close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

bd000103014

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
РУБЦОВА ЮЛИЯ ПАВЛОВНА
УЧАСТИЕ МИКРОСКОПИЧЕСКИХ
ГРИБОВ В БИОПОВРБЖДЕНИИ
ДРЕВЕСНОСТРУЖЕЧНЫХ ПЛИТ
03.00.07 - микробиология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Нижний Новгород - 2003
Работа выполнена на кафедре физиологии и биохимии растений
Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского
Научный руководитель:
Доктор биологических наук, профессор Смирнов В.Ф.
Официальные оппоненты:
Доктор биологических наук, профессор Дегтева Г.К.
Кандидат биологических наук, доцент Собакинский В.В.
Ведущая организация:
Ф Г У П "Центральный научно-исследовательский и проектный
институт лесохимической промышленности" (ЦНИЛХИ)
Защита состоится <«^> декабря 2005 г. в :;^ часов на заседании
диссертационного совета К 212.166.06 в Нижегородском государ­
ственном университете им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603950, ГСП20, г. Нижний Новгород, пр. Гагарина, 23, корп. 1, биологический
факультет
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Нижегородского
государственного университета им. Н. И. Лобачевского
Автореферат разослан «<2^ ноября 2005
Ученый секретарь
диссертационного совета
кандидат биологических наук,
доцент
, .
МУ
\
Александрова И.Ф.
3£»£^.
Z12.M3I
3
^i'^'fS
О Б Щ А Я ХАРАКТЕРИСТИКА Р А Б О Т Ы
Актуальность
темы. Среди всех видов биоповреждений
особенно часто встречаются и
микробиологические
приносят большой ущерб. На их долю, по данным
статистики, приходится около 20% от общего числа повреждений материалов (Лнисимов,
1985).
Известно,
что
древесина
и
строительные
материалы
на
ее
основе
(древесностружечные плиты - ДСП) могут подвергаться процессу биоповреждений.
Основными агентами биоповреждений древесностружечных плит являются различные
микроорганизмы, главным образом микроскопические грибы (Баженов и др., 1992).
Доминирующая роль грибов среди микроорганизмов в процессах биоповреждений
обусловлена их метаболическими особенностями, которые заключаются в очень богатом
ферментативном
аппарате
(Дьяков,
2003). С
его помощью
они
осуществляют
разнообразные химические превращения сложных субстратов, которые не доступны
другим микроорганизмам. Многим грибам свойственна способность образовывать
токсические продукты, что еще больще повышает их конкурентоспособность за освоение
субстрата (Каневская, 1984). Немалую роль в микологическом повреждении материалов
играет способность грибов расти в биологически экстремальных условиях. Споры стойки к
высыханию, известны случаи, когда они выдерживали высушивание в течение 20 лет и
более. Значительная часть грибных спор переносит низкие температуры без потери
биохимической
активности.
Отличительной
особенностью
некоторых
грибов,
вызывающих повреждение материалов, является их способность расти на твердых сухих
субстратах за счет атмосферного увлажнения (Ильичев и др., 1987).
В качестве своеобразной экологической ниши для фибов в настоящее время выступают
различные промышленные и строительные материалы (бумага, древесина, металл, бетон,
пластмасса, резина, кожа, топливо, лаки, краски, и т. д.), в результате «колонизации»
которых сапрофитными грибами формируется своеобразная группа грибов - технофилов.
Биоповреждение материалов и изделий микроскопическими фибами происходит за счет
механического разрушения разрастающимся мицелием, биозафязнения и, главным
образом, вследствие воздействия ферментов и органических кислот (Анисимов и др.,
1987).
В последнее время много внимания уделяется биодефадации строительных материалов
на основе древесины. Одним из таких материалов, имеющим широкое применение в
строительстве, мебельной промышленности, вагоно- и автомобилестроении являются
древесностружечные плиты (ДСП). В настояике ч№кй'*АН1йй^*й«»5ДЬП на основе
I
бИБЛИОТЕКА
I
! i^'^XM'
фенолоформальдегидных и на основе карбамидных полимеров. Однако имеется ряд
преимуществ карбамидных плит перед фенолоформальдегидными ДСП. К недостаткам
фенолоформальдегидных ДСП относятся выделение свободного фенола и формальдегида,
специфический запах и темная окраска. Плиты на основе карбамидных полимеров не
имеют запаха, бесцветны, стойки к действию ркружающей среды, экологически
безопасны. Известно, что и ДСП на основе фенолоформальдегидных, и на основе
карбамидных полимеров подвержены разрушающему действию фибов, главным образом
микромицетов. Однако процесс биодеструкции изучен слабо.
Учитывая постоянно совершенствующиеся рецептуры изготовления и прессования
ДСП,
а также
высокие адаптационные
возможности
микроскопических
грибов,
необходимо целенаправленное изучение механизмов и причин деструкции ДСП, что
позволит осуществить целенаправленный поиск средств защиты данного строительного
материала.
Цели и задачи исследований. Данная работа посвящена исследованию процесса
деструкции микроскопическими грибами различных рецептур ДСП с целью поиска
эффективных средств защиты данных строительных материалов от микробиологических
повреждений.
Для достижения поставленных целей были сформулированы следующие задачи:
• изучить видовой состав микроскопических грибов, выделенных с зараженных ДСП,
• выявить наиболее активных деструкторов ДСП,
• провести биохимическое тестирование микроскопических
грибов на наличие
ферментов, участвующих в разрущении лигноцеллюлозного комплекса,
• исследовать некоторые физиолого-биохимические особенности грибов - истинных
деструкторов ДСП,
• изучить микодеструкцию лигнина, выделенного из ДСП,
• произвести отбор наиболее активных биоцидов среди производных дитерпеноидов:
Биопаг-2; Биоцик Т-ТДК Н; Биоцид К-ОК-9 О; Биоцик Т-ТДК О с целью защиты ДСП от
биоповреждений.
Свя>ь темы диссертации с плановыми исследованиями. Работа выполнена в рамках
Всероссийской программы фундаментальных исследований ООБ РАН «Проблемы общей
биологии и экологии; рациональное использование биологических ресурсов (1998-2005
Г.Г.). Направление 12. Экологические проблемы биоповреждений».
Научная новизна работы. В работе впервые дан сравнительный видовой анализ
микобиоты двух
типов
древесностружечных
плит
на фенолформальдегидной
и
карбамидной основе.
Установлены активные микромицеты - деструкторы ДСП среди стандартных тест культур ГОСТ 9.049-91 и ГОСТ 9.05<-91.
Впервые выделены и идентифищ|рованы «дикие» штаммы микроскопических грибов,
значительно превышающие стандартные культуры по своей способности осуществлять
биодеструкцию древесностружечных плит.
Определены наиболее активные грибы - деструкторы ДСП которые могут разрушать
как фенолформальдегидные, так и карбамидные плиты: Aspergillus fumigatus, Paecilomyces
carneus, Stemphylium verruculosum, Trichoderma koningii. Для данных микроскопических
фибов подобраны оптимальные условия культивирования, обеспечивающие наиболее
высокий выход метаболитов, связанных с процессом биоповреждения ДСП.
Исследованы физиолого-биохимические особенности микромицетов - деструкторов
данного материала: выявлена высокая фенолоксидазная, пероксидазная, каталазная и
целлюлазная активности исследуемых грибов. Установлено, что микромицеты, имеющие
более широкий спектр лигнинолитических и целлюлолитических ферментов, оказались
более активными деструкторами ДСП.
Изучена микодеструкция 4 видов лигниновых препаратов, выделенных из ДСП:
сернокислотного лигнина из ДСП на основе фенолформальдегидных смол (СЛ из
ФФДСП), сернокислотного лигнина из ДСП на основе карбамидных смол (СЛ из КДСП),
диоксанового лигнина из плит на основе фенолформальдегидных смол (ДЛ из ФФДСП),
диоксанового лигнина из плит на основе карбамидных смол (ДЛ из КДСП).
Среди производных дитерпеноидов выявлены наиболее перспективные с точки зрения
ингибирующего действия на рост микроскопических грибов и бактерий, участвующих в
деструкции промышленных и строительных материалов. Предложен метод зашиты ДСП от
биоповреждений.
Практическая значимость работы. Разработаны приемы повышения биостойкости
древесностружечных плит. Данные меры могут служить основой для создания новой
рецептуры изготовления и прессования ДСП грибостойкого типа. Рекомендуемые нами
препараты могут быть использованы не только на стадии производства плит, но и на
стадии
эксплуатации
данного
материала.
Даны
рекомендации
по дополнению
существующего ГОСТа культурами «диких» грибов - активных деструкторов древесных
материалов.
Публикации. По теме диссертации опубликовано и принято к печати 12 работ
Полозкения, выносимые на защиту.
1
Показано, что несмотря на наличие в составе ДСП грибосгойких компонентов
(фенолформальдегидных и карбамидных смол), данные материалы способны разрушаться
микроскопическими грибами.
2.
Все виды лигнина, выделенные из фенолформальдегидных и карбамидных плит
сернокислотным
и
диоксановым
методами,
способны
поддерживать
рост
микодеструкторов, то есть не являются грибостойкими (за исключением препарата ДЛ из
ФФДСП).
3
Скрининг ряда дитерпеноидов на наличие у них фунгицидной активности позволил
рекомендовать
препарат
Биоцик
Т
в
качестве
средства
защиты
ДСП
от
микробиологических биоповреждений.
Апробация работы.
Международной
Материалы диссертации доложены и обсуждены на: V
научно-практической
конференции
«Современные
проблемы
биологических повреждений материалов» (Пенза, 2002), I Всероссийской научнотехнической конференции «Проблемы строительного материаловедения: Соломатовские
чтения»
(Саранск,
2002), IV
Международной
научно-практической
конференции
«Реставрац1я музейних пам яток в сучасних умовах Проблеми та шляхи ix вир!шения»
(Киев, 2003), VIII (IX, X) Нижегородской сессии молодых ученых (Н Новгород, 2003.
2004, 2005), Международной научно-технической конференции «Биоповреждения и
биокоррозия в строительстве» (Саранск, 2004), Международной научно-технической
конференции «Актуальные вопросы строительства» (Саранск, 2004), 9 Пущинской школеконференции молодых ученых «Биология - наука X X I века» (Пущино, 2005), 1-ый
Международный форум «Актуальные проблемы современной науки» (Самара, 2005). На
основе
проекта:
«Физиолого-биохимические
основы
защиты
древесностружечных
материалов от биоповреждений, вызываемых микроскопическими фибами» получен грант
Министерства образования и науки Российской федерации по ведомственной научной
профамме «Развитие научного потенциала высшей школы». Задание 4597 - 2005 год.
Структура и объем работы. Материалы диссертации изложены на 136 страницах
машинописного
текста.
Диссертация
состоит
из
введения,
обзора литературы,
экспериментальной части, выводов и списка литературы. В работу включено 26 рисунков и
7
13 таблиц
Указатель литературы включает 139 источников, в том числе 26 на
иностранных языках.
О Б Ъ Е К Т Ы , М А Т Е Р И А Л Ы И М Е Т О Д Ы ИССЛЕДОВАНИЙ
В данной работе использовали древесностружечные плиты (ДСП) на карбамидной и
фенолформальдегидной основе марки П-А, I. М, Ш, Е1 ГОСТ 10632-89. Объектами
исследования служили штаммы микроскопических грибов ГОСТ 9.049-91 и ГОСТ 9.051 -91
(деструкторы различных
промышленных материалов), а также "дикие" штаммы,
выделенные нами с ДСП, подвергшихся процессу биоповрежд^чия.
Для исследования биоцидной активности испьггывали некоторые производные
дитерпеноидов: Биопаг-2; Биоцик Т-ТДК Н; Биоцид К-ОК-9 О; Биоцик Т-ТДК О.
синтезированных ООО «Лесма» г. Н. Новгород. Рабочие концентрации соединений
подбирали экспериментально.
Идентификацию микромицетов, выделенных с зараженных ДСП производили на
основании их морфолого - культуральных особенностей, используя определители: К.Б.
Райпер, С.А. Том, Д.И. Феннел (Raper, Thorn, Fennell, 1949); Т.С Кириленко (1977): К
Домш, В. Гаме (Domsch, Gams, 1980); В.И. Билай, Т. И. Билай, Е.Г. Мусич (1982); Л.Ю.
Лугаускас, А. Н. Микульскене, Д.Ю. Шляужене (1987); В. И. Билай, Э.З. Коваль (1988),
Э.З. Коваль, Л.П. Сидоренко (1989).
С целью определения спектра лигнолитических и целлюлолитических ферментов грибы
- истинные деструкторы ДСП подвергали действию биохимических тестов (Билай, 1982,
Falkon, 1995).
Целлюлозную активность
определяли
по
количеству
редуцирующих
Сахаров
(глюкозы), образовавшихся в реакционной смеси при использовании в качестве субстрата
фильтровальной бумаги. Активность выражали в мкМолях глюкозы, освободившейся за 1
час при действии 1 мг белка. О количестве редуцирующих Сахаров, имеющихся в среде,
судили по реакции с пикриновой кислотой (Кушманова, Ивченко, 1974).
Определение
активности
фенолоксидазы
и
пероксидазы
проводили
фотоэлектроколориметрическим быстрым методом Бояркина (1951, 1954). Активность
фенолоксидазы выражали в условных единицах (усл.ед.) по окислению пирокатехина в
присутствии парафенилендиамина на 1 мг белка за 1 минуту. Активность пероксидазы
также представляли в условных единицах (усл.ед.) по окислению бензидина в присутствии
Н2О2 на 1 мг белка за 1 минуту.
8
Активность внеклеточной каталазы измеряли спектрофотометрическим методом
Бергмайера (Кураков и др., 2001) и выражали в мкМоль Н2О2 на мг белка за минуту.
Белок в мицелии и культуральной жидкости определяли по методу Лоури.
Для получения веществ лигниновой природы из ДСП использовали метод Комарова с
72%-й серной кислотой (Практические работы по химии древесины и целлюлозы, 1965) и
диоксановый метод (Богомолов, 1973).
Определение грибостойкости исходных и обработанных раствором Биоцика-Т
образцов ДСП производили как с помощью стандартных тест - культур ГОСТ 9.049-91 и
ГОСТ 9.05^-91, так и с помощью «диких» штаммов.
Исследовали наличие биоцидной активности у четырех производных дитерпеноидов
(через определение минимальной фунгицидной концентрации).
Экспериментальные данные обрабатывали с использованием пакета электронных
таблиц Microsoft Excel. Учитывали такие параметры, как среднее арифметическое и
доверительный интервал с уровнем значимости 95%.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Идентификация микромицетов, выделенных с зараженных ДСП. На первом этапе
работы определили грибы, поражающие данные материалы в условиях их эксплуатации. С
пораженных микромицетами фенолформальдегидных ДСП выделили в чистую культуру
и1таммы грибов, относящиеся к 27 видам, а с карбамидных плит - штаммы грибов,
относящиеся к 30 видам. Идентификацию микромицетов производили на основании их
морфолого - культуральных особенностей, используя определители (табл. 1).
Результаты
исследований
показали,
что
микобиота
фенолформальдегидных
лревесностружечных плит (ФФДСП) представлена 11 родами, 3 семействами, 2 порядками
и 2 классами, а микобиота карбамидных плит (КДСП) - 10 родами, 4 семействами, 3
порядками и 2 классами. Самое богато представленное семейство, как и в случае с
ФФДСП, так и в случае КДСП - семейство Moniliaceae, на его долю приходится около 75%
видового состава грибов. Полученные данные согласуются с приводимыми в источниках
литературы, где представители этого семейства упоминаются как часто встречаемые на
производных древесины (Билай, 1965; Нюкша, Коссиор, 1976; Кондратюк, Жданова, 2002).
Самыми распространенными родами этого семейства, как в случае ФФДСП, так и в случае
КДСП, были род Aspergillus и Penicillium. Однако на ФФДСП чаще других обнаруживали
род Aspergillus (9 видов), а на КДСП - род Penicillium (10 видов).
Таблица 1
Таксономическая характеристика микроскопических грибов, выделенных с
древесностружечных плит.
Порядок
Класс
Семейство
Moniliaceae
Hyphomycetales
Hyphomycetes
Dematiaceae
Tuberculariales
Tubcrcularia
Род
Количество видов
ФФДСП
КДСП
Aspergillus
9
7
-
Botrytis
1
Botryosporium
1
Monilin
1
1
-
-
Paecilomyces
1
Peniciliium
6
10
Trichoderma
1
2
Altemaria
-
Cladosporium
2
I
2
2
Stemphylium
2
1
Sterigmatobotrys
1
-
Fusarium
1
ceae
Zygomycetes
Mucorales
Mucoraceae
Mucor
2
3
Выявление деструкторов ДСП. Обнаружение роста микромицетов на каком-либо
материале не позволяет с уверенностью утверждать, что данные грибы являются
истинными его деструкторами, т. е. способны использовать компоненты материала в
качестве
источника
питания. Возможен
рост
микромицетов
за
счет
внешних
загрязнителей, которые в обязательном порядке присутствуют на поверхности материала.
Для выявления плесневых грибов - истинных деструкторов древесностружечных плит
проводили оценку грибостойкости (ГОСТ 9.049-91 и ГОСТ 9.051-91 с добавлением в
качестве тест - культур выделенных с древесностружечных плит штаммов).
Среди 27 видов микроскопических грибов, выделенных с ФФДСП, истинными
деструкторами были только 12 видов, а среди 30 видов микромицетов, выделенных с
КДСП - 14 видов. Таким образом, количество истинных деструкторов ДСП гораздо
меньше, чем исходное количество видов грибов, рост которых изначально обнаружили на
данном материале. Анализ видового состава грибов - истинных деструкторов данного
10
материала показал, что грибы' Aspergillus fumigatus
Paecilomyces carneus, Stemphylium
verruculosum, Trichoderma koningii принимали участие в разрушении и Ф Ф Д С П , и К Л С П
Однако большинство выделенных деструкторов специфичны для каждого вида материала
(или на основе фенолформальдегидной, или на основе карбамидной смолы) Это позволило
предположить, что данные грибы отличаются
по своим
физиолого-биохимическим
особенностям, что связано с различной химической структурой разрушаемых
субстратов.
ими
.
Определение грибостойкости Д С П . Данные материалы исследовали на устойчивость
к действию стандартных тест - культур грибов Г О С Т 9.049-91 и Г О С Т 9.051 -91 (табл. 2) и
«диких» видов (табл. 3).
Оценку грибостойкости вели по шестибалльной шкале ( 0 - 5
баллов). Материал
считали фибостойким, если он получал оценку 0 - 2 балла.
Таблица 2.
Грибостойкость Д С П на основе фенолформальдегидных и карбамидных смол к
Г О С Т о в с к н м грибам.
Вид гриба
ФФДСП
Aspergillus terreus BKMF-1025
Степень обр!(стания в баллах
ФФДСП
КДСП
КДСП
1
2
+БИОЦИК
0
+БИ0ЦИК
0
3
3
0
0
Aspergillus oryzae BKM F-2096
3
5
0
1
Alternaria alterrmta BKM F-1120
5
5
1
I
Chaetomium globosum BKM F-109
2
2
0
0
Fusarium moniliforme BKM F-136
5
4
1
1
Penicillium ochrochloron BKM F-1702
4
5
1
1
Penicillium cyclopium BKM F-265
3
5
0
1
Penicillium chysogenum
1
3
0
0
2
4
0
0
5
5
0
1
BKMF-378
3
5
1
1
BKMF-310
5
5
0
1
Trichoderma viride BKM F-1117
3
5
1
2
Суммарная суспензия
4
5
1
1
Aspergillus niger
BKMF-1119
BKMF-245
Penicillium funiculosum BKM
Penicillium brevicompaclum
Paecilomyces variotii
Penicillium martensii
F-IllS
BKMF-234
11
Таблица 3.
Грибостойкость ДСП на основе фенолформальдегидных и карбамидных смол к
<^иким» грибам.
Степень обрастания в баллах
Вид гриба
ФФДСП
КДСП
ФФДСП
КДСП
+БИ0ЦИК
+БИ0ЦИК
Atlernaria alternata.
3
5
0
1
Aspergillus carbonarius.
4
5
0
0
Aspergillus flavus.
4
4
1
0
Aspergillus fumigot4s.
5
5
2
2
Aspergillus niger.
4
5
1
1
Aspergillus orysae,
5
4
1
1
Aspergillus penicilloides.
5
5
0
0
Aspergillus usius.
5
5
0
1
0
Bolryosporium longibrachiatum,
5
3
0
Mucor globosus,
5
4
1
1
Mucor hiemalis,
5
4
0
1
Paecilomyces carneus,
5
5
1
I
Penicillium cyclopium.
5
5
0
0
PemcUliumfuniculosum.
4
5
0
0
Penicillium nigricans,
5
4
0
0
Penicillium notatum,
3
5
0
0
Penicillium palitans.
5
5
1
1
Penicillium variabile.
4
5
0
0
Penicillium variotii.
4
5
1
2
Stemphylium verruculosum,
5
5
2
2
Trichoderma koningii.
5
5
2
2
Trichoderma lignorum
4
4
0
Суммарная суспензия
5
5
2
»
2
Анализ результатов таблиц 2 и 3 показал, что ДСП на основе фенолформальдегидных и !
карбамидных смол подвержены деструкции как под действием стандартным тест - кулыур
так и «диких» видов. Однако, биодеструкция ДСП «дикими» грибами несколько выше, чем
12
ростовскими видами. Многие фибы вызывали деградацию Д С П , оцененную в 5 бал;юв,
г.е. практически полностью разрушали данный вид материала.
Среди «диких» видов грибов - активных деструкторов Д С П были штаммы уже
внесенные в Г О С Т : А
orysae, А niger, Alt alternata, Р
cyclopium, Р funiculosum, но
присутствовали и те, которые не внесены в данный список: А carbonarius, А fumigatus, А
penicilloides,
А. uslus, В. longibrachiatum, М
globosus, М
hlemalis. Расе
carneus, Р
funiculosum Р. nigricans, Р notatum, Р palitans, Р variabile, Р variotii, S verruculosum, Т
koningii. Данные штаммы, на наш взгляд, можно рекомендовать для дополнения ГОСТа по
методам испытаний на грибостойкость Д С П , древесины и материалов на ее основе.
Биохимическое
тестирование
грибов
-
деструкторов
ДСП
на
наличие
ферментов, участвующих в разрушении лигноцеллюлозного комплекса. Известно, ч го
биодеградация материалов, содержащих древесину, может осуществляться двояко: за счет
расщепления лигнинового компонента или за счет разрушения целлюлозного компонента
(Лх.медова,
1996) Если
деструкция
идет по первому
пути, то большее
значение
приобретают ферменты класса оксидорсдуктаз (внеклеточные оксидазы: фенолоксидаза,
лакказа, тирозиназа, пероксидаза, каталаза), деградация по второму пути предполагает
активное участие ферментов класса гидролаз, в частности целлюлаз С целью определения
спектра
лигнинолитических
и
целлюлолитических
деструкторы древесностружечных
ферментов
фибы
-
истинные
плит подвергали действию биохимических тестов
(Falkon. 1995).
Максимальный спектр выбранных характеристик имели 8 из 22 фибных штаммов
(1абл. 4). А flavus, А fumigatus, М. globosus, Раес
carneus, Р palitans, Р
variotii, S
verruculosum, Т koningii давали положительные результаты более чем на пять из шести
предложенных тестов. Грибы, имеющие более широкий спектр лигнинолитических и
целлюлолитических
ферментов,
на
наш
взгляд,
могут
являться
более
активными
деструкторами Д С П .
Важно отметить, что четыре из восьми вышеперечисленных фибов, как отмечалось
ранее, принимали участие в деструкции как фенолформальдегидных, так и карбамидных
ДСП
Aspergillus fumigatus, Paecilomyces carneus, Stemphylium verruculosum, Trichoderma
koningii Учитывая эти факторы, дальнейшую работу по определению ферментативной
активности проводили на этих четырех фибах.
13
Таблица 4.
Биохимические характеристики грибов - истинных деструкторов ДСП.
и
3
Название штамма гриба
= a
i1
V
Altemaria alternata
i g
+
+
Aspergillus flavus
-
+
+
Aspergillus fumigatus
+
+
Aspergillus niger
+
Aspergillus orysae
-
-
Aspergillus carbonarius
Aspergillus penicilloides
Aspergillus ustus
Botryosporium
s
a
S
m -
я
+
-
4
-
CS
s
s
s
s
o.
s
f+
+
+
s
§
s
u
b£
I
+
с
3
en
«a
c;
2
Ч
1
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
-
-
-
Mucor globosus
+
+
+
+
+
Mucor hiemalis
-
-
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
longibrachiatum
Penicillium nigricans
+
+
+
Penicillium notatum
+
+
Penicillium palitans
-
+
+
+
Penicillium variabile
-
-
-
+
+
-
+
Paecilomyces carneus
+
+
+
Penicillium cyclopium
+
+
Penicilliumfimiculosum
+
+
-
-
+
+
-
+
+
+
Stemphylium verruculosum
+
+
+
+
Trichoderma koningii
-
+
+
+
+
+
+
+
Trichoderma lignorum
-
-
+
+
+
+
Penicillium variotii
+/- - положительная/отрицательная реакции на биохимические тесты.
14
Физиолого-биохимические
сравнении
активности
особенности
разных
грибов
ферментативных
-
деструкторов
систем
большого
ДСП.
При
числа грибов,
принадлежащих к разным систематическим и экологическим группам, многие авторы
показали, что уровни активности ферментов зависят от вида и штамма продуцента
(Гусаков, Синицын, 1998, Гукасян, 1999).
В связи с тгим представляло интерес сравнить активность фенолоксидазы, каталазы,
пероксидазы, целлюлазы микромицетов {Aspergillus fumigatus, Paecilomyces carneus.
Stemphylium verruculosum, Trichoderma koningii), относящихся к разным родам. Кроме того,
изучение динамики активности ферментов важно с точки зрения прогнозирования
процессов биоповреждения промышленных материалов, в деструкции которых могут
о
Z >.>
9
11
13
15
17
19
21
9
t, сутки
11
13
15
17
19
21
t, сутки
FVic 2 Временная динамика
FVic 1 Временная динамика
каталазной активности фиба
фенолоксидазной активности гриба
Aspergius furrigatus
Stemphylium verruculosum
--♦--4,6
—.— 5
-. - 5,4
--х---5,8
t
f
ia s?
м n
ES
13
15
17
19
21
23
25
t, сутки
П4С 3 Временная динамика
FVc 4 Временная динамика
пероксидазной активности гриба
целлюлазной активности гриба
StemphyHlum verruculosum
Trichoderma koningit
27
15
принимать участие экстрацеллюлярные ферменты выделенных микромицетов.
В
заданных
фенолоксидазы
условиях
из
культивирования
исследуемых
наиболее
нами грибов оказался 5
активным
продуцентом
verruculosum
Максимум
активности наблюдали на 7-е сутки, при рН среды 7,4 он составил 4,527 у.е. (рис 1).
При сравнении активности экстрацеллюлярной каталазы самой высокой она была у
фиба А fumigatus К
19-м суткам при рН среды 7,4 каталазная активность достигла 1,195
мкМоль НгОг/мг белка-мин (рис. 2).
Наибольшую пероксидазаную активность обнаружили у гриба 5 verruculosum Для S
verruculosum, пик активности фермента приходился на 7-е сутки при рН среды 5,8 и
составил 24,56 (рис. 3).
Самым активным продуцентом целлюлаз из исследуемых нами грибов оказался
микромицет
Т.
koningii.
Его
целлюлазная
активность
достигла
к
22
суткам
культивирования 19,110 мкМоль глюкозы/мг белка-час при рН=5,4 (рис. 4).
Биодеструкция лигнина из Д С П микроскопическими грибами. Из источников
литературы известно, что ни фенолформапьдегидная, ни карбамидная смолы не могут
использоваться грибом в качестве единственного источника углерода (Соломатов и др.,
2001). Следовательно, рост грибов на Д С П возможен лишь за счет древесных частиц. В то
же время, смолы могут химически взаимодействовать с активными группировками
лигнинового и целлюлозного компонентов Д С П , тем самым влиять на их доступность для
микодеструкторов.
В связи с вышесказанным представляло интерес изучить грибостойкость лигнинового
компонента Д С П различной рецептуры, а также исследовать его влияние на скорость роста
и активность лигнолитических ферментов культур истинных деструкторов. С этой целью
исследовали лигнин, выделенный двумя методами - диоксановым (ДЛ) и сернокислотным
по Комарову ( С Л ) из опилок Д С П двух рецептур - на основе фенолформальдегидных
( Ф Ф Д С П ) смол и на основе карбамидных (КДСП) смол. Таким образом, получили 4 вида
лигниновых препаратов.
Для данного исследования смешанную культуру и монокультуры грибов А fumigatus,
Р carneus, S verruculosum, Т koningii выращивали на среде с 2 % лигниновым препаратом
в качестве единственного источника углерода. Показали, что все виды лигнина, за
исключением препарата Д Л из Ф Ф Д С П , способны поддерживать рост микодеструкторов,
то есть не являются грибостойкими (табл. 5).
16
Таблица 5.
Оценка возможности использования препаратов лигнина в качестве источников
питания для грибов - деструкторов Д С П .
Наличие роста грибов
Вид гриба
СЛиз
СЛиз
ДЛнз
ДЛ из
ФФДСП
КДСП
ФФДСП
КДСП
Р. carneus
+
+
-
+
S verrucutosum
+
+
А. fumigatus
+
+
Т koningii
+
+
Суммарная суспензия
+
+
+
+
-
+
+
+/- - наличие/отсутствие роста грибов
Для изучения влияния препаратов лигнина на характер роста колоний микромицеты
культивировали на бессахарозной твердой питательной среде, в которую добавляли один
из трех видов поддерживающих рост грибов лигнинов в конечной концентрации 2%. О
росте грибов судили по диаметру D колоний на поверхности агаризованной среды ЧапекаДокса на 14-е сутки культивирования (табл. 6).
Таблица 6.
Рост колоний микодеструкторов Д С П
Диаметр колонии гриба, мм
Вид гриба
Контроль
СЛиз
СЛиз
ДЛиз
ДЛиз
one
ФФДСП
КДСП
ФФДСП
КДСП
1,5
18,5
0
1
Р carneus
51,8
S verrucutosum
66,1
15
24
0
2,5
90
50
50
0
45
84,1
50
50
0
25
Т koningii
А fumigatus
Установили, что все четыре исследуемых гриба на среде с лигнинами, полученными
сернокислотным методом, показали больший диаметр колоний, чем на средах с
диоксановыми лигнинами. Значения диаметра колоний грибов последовательно убывали в
ряду СЛ из КДСП > СЛ из ФФДСП > ДЛ из КДСП > ДЛ из ФФДСП. Известно, что при
сернокислотном методе выделения изменения в лигнине обусловлены реакциями
конденсации, всегда протекающими при кислотном гидролизе. Диоксановый метод
пыделения не вызывает существенных изменений в лигнине, но препараты, полученные
17
эгим методом не всегда свободны от неуглеводных примесей (Сарканен, Людвиг. 1975)
Вероятно, при выделении любым из названных методов в лигниновых препаратах остается
некоторое количество полимерных смол, но диоксановый метод приводит к их меньшему
удалению,
чем
сернокислотный.
Именно
большим
или
меньшим
содержанием
определенного вида смол в лигниновом препарате объясняли прямое соответствие
диаметра колоний грибов результатам грибостойкости данных смол. Лигнины из ДСП с
менее грибостойкой карбамидной смолой обуславливали больший диаметр колоний, чем
лигнины
из
ДСП
на
грибостойких
фенолформальдегидных
смолах, а препарагы.
полученные методом, в меньшей степени влияющим на количество полимерных смол
(диоксановым), больше снижали диаметр колоний фибов по сравнению с лигнинами.
полученными сернокислотным методом.
Исследование биоцидной активности некоторых производных дитепренондов.
Известно, что разрушению под действием микроорганизмов подвергается широкий круг
материалов как природного, так и синтетического происхождения.
Микроорганизмы
обладают
мощным, лабильным
ферментативным
аппаратом
н
поэтому быстро адаптируются к изменениям окружающей среды, в том числе и к
биоцидным соединениям. В настоящее время все большую актуальность приобретает
поиск
новых
высокоэффективных
биоцилных
препаратов,
обладающих
низком
экологической нафузкой на окружающую среду. Такими биоцидными препаратами мог\т
быть дитерпеноиды, получаемые из растительного сырья. Объектами наших исследований
были 4 производных дитерпеноидов в концентрациях 0 , 1 % , 0.5%, 1.0%. 5,0%. Изучали их
биоцидную активность по отношению к микроскопическим фибам и бактериям активным
деструкторам
строительных
и
промышленных
материалов.
Испытания
проводили по стандартным методикам. Бактерицидную и фунгицидную активности
определяли по величине радиуса зоны ингибирования роста тест - культур, которая
образуется вокруг лунок с исследуемым веществом (табл. 7).
В
эксперименте
исследовали
водные
растворы
данных
соединений.
Наиболее
перспективным с точки зрения ингибирующего действия на рост микроскопических
фибов (фунгицидная активность в концентрациях > 1,0%) и бактерий (бактерицидная
активность в концентрациях > 0,1%), участвующих в деструкции промышленных и
строительных материалов, стал препарат Биоцик Т-ТДК Н. Именно это соединение взяли
для дальнейшего изучения.
18
Таблица 7
Исследование биоцидиой активности некоторых производных дитерпеноидов.
Исследуемое
Зона ингибирования
Зона ингибирования
роста фибов
роста бактерий
(R, мм)
( R , мм)
-
7,0
Концентрация, %
вешество
0,1
0,5
Биопаг-2
1,0
2,0
11,0
0,1
-
6,0
2,0
10,0
5,0
3,0
11,0
0,1
-
9,0
1,0
6,0
9,0
5,0
4,0
10,0
0,1
-
11,0
0,5
Ьиоцик Т-ТДК О
8,0
1,0
0,5
Биоцик К-ОК-9 О
9,0
5,0
0,5
Биоцик Т-ТДК Н
5,0
1,0
5,0
11,0
13,0
3,0
14,0
- отсутствие зоны ингибирования роста микроорганизмов
Исследование активности экстрацеллюлярных ферментов грибов, выделенных с
Д С П , в условиях воздействия биоцидов. На данном этапе работы исследовали влияние
сублетальных
концентраций
лигнинолитических
Биоцик
Т-ТДК
и целлюлитических
И
на
активность
экстрацеллюлярных
ферментов при максимуме
ферментативной
активности. Биоциды вводили в среду культивирования грибов на 3-й сутки (in vivo)
Результаты исследований данной серии опытов показали, что Биоцик-Т действительно
проявлял ингибирующее действие на каталазу, фенолоксидазу, пероксидазу и целлюлазу
грибов Р carneus, S verruculosum, А fumigalus, Т. koningii (рис. 5).
Для
фенолоксидаз.
пероксидаз, целлюлаз
максимальный
ингибирующий
эффект
фунгицида Биоцик-Т наблюдали у гриба S verruculosum, и лишь для каталаз - у гриба А
19
fumigatus
Таким
образом,
предположили,
что
ферментативная
система
гриба S
verruculosum менее стойка к действию данного биоцида. Минимальный эффект Биоцик
оказывал на А fumigatus - для фенолоксидаз, пероксилаз и Р carneus - для цeллюлaJ и
каталаз.
Сильнее ингибировались пероксидазные комплексы ферментов (в 3,4-43,7 раза). Более
устойчивой оказалась фенолоксидазная система (ингибирование в 1,4-4,2 раза).
О котроль
■ биоцнк
3*
55
1*
Ьз
|2
6
3
<!
S
3
^
сл
каталазная аппвность
фенолоксидазная активность
Оконгроль
?'*
Оконгроль
Ибнсифк
512
>,
i 9
Л_
i 6
л
S
t2
<
Е
псрокснаазшм airniaiiorrb
цсллюлазняя активность
Рис. 5. Влияние препарата Биоцик Т-ТДК Н на ферменты грибов - деструкторов ДСП
Биоцидный
эффект
препарата
Биоцик
Т-ТДК
Н
(дегидроабиетил-4
карбонилэтоксидиметил-этиламмоний бромид) - четвертичного аммониевого соединения
на основе дитерпеновых кислот (канифоли), может быть связан с его дестабилизирующим
действием на нативную структуру ферментов. Он приводит к нарушению третичной
структуры
фермента,
вызывает
денатурацию
белков
и дезорганизацию
клеточной
мембраны (Злочевская и др., 1980).
Таким образом, Биоцик-Т проявил ингибирующее действие на ферменты грибов А
fumigatus,
S.
verruculosum,
P.
carneus,
Т.
koningii, поэтому
данное
соединение
20
действительно может быть рекомендовано в качестве эффекгивного средства защиты
строительных материалов на основе древесины, в частности ДСП.
Определение грибостойкости Д С П , обработанных фунгицидом Биоцик-Т. Широкое
применение древесины приводит к необходимости постоянного совершенствования мер
защиты конструкций и изделий из нее. Для обеспечения долговременной прочности
материалов из древесины, подвергающихся воздействию
внешней среды, зачастую
необходимо применять химические средства защиты. На эффеетивность средств защиты
влияют природа химического соединения, используемого в качестве консерванта, и метод
его нанесения.
Для обработки Д С П использовали метод поверхностной обработки. Фунгицид БиоцикТ в концентрации 1,0% ( М Ф К ) наносили на поверхность Д С П с помощью кисти. Давали
плите высохнуть. Установили, что древесностружечные плиты после обработки их
Виоциком-Т
приобретали
грибостойкие
свойства,
при
чем
как
ДСП
на
основе
фенолформальдегидных смол, так и Д С П на основе карбамидных смол по отношению и к
РОСТОВСКИМ, и к «диким» грибам грибостойки, так как они получали оценку по методу 1
не превышающую 2 баллов (табл. 2,3).
Данные меры могут служить основой для создания новой рецептуры изготовления и
прессования
ДСП
грибостойкого
типа.
Разработанные
нами
приемы
могут
быть
использованы не только на стадии производства Д С П , но и на стадии эксплуатации
данного материала. Однако прежде чем рекомендовать данный препарат для массового
использования
и
промышленного
применения
стоит
провести
ряд
испытаний
направленных на изучение его влияния на физико-механические показатели Д С П .
Таким образом, выявили, что и фенолформальдегидные
и карбамидные
плиты
разрушались как под действием стандартных, так и «диких» тест-культур грибов, которые
исгюльзовали как целлюлозный, так и лигниновый компонент Д С П в качестве источников
питания.
ВЫВОДЫ
I
Древесностружечные плиты как на фенолформальдегидной, так и на карбамидной
основе способны служить
источником
питания для микроскопических
грибов.
С
фенилформальдегидных плит было выделено 27 видов микромицетов, из них истинными
21
деструкторами оказалось 12 видов, а с карбамидных плит - 30 видов микромицетов, из них
истинные - 14 видов.
2. Д С П
деструкции
на
основе
как
фенолформальдегидных
под действием стандартных
и
карбамидных
тест
-
культур
смол
подвержены
(наиболее
активные
деструкторы - Alternaria alternata, Penicillium brevicompactum, Penicillium martensii) так ii
«диких» видов (наиболее а1сгивные деструкторы - Aspergillus fumigalus, Aspergillus
penicilloides, Aspergillus ustus, Paecilomyces carneus, Penicillium cyclopium, Peniciltium
palitans, Stemphylium verruculosum, Trichoderma koningii).
3. Биохимическое
максимальным
тестирование
микроскопических
спектром лигнолитических
грибов
и целлюлитических
микромицеты: Aspergillus fumigalus. Paecilomyces
показало.
что
ферментов обладали
carneus, Stemphylium verruculosum.
Trichoderma koningii, принимающие участие в разрушении и фенолформальдегидных, и
карбамидных Д С П . Грибы, имеющие более широкий диапазон лигнинолитичсских и
целлюлолитических ферментов, оказались более активными деструкторами ДСП.
4. Отмечено, что изменение активности экстрацеллюлярных ферментов: фенолоксидаз,
каталаз, пероксидаз, целлюлаз зависит от рН среды, времени культивирования и вида
гриба.
В
заданных
фенолоксидаз
и
условиях
пероксидаз
из
культивирования
исследуемых
наиболее
нами
активным
грибов
продуцентом
оказался Stemphylium
verruculosum, каталаз - Aspergillus fumigalus. целлюлаз - Trichoderma koningii
5. Показано, что полученные нами лигниновые препараты подвержены деструкции под
действием
микроскопических
грибов.
Биостойкость
препаратов
ли1нина
ш
фенолформальдегидных плит выше, чем у лигнина из карбамидных плит, а лигнин,
выделенный сернокислотным методом менее фибостойкий, чем выделенный диоксановым
методом.
6. Скрининг препаратов на основе производных дитерпеноидов показал, что наиболее
перспективным с точки зрения ингибирующего действия на рост микроскопических
грибов - деструкторов ДСП (фунгицидная активность в концентрациях > 1,0%.) и
бактерий (бактерицидная активность в концентрациях > 0,1 % ) , является Биоцик Т-ТДК 11
Данный
биоцид
проявлял
ингибирующее
действие
на
фенолоксидазы,
каталазы.
пероксидазы, целлюлазы грибов Aspergillus fumigalus, Paecilomyces carneus, Stemphylium
verruculosum, Trichoderma koningii.
7. Полученные результаты по исследованию ингибирующего действия Биоцика Т-ТДК
Н могут служить основой для создания новой рецептуры изготовления и прессования ДСП
22
грибостойкого типа. Разработанные нами приемы могут быть использованы не только на
стадии производства ДСП, но и на стадии эксплуатации данного материала.
Список работ Рубцовой Ю. П. (Клягиной), опубликованных по теме диссертации.
/.
Стручкова, И. В.
Микромицеты в зданиях Нижнего Новгорода и их связь с
биолеструкцией бетонов / И. В. Стручкова, Ю. П. Кпягина. В, Ф. Смирнов II Сборник
статей V Международной научно-праетической конференции «Современные проблемы
биологических повреждений материалов. (Биоповреждения - 2002)». - Пенза, 2002. - С
44-^6.
2.
Смирнов, В. Ф. Каменные строительные материалы как источник микогенного
загрязнения воздушной среды в зданиях Н. Новгорода / В. Ф. Смирнов, И. В. Стручкова,
Ю.
П. Клягина II
Материалы
Всероссийской научно-технической
конференции
«Проблемы строительного материаловедения: 1-е Соломатовские чтения». 1-3 сентября
2002. - Саранск, 2002. - С. 314-319.
.?.
Клягина. Ю. П. Исследование активности фенолоксидаэ у грибов - деструкторов
древесины и строительных материалов на её основе / В. Ф. Смирнов, Ю. П. Клягина II
Тезисы докладов VlII нижегородской сессии молодых ученых. (Технические науки). 10 14 февраля 2003. - Н. Новгород, 2003. - С. 139-140.
4.
Разработка мероприятий по защите от биоповрежцений архитектурного комплекса
Серафимо - Дивеевского монастыря / О. Н. Смирнова, Е. А. Захарова, В. Ф. Смирнов, Ю.
П. Клягина II Тези доповтдей IV М1жнародно! науково - практично! конференц!!.
Реставрац!я музсйних нам яток в сучасних умовах. Проблеми та шляхи ix вир!шения Ки1в,2003.-С. 151-152.
5.
Клягина. Ю. П. Микромицеты - деструкторы древесностружечных плит / Ю. П.
Клягина, Д. Г. Забегалина, В. Ф. Смирнов II Материалы Международной научнотехнической конференции «Биоповреждения и биокоррозия в строительстве».
2-4
.1екабря2003 - Саранск, 2004. - С. 188-191
6.
Клягина, Ю. П. Экологические и физиолого-биохимические аспекты разрушения
лрспесностружечных плит микроскопическими фибами / Ю. П. Клягина. П. Г. Забегалина
II Тезисы докладов IX нижегородской сессии молодых ученых. (Естественнонаучные
дисциплины) 25 -30 апреля 2004. - Н Новгород, 2004 - С . 269-271.
7.
Клягина, Ю. П. Разрушение древесностружечных плит (ДСП) микроскопическими
грибами / Ю. П. Клягина, В. Ф. Смирнов II Материалы международной научно-
23
технической конференции «Актуальные вопросы строительства». 14 - 16 декабря 2004. Саранск, 2004. - С. 338-342.
8.
Клягина. Ю.
П.
Экстрацеллюлярные ферменты микроскопических грибов -
деструкторов древесностружечных плит (ДСП) / Ю. П. Клягина II 9-я Пущинская школаконференция молодых ученых «Биология - наука X X I века». 18-22 апреля 2005. Пущино, 2005. - С. 195.
9.
Клягина. Ю. П. К вопросу биоповреждения микроскопическими фибами различных
древесностружечных плит / Ю. П. Клягина. В. Ф. Смирнов II 1-ый Международный
форум молодых ученых и студентов «Актуальные проблемы современной науки». 12-15
сентября 2005. - Самара, 2005. - С.38-41.
10. Маркина, А. В. Биохимические характеристики микромицетов - деструкторов
древесностружечных плит / А. В. Маркина, Ю. П. Клягина. В. Ф. Смирнов II 1-ын
Международный
форум
молодых ученых
и
студентов
«Актуальные
npo6.ie\ibi
современной науки». 12-15 сентября 2005. - Самара, 2005. - С. 64-68.
11. Клягина, Ю. П. Исследование целлюлазной активности грибов - деструкторов
древесностружечных плит и влияние на нее производных фуллерена / Ю. П. Клягина. И.
В. Стручкова, В. Ф. Смирнов II Вестник ИНГУ. Серия Биология. - И. Новгород, 2005. - С.
156-161.
12. Клягина,
Ю.
П.
Биодеструкция
лигнина
из
древесностружечных
n.iHi
микроскопическими грибами / Ю. П. Клягина, В. Ф. Смирнов, И. В. Стручкова, А. Н.
Трофимов, А. Н. Кислицын II Химия растительного сырья (в печати).
СПИСОК ЧАСТО ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ДСП - древесностружечные плиты,
С Л из Ф Ф Д С П - сернокислотный лигнин из ДСП на основе фенолформальдегидных
смол,
СЛ из КДСП - сернокислотный лигнин из ДСП на основе карбамидных смол.
ДЛ из Ф Ф Д С П - диоксановый лигнин из ДСП на основе фенолформальдегидных смол,
ДЛ из КДСП - диоксановый лигнин из ДСП на основе карбамидных смол,
М Ф К - минимальная фунгицидная концентрация,
ОПС - обедненная питательная среда Чапека - Докса (1 г/л сахарозы),
БС - бессахарозная среда Чапека - Докса.
Подписано к печати 17.11.2005. Формат 60x84 1/16.
Бумага офсетная. Печать офсетная.
Усл. печ. л. 1. Заказ 1577. Тираж 100.
Типография Нижегородского госуниверситета
им. Н.И. Лобачевского. Лицензия № 18-0099
603000, Н. Новгород, ул. Б. Покровская, 37.
18248 8 7
РНБ Русский фонд
2006-4
23448
/**
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
0
Размер файла
862 Кб
Теги
bd000103014
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа