Клиническая апробация от ИнтерЛабСервис

Разработка и клиническая апробация тест-системы
для количественного определения РНК ВИЧ на
основе метода Real-Time ПЦР
Авторы: Богословская Е.В., Зайцев В.В., Цыганова Г.М., Башкирова Г.М., Шипулин Г.А.
Источник: ФГУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва, Россия
Введение
Принцип детекции накопления флуоресцентного сигнала в процессе ПЦР-амплификации
(Real-Time ПЦР) открыл широкие возможности перед молекулярной диагностикой.
Наибольшая ценность данного метода заключается в возможности количественных
измерений. Причем, в отличие от традиционных подходов (например, ПЦР с
гибридизационно-ферментной детекцией) метод Real-Time ПЦР позволяет проводить
количественные измерения в более широком линейном диапазоне за меньшее количество
времени.
С этим связано появление в последнее время большого количества новых тест-систем, в
основе которых лежит метод Real-Time ПЦР (или ПЦР с детекцией продуктов в режиме
реального времени). В частности, для диагностики ВИЧ-инфекции за последний год
появилось на Российском рынке сразу 3 коммерческие тест-системы для количественного
определения РНК ВИЧ. Одна из них была разработана на базе ЦНИИЭ – «АмплиСенс ВИЧ
Монитор-FRT». При создании тест-системы за основу была взята ранее разработанная и
широко апробированная тест-система «АмплиСенс ВИЧ Монитор» с детекцией продуктов
амплификации методом гибридизационно-ферментного анализа. В основе этих двух тестов
лежит принцип ПЦР-амплификации ВИЧ совместно с внутренним контрольным образцом
(ВКО). Причем, ВКО играет роль не только контроля качества проведенного анализа в
каждом образце, но и является количественным стандартом, относительно которого
рассчитывается концентрация РНК ВИЧ в образце. Это имеет большое значение при работе с
клиническим материалом, для которого возможна различная эффективность экстракции
нуклеиновых кислот.
Целью настоящей работы было проведение расширенных клинических испытаний тестсистемы «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT» в сравнении с двумя традиционными ПЦРтестами «АмплиСенс ВИЧ Монитор» и «CobasAmplicor HIV-1 Monitor v. 1.5».
Материалы и методы.
Пациенты. Было протестировано 126 образцов плазмы крови от ВИЧ-инфицированных
пациентов на разных стадиях заболевания из Москвы и Московской области.
Забор крови и подготовка ее к анализу. Кровь забирали у пациентов утром натощак в
пробирку с 3%-ным ЭДТА из расчета 1:20. Для получения плазмы цельную кровь
центрифугировали при 800-1600 g в течение 20 минут. Плазму хранили при температуре
минус 700С.
Определение концентрации РНК ВИЧ. Каждый образец был протестирован параллельно с
помощью 3 тест-систем согласно прилагаемым инструкциям:
Тест-система «Cobas AmplicorHIV-1 Monitorv. 1.5»: анализировали 200 мкл образца,
экстракцию РНК проводили вручную, ПЦР и детекцию продуктов амплификации проводили
с помощью автомата Cobas Amplicor. Линейный диапазон измерения: от 400 до 750000
копий/мл.
Тест-система «АмплиСенс ВИЧ Монитор»: анализировали 100 мкл образца, экстракцию РНК
проводили вручную, для амплификации кДНК использовали амплификатор GeneAmp 2400,
детекцию продуктов ПЦР проводили вручную методом гибридизационно-ферментного
анализа (ГИФА). Линейный диапазон измерения: от 500 до 800000 копий/мл.
Тест-система «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT»: анализировали 100 мкл образца, экстракцию
РНК проводили вручную, Real-Time ПЦР проводили с помощью прибора RotorGene 3000
(CorbettResearch, Австралия). Линейный диапазон измерения: от 500 до 5000000 копий/мл.
Анализ результатов.
Полученные результаты вирусной нагрузки перед анализом логарифмировали. Если разница
логарифмов по одной из тест-систем превышала 0,5, образцы тестировали повторно.
Дискордантными результаты считали, если разница логарифмов превышала 0,5 в двух
постановках. Рассчитывали коэффициент корреляции Спирмена.
Секвенирование ДНК ВИЧ. Секвенировали только те образцы, для которых были получены
дискордантные результаты. По возможности секвенировали 4 фрагмента генома ВИЧ для
определения генотипа: фрагмент гена p24, ген протеазы, фрагмент гена обратной
транскриптазы, фрагмент гена gp120. Фрагмент гена обратной транскриптазы секвенировали
с целью выяснения возможных причин получения дискордантных результатов, поскольку в
области этого гена располагаются места посадки праймеров и зондов в тест-системах
«АмплиСенс».
Результаты
Концентрация РНК в 93 образцах (из 126) находилась внутри линейного диапазона трех
анализируемых тест-систем. Отличие между результатами менее чем на 0,5 lg наблюдалось в
91% образцов. Результаты вирусной нагрузки, полученные с помощью 3 тест-систем, хорошо
коррелировали между собой. Наиболее высокий коэффициент корреляции (по Спирмену)
был получен между тест-системами «АмплиСенс»: 0,944.
27 образцов ниже линейного порога детекции было выявлено с помощью тест-системы
«Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5». Из 27 образцов было обнаружено 3 дискордантных
(табл. 1).
В силу низкой концентрации РНК секвенировать дискордантные образцы не представлялось
возможным. С целью выяснения причины получения более высоких значений вирусной
нагрузки в тест-системах «АмплиСенс» образцы были протестированы после
предварительного разведения негативной плазмой в 2 раза. Все 3 образца детектировались в
2-кратном разведении, что говорит о том, что значения, полученные в тест-системе Cobas
Amplicor, скорее всего, занижены, поскольку аналитическая чувствительность тестов
«АмплиСенс» составляет 300 копий/мл.
Таблица 1.
№ образца Cobas Amplicor АмплиСенс (ГИФА) АмплиСенс FRT
30
< 400
1000
720
52
< 400
1 280
1 540
177
< 400
570
770
Было выявлено 2 дискордантных образца, для которых были получены результаты ниже
линейного порога тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT» (табл. 2). В результате
секвенирования фрагмента гена обратной транскриптазы было выявлено 4 мисметча в месте
посадки зонда для образца № 82. Образец содержит ВИЧ субтипа А. Для образца № 164
(субтип G) было выявлено не более 2 мисметчей в местах посадки праймеров и зонда, что не
должно влиять на эффективность выявления ВИЧ. Для эффективного выявления образца №
82 был выбран специальный зонд, который был включен в состав ПЦР-смеси (табл. 5).
Таблица 2.
№ образца Cobas Amplicor АмплиСенс
(ГИФА)
АмплиСенс FRT
82
1 540
1 730
< 500
164
3 990
723
< 500
Было выявлено 4 образца, в которых результаты вирусной нагрузки превышали линейный
порог детекции тест-систем «CobasAmplicor HIV-1 Monitor v. 1.5» и «АмплиСенс ВИЧ
Монитор». При этом, с помощью тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT» удалось
получить количественные результаты для этих образцов.
Из 93 образцов, в которых концентрация РНК находилась внутри линейного диапазона 3
тест-систем, было выявлено 8 дискордантных образцов. В 2 образцах наблюдались более
низкие значения в тест-системе «Cobas AmplicorHIV-1 Monitorv. 1.5» по сравнению с
остальными тестами, в 2 образцах более низкие значения были получены в тест-системе
«АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT». В 4 образцах тест-системы «АмплиСенс» давали более
высокие значения вирусной нагрузки по сравнению с тест-системой «Cobas Amplicor HIV-1
Monitor v. 1.5» (табл. 3).
Таблица 3. Дискордантные результаты (lg копий РНК/мл).
№ образца Cobas Amplicor АмплиСенс (ГИФА) АмплиСенс FRT АмплиСенс FRT (М)
81
485
1 460
2 520
48
72 100
258 000
251 000
75
53 900
32 500
14 800
154
238 000
112 000
71 500
125
31 000
68 700
103 000
158
9 040
25 900
43 100
159
29 800
93 500
185 000
112
1 720
3 120
5 310
* Жирным шрифтом выделены результаты, максимально отличающиеся от остальных.
С целью выяснения причин завышения показателей вирусной нагрузки ВИЧ в тест-системах
«АмплиСенс» образцы были протестированы в разведениях, близких к детекционному
порогу тест-систем (табл. 4). Например, образец № 81 был протестирован в разведении 1:5.
Исходя из значения, полученного в тест-системе «Cobas Amplicor», концентрация РНК в 5кратном разведении должна быть менее 100 копий/мл, т.е. такой образец не должен быть
детектирован в тест-системе «АмплиСенс», поскольку ее чувствительность не превышает
300 копий/мл. Тем не менее, для разведенного образца был получен результат 510 копий/мл.
Таблица 4.
№ образца
Разведение
Расчетная концентрация РНК
(Cobas Amplicor)
АмплиСенс FRT (копии
РНК/мл)
81
1:5
97
510
112
1:10
172
1 070
125
1:100
310
1 060
159
1:100
298
2 060
158
1:50
180
+ (420)
С целью выяснения причины получения более низких результатов в тест-системе
«АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT» был секвенирован фрагмент гена обратной транскриптазы
для образцов №№ 75 и 154. Анализ нуклеотидных последовательностей показал, что оба
образца содержат ВИЧ субтипа В. Для образца № 154 не было выявлено достаточного
количества мисметчей в местах посадки праймеров и зонда, которое могло бы повлиять на
эффективность амплификации. Для образца № 75 было выявлено 2 мутации в месте посадки
одного из праймеров, причем одна из них располагается непосредственно на 3`конце. Для
эффективного выявления образца № 75 был выбран специальный праймер, который был
включен в состав ПЦР-смеси (табл. 5).
Таким образом, состав ПЦР-смеси претерпел ряд изменений: изменилось соотношение
праймеров в сторону повышения эффективности выявления ВИЧ субтипа G, были введены
дополнительные праймер и зонд. Образцы, для которых были получены «заниженные»
результаты в тест-системе «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT», были протестированы повторно
с использованием модифицированной ПЦР-смеси в сравнении с тест-системой
«CobasAmplicor». В результате повторного исследования были получены сопоставимые
результаты в двух тестах (табл. 5).
Таблица 5.
№ образца Cobas Amplicor АмплиСенс FRT
(М)
82
867
715
164
3530
917
75
53900
29300
154
238 000
80600
Обсуждение
Для всех 3 тест-систем, участвовавших в данном исследовании, были получены результаты,
которые хорошо коррелировали между собой. Наименьшее расхождение результатов было
получено для тест-систем «АмплиСенс» (в 1 образце из 93 (1,1%) отличие между
результатами составило 0,54 lg). Объясняется это тем фактом, что в обоих тестах
используются одни и те же праймеры. Также высокая сходимость результатов (2
дискордантных образца из 93 – 2,2%) была получена для тест-систем «АмплиСенс ВИЧ
Монитор» и «Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v. 1.5», что согласуется с более ранними
данными по сравнительным испытаниям этих тестов [3, 4].
Наибольшее количество дискордантных результатов было обнаружено между тест-системами
«АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT» и «Cobas AmplicorHIV-1 Monitorv. 1.5» (8 образцов из 93 –
8,6%). В 4 образцах из 8 наблюдалось завышение результатов в тест-системе «АмплиСенс»
по сравнению с результатами, полученными в тест-системе «Cobas Amplicor HIV-1 Monitor v.
1.5». При последующем тестировании этих образцов в разведениях, близких к
детекционному порогу тест-систем, оказалось, что результаты вовсе не завышены. Скорее,
наоборот, можно говорить о некотором занижении результатов с помощью тест-системы
«Cobas Amplicor». С другой стороны, максимальное отличие между результатами не
превышало 0,8 lg.
В 2 образцах из 8 дискордантных наблюдалось занижение результатов в тест-системе
«АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT». Кроме того, было выявлено 2 образца, в которых РНК не
детектировалась с помощью тест-системы «АмплиСенс ВИЧ Монитор-FRT», в то время как в
других тестах вирусная нагрузка была порядка 1000 копий/мл. Поскольку эти 4 пробы
представляли для нас наибольший интерес, для них были секвенированы фрагменты гена
обратной транскриптазы, в области которого располагаются места связывания праймеров и
зондов, используемых в тест-системах «АмплиСенс». Для 2 проб из 4 были определены
причины снижения эффективности амплификации: для пробы № 82 было обнаружено 4
мутации в месте посадки зонда, для пробы № 75 были выявлены мутации в одном из
праймеров, одна из которых располагается на 3`конце. Полученные данные были
использованы для дальнейшей оптимизации отечественных тестов, т.е. в ПЦР-смесь были
введены дополнительные праймеры и зонды. Для двух других проб (№№ 164, 154) не было
обнаружено достаточного количества мисметчей, которые бы вносили вклад в эффективность
амплификации. Тем не менее, изменение соотношения праймеров в ПЦР-смеси привело к
увеличению эффективности выявления этих двух образцов.
Заключение
В результате проведенного исследования были показана хорошая корреляция результатов
вирусной нагрузки, полученных с использованием 3 тест-систем. В подавляющем
большинстве случаев отличия между результатами не превышали 0,5 lg. Проведенное
исследование позволило провести оптимизацию отечественных тестов, в результате которой
повысилась эффективность выявления наиболее распространенных субтипов ВИЧ-1 в
России.