close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000103001

код для вставкиСкачать
На правах руюписи
ЖЕМЧУГОВ
Владислав Евгеньевич
Обоснование принципов создания
комплексных прешфатов для профилактики и лечения
бактериальных и BiqiycHbix заболеваний
03.00.07. - мшфобиология
14.00.36. — аллергология и иммунология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктсфа медицинских наук
п.Оболенск-2004
Работа выполнена в Федеральном государственном унитарном
предприятии - Государственном научном центре прикладной
ми1фо15иологии
Научный консультант:
Доктор
медицинских
наук, профессор. Академик РАМН
Заслуженный
деятель
науки
Российской
Федерации
Лауреат Государственных премий СССР и России
Лауреат премии Правительства РФ
Анатодий Андреевич ВОРОБЬЕВ
Офиг^шльные оппоненты:
Дрктор биологических наук, профессор
САВИЦКАЯ Ki^uHtt Илларионовна
Заслуженный деятель науки РФ,
доктор медицинских наук, професссф
ЗЕМСКОВ Владши^ Михайлович
Доктор медицинских наук, профессор
КАЛУЦКИЙ Павел Вячеславович
Ведущее учреяедение:
Московский ваучно-исследовательский институт вакцин и сывороток
им. Н И . Мечникова РАМН.
Защита состоится Ж/p-f
ZOOJ^TB//' часов
на заседании диссертационного совета Д.208.040.08 при Московской
медицинской академии им. И.М. Сеченова (19992, г. Москва, ул. Б.
Пироговская, д.2/6)
Н99Р2,
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской
медицинской академии им. И.М. Сеченова (117998, Нахимовский
проспект, 49)
% »
Авторефератртоспан «г/
Ученый се1фетарь
диссертационного совета,
Д.М.Н., профессор
' /'^^
2Ш4 г.
А.Ю. Миронов
^f^?75'7
3
Аеттальность проблемы.
В
результате
многолетних
значительных
усилий
сотрудников
противочумной службы, Госсанэпиднадзора в целом, в России практически
нет заболеваний людей особо опасными инфекционными заболеваниями.
Однако,
снижение
эпидемически
и
или
отсутствие
эпизоотически
эпидемиологического
плановой
опасных
наблюдения очагов
вакцинации
сопредельных
зоонозов
населения
территорий,
может
привести
к
вспышкам заболеваний, вызванных, в том числе особо опасными микробами.
Возможны вспышки инфекционных заболеваний в зонах вооруженных
конфликтов, природных и техногенных катастроф, а также вокруг них.
Сохраняется угроза биотерроризма с использованием возбудителей особо
опасных инфекционных заболеваний (Онищенко Г.Г.,
потенциальных
агентов,
которые
могут
2000).
быть
В списке
использованы
биотеррористами, возбудитель туляремии занимает одно из первых мест,
наряду с Yersinia pestis,
Burkholderia mallei et
Biirkholderia pseudomallei
(Воробьев A.A., 2002 a; Материалы 3 международной конф. по туляремии,
Умеа, 2000; Warawa J . , Woods D., 2002; Sj6stedt A., 2003).
Существующие живые вакцины имеют ряд недостатков, затрудняющих
их производство, хранение и применение. Некоторые страны принципиально
отказываются от применения живых вакцин для профилактики нечасто
встречающихся
заболеваний,
например,
туляремии.
Химические
или
молекулярные вакцины имеют неоспоримые преимущества перед живыми,
например, возможность сочетанного применения с антибактериальными
препаратами,
низкую
транспортировке
реактогенность,
(Хаитов
P.M.,
1997,
стойкость
при
1999).
Основное
превосходство живой туляремийной вакцины напряженности
иммунитета
-
в
большинстве
хранении
априорное
по длительности
случаев
и
не
и
является
необходимым - при сезонной или ситуационной иммунизации. Кроме того,
химическая туляремийная вакцина является самостоятельным препаратом,
имеющим собственные показания для применения, в частности она может
HUL. НАЦИОНАЛЬНАЯ
БИБЛИОТЕКА
dlcrapSj*^
гоо^рк
4
использоваться для ревакцинации на фоне более ранней вакцинации живой
вакциной, при конструировании комплексных профилактических препаратов
для
активной
профилактики
нескольких
инфекций.
Принципиальная
возможность создания неживой туляремийной вакцины показана нами ранее
(Хлебников B.C., Жемчугов В.Е. и др., 1991).
Насущной
потребностью
является
разработка
профилактических
препаратов, в том числе комплексных, пригодных, как для парентерального,
так и для орального введения (Воробьев А.А., 1976, 1997).
За последние 10 лет в России и сопредельных государствах отмечен
значительный рост заболеваемости тяжёлыми инфекциями, такими, как
вирусные
гепатиты,
герпетические
и
хламидийные
поражения
урогенитального тракта. Проблема вирусных гепатитов актуальна для всего
мира в силу контагиозности вирусов. Распространение вирусов среди
населения России идёт настолько быстро, что в сочетании с затруднённой
диагностикой, бессимптомным течением, высоким процентом фатальной
хронизации - кровяные вирусные гепатиты названы «угрозой здоровью
нации» (Онищенко Г.Г., 2000).
Увеличилось
количество
хирургических
вмешательств,
пиелонефритов
и
т.д.,
гнойно-септических
обструктивных
вызванных
осложнений
заболеваний
условно-патогенными
легких,
и
ранее
неизвестными видами микроорганизмов (А.Г. Чучалин, М.Н. Зубков, и др.,
2002).
Широкое
и
всё
возрастающее
по
количеству
и
ассортименту
применение антибиотиков и других противоинфекционных средств часто
эффективно лишь короткое время и приводит к еще более тяжёлым
последствиям в виде дисбактериозов, аллергических проявлений, тотального
иммунодефицита.
Неудовлетворенность большинства мыслящих врачей результатами
применения
подхода
к
антибактериальных
лечению
срждств,
большинства
распространение
болезней
стимулируют
системного
применение
5
иммунологически активных препаратов в комплексной профилактике и
терапии
инфекционных
заболеваний
и
осложнений
терапевтической,
хирургической и гинекологической патологии (Воробьев А.А., 2002,6; 2003;
Семенова
И.Б.,
1998).
иммуностимуляторы
Значительное
распространение
нового поколения -
разработанные
получают
на основе
«пептидного» подхода к конструированию биологически активных молекул,
т.е.
синтетического
воспроизведения
активного
участка
природного
соединения (Атауллаханов Р.И., 2002; Жемчугов В.Е., Кутырев В.В., 2000;
Жемчугов В.Е., Майоров В.А. и др., 1996).
Веб
вышеизложенное
явилось
основанием для суммирования
и
обобщения автором многолетнего личного и коллективного опыта в области
разработки средств диагностики, профилактики и лечения особо опасных и
других инфекционных заболеваний, способов производства и применения
этих средств.
Цель работы.
Целью настоящей работы является обоснование принципов создания
новых вакцинных и неспецифических иммуностимулирующих препаратов, а
также комплексных препаратов и схем их применения для профилактики
бактериальных,
включая
особо
опасные,
и
вирусных
инфекционных
заболеваний.
Задачи работы:
1. С учётом биохимических и микробиологических
особенностей
патогенеза указанных заболеваний создать методы поиска и вьшеления
протективных
антигенов
возбудителей
бактериальных
инфекций
на
примерах Francisella tularensis и Burkholderia pseudomallei.
2. Определить диапазон протективной активности
туляремийного
комплекса «С», тактику и технологию его применения, как Mononpenapaia,
так и в составе комлексных профилактических схем, при различных способах
аппликации, включая оральный.
6
3. Создать лабораторную технологию
туляремийного
микроба,
как
производства «С»-комплекса
основного
компонента
корпускулярной
туляремийной вакцины.
4. Получить и изучить протективность фракций «С»-комплекса для
понимания роли его отдельных компонентов в патогенезе туляремийной
инфекции
у
различных
чувствительности
по
групп
профилактических
восприимчивости
экспериментальных
противотуляремийных
и
инфекционной
животных,
препаратов
создания
следующего
поколения.
5. Выбрать
адекватный
профилактики,
включая
инфекционных
заболеваний,
иммуномодулятор,
экстренную,
применимый
бактериальных
потенцирования
действия
и
для
вирусных
протективных
антигенов, а также в схемах лечения заболеваний, сопровождающихся
иммунодефицитом.
6. Обосновать пути создания комплексных химических вакцин против
нескольких
инфекционных
заболеваний
на
примере
препарата
для
профилактики чумы и туляремии
Н а у ч н а я новизна.
-В результате проведённых исследований из биомассы
Francisella
tularensis подвидов drA» и «В» выделен протективный антигенный комплекс
«С». Иммунизация препаратами «С»-комплекса защищает лабораторных
животных 1-П групп по восприимчивости и инфекционной чувствительности
к возбудителю туляремии от гибели при заражении летальными дозами
Francisella tularensis подвидов «А» и «В».
-При
комплекса
иммунизации
получены
моноклональные
лабораторных
превентивные
антитела
к
животных
препаратами
поликлональные
возбудителю
туляремии,
«С»-
сыворотки
пригодные
и
для
углублённого изучения патогенеза туляремии у различных видов животных,
а также человека, конструирования современных средств индикации и
7
идентификации туляремийного микроба, средств экстренной, специфической
профилактики туляремии.
-Разработана
методика
детектирования
и
накопления
«ранних»
антигенов сапного и мелиоидозного микробов в сыворотке крови модельных
животных
с
применением
комплекта
специально
сконструированного
оборудования; показано появление антигенов Burkholderia mallei
в крови
кроликов и обезьян на 5-7 сутки, антигенов Burkholderia pseudomallei в крови
крыс - на 2-3 сутки после экспериментального заражения. Созданы основы
для планомерной работы по поиску и выделению протективных антигенов
возбудителей
сапа
и
мелиоидоза
-
потенциальных
компонентов
комплексного препарата для активной иммунизации.
-Получены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к
антигенам Burkholderia
pseudomallei
и
Burkholderia
mallei. Показана
специфичность взаимодействия моноклональных антител гибридомы MDs с
клетками различных штаммов возбудителя мелиоидоза, а М К А гибридомы
SF) с клетками возбудителя сапа.
-Выбрана аминокислотная последовательность и синтезирован пептид,
воспроизводящий
функциональные
гранулоцитарно-макрофагального
детерминанты
колониестимулирующего
человеческого
фактора (ГМ-
К С Ф ) с сохранением их биологической активности. Обосновано включение
синтетического пептида Г М - К С Ф в состав комплексного препарата для
активной иммунизации.
-Показана
возможность
предотвращения
глутоксимом
гибели
лабораторных животных при заражении 10 смертельными дозами чумного,
мелиоидозного микробов, снижения инфекционной чувствительности мышей
к возбудителю туляремии (вакцинный штамм).
-Впервые
продемонстрирюван
профилактического применения
положительный
эффект
окисленного глутатиона (глутоксима) при
тяжелом заболевании вирусной этиологии - лихорадке Западного Нила.
8
-Обоснована
конструкция
профилактики
и лечения
включающего
антигенные
принципиально
особо
опасных
комплексы
нового
препарата
инфекционных
соответствующих
для
заболеваний,
возбудителей,
например, протективный туляремийный «С»-комплекс и иммуномодулятор
нового класса тиопоэтинов - глутоксим.
11ра1сгнческяя значимость работы.
-Впервые выделен
комплекс
«С»
и охарактеризован
возбудителя
туляремии.
протективный
Показаны
антигенный
защитные
свойства
указанного комплекса «С» для животных I I группы по чувствительности к
возбудителю туляремии (крысы) и I группы (мыши, морские свинки), а также
кроликов
(промежуточная
группа)
при
заражении
F.
tularensis
голарктического (штамм 503) и неарктического (штаммы А-Со1е, Shu-SD)
подвидов. (Патент Р Ф №
2147234, приоритет от 09.03.1999г.). Создана
технология получения значительных количеств «С»-комплекса, которая
может служить основой опытно-промыи1лен1юго регламента химической
туляремийной вакцины. (Патент Р Ф № 2221591, приоритет от 27.01.2003г.)
-
Получены
моноклональные
антитела
к
возбудителям
сапа
и
мелиоидоза, пригодные для создания соответствующих диагностикумов.
-Впервые синтезирован уникальный пептид, воспроизводящий участок
человеческого
гранулоцитарно-макрофагального
фактора ( Г М - К С Ф ) (патент Р Ф №
колониестимулирующего
2061699, приоритет от 16.11.1994г.),
пригодный для диагностики миелодиспластических
состояний, депрессии
кроветворения (патент Р Ф W2 2136307 приоритет от 16.11.94г.) и лечения
гематологических
заболеваний (патент
РФ
№
2136308, приоритет
от
16.11.94г.).
- Показана перспективность, как средства экстренной профилактики
чумы и мелиоидоза, композиционного препарата, включающего глутоксим
(бис-глутатион) и протективный «С»-комплекс туляремийного
(патент Р Ф № 2147234, приоритет от 09.03.99г.).
микроба
9
-Впервые установлена возможность экстренной профилактики чумы,
туляремии
и мелиоидоза препаратом глутоксим, повышения
при его
введении мышам их резистентности к вакцинному штамму туляремийного
микроба.
-Разработаны способы лечения вирусных гепатитов (патент Р Ф №
2160603, приоритет от 23.11.99г.), заболеваний урогенитального тракта
вирусной, хламидийной, и бактериальной природы (патент Р Ф № 2160604,
приоритет
от
23.11.99г.),
пациентов
от
вирусов
обеспечивающие
по
данным
освобождение
ПЦР
на
срок
организма
более
года.
Иммуностимулирующая эффективность при вирусных инфекциях основного
компонента технологии лечения в соответствии с запатентованным способом
-
глутоксима,
подтверждена
при заражении
лабораторных
животных
вирусом Лихорадки Западного Нила.
-При
участии
автора
создан
комплект
биотехнологического
оборудования, включая «чистую комнату» (патент Р Ф
№
2017525 от
31.03.92г.) для экспериментальных исследований патогенеза особо опасных
инфекций,
опытного
и
масштабного
биотехнологического
и
фармацевтического производства с высокой степенью защиты препаратов
( G M P ) и персонала.
Апробация работы и публикация материалов.
Результаты
исследований,
связанных
с
созданием
химической
туляремийной вакцины на основе «С»-комплекса, поисков протективных
мелиоидозного
и сапного антигенов,
отражены
в
отечественных
и
зарубежных публикациях (Khlebnikov V.S., Golovliov I.R., Kulevatsky D.P.,
Zhemchugov V.E., et al, 1996) в том числе семи работах в центральных
журналах, двух сообщениях
на международных
конференциях, одной
монофафии, а также описании изобретения к патенту Р Ф № 2221591 от
27.01.2003 г.
Технологии в соответствии с патентом Р Ф № 2147234 используются
Российским
научно-исследовательским
противочумным
институтом
10
«Микроб» по лицензионному договору от 31.10.2002г., зарегистрированному
«Роспатентом» 25.02.2003 г.
Исследования по поиску эффективных иммунологически активных
препаратов и метаболических иммунокорректоров, разработке схем их
применения
при
лечении
заболеваний отражены
особо
опасных
и
других
в ряде публикаций, описаниях
инфекционных
изобретений
к
■ патентам № 2147234, № 2160603, № 2160604, а также представлены в виде
постера на третьей международной конференции по туляремии в г. Умеа
(Швеция) в августе 2000 года. На четвертой международной конференции по
туляремии в Великобритании (сентябрь 2003 года) в виде доклада впервые в
мире представлены данные о защите антигенным комплексом «С» из штамма
15 (тип «В») мышей от гибели при заражении высоковирулентным штаммом
F. tularensis типа «А» {А-Со1е).
Основные результаты диссертационной работы изложены в монофафии
автора «Как мы делали химические вакцины. \3аписки о современных
«охотниках за микробами»; ( М . : «Наука», 2004г.), объёмом 349 страниц,
состоящей из двух
глав, сопровождаемой списком литературы из 321
источника (165 отечественных и 156 зарубежных), включающей 23 таблицы,
20 рисунков и фотографий, а также приложение.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Из клеток Francisella tularensis голарктического и неарктического
подвидов выделен антигенный комплекс - «С», защищающий лабораторных
животных I и I I фупп по инфекционной чувствительности от гибели при
заражении голарктическими
и неаркгическими
штаммами
возбудителя
туляремии.
2. При
лабораторных
иммунизации протективным «С»-комплексом в организме
животных
вырабатываются
антитела,
превентивные
для
лабораторных животных при заражении штаммами Francisella tularensis
подвидов «А» и «В».
II
3. Иммуномодулятор глутоксим усиливает протективное действие
антигенных комплексов, выделенных из клеток возбудителей туляремии,
чумы, а также повышает резистентность лабораторных животных при
заражении Yersinia pestis, Francisella tularemia, Burkholderia pseudomallei,
вирусом лихорадки Западного Нила.
4. Синтетический пептид, соответствующий структуре
человеческого
фанулоцитарно-макрофагального
фрагмента
колониестимулирующего
фактора (ГМ-КСФ) С - С ' " воспроизводит in vitro биологические функции
полного природного белка - стимуляцию дифференцировки и пролиферации
клеток-мишеней.
5. Разработана и апробирована оригинальная лабораторная методика,
пригодная для обнаружения и накопления антигенов возбудителей сапа и
мелиоидоза на ранних стадиях инфекционного процесса, с использованием
специально изготовленного комплекта биотехнологического оборудования.
6. В состав комплексного препарата для активной иммунизации против
бактериальных
и/или
вирусных
заболеваний
предлагается
включать
следующие компоненты:
-«С»-комплекс туляремийного
микроба
в
качестве антигена для
активной иммунизации против туляремии, а также
неспецифического
иммуностимулятора;
-Окисленный
глутатион,
соответствующий
Фармакопейному
препарату глутоксим, или синтетический фрагмент человеческго Г М - К С Ф в
качестве адьювантов-иммуностимуляторов;
-Протективные
антигены
возбудителей
одного
или
нескольких
инфекционных заболеваний, в частности химическую чумную вакцину
(ХЧВ);
Crpvicrvpa и объем работы.
Диссертация состоит из обзора литературы, описания материалов и
методов; 5 глав собственных исследований; заключения и выводов; включает
12
список
литературы
из
407
источников
(172
отечественных
и
235
зарубежных), содержит 31 таблицу, 5 рисунков. Всего - 308 страниц.
Результаты исследований. Материалы и методы.
Штаммы.
В работе использовали штаммы F. tularensis: вирулентные «Shu», «АCole» неар!сгического подвида; «505» голарктического подвида; и вакцинный
«75 НИИЭГ»
голарктического подвида из колекций В Ы И И прикладной
микробиологии {1982-1992гг) и Российского
научно-исследовательского
противочумного института «Микроб» (1998-2004гг). Для исследований по
поиску протективных антигенов возбудителей сапа и мелиоидоза, получения
и тестирования моноклональных антител использовали штаммы
В.
pseudomallei 57576, 100, С-141 и В. mallei - 10230, Ц-5, некоторые другие из
коллекций В Н И И прикладной микробиологии и Волгофадского научноисследовательского противочумного института.
Культивирование
Бактерии F. tularensis выращивали при 37°С на плотной и жидкой
средах производства Н И И прикладной микробиологии (в настоящее время
Г Н Ц П М ) (эритрит-агар с цистином, глюкозой, витаминами и триптическим
гидролизатом
тестирования
применяли
«черного
протективности
выращивание
соответствии
альбумина».
с
на
регламентами
Для
антигенов
В.
накопления
биомассы
pseudomallei
и
плотной, жидкой
ВНИИ
В.
mallei
и бифазной средах
прикладной
и
микробиологии
в
и
Волгоградского научно-исследовательского противочумного института.
Высушивание биомассы ацетоном
Для получения высущенных ацетоном клеток взвесь бактерий с
концентрацией 30-35 млрд в 1 мл осаждали центрифугированием при 15000 g
в течение 40 мин при 4°С. Осадок ресуспендировали и трижды переосаждали
в 3-кратном объеме ацетона, охлажденного до -30°С. Для окончательного
удаления ацетона и влаги применяли роторный испаритель.
13
Приготовление водно-солевого экстракта
Чтобы
приготовить
водно-солевой
экстракт
(ВСЭ)
высушенные
ацетоном клетки ресуспендировали в физиологическом растворе (100 мг
сухих клеток в 1 мл), инкубировали 8 ч при ЗТС и 16 ч при А°С. Суспензию
центрифугировали при 15000 g 40 мин при 4°С. Полученный супернатант
центрифугировали при 100000 g
в течение 1 ч при 4°С. Надосадок
использовали в качестве В С Э .
Выделение
и накопление
«С»-комплекса,
Процедура описана в
разделе «Собственные исследования»
ЛПС получали экстракцией
фенолом по Вестфалю
(Westphal О.,
Jann К., 1972)
Конструирование гибридом и наработку моноклональных
(МКА)
антител
осуществляли по стандартной методике. Слияние клеток мышей
BALB/C, иммунизированньпс «С»-комплексом с клетками миеломы SP2/0
проводили
очищали
с
использованием
путем
полиэтиленгликоля.
высаливания
сульфатом
МКА
аммония
окончательно
или
аффинной
хроматографией на белок-А-сефарозе.
Определение иммуногенности
«С»-комплекса из штамма
«Schu»
для обезьян. Для заражения животных использовали двухсуточную агаровую
культуру F. tularensis, «Schu». Эксперименты проводили на клинически
здоровых обезьянах - гамадрилах обоих полов массой 4 - 6 кг, полученных
из Сухумского питомника обезьян.
Иммунизацию препаратами «С»-комплекса осуществляли подкожно в
верхнюю треть плеча в дозе 2,0 мг/особь в 0,5 мл физиологического раствора.
Заражение иммунизированных животных проводили штаммом «Schu»
в дозе 787 К О Е чер)ез 30 дней после иммунизации. После заражения обезьян
наблюдали в течение 20 суток с ежесуточным измерением ректальной
температуры.
В
процессе
наблюдения
Исследование
морфологических
изменений
забирали
в
образцы
органах
и
крови.
выделение
возбудителя туляремии из крови и внутренних органов (регионарные
и
лимфоузлы,
селезенка, печень, легкие) проводили на 20 день после
заражения. В
качестве критериев развития типичного
специфического
инфекционного процесса при благоприятном исходе заражения считали
повышение температуры в течение одних и более суток до ЗР.З'С и выше
или же наличие во внутренних органах морфологических изменений,
характерных для туляремии.
Обязательным
подтверждением
любого
из
этих
критериев
являлось
выделение культуры возбудителя из органов или крови. Для интактных
животных - выявление специфических антител в серологических тестах (1:40
и более в Р А или 1,88 и более в Р П Г А ) ; для иммунизированных животных увеличение титра специфических антител, определяемых в Р А и Р П Г А , в 4
раза и более по сравнению с уровнем до заражения. При этом уровень титров
не должен быть ниже принятого минимального диагностического уровня 1:80 для Р А и 1:320 для Р П Г А . Напряженность иммунитета, создаваемого
препаратом «С»-комплекса, считалась удовлетворительной, если у 70%
иммунных обезьян не отмечалось развития специфического инфекционного
процесса в клинически выраженной форме. При этом 100% интактных
обезьян должны иметь отчетливые признаки инфекционного процесса.
Постановка
серологических реакций
Иммуноэлектрофорез
( И Э Ф ) проводили в 0,9% агарозном геле в
медннал-ацетатном буфере рН 8,6 ионной силы 0,025.
РПГА
и
диагностикумов
РА
ставили
(Одесское
препаратов). Реакцию
согласно
предприятие
наставлениям
соответствующих
по производству
диффузной преципитации
(РДП)
бактерийных
проводили
по
Оухтерлони в геле 0,9% агарозы на медннал-ацетатном буфере с ионной
силой 0,025 рН 8,6, используя лунки диаметром 4 мм.
Постановка гшмуноферментного анализа. И Ф А для определения М К А
проводили в прямом варианте. Для осадки на твердую фазу использовали
антигены F.
tularensis, В. pseudomallei и В.
антительные
препараты
в
различных
mallei
концентрациях.
затем добавляли
Образовавшийся
15
комплекс
выявляли
с
помощью
меченных
пероксидазой
хрена
«антивидовых» антител. В других ситуациях применяли «сэндвич-вариант»
И Ф А с посадкой первьпс антител на пластик, иногда двойной «сэндвичвариант».
Физико-химические методы исследования
Концентрацию белка и углеводов определяли по O.Lowry et а1., (1951)
и М. Dubois et al., (1956) соответственно.
Электрофорез в полиакриламидном геле ( П А А Г ) с додецилсульфатом
натрия проводили по U.K.
Laemmly et al., (1970), в
12,5% или
8%
разделяющем геле. Гели окрашивали серебром (Oacley В.К. et al., 1980).
Спектры
кругового дихрюизма (КД) регистрировали на дихрографе
«Jasco-500A» (Япония) в кюветах с длинной оптического пути 1 мм,
инфракрасные ( И К ) спектры - на «Specord IR-71» (Германия).
Исследование ЛПС-белкового препарата
комплекса F.
tularemis.
(солюбилизата)
Липополисахаридно-белковый
из «С»-
препарат
(ЛБП)
выделяли, обрабатывая «С»-комплекс 50 м М трис-НС1 буфером рН 8,0,
содержащим 2 м М ЭДТА, 0,15 М NaCI, 0,05 М дезоксихолата натрия, при
постоянном перемешивании в течение 3 ч при 20''С с последующим
центрифугированием (105000 g, 1 ч). Супернатант наносили на колонку с
сефакрилом S-200. Гель-фильтрацию проводили в 10 м М трис-НС1 буфере
рН 8,0 содержащем 0,15 М NaCl и 0,01 М дезоксихолата натрия, на колонке
16x900 мм. Профиль элюции регистрировали по поглощению при 280 нм.
Фракции солюбилизата после гель-фильтрации диализовали против буфера
без детергента,
концентрировали
на
мембране
РМ-10
(«Amicon»)
и
лиофильно высушивали.
Электронную
Япония.
микроскопию проводили
Препараты
фосфорновольфрамовой
ультратоме ( L K B
уранилацетата.
контрастировали
кислоты.
на
микроскопе
нейтральным
Ультратонкие
срезы
8800-ТП, Швеция) и контрастировали
«Hitachi»,
раствором
готовили
на
1 % раствором
16
Экстракцию липидов из 1г «С»-комплекса осуществляли по методу J .
Folch и их концентрацию определяли фавиметрически.
Спектры
кругового дихроизма регистрировали на приборе Jasco-500,
ультрафиолетовые
- на Shimadzu UV-2100 (Япония); инфракрасные - на
Specord IR-71 (Германия).
Получение
гипериммунных
сыворотки против клеток F.
антисывороток.
Гипериммунные
tularensis штамма 15 получали по схеме:
кроликам с интервалом 10 дней вводили 2, 4 и 6 млрд клеток, затем на 45сутки - 6 млрд клеток с полным адьювантом Фрейнда и еще через 7 дней - 10
млрд
клеток
внутривенно.
Иммунизацию
проводили в
четыре
точки
подкожно в паховой области. Забор крови осуществляли через 7 дней после
последней иммунизации.
Определение
протективной
активности
препаратов
«С»-
комплекса иЛБП. Протективность «С»-комплекса и его фракций изучали на
мышах, морских свинках, кроликах. Заражение осуществляли культурами F.
tularensis штаммов 15 НИИЭГ,
503, «Shu», «A-Cole» внутрибрюшинно и
подкожно, животных наблюдали 21-28 дней.
Исследование и наработка протеаз возбудителя мелиоидоза
Гель-фильтрацию проводили на колонке с ультрагелем АсА-44 ( Л К Б ,
Швеция).
Концентрирование
растворов
белков
осуществляли
методом
ультрафильтрации на мембране РМ-10 (Амикон, С Ш А ) .
Протеолитическую активность в растворе
определяли посредством
измерения количества тирозина, освобожденного при гидролизе казеина, с
помощью
реактива
электрофоретических
фибриногена,
Фолина.
фракций
выделенного
непрореагировавшего
в
субстрата
Протеолитическую
определяли
ПААГ
с
Кумасси
in
situ
по
последующим
R-250.
Место
активность
расщеплению
окрашиванием
локализации
протеазы в П А А Г выглядело, как светлая полоса на синем фоне окрашенного
субстрата. В
качестве
исследуемых
субстратов
использовали
бычий
гемоглобин, Б С А и овальбумин (Реахим), а также человеческий и бычий
17
имк1уноглобулины G.
Ингибиторы: фенилметилсульфонил фторид, ЭДТА,
Е-аминокапрюновая кислота в концентрации ПО
М , соевый ингибитор
трипсина 0,2 мг/мл, вводили в раствор субстрата - казеина и далее проводили
определение протеолитической активности в исследуемых фракциях как
описано выше.
Электроэлюцию материала из П А А Г проводили по методу
Ан дер Лана и соавторов (Lan А. D. et al., 1980) с использованием
электродного буфера системы Лэммли в присутствии 0 , 1 % ДЦС-Na.
Осаждение
сульфатом
антигенных
аммония.
фракций
возбудителя
мелиоидоза
Лиофильно высушенный материал культуральной
жидкости штамма VPA растворяли в небольшом объеме дистиллированной
воды и добавляли сульфат аммония до 2 5 % насыщения. Осадок, содержащий
высокомолекулярные
соединения,
собирали
центрифугированием,
а
к
супернатанту добавляли сульфат аммония до 6 5 % насыщения. Осадок
(фракция 65%) собирали центрифугированием, растворяли в небольшом
объеме
дистиллированной
воды
и ставили на диализ
против
0,01М
фосфатного буфера +0,14М NaCl +0,02% NaNj, рН 7,2.
Синтез
пептидов
колониестимулирующего
нами
пептидов
из
гранулоцитарно-макрофагального
фактора (ГМ-КСФ).
осуществляли
твердофазным
Синтез сконструированных
методом
на
пептидном
синтезаторе "Biosearch 9500". В соответствии с описанием изобретения к
патенту
РФ
№
2061699. Полипептиды характеризовали аналитической
В Э Ж Х , аминокислотным анализом и FAB-масс-спектрометрией.
Статистическая
обработка
результатов.
Статистическую
обработку результатов проводили с использованием методов вариационной
статистики, по Ашмарину И.П., Воробьеву А.А. (1962), а также по Гублеру
Е.В., Генкину А.А. (1973).
Некоторые методики описаны непосредственно в главах собственных
исследований для удобства восприятия.
18
Технология выделения и свойства протективного «С»комплекса из F. tularensis
После предварительного анализа антигенного состава туляремийного
микроба
с применением различных
иммунохимических
методов нами
получен «С»-комплекс, характеризуемый, как «поверхностные структуры
туляремийного микроба». Способ его выделения и наработки изложен в
публикации от 1994 года (Khlebnikov V.S., Golovliov I.R., Zhemchugov V.E.
et al. 1994), усовершенствованный способ - в
патенту Р Ф № 2221591
включает
(Жемчугов В.Е., Дятлов И.А. и др., 2004). Он
выращивание
туляремийного
описании изобретения к
вирулентного
микроба, его
или
вакцинного
инактивацию, обработку
штамма
ультразвуком
с
последующей очисткой препарата дифференциальным центрифугированием,
колоночной
хроматографией, ультрафильтрацией
или
осаждением
в
изоэлектрической точке.
Физико-химические, биохимические и антигенные
комплекса.
свойства
«С»
Количество белка, углеводов, липидов и нуклеиновых кислот в
препарате различных многочисленных серий составило соответственно 122 2 % , 15-30%, до 4 0 % при отсутствии нуклеиновых кислот. Инфракрасные
спектры,
выполненные
на
приборе
«Specord
IR-71», типичны
для
органических молекул микробного происхождения, в то же время имеют
несколько
типичных
пиков,
делающих
возможным
применение
ИК-
спектроскопии для тестирования и паспортизации разных партий препарата
(наряду с другими методами). По данным спектров кругового дихроизма,
выполненных на приборе <Jasco-500A», «С»-комплекс (из штамма Shu)
содержит белки преимущественно а-спиральной структуры, что также может
быть применено для паспортизации отдельных серий препарата (Хлебников
B.C., Кулевацкий Д.П., Жемчугов В.Е. и др., 1991).
Структура
«С»-комплекса
весьма
прочная
и
сохраняется
при
профевании препарата. Нами изучены протективные свойства препаратов
«С»-комплекса, простерилизованных нафеванием при 100°. Средние дозы,
19
защищаюище 50% животных (ЕД50), профетого однократно в течение 30
мин,
однократно в течение 45 мин, дважды по 30 мин
и нефетого
препаратов практически не отличались и составили от 763 до 1700 мкг.
Полученные данные in vivo подтверждают результаты исследований спектра
кругового дихроизма о температурной стабильности белков «С»-комш1екса.
При исследовании под электронным микроскопом с увеличением
40000 раз «С»-комплекс
представляет
собой «смятые салфетки»
или
«целлофановые мешки», сохраняющие иногда форму клеток, при увеличении
120000 раз выглядит как многослойные липосомы. Препарат нетоксичен при
внутривенном введении кроликам в дозе до 100 мг, при внутрибрюшинном
введении мышам до 10-15 мг.
В процессе отработки технологии получили 16 серий «С»-комплекса из
штамма Shu и 6 из штамма 15/3. По результатам изучения их протективности
можно заключить, что ЕДзо колеблется от 235 мкг до 1707 мкг в зависимости
от
серии
препарата,
партии
исходной
биомассы,
партии
мышей,
вирулентности и заражающей дозы штамма 503. «С»-комплекс из штамма
15/3 обладает такой же протекгивностью для мышей С В А , как и препарат из
штамма Shu. Активность препарата со сроком хранения 2 года при +4°С в
атмосфере
воздуха
не изменилась. Протективность
«С»-комплекса
из
штаммов Shu и 15/3 для морских свинок при заражении штаммом 503 в
дозе от 60 до 130 клеток (по высеву) не отличается - их ЕДзо составляют
56,4 мкг и 35,6 мкг соответственно.
Путем
обработки
«С»-комплекса
дезоксихолатом
натрия
с
последующей гель-хроматофафией получен ряд протективных фракций..
(Табл.1)
20
Таблнца1
Протективные свойства фракций солюбилизата «С»-ком11лекса для мышей
С В А при заражении штаммом <d03»
Препарат и
способ
иммунизации
I I пик из «С»5Аи 09.12.87
Заражающая
доза
(микробных
клеток)
95
Фракция 1а из II
пика
95
150
Исходный
солюбилизат
ДОХ
II пик
солюбилизата
«С»-5Л«
26.01.88
ПО
II пик. обработ.
протеазой «Е»
80
Иммуниз
ируюшие
дозы
(мкг)
160
32
6.4
13
200
40
8
1,6
1700
340
68
13.6
200
40
8
1.6
1000
200
40
3
EZl)o (мкг)
средн.
27.23
207.61
1707,68
152.8
686.1
Все пали
80
контроль
Нейтрализация белковой части одной из фракций «С»-комплекса
протеиназой «Е» не привела к снижению ее протективной активности.
Протективная
активность
препарата, полученного из солюбилизата «С»-
комппекса аффинной хроматографией на сорбенте с превентивными МКА
FBII-X
(АфАгРВП-Х),
весьма высока - Е Д о составляет около 20 мкг.
В
21
результате обработки моноклональньши антителами FBII-X
антигенный
комплекс
способность
АфАгРВП-Х
терял
протективность,
а
также
реагировать в И Ф А с М К А FBII-X, образовывать преципитат с М К А F B I I - X ,
иммуноглобулинами
интактного
человека,
коммерческой
туляремийной
сывороткой и кроличьей специфической антисывороткой к клеткам штамма
15/3. Обработка AфAгFBII-X
иммуноглобулинами
интактной мыши
к
подобным эффектам не приводила.
Коллективом исследователей проведено изучение протективности «С»
на обезьянах при заражении штаммом Schu неарктической разновидности.
Установлено, что подкожная иммунизация препаратом «С» в дозе 2 мг
предотвращала развитие инфекции в клинически выраженной форме у 7 0 %
обезьян при подкожном заражении штаммом Schu в дозе 787 К О Е .
Титры антител, выявляемые в Р П Г А
и РА
после заражения, у
иммунизированных животных существенно не увеличивались, в то время как
у всех интактных животных к двадцатому
выявлялись
гемагглютинируюище
инфекционного процесса у этих
дню после заражения в крови
антитела
в
титре
1:1280.
Наличие
животных подтверждалось характерными
для туляремии патоморфологическими изменениями во внутренних органах
и
выделением из них культуры возбудителя. Полученные
подтверждают
возможность
иммунизированньк
предотвращения
заболевания у
«С»-комплексом и затем зараженных
результаты
приматов,
вирулентным
штаммом F. tularensis, Schu.
Исследовали протективность при оральном введении «С»-комплекса,
полученного по технологии в соответствии с патентом 2221591 (Жемчугов
В.Е., Дятлов И.А. и др., 2004). Иммунизированных per os белых мышей на 21
сутки подкожно заражали F. tularensis, штамм 15 в дозе 10 млн клеток по
стандарту мутности Г И С К им Л.А. Тарасевича. Срок наблюдения составлял
18 суток. Установлен
отчетливый протективный эффект «С»-комплекса -
ЕДзо составила 50 мг.
В дальнейшем предстоит отработать дозировки и
22
схему
оральной
иммунизации
«С»-комплексом,
а
также
создать
оптимальную лекарственную форму вакцинирующего препарата.
Проведен эксперимент по сравнительному изучению протективности
«С»-комплекса из F. tularensis вакцинного штамма типа « В » при заражении
вирулентными штаммами F.
tularensis типов «А»
и «В».
Результаты
эксперимента доложены на международной конференции и опубликованы
(Zhemchugov V.Ye. et al., 2003; Жемчугов B.E., 2004,a). Препарат «C»комплекса
получен из вакцинного штамма F.
лиофильно
высушен,
стерилизован
tularensis IS
у-излучением.
Данные
ПИИЭГ,
о
средней
продолжительности жизни иммунных и контрольньпс животных, а также
иммуногенности «С»-комплекса представлены в таблице 2.
Таблица 2
Иммуногенность С-комплекса для белых мышей
при туляремийной инфекции.
Вар-т
иммунизац
ИИ
«С»компл. п/к
«С»компл. в/б
«С»компл. п/к
«с»компл. в/б
«С»комлл. п/к
«С»компл. в/б
Заража
ЮЩИЙ
штамм
А'Со
1ё
100
м.к.
А'Со
1е
100
n/N; Л t (сут.)
5 мкг
25 мкг
125 мкг
625 мкг
ЕЛо
мкг
5/6
18,5
6/6
21
6/6
21
6/6
21
2,95
4/6
16,3
6/6
21
6/6
21
5/6
18,5
5,02
0/6
7,6
0/6
8,7
1/6
11,7
2/6
14,2
630
0/6
7,3
0/6
7,0
1/6
10,7
2/6
13,2
630
0/6
5,0
1/6
7,8
5/6
18,5
6/6
21
56,23
4/6
16
5/6
18,5
5/6
18,3
0/6
5,2
33,11
М.К.
503
100
м.к.
503
100
M.K.
15
НИИЭГ
10 млн
м.к.
15
НИИЭГ
10 МЛН
23
1 М.К. 1
1
1
1
1
1
I
I
I
Положительный контроль
Живая
туляремийная
вакцина
А Со
1е
75НИИЭГ
100м.к.
F.tularensis
503
/5НИИЭГ 100 М.К.
15
F.tularensis НИИЭГ
/ 5 Н И И Э Г 10 млн
м.к.
F.lularensis
2 м.к.
200 м.к.
20 М.К.
2000 м.к.
0/6
7.8
3/6
14
2/6
11,2
5/5
21
93
0/6
6
0/6
5.7
2/6
11,3
6/6
21
295
Л/6
8
0/4
3.7
2/6
9.7
5/6
18,5
295
Контроль заражающей дозы
А'Со
1е
100 М.К.
503
100М.К.
15
НИИЭГ
10 млн
м.к.
Контроль
Контроль
Контроль
0/6
6,7
ЛД5о= 3 м.к.
0/6
5.8
ЛД50= 1 М.К.
0/6
3,6
ЛД„=2936м.к.
A t - средняя продолжительность жизни животных в группе, сут.
n/N - отношение числа выживших б/м к общему числу б/м в группе.
По результатам, представленным в таблице 2, можно заключить:
- Испытанная серия «С»-комплекса протективна
для белых мышей при
заражении F.tularensis типа «В» -штаммы «15 НИИЭГ»
также
ЕДзо
м.к.
и «503», а
при заражении штаммом типа «А» - «А 'Cole».
-
Наиболее высокий уровень защиты получен против штамма «А 'Cole».
-
Взятая
в опыт серия живой туляремийной вакцины эффективна при
заражении штаммами типов «А» и «В».
Приведённые результаты экспериментов по изз^ению специфической
эффе1ггивности «С»-комплекса позволяют сделать вывод, что препарат готов
к проведению полномасштабных доклинических и клинических испытаний в
24
качестве туляремийной вакцины. Разнообразие методов, использованных для
выделения и очистки «С»-комплекса, позволяет разработать оптимальную
технологию его производства в зависимости от требуемых количеств и
лекарственной
формы.
Относительно
простая
технология
получения
больших количеств лиофилизованного препарата в сочетании с низкой
токсичностью
аэрозольной
позволит
при
иммунизации
установлено,
что
необходимости
значительных
препарат
использовать
контингентов
«С»-комплекса
устойчив
его
людей.
к
для
Твёрдо
нагреванию,
воздействию света и кислорода воздуха, что немаловажно для химической
вакцины.
Тщательное
изучение
накопленных
образцов
препаратов
«С»-
комплекса, полученных по различным модификациям технологии и с
различными сроками хранения (свыше 15 лет) позволяет оптимизировать
технологию
промышленного
производства
и
хранения
препарата
для
активной иммунизации против туляртмии - субъединичной туляремийной
вакцины.
При
получении
МКА
к
протективному
«С»-комплексу
было
клонировано 5 гибридом, получивших названия FA3-5, FD9-1, F B I l - x , FF4-1,
FG8-6. М К А
гибридомы FBU-x
по данным И Ф А
наиболее активно
взаимодействовали с комплексом «С» - до разведения 1/10'.
Таблица 3
Исследование превентивных свойств М К А F B I 1-х для морских свинок
при заражении F. tularensis, 503
Препарат
А Ж гибридомы
FB11-X
Доза
Заражаю
(вмг
щаядоза
общего
белка или живых
МК
млАЖ*)
1,0 мл
0,2 мл
0,04 мл
0,008 мл
112
112
112
112
Отношение
количества
выживших
животных к
взятым в опыт
1/6
0/6
1/6
0/6
Средняя
продолж.
жизни
погибших
животных,
дин
16,2±1,7
16,7±1,2
15,2±1,1
17,8±1,7
ЕД50**
мгили
мл
1,3 мл
25
Физиологический
раствор
MKAFB11-X
очищенные на
белок А-сефарозе
Физиологический
раствор
Поликлональная
кроличья
сыворотка на «С»
комплекс
из
клеток штамма 15
(мл)
1,0 мл
112
0/5
8,8±1,1
2,0 мг
0,4 мг
0,08 мг
0,0016 мг
54
54
54
54
3/5
1/5
1/5
3/5
17,5±0,2
12,5±0,1
13,5±0,2
12,5±0,2
0,5 мг
54
0/5
9.2±1,3
1,0
0,2
0,04
54
54
54
3/6
1/6
2/6
18,5±0,3
16,5±0,4
12,4±03
0,008
54
0/6
12,2±0,4
Все
пали
0,3 мг
Все
пали
0,48
* АЖ - асцитическая жидкость, содержащая МКА FBI 1-х.
** ЕДзорасчитана для однократного введения препарата.
Из представленных в табл. 3 данных видно, что М К А гибридомы F B I 1X, а также поликлональная кроличья сыворотка к «С»-комплексу, способны
защищать морских свинок от гибели при заражении вирулентным штаммом
F. lularensis, 503.
Поиск протективных антигенов В. mallei и В. pseudomallei.
За 6 лет работы коллективом исследователей трех организаций
получено несколько десятков антигенных препаратов, охарактеризованных
иммунохимическими и физико-химическими методами. Способы получения
препаратов включали фракционирование экстрактов биомассы сапного и
мелиоидозного
микробов
сульфатом
аммония,
50%
ацетоном,
дифференциальное центрифугирование, различные способы хроматографии,
применение магносорбентов и т.д. Препараты обладали отчетливым, но
незначительным протективным эффектом при заражении вирулентными
культурами штаммов C-I41 и 57576 возбудителя мелиоидоза, и штаммом Ц-5
возбудителя сапа. К сожалению статистически достоверной разницы ЛД50
культур для опытных и контрольных групп животных не получено, или эта
разница нивелировалась по результатам выделения микробов из органов
выживших в течение срока наблюдения животных. Тем не менее, наиболее
26
эффективными
ацетоновый
оказались
100»; «II
«агарозный
пик Ц-5»,
материал
Ц-5»;
при иммунизации
«супернатант
которыми
можно
определить ЕД5о при всех павших интактных животных .
Получение и характеристика
этапе
приготовили
«перекрёстных» антигенов. На первом
иммуносорбент
на основе иммуноглобулинов
из
лошадиной туляремийной сыворютки; выделили на этом иммуносорбенте
аффинной хроматографией соответствующие антигены из водно-солевого
или иного экстракта биомассы возбудителя мелиоидоза.
материал
тестировали
иммунохимическими,
биохимическими методами. В
Накопленный
серологическими
процентном отношении большую
и
часть
препарата составляли липополисахариды, определялся и белок (по Лоури).
Материал активно
взаимодействовал с туляремийной
антисыворотками, по данным И Э Ф
содержал
антигены
«5»,
«6»
и
мелиоидозной
с антимелиоидозной сывороткой -
по
схеме
Н.Н.
Пивня.
Отчетливой
протективностью против мелиоидоза «пер)екр)естный антиген» не обладал,
хотя
и
повышал
резистентность
лабораторных
животных
на
1-2
Ig
(Жемчугов В.Е. и др., 1991).
Изучили протеюпвность живой туляремийной вакцины ( Ж Т В )
в
комплексе с препаратами антигенов из культур возбудителей сапа и
мелиоидоза.
Антигены в дозе 500 мкг по сухому весу мышам вводили
одновременно с живой туляремийной вакциной ( Ж Т В ) и через 14 дней, на
пике развития иммунного ответа на Ж Т В . Кроме того, Ж Т В и антигенные
комплексы вводили в чистом виде. На основе полученных данных можно
выделить перспективные антигенные комплексы для дальнейшей работы «высокомолекулярная фракция В. pseudomallei, штамм 100» и «супернатант
после высаливания 70% сульфатом аммония
экстракта клеток В. mallei,
штамм Ц-5». Синергического усиления иммунного ответа, к сожалению не
получено.
Отработка
технологии
выделения и очистки протеаз возбудителя
мелиоидоза. Важную роль в патогенезе псевдомонадных инфекций ифают
27
внеклеточные антигены, токсины и ферменты. Это обуславливает интерес к
протеолитическим ферментам В. pseudomallei в качестве профилактических и
лечебных препаратов по аналогии с комбинированной вакциной против
Pseudomonas aeruginosa, куда входит 2 анафермента - эластаза и щелочная
протеаза. Процедура выделения и тестирования протеаз описана в главе
«Материалы
и
методы».
Испыгывали
действие
на
протеолитические
ферменты мелиоидозного микроба ингибиторов: «фенил- метил - сульфонил
- фторида» ( Ф М С Ф ) , этилендиаминтетраацетата ( Э Д Г А ) , 8-аминокапроновой
кислоты
в
концентрации
110 М ,
соевого
ингибитора
трипсина
в
концентрации 0^2 мг/мл, которые вводили в раствор субстрата - казеина.
Далее проводили определение протеолитической активности растворимых
образцов антигенных фракций. Кроме того, проводили электрофорез с
фибриногеном, вводя ингибиторы в исследуемые препараты. Установили,
что наиболее активные протеазы элюируются в составе низкомолекулярной
фракции. Ориентировочная молекулярная масса фермента 25000-35000
дальтон.
Фракции
с
протеолитической
активностью
собрали
и
сконцентрировали на мембране РМ-10. Анализ методом электрофореза в
П А А Г вьивил, что эти образцы гетерогенны и содержат 5-7 компонентов.
Электрофорез
мелиоидозного
в
микроба
присутствии
как
фибриногена
минимум
двух
выявил
протеаз
с
наличие
у
различными
характеристиками. Одна из них сохраняет активность даже в присутствии
ДЦС-Na, расщепляя фибриноген в процессе элеетрофореза. Другая, с
молекулярной массой ~ 35000d, активизируется после удаления ДЦС-Na.
Разделение протеаз проводили методом препаративного электрофореза с
последующей электроэлюцией.
После электрофореза окрасили полоску,
сравнили со стандартными белками и согласно их положению разрезали гель
на сегменты. Сегменты измельчили и перенесли в трубочки (Ь-7см, d-0,8) для
электроэлюции. Установили, что протеолитической активностью обладают
два белка с молекулярной массой более 70000d и 35000d. Полученные
результаты свидетельствуют о существовании у мелиодозного микроба не
28
менее двух протеаз с различными физико-химическими характеристиками,
которые можно разделить по предложенной схеме. Определение субстратной
специфичности
показало,
что
протеазы
В.
pseudomallei
гидролизуют
тестированные белковые субстраты: гемоглобин, овапьбумин, БСА, бычий и
человеческий IgG, фибриноген, но в 2-3 раза менее эффективно, чем казеин.
Проведенный
протеолитическая
ингибиторный
активность
анализ
подавляется,
свидетельствует,
хотя
и
не
что
полностью,
в
присутствии Ф М С Ф и ЭДТА. Это указывает, что, вероятно, одна из протеаз
относится к классу сериновых (ингибируется Ф М С Ф ) ,
а другая - к
металлопротеазам (ингибитор - Э Д Г А ) .
Таким образом, определены способы вьщеления и наработки двух
компонентов
культуральной
жидкости В.
pseudomallei
штамм
VPA,
обладающих протеолитической активностью. Показана пригодность метода
препаративного элекгрофо1>еза и электрофоретической элюции, в отличие от
хроматографических методов, для разделения двух протеаз с сохранением
работоспособности ферментов, отработаны различные методы тестирования
их активности. Наработка протеаз в достаточном количестве позволит
провести более детальный субстратный и ингибиторный анализ, определить
оптимум рН, стабильность и ряд других характеристик. В завершение этого
раздела следует сделать вывод, что в технологии получения биомассы
мелиоидозного
микроба
необходимо
использовать
более
мощные
ингибиторы протеаз, чем Ф М С Ф .
Получение моноклонапьных антител
При
иммунизащ1И
ацетонвысушенных
клеток
мышей
(ВСЭ
к В. pseudomallei и В. mallei.
BALB/C
АВК)
водносолевым
штамма
57576
экстрактом
возбудителя
мелиоидоза была получена гибридома MDj^ продзщирующая М К А класса
"IgM". При иммунизации мышей этой же линии В С Э А В К штамма 10230
возбудителя сапа получили гибридому SFj.
Нами совместно с коллегами из Волгоградского
института
проведено
исследование
МКА
указанных
противочумного
гибридом
на
29
взаимодействие
с мз'зейной коллекцией штаммов
возбудителей сапа и
мелиоидоза в И Ф А и Р П Г А (Табл. 4).
Таблица 4
Результаты иссследования специфичности и активности
М К А MDs и SF3 методом иммуноферментного анализа
Возбудитель, штамм
В. mallei
В-120
B.mallei
Ц-5
B.mallei
Будапешт
B.mallei
L-12
B.mallei
10230
B.mallei
8
B.mallei
Миксован 11
B.mallei
11
B.mallei
Загреб
B.mallei
Ц-4
B.pseudomallei
VPA
B.pseudomallei
Vang
B.pseudomallei 57576
B.pseudomallei
m
B.pseudomallei
100
B.pseudomallei
97
В pseudomallei
C-141
B.pseudomallei
110
B.pseudomallei
№2
B.pseudomallei 56770
Препарат
МКА
SFj
10.07.86
Препарат М К А
M D , 10.11.86
Препарат
МКА
MD,
10.07.86
Препарат
МКА
SFj
АСЦИТ
1:10
1:20
1:160
1:40
1:80
1:320
1:40
1:20
-
1:160
1:160
1:40
1:40
1:80
1:160
1:40
1:20
1:160
1:40
1:20
-
-
1:160
1:160
1:40
1:40
1:40
1:80
1:20
1:160
1:1280
1:40
1:640
1:320
1:40
1:20
1:20
1:160
1:80
1:320
-
1:160
1:1280
1:640
1:80
1:20
1:5120
1:5120
-
-
-
1:5120
1:5120
1:80
1:10240
1:1280
1:20
1:20
1:10240
1:280
-
-
1:160
1:640
-
-
1:2560
1:1280
-
-
-
-
-
-
1:320
-
-
-
-
-
-
30
-
B.pseudomallei 59361
1:2560
1:10240
1:320
К а к видно из таблицы 4, М К А M D j хорошо с в я з ы в а ю т с я т о л ь к о с
клетками
возбудителя
мелиоидоза, а 8Рз с
Поэтому они могут б ы т ь
различных
клетками
сапного
использованы при разработке и
диагностикумов,
предназначенных
для
микроба.
производстве
индикации
и
идентификации соответствующих бактерий.
Кроме
того,
специфичность
иммунопреципитации
культур
поскольку
MDj
МКА
соответствующий
им
реакции
мелиоидозного
обладают
антиген,
подтвердили
микроба
свойством
вероятно
за
счбт
в
геле
путем
агарозы,
преципитировать
множественности
и
повторяемости детерминантов на нём. М н о г о ч и с л е н н ы м и опьггами - И Ф А ,
И Э Ф , установлено, что М К А M D s направлены к антигену « 6 » по схеме Н . Н .
Пивня.
Изучение раннего патогенеза
метюидозной
и сапной инфекций in vivo.
М ы предположили, что в а ж н е й ш у ю роль в распространении и обеспечении
беспрепятственного размножения микробов и ф а ю т антигены, п о я в л я ю щ и е с я
в крови в ранние сроки после заражения. Вероятнее всего т а к и м и «ранними»
антигенами могли оказаться летальный токсин или эластаза (протеаза Ш ) .
Исходили из того, что ранние антигены находятся в сыворотке в свободном
состоянии и л и связаны с антителами при вторичном контакте животного с
возбудителем и л и его антигенами. Поэтому в части о п ы т о в
животных
предварительно иммунизировали наиболее полным антигенным материалом
-
взвесью
ацетон-высушенных,
или
инактивированных
фенолом
(после
диализа) клеток. Несколько опытов по поиску ранних мелиоидозных
сапных антигенов провели на кроликах. П о д хлороформенным
кролику
вскрывали
брюшную
полость
и
между
петлями
и
наркозом
кишечника
помещали диффузионную камеру, содержащую 1 млрд. клеток ( п о стандарту
мутности Г И С К
mallei,
им Л . А . Тарасевича) В. pseudomallei,
ш т а м м 100 или В.
ш т а м м Ц-5. Б р ю ш н у ю стенку наглухо у ш и в а л и , ш о в
заклеивали
клеолом. К р о в ь для исследования из у ш н о й вены кроликов брали через 1, 2, 3
31
суток, далее на 7, 14, 2 1 , 30 дни. Поиск антигенов осуществляли в двзтс
вариантах, в зависимости от того, были ли опытные животные до заражения
иммунизированы,
или
нет.
Сыворотки
от
неиммунных
животных,
в
частности от кроликов с вшитыми диффузионными камерами, исследовали
методом
дот-блоттинга.
Для
этого
на
нитроцеллюлозную
бумагу
последовательно наносили, соблюдая технологию И Ф А , - специфическую
кроличью сыворотку к В С Э А В К мелиоидозного микроба (штамма 100) или
сапного (штамм Ц-5), исследуемую кроличью сыворотку, как «антиген»,
затем вторые антитела - спещ1фическую козью сьшоротку к целым клеткам
или их В С Э , и «антикозьи» иммуноглобулины, меченные пероксидазой
хрена.
Для выделения иммунных комплексов из сывороток предварительно
иммунизированных и затем зараженных животных выбрали метод аффинной
хроматографии на белок «А»-сефарозе. Все фракции собирали и исследовали
в дот-блоттинге и иммуноблоттинге со специфическими сыворотками к
туляремийным или мелиоидозным антигенам, по схеме, описанной выше.
Установлено,
что
определяются
мелиоидозные
и
туляремийные
антигены в области, где расположены иммуноглобулины. Чувствительность
метода оказалась весьма высокой. Из исходной смеси с концентрацией
антигенов 1мкг/мл, в пробу для электрофореза и последующего блотгинга
внесено 10 мкл, практически - 0,01 мкг антигенов. На основании результатов
проведённых опытов можно заключить:
-предложенные методики обнаружения, выделения и идентификации
антигенов
мелиоидозного
и
сапного
микробов
из
сывороток
экспериментально зараженных животных пригодны для указанных целей.
-с помощью аффинной хроматофафии на белок «А»-сефарозе из крови
предварительно иммунизированных и затем экспериментально заражённых
обезьян и кроликов выделены комплексы антител животных и антигенов
мелиоидозного микроба.
32
-показано, что антигены В. pseudomallei появляются в сьшоротке крови
экспериментально заражённых крыс со 2 суток от момента заражения.
-С
помощью
возбудителя
сапа
разработанньк
в
сыворотках
тест-систем
крови
обнаружены
антигены
экспериментально,
аэрогенно
заражённых обезьян, полученных на 3,7,14 сутки после заражения.
-Разработанные методические приёмы и тест-системы могут быть
применены
для
выделения,
накопления
и
идентификации
антигенов
возбудителей сапа и мелиовдоза (и не только их) в процессе изучения
патогенеза инфекционного процесса (при создании химических вакцин) и
поиска протективных антигенов.
Разработка пептидного иммуностимулятора на основе фрагмента
Г М - К С Ф человека
Применение
химических
вакцин
-
неживых,
корпускулярных,
молекулярных, не мыслится без имм)^остимуляторов.
В
экстренных ситуациях применение только
иммуностимуляторов
позволяет достичь желаемого профилактического или лечебного эффекта.
Как примеры, можно привести деринат, амиксин, гриппферон, иммунофан,
ликопид полиоксидоний, гепон, глутоксим, некоторые другие, успешно
применяемые при острых вирусных респираторных и других инфекциях.
Нами
была
предполагаемой
изучена
эффективность
химической
туляремийной
применения
вакцины
в
составе
различных
иммуностимуляторов/иммуномодуляторов - хитозана, продигиозана, фуппы
мурамилпептидов,
гидроокиси
алюминия,
полиоксидония.
Все
перечисленные препараты имеют достоинство, переходящее в недостаток широкий спектр действия, связанный с естественным путем их восприятия и
процессинга. Более прогрессивньши считаются иммунологически активные
препцгаты, представляющие собой целые природные молекулы - цитокины
или иммунокины, а лучше их фрагменты. Подобные препараты обладают
минимальным количеством побочных эффектов, "точечным" действием,
хорошей "управляемостью" - например, иммунофан, гепон, глутоксим.
33
Мы
определили
воспроизводящий
проведенные
часть
последовательность
природного
исследования,
и
белка
синтетический
синтезировали
ГМ-КСФ.
пептид
Как
пептид,
показали
оказывает
на
культивируемые клетки действие, аналогичное действию цельной молекулы
ГМ-КСФ, что и позволило предложить его в качестве средства для
культивирования предшественников фанулоцитов и макрофагов (Жемчугов
В.Е., Зурочка А.В. и др., 1999; Жемчугов В.Е., Румянцев А.Г. и др., 1999).
Действие пептида на кластеро- и колониеобразование клеток крови изучали в
двух
моделях:
культивирование
в диффузионных
камерах
'in
vivo",
культивирование, "in vitro" в агарозных культурах на планшетах. Оценивали
влияние синтетического пептида и стандарта Г М - К С Ф на кластеро- и
колониеобразование у больных в фазе обострения и ремиссии атонического
дерматита (площадь поражения более 70%) через 14 суток культивирования.
Установлено, что использование пептида позволяет определить не только
наличие депрессии кроветворения, но и оценить выраженность ремиссии и
объективными лабораторными тестами подтвердить улучшение состояния
фанулоцитарно-макрофагального звена кроветворения у больных.
Для следующего эксперимента клетки (в количестве 5x10 кл/мл) из
гепаринизированной крови донора выделяли методом центрифугирования в
фадиенте плотности фиколл-верофафин (р= 1,077) и после культивирования
в течение 1 часа с пептидом в конценфации от 10 мкМ до 1мМ в 1мл
помещали
в
диффузионные
камеры,
которые
имплантировали
внутрибрюшинно мышам линии СВА. Через 14 дней камеры удаляли,
осторожно выдавливали их содержимое на стекло и подсчитывали кластеры,
малые и большие колонии моноцитов, фанулоцитов и смешанные колонии,
окрашивая
их
концентрациях
по
Романовскому-Гимзе.
пептид оказывал
Установлено,
что
во
всех
выраженное влияние на кластеро- и
колониеобразование. Контролем служило спонтанное колониеобразование в
отсутствие колониестимулирующих факторов.
34
Д л я культивирования в агарозной культуре лейкоциты выделяли из
крови способом, описанным в ы ш е , и помещали в планшеты с лунками 0,5см'
X 1см' с агарозным гелем и пептидом в концентрации от Ю О н М до 1 м М в
1мл. В контроле в л у н к и помещали 0 , 8 6 % раствор N a C l . У ч ё т проводили
через 14 дней культивирования. Показано,
что созданный пептид оказывал
выраженное стимулирующее действие на кластеро- и колониеобразоваиие
лейкоцитов крови "in vitro", особенно в концентрации 10-100 м к М .
Следовательно,
синтетический
пептид,
воспроизводящий
фрагмент
нативной молекулы Г М - К С Ф , может б ы т ь использован для диагностики,
профилактики и лечения различных заболеваний, а также как адьювант в
составе вакцин.
Обоснование принципов конструирования комплексного
вакцинирующего препарата
В
настоящее
время
нет
иммунологически
активного
препарата,
эффективного при широком спектре инфекционных заболеваний, включая
особо опасные. Кроме того, в арсенале средств экстренной профилактики
необходимо иметь препараты, обладающие защитным действием против
неопределённо широкого кр)та возбудителей инфекционных заболеваний.
Их применение - в комплексной терапии хронических инфекционных
заболеваний,
а
также
для
ликвидации
последствий
вероятного
акта
«биологического терроризма» (Онищенко Г.Г., Сандахчиев Л.С. и др., 2000),
природных и техногенных катастроф.
Результаты применения глутоксима
при бактериальных инфекциях
С
1998
профилактики
метаболического
Глутоксим
глицин
г.
мы
приступили
и
лечения
различных
иммунокорректора
представляет
динатриевую
собой
соль
удостоверение № 98/279/3).
к
разработке
комплексных
заболеваний
нового
поколения
с
-
схем
включением
глутоксима.
бис-(гамма-Ь-глутамил)-цистеинил-бис-
(ВФС
№
42-3199-98,
регистрационное
35
Цель предпринятых исследований - изучить способность глутоксима, а
также липополисахаридно-белкового «С»-комплекса туляремийного микроба
(Жемчугов
В.Е.,
Дятлов И.А.
интактных
животных
оптимальное время
к
и др., 2004), повышать резистентность
чуме,
мелиоидозу
и
туляремии,
установить
введения для наступления защитного эффекта
и
наиболее действенные дозировки препаратов, а также оценить влияние
глутоксима на протективные свойства «С-комплекса».
Для изучения влияния глутоксима на устойчивость животных к чуме
четырём опытным группам по 6 мышей подкожно вводили по 0,5; 2; 5; 12,5 и
62,5 мг препарата, 6 контрольным - 0,2 мл физраствора. Опытные и
интактные мыши были заражены через О часов, 1 час, 6 часов и 24 часа десятью
Del V. pestis, штамм 231 из коллекции РосНИПчИ "Микроб",
подкожно. Всех
выполнением
животных
наблюдали
посевовчггпечатков
14 дней, вскрывая павших, с
органов
на
агаровые
пластинки.
Результаты приведены в таблице 5.
Таблица 5
Протективная активность глутоксима (Гл) для
белых мышей при заражении 10 Del Y. pestis, 231
Доза Г л , Отношение кол-ва выживших Средняя продолжительность
мг
животных к взятым в опыт
жизни (сут.)
Схема
3
1
4
2
опыта
1
2
3
4
6ч
Оч
1ч
24ч
0,5
2,5
12,5
62,5
Контр
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
1/6
3/6
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
0/6
ЬВЕД,,
2,15
2,03
1,92
2,15
ЕД50
141,3
107,2
83,2
141,3
6,7±
0,82
6,8±0
,58
6,5dfc0
,61
6,8±
0,8
6,5±0
.6
6,5±0,
5
7,5±1,
1
9,2±2,
4
7,2±
0,63
6,1±0,
23
6,7±0,
68
12,3±
6,3±0,
4
7,3±0
А
6,1±0
,86
6,5±0
,5
6,1±0
,23
36
[мг/мышь I
I
I
I
I
I
I
I
~
Как видно из приведённых данных, максимальная защита животных
достигалась при введении препарата за 6 часов до заражения белых мышей К
pestis 231 в дозе 10 Del.
Применение глутоксима при туляремии и мелиоидозе. Для изучения
влияния глутоксима на неспецифическую резистентность к мелиоидозу
препарат в дозах 0,5; 2,5; 12,5 и 62,5 мг вводили беспородным белым мышам
однократно, подкожно в объеме 0,2 мл за 1, 6, 12 и 18 часов до заражения
вирулентной культурой возбудителя мелиоидоза штамма 59361. Далее
определяли процент погибших животных, их среднюю пртдолжительность
жизни ( С П Ж ) при сроке наблюдения 1 месяц. При исследовании воздействия
глутоксима на неспецифическую резистентность мышей к
заражению F.
tularensis, препарат вводили внутрибрюшинно в дозе 2 мг/мышь (0,5 мл) за 6
час до подкожной инокуляции культуры штамма
15. В
опытных
и
контрольной группах определяли ДЦи по стандартной методике.
Чтобы
установить
протективности
возможность
«С»-комплекса,
усиления
выделенного
из
глутоксимом
клеток
F.
tularensis,
последний вводили мышам подкожно в кратно возрастающих дозах без
глутоксима и в сочетании с ним.
Через 21 день одну группу животных
заражали вирулентным штаммом возбудителя мелиоидоза (ЮДЦзо), другую
- F. tularensis, штамм 15 в летальной дозе 4 • 10* м.к.
В другой аранжировке опыта глутоксим вводили мышам однократно
за 6 часов до вакцинации
«С»-комплексом. Группе мышей, которых
иммунизировали «С»-комплексом и впоследствии заразили возбудителем
мелиоидоза,
глутоксим
вводили
дважды:
за
6
час
до
инокуляции
туляремийного «С»-комплекса и за б час до контрольного заражения.
Установлено, что на 18 сутки после заражения животных возбудителем
мелиоидоза в дозе ЗООЛДзо вирулентного штамма 59361 глутоксим защищал
от гибели 3 4 % мышей при 100% гибели в контроле. На 30 сутки наблюдения
отмечено снижение числа выживших животных до 17%, в то же время
37
зарегистрировано
достоверное
повышение
показателя
СПЖ
(р<0,05)
погибших м ы ш е й , получавших глутоксим. Наиболее эффективно глутоксим
защищал ж и в о т н ы х от мелиоидоза в дозе 2,5 мг, при введении за 1,6,12 и л и
18 час до заражения.
У с т а н о в л е н о т а к ж е , ч т о введение глутоксима повышало
устойчивость
специфически невакцинированных м ы ш е й к туляремийному микробу - ЛД^о
штамма 15 для о п ы т н ы х м ы ш е й превышало в 4 раза ЛД;о
контрольных
животных.
Далее н а м и б ы л о изучено влияние глутоксима на иммуногенность « С » комплекса для м ы ш е й в отношении возбудителей мелиоидоза и туляремии.
«С»-комплекс
может
рассматриваться
одновременно
в
неспецифического и специфического средства профилактики
качестве
мелиоидоза,
у ч и т ы в а я наличие о б щ и х антигенов у этих бактерий («Мелиоидоз», 1995).
Отмечено, что вакцинация м ы ш е й «С»-комплексом в дозах 10, 50 и 250 мкг
защищала
этом С П Ж
от гибели при заражении В. pseudomallei
до 2 8 % ж и в о т н ы х , при
п а в ш и х м ы ш е й л и ш ь незначительно превышала аналогичный
показатель в контрольной ф у п п е интакгных ж и в о т н ы х (р>0,05). Двухразовое
введение глутоксима, за 6 час до в а к щ ш а ц и и комплексом « С » и за 6 ч а с до
заражения, способствовало
у в е л и ч е н и ю выживаемости ж и в о т н ы х на 1 2 % и
существенному росту С П Ж (р<0,05).
При
и з у ч е н и и адьювантного действия глутоксима установили,
что
однократное введение препарата за 6 часов до вакцинации 25-100 мкг « С » комплекса
увеличивало
выживаемость
животных
на
14-17%, при
этом
существенно возрастала (р<0,05) их средняя продолжительность ж и з н и при
заражении летальной дозой штамма 15 туляремийного микроба.
Проведенные
исследования
показали
возможность
с
помощью
глутоксима п о в ы ш а т ь резистентность организма к мелиоидозу и туляремии.
П р а к т и ч е с к и ценной
является отмеченная нами способность
увеличивать протективность туляремийного комплекса « С » в
глутоксима
отношении
мелиоидоза и т у л я р е м и и , что может б ы т ь использовано при разработке
38
профилактических препаратов против этих инфекций, в том числе комплексных (Жемчугов В.Е., Кутырев В.В., 2000).
По итогам выполненных экспериментов можно заключить:
-глутоксим обладает неспецифическим защитным действием для бельпс
мышей при заражении Y. pestis. Схема применения и оптимальные дозы
препарата будут отработаны в процессе дальнейших исследований.
-глутоксим при использовании по определённой схеме обеспечивает
достоверный уровень неспецифической защиты мышей от мелиоидоза и
туляремии.
-глутоксим
усиливает
вакцинирующий
эффект
поверхностного
туляремийного комплекса «С» для лабораторных животных по отношению к
возбудителям мелиоидоза и туляремии.
Применение
глутоксима
при
вирусных
инфекциях.
Предполагаемый
механизм действия глутоксима (окисленного глутатиона), как средства для
экстренной профилактики бактериальных инфекций - активация метаболизма
ключевых клеток - макрофагов. Возможно, это позволяет им подавить
внедрившиеся микроорганизмы в стадии адаптации или в латентной фазе,
клинически - в инкубационном или продромальном периоде. В связи с этим
большой интерес представляет оценка in vivo эффективности
как средства
экстренной профилактики
гемморагических
лихорадок
на
примере
глутоксима,
и лечения нейровирусных
экспериментальной
и
формы
лихорадки Западного Нила (ЛЗН). Опьггы проводили на беспородных белых
мышах массой б-8г при подкожном инфицировании вирусом Л З Н в дозе
20ЛД5О,
а также в монослое культуры куриных фибробластов ( К Ф ) по
образованию негативных колоний под агаром и цитопатическому действию
(ЦПД). При оценке противовирусной эффективности глутоксима препарат
вводили животным однократно по профилактическим схемам в дозах 10, 2 и
0,4мг на мышь,
за 24, 6, 1 час до инфицирования. Анализ полученных
данных свидетельствует, что глутоксим в исследуемых дозах и схемах не
защищает
животных
от
гибели.
Возможно,
это
связано
с
низкой
39
концентрацией препарата в тканях головного мозга или с заведомой
неспособностью
новорожденных
мышей
генерировать
протективный
иммунитет к вирусу ЛЗН. Вместе с тем, изучение подавления репродукции
вируса под влиянием глутоксима показало, что препарат снижает уровень
накопления возбудителя в головном мозге в 10-100 раз по сравнению с
контролем в том случае, когда его вводили животным за 1 и б часов до
инфицирования, в дозе 10 и 2 мг на мышь. Наиболее эффективное
подавление репродукции вируса отмечено при введении глутоксима в дозе 10
мг за 1 час до инфицирования.
применения
препарата
в
Планируется подбор оптимальной схемы
зависимости
от
задач - профилактической,
экстренной (лечебно-профилактической), лечебной.
Эксперименты с редкими для нашей страны вирусами и бактериями
позволяют получить ценную информацию о механизме действия препарата,
сроках наступления эффекта и оптимальных дозах. Позже с использованием
полученной информации об оптимальных дозах и схемах применения
глутоксима нами разработаны и запатентованы «Способ лечения вирусных
гепатитов» (Жемчугов В.Е., Гринченко А.Ю., Наги И.В.
2000) и «Способ
лечения урогенитальных инфекций» (Жемчугов В.Е. Гринченко А.Ю. 2000).
В
настоящее время на основе положительных результатов применения
указанных способов готовятся их клинические испытания.
Перспективы конструирования многоцелевого
вакцинирующего препарата
Приведенные выше
результаты дают основания предложить состав
комплексного или многоцелевого иммунизирующего препарата для защиты
от
нескольких
подтверждения
бактериальных, возможно, и вирусных инфекций. Для
рюальности
технологии
получения
многоцелевого
вакцинирующего препарата нами был спланирован и проведен эксперимент,
результаты которого представлены в таблице 6.
Варианты состава комплексного препарата включали: № 1 - «Ф1» V.
pestis , «ОСА» Y. pestis: «С»-комплекс F. tularensis - в соотношении по весу
40
4:1:2; №2 состав №1 с добавлением «8»***-слоя Y. pestis - 4:1:2:2; №3 вариант № 1 + глутоксим в дозе 2 мг, введенный подкожно за 6 часов до
иммунизации; №4 - состав №2 + глутоксим в дозе 2 мг, веденный подкожно
за 6 часов до иммунизации. Приготовленные комплексные
препараты
титровались от 1/1 до 1/8 исходной дозы.
В качестве «положительного»
Химическую
чумную
вакцину
контрольного препарата использовали
(ХЧВ**)
(«Ф1»:
«ОСА»
-
4:1);
рекомендуемая авторами одна человеке-доза компонентов - 160 и 40 мкг,
соответственно. Исходный препарат титровали с 1/5 человеко/дозы (ч/д) до
1/625 ч/д с шагом 5. «Отрицательным» контролем служили интактные,
иеиммунные
животные.
Иммунизировали
белых
мышей
однократно
подкожно. Заражали на 21 сут Y. pestis 231 в дозе 5000 м.к. (200 Del).
Таблица б
Протективная активность комплексного
препарата для мышей при заражении К pestis
№
п/п
Препарат
1
Вариант № 1
2
Вариант №2
3
«С» комплекс
в/б
4
Вариант №3
5
Вариант №4
6
«С»комплекс в/б
ЕДзо
(мкг А Г )
Ф1-50
ОСА-12,5
«С» - 25
Ф1-18
ОСА - 4,5
С-9
S-9
142
Ф1-36
ОСА - 95
«С»-18
Ф1-30
ОСА - 7,5
«С» -15
«S»-15
126
Средняя продолжительность
жизни (сут.)
1
1/2
1/4
1/8
21
16,3
17,8
15,7
18,6
17
17,3
20,2
6,2
4,7
4,5
3,7
21
18
18,3
15,5
16,8
17,5
17,2
15,2
5
5
8,5
4,5
41
+ глутоксим
п/к
7
ХЧВ
8
«-«
Контроль
Ф1-41,6
ОСА -10,4
16Д
6,3
-
3,4
-
7,5
5.7
■ Препарат получен в соответствии с технологией по патенту РФ № 2221591
(Жемчугов В.Е., Дятлов И.А., Кутырев В.В., Волох О.А., 2003);
' Препарат получен в соответствии с технологией по публикации (Дальвадянц
СМ., Дятлов И.А., Еремня С.А., Кугырев В.В., 2003);
' Препарат получен в соответствии с технологией по публикации - (Дятлов И.А.,
Антонова О.А., 1997);
Наблюдали за всеми животными в течение 21 суток. По результатам
эксперимента расчитывали Eflj^ для каждого из компонентов комплексного
препарата. На основании данных таблицы 6 можно сделать выводы:
- Комплексный препарат для активной иммунизации, указанного
состава позволяет защитить мышей
от гибели при заражении высокими
дозами вирулентной культуры чумного микроба - вариант № 1 ;
- «С»-комплекс при внутрибрюшинном введении в концентрациях,
защищающих
от
гибели
при
заражении
вирулентными
штаммами
возбудителя туляремии, увеличивает продолжительность жизни иммунньк
белых мышей, зараженных возбудителем чумы. Возможно, более высокие
дозы этого препарата, согласно теоретически
расчитанои ЕДзо, обеспечат
защиту лабораторных животных от гибели при заражении Y. pestis;
- Введение в состав комплексного препарата «С»-комплекса
tularensis и белка «8»-слоя Y. pestis
F.
позволяет снизить содержание
компонентов Х Ч В -«Ф1» и «CXZA».
-
Предполагается
испытать
в
составе
комплексного
препарата
протекгивные антигены сибиреязвенного и мелиоидозного микробов.
42
Выводы
1.Из
биомассы
возбудителя
туляремии
голарктического
и
неарктического подвидов выделен протективный антигенный комплекс «С»,
представляющий собой фрагменты поверхностных структур микробной
клетки, состоящие из липополисахарида и белков.
2.Иммунизация препаратами «С»-комплекса, полученного из клеток
вакцишюго штамма 15 (подвид «В»), защищает лабораторных животных I-II
фупп по восприимчивости и инфекщюнной чувствительности к возбудителю
туляртмии от гибели при заражении летальными дозами Francisella tularensis
«А» и «В» подвидов; ЕДзо «С»-комплекса из клеток F. tularensis штамммов
15, Shu или 503 для белых мышей составляет от 100 до 1000 мкг при
заражении 10^- lO' клеток штаммов 503 (подвид «В») или А-Со1е (подвид
«А»). Препарат «С»-комплекса сохраняет протективность при стерилизации
прогреванием до ЮО'С и оральном введении белым мышам.
3.Создана
технология производства опытно-промышленных
серий
препарата «С»-комплекса, защищенная патентами Российской Федерации.
4.При иммунизации лабораторных животньпс - кроликов и мышей
препаратами «С»-комплекса, выделенного из биомассы штаммов Francisella
tularensis «А» и «В» подвидов, получены превентивные поликлональные
сыворотки и гибридома, продуцирующая превентивные моноклональные
антитела. Введение сывороток или моноклональных антител лабораторным
животным защищает их от гибели при послед)аощем заражении летальными
дозами штаммов 15, 503 («В»); ЕД50 моноклональных антител гибридомы
F B I 1-Х для белых мышей и морских свинок составляет 0,3 - 1,9 мг при
заражении 10^ - 10^ клеток штамма 503; ЕДзо поликлональной сыворотки
кроликов, иммунизированных «С»-комплексом, составляет 0,2 - 0,6 мл при
заражении 10^ клеток штамма 503. Продолжительность жизни мышей с
привитой гибридомой F B I 1-Х, зараженных 10^ клеток F. tularensis, штаммм
Shu,
в два раза выше (Р<0,05) по сравнению с продолжительностью жизни
контрольной группы интактных мышей.
43
5.Разработан метод детектирования и накопления «ранних» антигенов
сапного и мелиоидозного микробов в сыворотке крови модельных животных
с применением комплекта специально сконструированного оборудования диффузионных
камер
и
мембранных
антигенов Burkholderia mallei
в крови
фильтров;
показано
появление
кроликов и обезьян на 5-7 сутки,
антигенов Burkholderia pseudomallei в крови крыс на 2-3 сутки после
экспериментального заражения. Созданы основы для целенаправленного
поиска факторов вирулентности - протеюгивных антигенов возбудителей
сапа и мелиоидоза с целью включения их в состав комплексного препарата
для активной иммунизации.
б.Получены гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела,
специфичные в отношении Burkholderia pseudomallei (MD5) и Burkholderia
mallei (SFj).
7.Теоретически выбрана последовательность аминокислотных остатков
С'*-С"'
нативного
человеческого
колониестимулирующего
фактора
гранулоцитарно-макрофагального
(ГМ-КСФ)
и
синтезирован
пептид,
имеющий его функциональные детерминанты.
8.Синтетический
пептид
С'*-С
воспроизводит
активность природного полного белка ,ГМ-КСФ;
эффективно
стимулирует
пролиферацию
и
биологическую
в дозах
1нМ-10мкМ
дифференцировку
клеток-
мишеней, в том числе взятых от больных и доноров. Синтетический аналог
фрагмента человеческого ГМ-КСФ перспективен для включения в состав
комплексного иммунопрофилактического препарата в качестве адьюванта.
9.Показана
возможность
предотвращения
глутоксимом
гибели
лабораторных животных при заражении 10 смертельными дозами чумного,
мелиоидозного микробов, снижения инфекционной чувствительности мышей
к
возбудителю
туляремии
(вакцинный
эффективно защищает экспериментальных
штамм).
Глутоксим
животных
введении в дозах 2 - 60 мг за 6-10 часов до заражения.
наиболее
при однократном
44
lO.Ha
модельных
возможность успешного
лабораторных
животных
продемонстрирована
профилактического применения
окисленного
глутатиона (глутоксима) при тяжелом заболевании вирусной этиологии лихорадке Западного Нила (ЛЗН); введение глутоксима однократно в дозах
1-10 мг мышам-сосункам
за 6-10 часов до заражения вирусом Л З Н
статистически достоверно уменьшает в 10-100 раз накопление вируса в мозге
животных.
11.Обоснована конструкция принципиально нового
многоцелевого,
комплексного препарата для профилактики бактериальных, в том числе
особо опасных,
антигенные
и вирусных инфекционных заболеваний, включающего
комплексы
протективиый
соответствующих
туляремийный
«С»-комплекс,
возбудителей,
компоненты
например,
химической
чумной вакцины имл!уиомодулятор нового класса тиопоэтинов - глутоксим.
Показана
в
эксперименте
протективность
комплексного
препарата,
состоящего из «Фракции 1» (Ф1) V. pestis, «Основного соматического
антигена» (ОСА) Y. pestis, «С»-комплекса F. tularemis - в соотношении по
весу 4:1:2, а также глутоксима в дозе 2 мг для белых мышей при заражении
возбудителем чумы, штамм 231 в дозе 200 Del.
45
С п и с о к работ, о п у б л и к о в а н н ы х п о т е м е диссертации
1 .Арзамасцева Л . В . , Афанасьев С.С., Григорьев В . В . , Ж е м ч у г о в
В.Е.
Изолированное чистое помещение гибкой технологической системы. П а т е н т
2017525 Р Ф . Приоритет от 31.03.1992; О п у б л и к о в а н 15.08.1994. Б ю л . № 15.
2.В0Л0ДИН
Н.Н.,
Сидоренко
СВ.,
Жемчугов
В.Е.
Проблемы
антибактериальной терапии в неонаталогии и реальные п у т и их решения //
Антибактериальная
терапия
в
педиатрической
практике:
Материалы
международной конфергенции. - М о с к в а , 25-26 м а я 1999. - С . 60-63.
З.Евсеев А.А., Денисова Е.Н., Бреусенко В.Г.,
Умаканова М.М.,
Григорян С.С., Жемчугов В.Е. Интерфероновый статус у больных с острыми
воспалительными
заболеваниями
придатков
//
Вестник
Российской
ассоциации акушеров-гинекологов. - 1998. - № 1. - С. 32-37.
4.Жемчугов В.Е. Как мы делали химические вакцины / Записки о
современных охотниках за микробами. - М.: «Наука» - 2004, - 349с.
З.Жемчугов
В.Е.
О
сохранении
и
распространении
патогенных
микроорганизмов (гипотеза) // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2004,б-№5-с.54-58.
б.Жемчугов В.Е., Володин Н.Н., Зубков М.Н. Современные принципы
профилактики и лечения инфекционных заболеваний у новорожденных // Ж .
Профилактика заболеваний и укрепление здоровья. - 2000. - № 6. - С. 14-18.
7.Жемчугов В.Е., Гринченко А . Ю . Способ лечения урогенитальных
инфекций. Пат. 2160604 Р Ф . Приоритет 23.11.1999; Опубликован 20.12.2000.
Бюл.№35.- Юс.
8.Жемчугов
вирусных
В.Е.,
гепатитов.
Гринченко
Патент
А.Ю., Наги
2160603
РФ.
И.В.
Приоритет
Способ
лечения
от 23.11.1999;
Опубликован 20.12.2000. Бюл. № 35.-12 с.
9.Жемчугов В.Е., Дятлов И.А., Кутырев В.В., Волох О.А. Способ
получения препарата для активной иммунизации против туляремии. Патент
2221591 Р Ф . Приоритег от 27.01.2003; Опубликован 01.2004. Бюл.№ 2. -12 с.
46
Ю.Жемчугов В.Е.,
Зурочка
А.В., Румянцев
А.Г.
и
др.
Способ
диагностики депрессии кроветворения. Патент 2136307 Р Ф . Приоритет от
16.11.1999; Опубликован 10.09.99. Бюл. № 25. - 4 с.
11.Жемчугов
В.Е.,
Кожемякин
Л.А.,
Румянцев
А.Г.
Коррекция
последствий воздействия малых доз радиации глутоксимом // Экологические
и генетические проблемы педиатрии: Ш-й конгресс педиалров России. Москва, 27-28 октября 1998г.: Тезисы. - М., 1998. - № 79.
12.Жемчугов
В.Е.,
Кривоножко
А.В.
Метаболическая
иммунокоррекция глутоксимом у новорожденных // Тезисы V I I Российского
национального конгресса "Человек и лекарство". - Москва, 2000. - С. 118.
13.Жемчугов В.Е., Кутырев В.В. Препарат для профилактики и лечения
особо опасных инфекционных заболеваний. Патент 2147234 Р Ф . Приоритет
от 09.03.1999; опубликован 10.04.2000. Бюл. № 10. -10 с.
И.Жемчугов В.Е., Майоров В.А., Зурочка А.В. и др. Синтетический
полипептид, способ получения и средство для культивирования на его
основе.
Патент
2061699
РФ,
приоритет
от
16.11.1994;
Опубликован
10.06.1996. Бюл. № 16. - 12 с.
15.Жемчугов В.Е., Румянцев А.Г., Владимирская Е.Б. и др. Стимулятор
роста костно-мозговых клеток человека. Патент 2136308 Р Ф . Приоритет от
16.11.1994; Опубликован 10.09.99. Бюл. № 25.-10 с.
16.Жемчугов В.Е., Румянцев А.Г. и др. Профилактика "экологической
иммунодепрессии"
Экологические
и
метаболическим
гигиенические
регулятором
проблемы
нового
педиатрии.
поколения
//
111-й конгресс
педиатров России. Москва, 27-28 октября 1998.: Тезисы - М., 1998. - № 80.
17.Жемчугов В.Е., Сафонова Н.Г., Манешин Ю.М., Майоров
Иммуностимулирующее
действие
пептида
последовательности
В.А.
163-171
интерлейкина - ip человеке при иммунизации мышей корпускулярной
вакциной против туляремии // Факторы
клеточного
иммунитета
при
различных физиологических состояниях: Тезисы докладов к X I научной
конференции. - Челябинск, 1992. - С. 35-36.
47
18.Жемчугов
В.Е.,
Хлебников
B.C.,
Афанасьев
С.С.
и
др.
XapaiaepHCTHKa антигена Pseudomonas pseudomallei, выделенного с помощью
моноклональных антител // Актуальные вопросы профилактики опасных
инфекционных
заболеваний:
Материалы
межведомственной
научной
конференции. - Киров, 26-29 марта, 1991. - С. 36-37.
19.3урочка А.В., Жемчугов В.Е., Яровинский Б.Г. и др. Использование
пептидного
фрагмента
наружной
цепи
ГМ-КСФ
в
качестве
колониестимулирующей активности при клонировании К О Е - Г М in vitro II
Факторы
клеточного
физиологических, и
и
гуморального
патологических
иммунитета
при
различных
состояниях. Тезисы докладов
XII
Российской научной конференции. - Челябинск, 1995. - С. 47-48.
20.Казеннова Е.В., Аароне Э., Ладная Н.Н., Жемчугов В.Е., ЧейнгсонгПопов Р., Вебер Д., Покровский В.В., Бобков А.Ф. и др. Сравнительный
анализ распространения мутантного аллеля гена, кодирующего хемокиновый
рецептор CCR-5, среди инфицированных и неинфицированных ВИЧ-1 лиц в
России // Вопросы вирусологии. - 1998. - № 1. - С. 30-32.
21.Хлебников B.C., Ветчинин С . С , Головлев И.Р., Аверин С.Ф.,
Жемчугов В.Е. и др. Превентивная активность моноклональных антител,
специфичных
к
липополисахариду
Francisella
tularensis
II
Журнал
микробиол., эпидемиол. и иммунобиологии. -1992. - № 9-10. - С. 67-70.
22.Хлебников
B.C.,
Головлев
И.Р.,
Жемчугов
В.Е.
и
др.
Иммунологическая эффективность внешних мембран Francisella tularensis
для
обезьян-гамадрилов
//
Журнал
микробиол.,
эпидемиол.
и
иммунобиологии. -1994. - № 3. - С. 61-64.
23.Хлебников B.C., Головлев И.Р., Кулевацкий Д.П., Аверин С.Ф.,
Пширков
С.Ю.,
Тохтамышева
Н.В.,
Жемчугов
В.Е.
и
др. Изучение
биохимических антигенных и протективных свойств внешней мембраны
возбудителя
туляремии
// Молекулярная
вирусология. - 1991. - № 7. - С. 15-20.
генетика,
микробиология
и
48
24.Хлебников B . C . , К у л е в а ц к и й Д . П . , Головлев И.Р., А в е р и н С . Ф . ,
Ж е м ч у г о в В . Е . и др. Исследование ЛПС-белкового комплекса из внешней
мембраны
Francisella
tularensis
II
Журнал
микробиол.,
эпидемиол.
и
иммунобиологии. -1992. - № 3. - С . 13-17.
2 5 . Ш е п е л е в И.А., Д я т л о в И.А., В о л о х О . А . , Ж е м ч у г о в В . Е . и др.
Оценка
биокинетических
туляремийного
микроба
и
морфометрических
в процессе
оптимизации
показателей
пол)^ения
роста
клеточной
массы.// П р о б л . особо опасн. инфекций. - Саратов, 2003. - В ы п . 85. - С . 157163.
26.Khlebnikov V . S . , Golovliov I.R., Kulevatsky D.P., Tokhtamysheva N . V . ,
A v e r i n S . F . , Zhemchugov V . E . , et a l . Outer membranes o f a lipopolysaccharideprotein complex ( L P S - 1 7 k D a protein) as chemical tularemia vaccines // Fems
Immunology and medical Microbiology. -1996. - v . 13. - p. 227-233.
27.Klilebnikov V . S . , Pchelintsev S . Y . , Afanasiev S . S . , G o l o v l i o v I.R.,
Zhemchugov V . E . , Shcherbakov G . Y . Outer membranes o f Francisella
tularensis
as chemical tularemia vaccine // First International conferens on tularemia. - Ume4,
Sweden. -1995. - № 5. - abst. 5.
28.Zhemchugov V . , Zhukova S . , et a l . Application o f immunomodulating
drug G l u t o x i m against Burkholderia
pseudomallei
and Francisella
tularensis
infection // The 3-rd Int. conferens on Tularemia. - UmeS, Sweden, august, 27-30. 2000 - p. 69.
29.Zhemchugov V.E., Volokh O.A, Dyatlov I.A., et al. Outer membrane
"C"-complex from F. tularensis vaccine strain 15 protect from challenge with
F. tularensis type-A strain. // The 4-th Int. conferens on Tularemia. - City of Bath,
U K . - Sept., 16-18. - 2003 - abstr.№ S-29.
30.Zurochka A.V., Zhemchugov V.E., et al. Use of the GM-CSF external
chain peptide fragment as colonystimulating activity in CFU-GM-assay in vitro //
" 1 1 - * I F C C European Congress of Clinical Chemistry". - Tampere, Finland, 2-7
July. -1995. - abstract № 415.
MM А им. II. М. Сеченова
11олпнсано в печать
Тираж 100 экземпляров
2004 г.
РНБ Русский фонд
2006-4
23432
1
i
I
п
-1
" - ; ' "
'■'■^1
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
1
Размер файла
1 716 Кб
Теги
bd000103001
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа