх на территории России,
данный субтип представляет наибольшую опасность для птицеводческих
хозяйств России и сопредельных государств.
6. Генетически охарактеризован, на основе определённой нами первичной
структуры
генома,
первый
российский
велогенный
штамм
Stema/Astrakhan/275 5/2001 вируса БН, принадлежащий субтипу 5Ь.
7. Проведённый анализ соответствия результатов генотипирования по
фрагменту гена F (374 и.о. от начала открытой рамки считывания белка F - по
классификации Aldous с соавт., 2003) и результатов генотипирования по
практически полному геному показал высокую степень их корреляции
(К=0,98). Таким образом, показано правомерное использование участка гена F
5
(374 и.о.) для установления филогенетических взаимоотношений штаммов В Б Н
в пределах ро^а Avulavirus и внутри основных генетических линий.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Создан
лабораторный
вариант
детекционной
ОТ-ПЦР
системы,
позволяющий обнаружить различные варианты вируса БН, циркулирующие на
территории России и сопредельных государств. С помощью данной системы
обнаружены варианты вируса БН четырёх основных генетических линий из
шести, известных к настоящему времени.
2. На основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей
участка гена F (374 и.о.) штаммы ВБН, изолированные на территории России и
сопредельных государств, принадлежат к генотипам I и 2, а также субтипам За,
5Ь и 5d.
3. Анализ аминокислотной последовательности сайта протеолитической
активации белка слияния позволил установить, что на территории России и
Казахстана циркулируют штаммы как велогенного, так и лентогенного
патотипов. Штаммы различной степени патогенности встречаются как среди
домашних, так и диких птиц.
4. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность генома
российского
штамма
вируса
БН,
который
также
оказался
первым
представителем субтипа 5Ь с известной первичной структурой генома.
Установленная полная нуклеотидная последовательность генома штамма
Stema/Astrakhan/2755/2001 вируса болезни Ньюкасла позволяет использовать
его в качестве эталонного представителя субтипа 5Ь с велогенным патотипом.
5. Сравнение результатов филогенетического анализа по участку гена F и
последовательности практически полного генома В Б Н показало высокую
степень их корреляцрш (К=0,98). Полученные данные позволяют сделать
заключение о правомерном использовании участка гена F (374 и.о.) для
установления филогенетических взаимоотношений штаммов ВБН в пределах
рода ^vM/av/ntf и внутри основных генетических линий.
6
Апробация работы.
Результаты диссертационной работы были доложены и обсуждены на
совместном заседании отдела молекулярной вирусологии и апробационного
совета ГУ НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского РАМН (29.09.05).
Объем и структура диссертации.
Материалы диссертации изложены на 122 страницах машинописного текста.
Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и
методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения,
выводов и списка цитируемой литературы (121 источник), содержит 8 таблиц и
24 рисунка.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве исследуемого материала были использованы штаммы ВБН,
выделенные на территории России (11) и Казахстана (44), а также четыре
штамма из коллекции вирусов ГУ НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского,
изолированные на территории Украины и Белоруссии от домашней птицы.
Штаммы из России, исследованные в данной работе, были изолированы в
Костромской обл.. Астраханской обл. и в Приморском крае, как от диких (10),
так и от домашних птиц (1). Штаммы, выделенные в Казахстане, были
изолированы от домашних птиц за период с 1988-2004 гг. на территории
Алматинской, Жамбылской и ТалдыкорганскоЙ областей.
Также в работе были исследованы 182 образца полевого материала
(клоакальные смывы птиц) собранные на юге Приморского края в 2004 г. от
диких (142) и домашних птиц (40).
Последовательность
олигонуклеотадных
праймеров
подбиралась
с
помощью программы Primer Premier 5.00 (Premier Biosoft International, США) с
использованием нуклеотидных последовательностей различных изолятов ВБН,
доступных
в
базе
данных
GeneBank.
Определение
нуклеотидных
последовательностей осуществляли на автоматическом секвенаторе (ABI
7
PRISM 3100, США). Для построения алайментов использовали пакет профамм
DNASTAR V.3.12 (Lasergene, США). Построение филогенетических деревьев
осуществляли на основе двух алгоритмов: "ближайшего соседа" или "UPGMA"
в рамках 2-параметрической модели М. Кимуры с последующим 1000-кратным
ресэмплингом (MEGA 2.1).
Р Е З У Л Ь Т А Т Ы С О Б С Т В Е Н Н Ы Х ИССЛЕДОВАНИЙ
1. Создание лабораторного варианта ОТ-ПЦР тест-системы для детекции
Р Н К вируса Б Н в биологических образцах
Одной из задач данной работы было создание детекционной ОТ-ПЦР
тест-системы для обнаружения геномной РНК вируса БН, совмещённой с
определением генотиповой принадлежности ПЦР-положительных образцов на
основе сиквенса амплифицируемых фрагментов ДНК.
Для синтеза на матрице вирусной РНК комплиментарной ДНК был
подобран праймер 614F. Место посадки этого праймера расположено в районе
3'-конца гена М (рис. 1А). Для детекции вируса БН в пробах полевого
материала с очень низким содержанием вирусной РНК применялся вариант
"гнездовой" ПЦР: внешняя пара праймеров 614F/1356R (рис. 1С); внутренняя
пара 1045F/601R (рис. Ш ) . Для амплификации фрагментов ДНК культуральных
штаммов В Б Н
с целью их дальнейшего генотипирования применялся
однораундовый или "полу-гнездовой" варианты ПЦР в зависимости от
концентрации вирусной РНК в пробе. Однораундовый вариант ПЦР проводили
с участием пары 614F/3232R (рис. IB). В "полу-гнездовом" варианте ПЦР
использовали пары праймеров: внешняя 614F/3232R (рис. I B ) и внутренняя
пара614Р/1356Я(рис. 1С).
Разработанная ОТ-ПЦР система была протестирована на культуральных
штаммах вируса БН, а также образцах полевого материала (Приморский край,
2004 г.). Важно отметить, что в нашем распоряжении не было штаммов всех
известных шести генотипов вируса БН (APMV-1) и штаммов других
8
парамиксовирусов
птиц (APMV-2 -
APMV-9), ввиду
чего, не было
возможности проверить универсальность и специфичность ОТ-ПЦР системы.
Однако,
при
анализе
первичной
структуры
генома
ранее
охарактеризованных штаммов (GenBank), можно сделать заключение о
возможности использования предложенной нами ОТ-ПЦР системы для
обнаружения всех известных к настоящему времени генотипов вируса БН в
пределах рода Avulaviras.
геномнвя Р Н К
"СЕ
А
В
с
Fg«rw
HNfl«M
л&лг9
лШ^^
синтез к Д И К
«0.
teste
«WF^
WWP^
D
■Ш.
323QR
amtm
1-ык раунд П Ц Р
iwsr
юп
лот
2-аК раунд П Ц Р
Х П П ф Ш 1-ыйраунд
ffRSKipur 2-гЛ раунд ПЦР
1П^
сехмнирпанне
Рисунок 1. Схематическое изображение ОТ-ПЦР тест-системы В Б Н для проб с высоким и
низким содержанием вируса (см. в тексте), а также стратегии секвенирования. A-D - стадии
ОТ-ПЦР тест системы. Е - стадия секвенирования амплифицированных фрагментов ДНК.
Стрелками обозначены направления олигонуклеотидных праймеров.
2. Генетическая характеристика штаммов В Б Н , выделенных на
территории России и сопредельных государств
2.1. Исследование штаммов В Б Н , изолированных на территории России,
Украины и Белоруссии
Вирусы, изолированные в Астраханской области
На основе филогенетического анализа по участку гена F (по системе,
предложенной Aldous с соавторами в 2003 г.) штаммы ВБН, изолированные в
9
Астраханской обл. в 2001 г., были отнесены нами к субтипу 5Ь (рис. 2) в
составе европейского кластера. Исследуемые астраханские штаммы бьши
выделены от диких птиц, являющихся основным резервуаром ВБН. Повидимому, циркуляция именно этого генотипа определяет современную
эпизоотическую ситуацию на территории северо-западного Прикаспия.
Вирусы, изолированные на территории Украины. Белорусии и Костромской
области России
Для
штаммов
Chicken/Kiey/1033/83,
Chicken/Kiev/2082/83,
Duck/Ukraine/376/87, Chicken/Belarus/1/86 и Duck/Kostr/25/86 была определена
нуклеотидная
последовательность
целого
гена
F
(порядка
1700 и.о.).
Филогенетический анализ этих штаммов по участку гена F показал, что
"украинские" штаммы принадлежат к второму генотипу, а штаммы из
Белоруссии и Костромской области к первому (рис. 2). Нами было установлено,
что штаммы Chicken/Belarus/1/86 и Duck/Kostr/25/86 в пределах первого
генотипа входят в состав западноевропейского кластера.
Штаммы, изолированные в Приморском крае в 2001-2002 гг.
Для
штаммов
Duck/FarEast/2687/2001,
Duck/FarEast/2713/2001,
Anas/FarEast/3658/2002,
Duck/FarEast/2686/2001,
Anas/FarEast/3638/2002
и
Anas/FarEast/3652/2002, выделенных от диких птиц в Приморском крае в 20012002 гг., была определена нуклеотидная последовательность целого гена F. На
основе филогенетического анализа по участку гена F эти штаммы были
отнесены к первому генотипу. Следует отметить, что приморские штаммы
вошли также как, и штаммы Chicken/Belarus/1/86 и Duck/Kostr/25/86, в
западноевропейский кластер.
2.2. Анализ штаммов В Б Н , изолированных от домашних птиц в
Казахстане в 1988-2004 гг.
Для штаммов ВБН, изолированных в птицеводческих хозяйствах
Казахстана
с
1988
по
2004
гг.,
была
определена
нуклеотидная
последовательность протяжённостью 1083 и.о., охватывающая участок гена М
10
(100
а.о.,
С-конец
белка
М),
расстояние
между
кодирующими
последовательностями генов М и F и начало гена F (206 а.о., N-конец белка F).
Пятнадцать штаммов 1998 года, два штамма 2000 г. и три штамма 2001 г. были
отнесены к субтипу 5Ь. Пять штаммов 2003 г. и столько же 2004 г. отнесены к
субтипу 5d. Десять штаммов более ранних лет изоляции отнесены к первому
генотипу (1988 г. - 2 штамма, 1989 г. - 3 штамма и 1998 г. - 5 штаммов). Три
штамма, вьщеленные в Жамбылской области (1 - 1988 г. и 2 - 1990 г.) были
отнесены к субтипу За. Один штамм 2001 г. ПМВ-1/курица/Алматы/93/01
принадлежал
к
второму
генотипу
(рис.
2).
Сравнительный
анализ
нуклеотидных последовательностей участка гена F казахстанских штаммов в
пределах субтипа 5Ь показал, что штаммы 1998-2001 гг. входят в состав
европейского кластера. Штаммы, вошедшие в первый генотип, оказались
генетически однородньпии и наиболее близкими к ранним изолятам:
Chicken/Belarus/1/86
и
Duck/Kostr/25/86,
принадлежащим
к
штаммам
западноевропейского кластера. Исследуемые в данной работе "казахстанские"
штаммы 2003-2004гг., по-видимому, образуют собственный кластер в пределах
субтипа 5d. Три казахстанских штамма, отнесённые к субтипу За, оказались
наиболее близкими к штаммам ГАМ-61, Mukteswar и сингапурским штаммам SGCK99062 и -SGCK99061 1999 г. Непатогенные или слабопатогенные
варианты ВБН к настоящему времени в составе субтипов 5Ь и 5d не описаны.
Исходя
из
этого,
можно
предположить,
что
циркуляция
высокопатогенньк штаммов субтипов 5Ь и 5d определяет современную
эпизоотическую ситуацию на территории Казахстана. По-видимому, за
последние 3 - 4 года произошла смена вариантов вируса Б Н субтипа 5Ь на
субтип 5d.
И
ПМВ-1/|Сур|1т/Ал>иты/22/98
ПМВ-1/11УР111П/ЛЛМ1ТЫ/24/98
ПМВ'1/|сурнца/Алмяты/2£^
11МВ-1/11у|Я1а/Алшты/2)1Л>
ПМВ-1/куря11Я/Алматы/30/98
ПМВ-1/курн1и/Алипы/31/98
ПМВ-1/1су|шш/Алшты/32;98
ПМВ-1/1су|>|1т/Ллматы/34У98
ПМВ-1/1Су|Ш1|а/Али1ты/3«/98
ПМВ-1/1сур||||1/Ал>ипы/37/98
ПМВ-1/кур11и/ЛлИ1ТЫ/38/98
ПМВ-1/|сур11и/Алиат1.1/39/98
ПМВ*1/курт»УАли1ты/42У98
ПМВ-1/курп(1/Ллматы/43Л8
ПМВ-1/|1у]>пи/Алматы/52/98
ПМВ-1/|сур|11и/Алматъ|/55/00
ПМВ-1/кур11и/Али>ты/б1/М
ПМВ-1/курпп/К0||ыр/ибД11
ПМВ-1/||ур|1аа/Ктыр/1г7Л11
ПМВ-1/курпа/К|Мыр/1гМ1
ПМВ-1/курнця/Алматы/352У88
ПМВ-1/нШ|КкЛ1й1мбыл/53«/90
ПМВ-1/|сур1ша/Жамбыл/353/90
Chickcn/Klev/r033«3
ailclini/Klev/20i243
Oicli/llkral>e/37«/«7
ПМВ-1/кураиа/Алиаты/93/01
Ducii/FarEaita713/2001
Dick/FarEaiVMtinWl
D>ck/FarEait/2M7/2001
ADai/FarEMt/3«SaaOin
Alias>FarEa<t/3«3<a0e2
Anai/FarEalt/3«S2/2M2
SUnil/A<traUili/27SSaMl
$Uriu/A>traUiaii/2758aMl
CorBoraiil/AitraUiaa/27Sl/2MI
Coot/Aitraldiaii/2743^001
ПМВ-1/|с)>ря||а/Алмт1/М/М
ПМВ-1/к>р||ца/Алматы/345/8<
ПМВ-1/|1ур«1и/Ллматы/449Д9
ПМВ-1/кур|П|а/Ллматы/4б2/89
ПМВ-|/|1ур111и/Ллматы/469/«9
nMB-I/Kypwa/AmaTbi^V/M
ПМВ-1/курноа/Алматы/33/98
ПМВ-1/|1ураиа/Алиаты/3!/98
ПМВ-1/|сур1щ/Ая>иты/47/98
ПМВ-1/кураш/Лст>на/$1/98
CMckai/Bclanu/I/8«
Diicli/Koilr/25/K
ПМВ-1/курииа/Талды1сорга11Л41Д13
ПМВ-1/курнца/Гадаыкорга11/342Л}3
ПМВ-1/|сурнца/Галды1соргян/34Э/03
ПМВ-1/|1урапа/Гал9ып1рга11/344/(13
ПМВ-1/|^нца/Талдикорга11/34М)3
ПМВ-1/1сур|1|а/Алиаты/540/<И
ПМВ-)/кура1и/АлиаП|/541/04
ПМВ-1/курн1и/Алматы/542ДМ
ПМВ-1/кур||ца/Алматы/»и«4
ПМВ-1/|1урш||а/Алиаты/МбД)4
Рисунок 2. Генотиповая принадлежность исследованных штаммов (в прямоугольниках).
Овалами обозначены генетические группы. Генотипы обозначены цифрами от 1 до 6, а
субгшш буквами от а до е. Филогенетический анализ с использованием нуклеотидных
последовательностей участка гена F длиной 374 н.о. проводили на основе алгоритма
«ближайшего соседа» в рамках 2-параметрической модели М. Кимуры с последующим 1000кратным ресэмплингом ( M E G A 2,1).
3. Изучение генетического разнообразия вируса БН,
циркулировавшего среди диких и домашних птиц в Приморском крае в
2004 г.
Полевой материал, собранный в Приморском крае в 2004 г., был
исследован с помощью созданной ОТ-ПЦР тест-системы для детекции РНК
ВБН непосредственно в клоакальных смывах. Общая зараженность ВБН
12
диких птиц составила 7 /142 = 4.9 % . Общая зараженность домашних птиц 1 / 40 = 2.5 % . На основе филогенетического анализа по участку гена F два
образца из восьми положительных были нами отнесены к 1-му генотипу,
один - к субтипу За, пять - к субтипу 5Ь.
Образцы, содержащие Р Н К В Б Н первого генотипа (Prm04-61-P и
Prm04-64-P), оказались генетически однородными и наиболее близкими к
ранее
описанным
"казахстанским"
штаммам
первого
генотипа,
принадлежащим к штаммам западноевропейского кластера.
Анализ
нуклеотидных
последовательностей изолятов
Ргт04-14-Р,
Prm04-22-P, Prm04-83-P, Prm04-94-P и Prm04-169-P, отнесённых к субтипу
5Ь, показал, что первые четыре образца ближе всего к штаммам Казахстана
1998 г., входящим в состав европейского кластера. Последний образец также
вошёл в европейский кластер, но в составе фуппы из "казахстанских"
штаммов (2000 и 2001 гг.) и "астраханских" штаммов 2001 г.
Единственный
образец Prm04-129-P, отнесённый
к
субтипу
За,
оказался наиболее близок к штаммам ПМВ-1/курица/Алматы/352/88, П М В 1/индюк/Жамбыл/536/90 и ПМВ-1/курицаУЖамбьш/553/90, изолированньпи в
Казахстане.
4. Филогенетические взаимоотношения исследуемых изолятов В Б Н в
пределах генетических групп
Генотип 1.
Сравнение
исследованных
штаммов
ВБН
и
ПЦР-положительных
образцов, отнесённых к первому генотипу, с ранее описанными штаммами
этого же генотипа по участку гена F, позволило установить их более детальную
дифференциацию.
Исследованные
штаммы
Duck/Kostr/25/86
и
Chicken/Belarus/1/86, изоляты из Казахстана 1988-1998 гг., а также изоляты
Приморского края (2004 г.) Prm04-61-P и Ргш04-64-Р образовали довольно
однородную группу, удалённую от группы штаммов Приморского края 20012002 гг., в пределах западноевропейского кластера первого генотипа.
13
Установлено, что
в популяциях диких птиц Приморского края
циркулируют штаммы ВБН первого генотипа, по меньшей мере, двух
вариантов.
Генотип 2.
В пределах генотипа 2 рядом авторов выделяется четыре чётких кластера
штаммов В Б Н (Alexander, 2000; Давыдкин с соавт., 2001). Два из них кластеры вакцинных штаммов, родоначальником первого является штамм
LaSota, а второго - В 1 . Третий кластер представляют штаммы с велогенным и
мезогенным характером патогенности. Четвёртый кластер составляют всего три
штамма евразийского континента с лентогенным характером патогенности.
Из исследованных в данной работе штаммов к генотипу 2 нами были
отнесены три штамма с Украины 1980-х гг. и один штамм Казахстана 1991 г.,
выделенные от домашней птицы. Более детальньШ анализ нуклеотидных
последовательностей гена F или его участка позволил сделать вывод, что
исследованные штаммы являются вариантами вакцинного штамма LaSota,
широко применяющегося в птицеводческих хозяйствах и входят в состав
кластера вакцинных штаммов ряда LaSota. Следует также отметить, что нами
не были обнаружены варианты вакцинных штаммов второго генотипа в
популяциях диких птиц, что, по-видимому, свидетельствует о низкой
эффективности трансмиссии этих штаммов от дикой к домашней птице.
Субтип За.
Субтип За составляют штаммы мезогенного и велогенного патотипов.
Некоторые мезогенные штаммы этой группы используются в качестве
вакцинных в птицеводческих хозяйствах. Исследованные штаммы и образцы
(11МВ-1/индюк/Жамбьш/536/90,
ПМВ-1/курица/Жамбыл/553/90,
ПМВ-
1/курица/Алматы/З 52/88 и Prm04-129-P), отнесённые к этому субтипу,
оказались наиболее близкими к сингапурским штаммам -SGCK99062 и SGCK99061, а также к вакцинным аттенуированнь»! штаммам Mukteswar
(BINLA40166) и ГАМ-61. Можно предположить, что исследованные штаммы
Казахстана и один из изолятов Приморского края 2004 г. могут быть
14
вариантами вакцинного штамма или эндемичными штаммами обследованных
регионов. Отсутствие сведений об использовании вакцинных вариантов вируса
БН в этих регионах не позволяет сделать заключение о возможности
интродукции вакцинного варианта вируса субтипа За в популяции диких птиц.
Субгип 5Ь.
Анализ исследованных штаммов ВЕН и "ОТ-ПЦР положительных"
образцов, отнесённых к субтипу 5Ь по участку гена F, позволил установить их
более детальную классификацию в пределах генотипа. Рядом авторов субтип 5Ь
считается генетически гетерогенным, и в его пределах выделяются четыре
различных кластера (Aldous et al., 2003). Первый кластер, состоит в основном
из штаммов ВЕН, изолированных в Европе в середине 1990-х гг. Второй
кластер представлен штаммами, выделенными на африканском континенте
также в середине 1990-х гг. Третий кластер (самый малочисленный) состоит из
трёх португальских изолятов и одного болгарского (1993-1998 гг.). Четвёртый
кластер
представлен
неклассифицированньПкШ
(возможно
кластерообразующими) штаммами различного географического происхождения
(Азия, Южная Америка и Европа) и сроком вьщеления с 1982 по 1994 г.
Исследованные штаммы ВЕН и изоляты, отнесённые нами к субтипу 5Ь,
вошедшие в состав европейского кластера, можно разделить на две отдельные
генетические группы. В первую группу попали штаммы Казахстана 2000 и 2001
гг., штаммы Астраханской обл. 2001 г. и один ПЦР-положительный образец
Приморского края 2004 г. Во вторую группу вошли казахстанские штаммы
1998 г. и четыре варианта вируса из Приморского края 2004 г.
Установлено, что в популяциях диких птиц Приморского края в 2004 г.
циркулировали штаммы В Е Н субтипа 5Ь, по меньшей мере, двух вариантов.
Штаммы ВЕН двух вариантов субтипа 5Ь были также изолированы на
территории Казахстана во время эпизоотии с 1998 по 2001 гг.
Учрпывая то обстоятельство, что на территории Казахстана в 1998 г.
преобладали варианты вируса второй группы, а в 2000-2001 гг. варианты
первой группы субтипа 5Ь, можно предположить, что в период с 1998 г. по 2000
15
г. произошла смена вариантов вируса БН субтипа 5Ь, циркулирующего среди
домашней птицы на территории Казахстана.
Субтип 5d.
В состав субтипа 5d входят штаммы ВБН, изолированные в азиатской
части Евразийского континента, и их разделяют на два кластера. В первый
кластер входят штаммы, преимущественно выделенные в Тайване в период с
1998 г. по настоящий момент. Второй кластер составляют штаммы,
изолированные в Китае и Средней Азии (Aldous et al., 2003).
Среди изученных нами к субтипу 5d были отнесены только казахстанские
штаммы 2003 и 2004 гг. При построении филогенетического древа данные
штаммы образовали отдельную ветвь, практически равноудалённую от ветвей
двух ранее описанных кластеров этого субтипа. На основании этого можно
предположить, что казахстанские штаммы образуют свой самостоятельный
генетический кластер.
Исходя из представленных выше данных можно сделать вывод, что в
период с 1998 г. по 2000 г. произошла смена вариантов вируса БН второй
группы субтипа 5Ь на варианты вируса первой группы, а с 2001 г. по 2003 г. в
популяции ВБН произошла интродукция вариантов нового кластера субтипа 5d.
Таким образом, совместная циркуляция штаммов ВБН субтипов 5Ь и 5d будет
определять современную эпизоотическую ситуацию в Казахстане и на
сопредельных территориях.
5. Анализ сайта расщепления белка F исследуемых изолятов В Б Н
Протеолитическое нарезание белка Fo является неотъемлемой и важной
частью жизненного цикла вируса БН. Нарезание белка Fo приводит к его
активации (проявлению биологической активности), необходимой в процессе
слияния вирусной и клеточной мембран. Как полагают, эффективность
протеолиза белка Fo, опосредованная аминокислотной последовательностью
сайта нарезания, является одним из главных маркеров инфекционности и
патогенности вируса БН. Низкопатогенные и некоторые вакцинные штаммы
16
ВБН
имеют
расщепления
следующую
F-протеина:
высокопатогенные
аминокислотную
последовательность
109SGGG(R/K)QGRLIG119,
штаммы
109SGGRRQ(K/R)RF(VЯ)G119.
содержат
Последняя
в
то
сайта
время как
последовательность
включает
пару
основных
аминокислот в положениях 115 и 116, фенилаланин в позиции 117 и аргинин в
позиции ИЗ, что обеспечивает эффективность расщепления клеточными
протеазами и модулирует вирулентность на молекулярном уровне. Анализ
аминокислотных последовательностей сайта протеолитического расщепления
белка F
исследованных
изолятов
позволил
предположить,
что
все
обследованные варианты ВБН 1-го и 2-го генотипов слабопатогенны и имеют
последовательность сайта нарезания белка Fo [SGGG(K/R)QGRLIG], а вирусы
субтипов За, 5Ь и 5d - высокопатогенны и содержат последовательность
[SGGRRQRRFIG]. При этом необходимо отметить, что штаммы различной
степени патогенности встречаются как у домашней, так и у дикой птицы.
б. Анализ первичной структуры полного генома штамма В Б Н
Stenia/Astrakhan/2755/2001
К началу проведения данной работы было известно 27 полноразмерных
последовательностей вирусного генома ВБН, представителей генотипов 1, 2 и
субтипов ЗЬ, Зс, 4а, 4Ь, 5а и 5d. В процессе выполнения данной работы стали
известны
ещё
три
последовательности
практически
полного
генома
представителей генотипа 6. Также нужно отметить, что в базе данных не было
представлено ни одной полноразмерной нуклеотидной последовательности
генома вируса, выделенного на территории России.
Для определения полной нуклеотидной последовательности генома был
выбран штамм Stema/Astrakhan/275 5/2001. Принадлежность этого штамма к
субтипу 5Ь по участку гена F была установлена нами ранее, что облегчило
дальнейшую стратегию подбора праймеров для проведения реакций ОТ, ПЦР и
секвенирования фрагментов генома. После реакций ОТ-ПЦР были получены
три перекрывающихся фрагмента ДНК, составляющие вирусный геном.
17
Полученные фрагменты Д Н К были использованы для определения полной
нуклеотидной последовательности генома исследуемого штамма. Определённая
нами
нуклеотидная
последовательность
генома
штамма
Stema/Astrakhan/2755/2001 длиной 15154 н.о. (без 39 3'-концевых н.о.) была
депонирована в базе данных GenBank (AY865652).
Реальная
картина
филогенетических
взаимоотношений
изучаемых
штаммов В Б Н возможна лишь при анализе нуклеотидных последовательностей
полного генома всех существующих вариантов вируса. Однако определение
последовательности полного генома вируса является очень трудоёмким и
дорогостоящим
процессом.
филогенетических
Поэтому
взаимоотношений
исследователями
штаммов
для
вируса
установления
используются
последовательности различных участков генома, так или иначе отображающих
реальную картину филогении вируса. В связи с этим, нами была предпринята
попытка сравнения результатов филогенетического анализа по практически
полноразмерным последовательностям генома и аналогичного анализа по
участку гена F (374 и.о., согласно классификации Aldous с соавторами, 2003 г.).
Сравнение данных этих анализов по разным фрагментам генома показало их
высокую степень корреляции ([С=0,98), что позволяет сделать заключение о
правомерности использования данного участка гена F для установления
филогенетических взаимоотношений штаммов В Б Н в пределах рода Avulavirus
и внутри основных генетических линий.
На основании анализа первичной структуры генома исследованного
штамма Stema/Astrakhan/2755/2001 и штаммов с известными биологическими
свойствами,
а
также
(аминокислотный
молекулярно-генетических
состав
вирусных
белков,
признаков
патогенности
последовательность
сайта
протеолитической активации белка FQ И белка H N , кратность геномной Р1Ж
шести нуклеотидным остаткам, наличие биологически активного белка V ) был
установлен его велогенный характер патогенности.
Chicken/N Ire)And/UUler/67
IsoUtB l-2progedtur
ШЛШ1-2
Mucd 5peciea/U SVLargo^l
AiiliingaAJS(FIV440>3J93
^jamefawW S (САУ211472/02
Во«Ла1у/2736ЛЮ
Isolate 99-0655
iMfale 99-1435
hoMe 99-086810
Isolate 99-0868hj
'
Isolate 99-1997PR-32'
bolatB9l-l252
/
Isolate 02-1334
/
Isolate 98-1154
'
Isolate 98-1249
'
Isolate 01-1108 /
»_"
I)
Chicken/US(CAyi083(FontaiMy72 a
4
StBma/Aslialihaji/27S5/200l
Coclcatoo/Indonesia/14698/90
a
Dui*/US;i54979-l/2001
DucWUSyi 19535-1Д001
Chidteii/U 87101250-2/2001
9.0S
Рисунок 3. Филогенетическое
древо
штаммов
с
известным
полным
геномом.
Филогенетический анализ с использованием нуклеотидных последовательностей длиной
11902 н.о. проводили на основе алгоритма «ближайшего
параметрической модели М. Кимуры с последующим
соседа» в рамках 2-
1000-кратным ресэмплингом
( M E G A 2.1). Разделение на генотипы и субтипы по участку гена F, основанное на системе
Aldous с соавторами 2003 г.
вьгаоды
1. Установлено, что разработанный лабораторный вариант ОТ-ПЦР тестсистемы является эффективным для детекции геномной РНК вируса болезни
Ньюкасла (ВБН) разных генотипов в биологических образцах, включая
полевые. С помощью разработанной системы, на основании анализа 59
19
штаммов ВБН, выделенных в различных географических регионах (Россия,
Казахстан, Белоруссия и Украина) от домашних и диких птиц, были
выявлены четыре из шести известных к настоящему времени генотипов.
2. Определена первичная структура участка гена F (374 н.о.) для 67
изученных вариантов ВБН и выявлено генетическое разнообразие вирусов
(генотипы 1, 2, 3 и 5), циркулировавших на территории России и
сопредельных государств в период с 1983 по 2004 г.
3. На основе филогенетического анализа по участку гена F установлена
генотиповая принадлежность вирусов БН, циркулировавших в популяциях
диких птиц на территории России: в Астраханской обл. выявлены
представители субтипа 5Ь, в то время как в Приморском крае России
обнаружены варианты вируса первого генотипа и субтипов За и 5Ь.
4. Установлено, что среди домашней птицы на территории Казахстана в
эпизоотический и межэпизоотический периоды с
1988 по 2004 гг.
циркулировали штаммы вируса БН генотипов 1 и 2, а также субтипов За, 5Ь
H5d.
5. Выявлены различия в аминокислотных последовательностях сайта
протеолитической активации белка Fo у исследованных вариантов ВБН
разных генотипов. Последовательность [SGGG(K/R)QGRLIG] вариантов
вируса БН генотипов 1 и 2 соответствует лентогенному (слабопатогенному)
характеру патогенности, тогда как последовательность [SGGRRQRRFIG]
субтипов За, 5Ь и 5d ВБН характерна для велогенных (высокопатогенных)
штаммов.
6. Впервые определена первичная структура генома (>1,5х10'' н.о.)
российского
велогенного
штамма
ВБН
Stema/Astrakhan/2755/2001.
Отсутствие данных о полной нуклеотидной последовательности генома
других представителей субтипа 5Ь позволяет рассматривать его в качестве
прототипного для этого субтипа.
7. На основе выявленной высокой степени
корреляции данных
филогенетического анализа по участку гена F (374 н.о.) и данных
20
аналогичного анализа по фрагмету генома протяженностью II902 н.о.
(К=0,98), сделано заключение о правомерном использовании указанной
части гена F для установления филогенетических
взаимоотношений
штаммов ВБН в пределах рода Avulavirus и внутри основньпс генетических
линий.
Список работ по теме диссертации.
1. Bogoyavlenskiy А., Berezin V., Prilipov А., Usachev Е., Lyapina О.,
Levandovskaya S., Korotetskiy I., Tolmacheva V., Makhmudova N.,
Khudyakova S., Tustikbaeva G., Zaitseva I., Omirtaeva E., Ermakova O.,
Daulbaeva K., Asanova S., Kydyrmanov A., Sayatov M., King D.
Molecular Characterization of Virulent Newcastle Disease Virus Isolates
from Chickens during the 19988 NDV Outbreak in Ka2akhstan. // Virus
Genes. - 2005. - V.31. -P.13-20.
2. E.B. Усачёв,
И.Т. Федякина,
А.Г. Прилипов,
М.Ю. Щелканов,
С.С. Ямникова.
Д.Н.
Львов,
Молекулярно-генетическая
характеристика вируса болезни ньюкасла Stema/Astrakhan/2755/2001
изолированного в России // Мол. Ген. Микробиол. Вирусол. - 2006. - №1.
- в печати.
3. Bogoyavlenskiy А., Berezin V., Prilipov А., Usachev Е., Lyapina О.,
Levandovskaya S., Korotetskiy Г., Tolmacheva V., Makhmudova N.,
Khudyakova S., Tustikbaeva G., Zaitseva L, Omhtaeva E., Ermakova O.,
Daulbaeva K., Asanova S., Kydyrmanov A., Sayatov M., Kmg D. Частичные
нуклеотидные
депонированные
последовательности
в
GenBank.
гена
AY847361,
F
штаммов
AY847360,
ВБН,
AY847359,
AY847358, AY847357, AY847356, AY847355, AY847354, AY847353,
AY847352.
4. Usachev E.V. and Prilipov A.G. Нуклеотидные последовательности целого
гена F штаммов ВБН, депонированные в GenBank. AY965079, AY965078,
AY965077, AY972103, AY972102, AY972101.
л
11821560
РНБ Русский фонд
2006-4
21992
Заказ №571. Объем 1 шл. Тираж 100 экз.
Отпечатано в ООО «Петроруш».
г. Москва, ул. 11ал11ха-2а, тел. 250-92-06
www.postator.ni
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
871 Кб
Теги
bd000102203
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа