close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

519.Методическое пособие к лабораторным и практическим занятиям по физической и коллоидной химии и биохимии животных для специальностей 110401 Зоотехния 111201 Ветеринария очной формы обучения В. Н. Кузьмичева И. Ю. Венцова 200994 89

код для вставкиСкачать
Министерство сельского хозяйства
Российской Федерации
ФГОУ ВПО «Воронежский государственный аграрный
университет имени К.Д. Глинки»
Факультет технологии животноводства
и товароведения
Кафедра физиологии и биохимии сельскохозяйственных
животных
МЕТОДИЧЕСКОЕ ПОСОБИЕ
к лабораторным и практическим занятиям
по физической и коллоидной химии и биохимии
животных (для специальностей 110401 «Зоотехния»,
111201 «Ветеринария», очной формы обучения)
ВОРОНЕЖ
2009
Рассмотрено и рекомендовано к утверждению на заседании кафедры физиологии и биохимии с.-х. животных 24 ноября 2008 г. Протокол № 3.
Утвержден методической комиссией факультета технологии животноводства и товароведения 22 декабря 2008 г. Протокол № 5.
Составители: доценты, кандидаты биологических наук В.Н.
Кузьмичева и И.Ю. Венцова
Рецензенты: кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры кормления с.-х. животных А.В. Аристов,
кандидат ветеринарных наук, доцент кафедры терапии, радиобиологии и клинической диагностики И. А. Измайлова.
Введение
Лабораторно-практические занятия представляют собой одно
из важнейших звеньев учебно-педагогического процесса. На этих занятиях студенты получают навыки экспериментальной работы (обращение с химическими реактивами, посудой, приборами и оборудованием), приучаются самостоятельно вести биохимический анализ
и на основе полученных данных объяснять биологические явления
в организме животных с помощью химических реакций и процессов,
делать выводы с учетом поставленных задач и требований практики
животноводства.
Методическое пособие способствует более глубокому усвоению и закреплению студентами теоретических положений
курса физколлоидной химии и биохимии.
Пособие составлено в соответствии с программой курса
«Биологическая и физколлоидная химия сельскохозяйственных
животных» для студентов факультета ветеринарной медицины и
технологии животноводства и товароведения.
Оформление работы:
1. Дата.
2. Тема, номер и название работы.
3. Введение, где необходимо очень кратко обосновать теоретически изучаемый вопрос. Для этого можно использовать материал из лекций, учебников и учебных пособий.
4. Принцип (или сущность) метода. Надо четко уяснить,
на чем основано определение того или иного вещества, показателя. Например, определение количества белка в сыворотке крови с помощью рефрактометра основано на нахождении коэффициента ее светопреломления и пересчета его через формулу
в количество белка.
5. Технология исследования (анализа): очередность
основных операций. Сюда могут быть включены схема, таблица,
рисунок и др.
6. Результаты опыта (анализа): материал наблюдений (например, отмечаем, что выпал осадок, изменился цвет и т. д.),
количество израсходованных (например, на титрование, коагуля1
цию и др.) реактивов, расчеты.
7. Выводы (в конце занятия или дома) обязательно! Они
являются ответом на вопросы задания к работе. Для того, чтобы
сделать выводы, анализируют полученные из опыта данные
с привлечением необходимых сведений из учебников, учебных
пособий, лекций, методических указаний, монографий, журналов и других источников. При этом теоретические положения
выводов должны быть нацелены на разрешение тех или иных
(связанных с изучаемой темой) практических задач животноводства.
Схема написания вывода и разрешения связанных с ним вопросов. Вывод - в сыворотке крови коров установлена гипопротеинемия, т. е. пониженное содержание белка. Предполагаемая
причина - дефицит белка в рационе. Она в известной мере согласуется с низкой молочной продуктивностью животных и плохой
упитанностью.
Действие специалиста: исследовать корма, входящие в рацион, на содержание переваримого белка и при подтверждении
причины довести протеиновое питание коров до нормы. Для этого добавить им в рацион богатые белком растительные корма
(люцерна, горох и др.) или азотистые кормовые добавки (мочевина, диаммонийфосфат и др.).
8. Задание на дом: подготовка отчета о проделанной работе
согласно заданию к ней.
Примечание: по оформлению каждой лабораторной работы студент отчитывается и получает оценку.
ОРГАНИЗАЦИЯ УЧЕБНОГО ПРОЦЕССА
ПО БИОХИМИИ
Каждый студент в биохимической лаборатории занимает
постоянное место.
Для самостоятельного изучения дисциплины на доске объявлений кафедры вывешен план лекций и практикума, указаны
учебники, учебные пособия, дополнительная литература. Используются также материал лекций и лабораторно-практических
занятий, программа курса.
2
По вопросам задания каждого пройденного занятия студенты отчитываются перед началом следующей лабораторной
работы.
Пропущенные или незачтенные лабораторные занятия
должны быть сразу же отработаны, и по ним сделан отчет.
По каждой пропущенной лекции студенты пишут реферат, представляют его преподавателю и устно отчитываются
о его содержании.
К семинарам, коллоквиумам, экзамену допускаются студенты при наличии у них конспекта лекций и оформленной тетради по практикуму.
При подведении итогов изучения дисциплины учитываются
оценки, полученные за оформление работ, отчеты по ним, семинарам и коллоквиумам. Студенты, имеющие средний балл 4,5
и выше, освобождаются от экзамена, и им автоматически ставится в зачетке «отлично». Для имеющих средний балл 3,5 - 4,4 по
их заявлению возможно собеседование на предмет получения
оценки «хорошо» или «отлично». Остальные сдают экзамен.
ПРАВИЛА РАБОТЫ И ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ
В ЛАБОРАТОРИИ БИОХИМИИ
1. На все время занятий каждый студент имеет выбранное
им рабочее место, которое содержит в чистоте и порядке.
2. Перед выполнением каждой работы следует ознакомиться с ее методикой, обратить внимание на пояснения и замечания к ней преподавателя.
3. Выполнение работы возможно только с разрешения
преподавателя.
4. В лаборатории ЗАПРЕЩЕНО:
работать без халата;
трогать реактивы, приборы, оборудование и другое, не используемое в работе;
пробовать на вкус реактивы или продукты реакции;
принимать пищу и пить воду;
бросать в раковину твердые материалы (бумагу, стекла, песок и др.);
3
нагревать на огне или вблизи включенных электроприборов легковоспламеняющиеся вещества (спирты, ацетон, хлороформ, эфир и др.).
5. Во избежание ожогов при нагревания жидкостей на спиртовке горлышко пробирки направлять на стену, но не на соседей или дверь - в нее могут внезапно войти. Нельзя при этом
заглядывать в горлышко.
6. Запах летучих веществ следует определять осторожно,
направляя его пары легким движением ладони на себя и делая
поверхностный (но не глубокий!) вдох.
7. В случае попадания реактивов в ротовую полость, на
руки и т. д. надо промыть указанные места водой.
При ожогах кислотой пораженные места сразу же хорошо
промывают водой, затем 3% раствором гидрокарбоната натрия
(питьевая сода) и опять водой.
При ожогах щелочами пораженные места промывают
обильно водой, затем 1% раствором уксусной кислоты и снова
водой.
При серьезных травмах надо сразу же обратиться в поликлинику.
8. При обнаружении неисправности отключить электросеть,
водопровод, приборы и оборудование и сообщить об этом преподавателю и лаборанту.
Последнее необходимо сделать также при возгорании.
9. По окончании выполнения лабораторной работы надо
вымыть посуду, руки, привести свое рабочее место в порядок
(протереть стол, поставить склянки с реактивами, пробирки,
штативы, стул на свои места).
10. Перед уходом из лаборатории каждый студент должен
сдать свое рабочее место дежурному по группе, назначаемому
на время занятий, а последний сдает лабораторию преподавателю или лаборанту.
Примечание: после ознакомления с настоящими правилами и инструктажа по ним преподавателем каждый студент
обязан расписаться в журнале по технике безопасности.
4
ЧАСТЬ I
Основы физической и коллоидной химии
ТЕМА 1. ОСМОТИЧЕСКИЕ ЯВЛЕНИЯ В ЖИВЫХ
СИСТЕМАХ
Работа 1. Изучение осмоса и определение осмотического
давления (ОД) с помощью естественной
полупроницаемой мембраны (ППМ)
Осмотические явления играют важную роль в жизни животных. Многие процессы обмена веществ (всасывание пищи, секреция и др.) связаны с различной проницаемостью тканей для воды и растворенных веществ.
Осмотическое давление выявляется при отделении раствора
от чистого растворителя полупроницаемой перегородкой (мембраной или ППМ), пропускающей молекулы растворителя и не
пропускающей без затраты энергии частицы растворенного вещества.
В этом случае наблюдается явление односторонней диффузии или осмоса - молекулы растворителя проникают через ППМ
в раствор, объем которого при этом увеличивается, а концентрация уменьшается.
Процесс осмоса происходит также при разделении ППМ
двух растворов неодинаковой концентрации. Растворитель при
этом перемещается из раствора с меньшей концентрацией в раствор с большей концентрацией.
В обоих случаях возникает давление частиц на ППМ, которое называется осмотическим.
Величина осмотического давления зависит от числа частиц растворенного вещества и не зависит от его природы.
Вант-Гофф выявил глубокое сходство между состоянием
вещества в растворе и газовым состоянием. Он установил, что
осмотическое давление вещества в разбавленном растворе пропорционально молярной концентрации и температуре:
P = CRT,
где Р - осмотическое давление;
С - молярная концентрация раствора;
5
R - коэффициент пропорциональности, численно равный газовой постоянной = 0,082 л-атм /градус;
Т - абсолютная температура.
Осмотическое давление одномолярного раствора при 0°С
(Т = 273) равно 22,4 атм.
Р = CRT = 1 • 0,082 • 273 = 22,4 атм.
Ход опыта
В сосуд, состоящий из стеклянного
флакона с натянутой на его обрезанное дно
ППМ 3 (стенка мочевого пузыря) и вставленной в горлышко измерительной трубочкой 4, наливают до верхнего уровня пробки
исследуемый подкрашенный раствор 2, например, сахарозы. Этот сосуд дном с ППМ
опускают в чашку с дистиллированной водой (растворитель - 1).
В силу весьма значительной разницы
в ОД молекулы растворителя (вода) из
внешнего сосуда через ППМ будут свободно и интенсивно проникать в раствор.
Это есть эндоосмос, вследствие которого
происходит разбавление концентрации
и уменьшение ОД (согласно первому
закону) раствора сахарозы, но увеличение его объема. Последнее
видно по поднятию раствора по трубке. Подъем будет наблюдаться до тех пор, пока не установится динамическое равновесие
между количеством молекул растворителя, проникающих через
ППМ в раствор и выходящих из него в обратном направлении. При
этом гидростатическое давление, установившееся в результате
осмоса, является мерой ОД. В момент равновесия ОД равно гидростатическому давлению столба раствора, которое вычисляют
по формуле:
P = ρ · h,
3
где ρ - плотность раствора, г/см ;
h - высота поднятия раствора по трубочке осмометра, см.
Рис. 1. Схема осмометра:
1 - растворитель;
2 - раствор;
3 - полупроницаемая мембрана;
4 - стеклянная трубочка.
6
Исходя из указанного, величина ОД по этому методу выражается в г/см2. Более точно ОД можно намерить в мм рт. столба, но
для этого надо вместо трубочки к сосуду присоединить ртутный
манометр.
Задание:
1. Ознакомиться с устройством и принципом работы осмометра.
2. Зарисовать схему осмометра.
3. Провести опыт и объяснить происходящее явление.
4. Определить величину ОД исследуемого раствора.
Работа 2. Определение ОД раствора криоскопическим
(косвенным) методом
Растворы замерзают при более низкой температуре, чем чистый растворитель. Понижение температуры замерзания раствора
зависит от концентрации раствора и от природы растворителя
и не зависит от природы растворенного вещества. Для любых растворов неэлектролитов одного и того же растворителя, содержащих одну грамм-молекулу растворенного вещества на 1000 г растворителя, понижение температуры замерзания одинаково. Эта величина называется криоскопической константой растворителя.
Криоскопическая константа воды = 1,86°.
Сущность метода заключается в определении депрессии
(Dt°C) исследуемого раствора и пересчете величины ее через формулу ( P = Dt °C ´ 22,4 атм ) показатель ОД в атм. Метод более точен, чем
1,86°C
предыдущий.
Ход опыта
Используют криоскоп Бекмана (рис. 2).
Вначале измеряют температуру замерзания исследуемого
раствора (t 1 ). Его наливают в пробирку 3, закрывают ее пробкой, в которую вставлены приготовленный согласно инструкции
термометр Бекмана 1 и проволочная мешалка. Пробирку 3 с помощью пробки укрепляет в более широкой пробирке 4 воздушная
рубашка, служит для более точного определения t1. Пробирку 4
помещают в сосуд 5 с охлаждающей (криогенной) смесью (состоит
7
изо льда и соли) и мешалкой 6.
Отсчет на термометре производят так.
После опускания ртутный столбик поднимается на несколько делений и вновь
падает. Вот эта точка его подъема перед вторым падением и есть истинная t1.
После этого, используя другую пробирку 3,
точно так же определяют t2 растворителя.
Затем находят депрессию раствора (Dt°C =
t1 - t2) и рассчитывают величину его ОД
по формуле:
Dt °C ´ 22, 4 атм
P=
,
1,86°C
где 1,86°С и 22,4 атм. есть величины, означающие, что 1 г-М любого вещества,
растворенного в 1 л воды, понижает ее
температуру замерзания на 1,86°С, а при
0°С производит ОД в 22,4 атм.
Задание:
1. Ознакомиться с устройством и
принципом работы криоскопа.
2. Зарисовать схему прибора.
3. Определить ОД крови и мочи лошади, зная, что в норме их
депрессия равна соответственно 0,58°C и 1,12 - 2,3°С.
4. Вычислить ОД 40% раствора глюкозы, используемого для
внутривенного введения млекопитающим. Каким этот раствор по
величине ОД является в отношении к крови животных?
5. Определить понижение температуры замерзания крови, если
ОД при 37°С равно 7,63 атм.
Рис. 2. Криоскоп Бекмана
Работа 3. Изучение механизма действия растворов
различного ОД на клетки крови
В зависимости от величины ОД растворы по отношению
к ОД бывают изо-, гипо- и гипертоническими. В изотоническом
растворе, имеющем одинаковое с клетками ОД, клетки остаются
без изменений, так как происходит равномерный двусторонний
8
осмос. В гипотоническом растворе (имеет меньшее значение ОД,
чем в клетке) вследствие всасывания растворителя (эндосмос)
клетки увеличиваются в объеме, что может привести к разрыву
их оболочек и выходу содержимого в раствор. Это явление называется лизис, т.е. распад. В гипертонических растворах (имеют
большее значение ОД, чем в клетке) происходит экзосмос, т.е.
выход растворителя (вода) из клеток и их сморщивание (плазмолиз).
Ход опыта
В три пробирки наливают по 1 мл раствора NaCl разной концентрации: в 1-ю – 0,9%, во 2-ю – 4%, в 3-ю – 0,2%.
В каждую пробирку вносят по 1 капле крови, встряхивают
и наблюдают, где произошел гемолиз, т.е. разрушение оболочки
эритроцитов, выход гемоглобина в раствор и придание ему лаковой
окраски.
Затем производят микроскопию клеток крови, для чего берут
предметное стекло, которое используют для приготовления 4-х мазков. 1-й мазок делают из цельной крови и используют его как контроль. Для этого кончиком стеклянной палочки берут из пробирки
каплю крови, наносят ее ровным слоем на край предметного стекла
и прикрывают покровным стеклом. Палочку вытирают фильтровальной бумагой или ватой.
Таким же образом последовательно делают мазки из пробирок
опыта – 1, 2, 3. Палочку после приготовления очередного мазка вытирают.
Затем предметное стекло с 4 мазками крови помещают на столик микроскопа и рассматривают клетки по порядку (начиная с мазка цельной крови) при увеличении 400-600 раз, обращая внимание на
их количество в поле зрения, форму, величину и окраску. Эти показатели клеток (2, 3 и 4-й мазки) сравнивают с аналогичными 1-го
мазка (контроль – цельная кровь) и отмечают замеченные сходства
и различия в протоколе.
Задание:
1. Отметить номер пробирки, где произошел гемолиз, и записать его признаки.
2. Зарисовать клетки крови, указав под рисунком название дей9
ствующего раствора, его концентрацию и величину ОД, а также (в
сравнении с контролем) количество клеток в поле зрения, их форму
и окраску.
3. Рассчитать величину ОД 0,9%, 4%, и 0,2% растворов NaCl
(считая, что NaCl в них полностью диссоциирует) и назвать эти растворы по отношению к крови, учитывая ОД последней.
4. Объяснить обнаруженные изменения клеток с позиций ОД.
5. Как объяснить единичные случаи обнаружения клеток в гипотоническом растворе и наличия клеток, сохранивших нормальную
форму, в гипертоническом растворе?
Вопросы для самоподготовки по теме 1
1. Понятие ОД, его законы (зависимость от концентрации
и температуры раствора, природы растворенных веществ и чему
равно ОД смешанного раствора) и следствия из них.
2. Осмос, экз- и эндосмос, ППМ – понятия, биороль.
3. Изо-, гипо-, гипертонические и физиологические растворы
(понятие, механизм действия на клетки, использование в практике
животноводства).
4. Тургор, гемолиз, плазмолиз - понятие, причины, биологическая роль и прикладное значение. Примеры.
5. Прямой и косвенный методы определения ОД - принцип,
технология выполнения, единицы измерения, использование
в практике.
6. В чем сходство и различие изотонического и физиологического растворов?
7. Какой раствор и почему является более опасным для клеток - гипо- или гипертонический?
8. Можно ли вывести клетку из состояния плазмолиза?
Если да, то как?
9. ОД клеток крови, органов, тканей, биологических жидкостей - величина, значение, поддержание постоянства.
10. Биологическая роль и регуляция ОД в организме.
11. Для чего и где в практике животноводства и ветеринарии применяют осмотически активные растворы?
10
ТЕМА 2. РЕАКЦИЯ СРЕДЫ
Все физиологические процессы в организме животного
протекают в водной среде при определенной концентрации водородных ионов. Вода, являясь слабым электролитом, в незначительной степени диссоциирует на ионы:
Н+.
Н2О ⇄ Н+ + ОНН+ + H2О→ Н3О+
ионы гидроксония
Для простоты изложения ионы гидроксония обозначаются
Поскольку этот процесс является обратимым, к нему можно
применить закон действия масс и найти выражение константы диссоциации воды:
K=
[H ][OH ] ,
+
-
[H 2 O]
где К - константа диссоциации воды, равная 1,8 · 10-16 при 22°С;
[Н2О] - концентрация недиссоциированных молекул воды,
которую вследствие ничтожно малой диссоциации воды можно считать постоянной и равной общему числу грамм-молекул
воды в литре, т.е. 1000 = 55,56 ;
+
-
18
[H ] и [ОН ] - концентрация водородных и гидроксильных
ионов в грамм-ионах на литр раствора.
Если перенести постоянные величины К и [Н2О] по одну
сторону равенства, то получается:
[Н + ] [ОН- ] = К[Н20],
где произведение двух постоянных величин К и [Н2О] также
представляет собой постоянную величину, которую обозначают
Кв (константа воды):
[Н+] [ОН-] = Кв.
Таким образом, произведение концентрации водородных
и гидроксильных ионов при данной температуре есть величина
постоянная. Она называется ионным произведением воды. При
22°С ионное произведение воды Кв равно:
11
K В = K [H 2O ]= 1,8 · 10 -16 · 55,56 = 10-14
В дистиллированной воде концентрации водородных
и гидроксильных ионов равны между собой:
[Н + ] = [ОН - ] = 10-14 = 10-7 моль/л.
Величина ионного произведения постоянна не только для
воды, но и для любых разбавленных водных растворов, в том
числе для растворов кислот и щелочей. Поэтому, зная концентрацию ионов Н+, легко найти концентрацию ОН-, и наоборот.
Например:
1. Если
C Н + = 10
-6
г-ион/л, то
КВ
10 -14
СОН - = + = - 6 = 10- 8
Н
10
[ ]
моль/л
2. Если CОН - = 10-11 г-ион/л, то Сн+ = 10-3 моль/л
Основываясь на постоянстве ионного произведения воды,
реакцию среды можно выразить только через концентрацию водородных ионов. Еще удобнее характеризовать реакцию среды
при помощи водородного показателя рН.
Водородный показатель - это отрицательный десятичный
логарифм концентрации водородных ионов:
рН = - lgC H +.
Если известна концентрация водородных ионов (СН+) раствора, легко вычислить рН его и, наоборот, зная рН, можно рассчитать СН+.
Пример 1. Найти рН раствора, концентрация водородных ионов которого СН+ = 0,001 = 10-3 г-ион/л;
рН; = - lgC H + = - (-3) =3.
Пример 2. рН раствора = 5; найти СН +.
СН+ = 10-5 г-ион/л; (0,00001 г-ион/л).
Соотношения между СН+ и рН можно представить следующей схемой:
С Н+
рН
Реакция
среды
С Н+
рН
Реакция
среды
1
0
10-1
1
10-2
2
10-3
3
Сильнокислая
10-8
8
10-9
9
10-10
10
10-4
4
10-5
5
10-6
6
Слабокислая
10-11
11
Слабощелочная
10-12
12
10-13
13
Сильнощелочная
12
10-14
14
10-7
7
Нейтральная
Таким образом, в нейтральной среде СН+ = СОН- ; рН = 7;
в кислой среде СН + > С он-; рН < 7;
в щелочной среде СН+ < СОН-; рН > 7.
Для определения реакции среды в растворах и биологическом материале используют 2 метода - колориметрический
и электрометрический.
Колориметрический метод основан на сравнении интенсивности окраски исследуемого раствора со стандартом (эталон), величина рН которого известна. Окрашивают растворы
с помощью индикаторов - слабые органические кислоты (реже слабые основания), ионы которых имеют одну окраску, а недиссоциированные молекулы - другую. Диссоциация же индикаторов зависит от реакции среды. Поэтому по их окраске
можно определить рН среды.
В анализах используют бумажки, пропитанные индикаторами, и растворы индикаторов.
Этим методом определяют рН бесцветных, слабомутных
и слабоокрашенных растворов.
Работа 4. Определение реакции среды с помощью
лакмусовой бумаги
Лакмусовую бумагу, пропитанную лакмусом (индикатор),
имеющим в кислой среде красный, в нейтральной - фиолетовый
и в щелочной - синий цвет, опустить в исследуемый раствор, затем
вынуть и по изменению цвета определить реакцию среды без выражения ее величины рН, а только какая она - кислая, щелочная,
нейтральная.
Задание: выполнить опыт и сделать вывод о реакции среды
раствора.
Работа 5. Определение реакции среды с помощью
универсальной индикаторной бумаги
Универсальную индикаторную бумажку (пропитана универсальным индикатором) опустить в исследуемый раствор, затем вынуть, сравнить с цветной шкалой для этого индикатора. И одна из
ее окрашенных полосок, которая совпадает по интенсивности с
13
окраской использованной универсальной индикаторной бумажки,
обозначает величину рН раствора. Если универсальная бумажка
по цвету располагается между двумя полосками шкалы, то за величину рН исследуемого раствора взять среднее из суммы значений рН
этих полосок.
Точность метода до 0,5.
Задание: выполнить опыт, определить величину рН сыворотки крови животного и сделать вывод о реакции среды.
Работа 6. Определение реакции среды бесцветных
растворов с помощью прибора Михаэлиса
В прибор Михаэлиса входят:
1.
Универсальный индикатор, имеющий область перехода
рН от 4 до 8.
2. Четыре основных индикатора:
альфа-динитрофенол, имеющий зону перехода от 2,8 до 4,4
гамма-динитрофенол, имеющий зону перехода от 4,0 до 5,4;
пара-нитрофенол, имеющий зону перехода от 5,4 до 7,0;
мета-нитрофенол, имеющий зону перехода от 6,8 до 8,4.
3. Четыре ряда растворов эталонов в ампулах, на которых
указана величина рН. Каждому из 4 основных индикаторов соответствует свой цветной ряд эталонов.
4. Фарфоровая чашка.
5. Пипетка для взятия основных индикаторов.
6. Цветная таблица для универсального индикатора.
7. Компаратор Уолполя с шестью пробирками.
Ход опыта
Исследование ведется в два этапа. Целью 1-го этапа является
выбор основного индикатора.
В фарфоровую чашку налить 3 мл исследуемого бесцветного
раствора и 3 капли универсального индикатора. Появившуюся окраску раствора сравнить с цветной шкалой и найти приблизительное
значение рН этого раствора. По этой величине рН, используя данные о зонах перехода индикаторов (см. пункт 2 выше), выбрать
основной - индикатор, в зоне которого находится рН данного
14
раствора. Этот индикатор используют во 2-м этапе опыта.
Цель 2-го этапа - определить рН раствора с точностью до
0,1. Для этого в пробирку компаратора Уолполя налить из
флакона 3 мл того же исследуемого раствора и добавить 0,5 мл
основного индикатора. Пробирку поставить в среднее гнездо
компаратора и подобрать для нее из одноименного с выбранным в 1-м этапе основным индикатором ряда эталонных растворов одинаковый по окраске эталон. Он и обозначает величину
рН раствора. Если цвет исследуемого раствора слабее этого эталона, но темнее другого (соседнего), то в расчет надо взять
среднее значение рН из их суммы.
Задание: определить рН бесцветного раствора аминокислоты универсальным и основным индикаторами и сделать вывод
о его реакции.
Работа 7. Определение рН слабоокрашенных и слабомутных
растворов с помощью прибора Михаэлиса
Ход опыта
Взять слабоокрашенный или слабомутный раствор и выполнить с ним все необходимое согласно 1-му этапу работы 7.
При выполнении 2-го этапа для устранения искажающего влияния окраски или мутности в гнезда компаратора ставят пробирки
согласно схеме (рис. 3.). Остальное, в том числе нахождение величины рН, делается, как и в работе 7.
Рис.3.
15
Задание: определить рН слабоокрашенного или слабомутного раствора (вытяжка из силоса или моча) с универсальным
и основным индикаторами и сделать вывод о его реакции.
Работа 8. Определение рН растворов и биологического
материала электрометрическим (потенциометрическим)
методом
Метод основан на измерении э.д.с. растворов и переводе
ее значения с помощью рН-метра (потенциометр) в величину
рН. Этим методом можно определить рН любых растворов
(сильноокрашенные, сильномутные, вязкие - кровь, молоко, моча, коллоиды), а также гомогенатов растительных и животных
тканей при температуре от 0°С до + 100°С.
Используют различные рН-метры (ЛПУ-01, рН-121, рН-340
и др.). Точность метода до 0,01 и выше (зависит от цены деления).
Ход опыта
Включить рН-метр ЛПУ-01 в сеть и прогреть 30 мин. В стаканчик налить исследуемый раствор (в чашку положить гомогенат) и, погрузив электроды, поставить на столик датчика. Тумблер «виды работ» поставить в положение «рН», а переключатель
«пределы измерений» - в положение «-2±14». По показанию термометра установить тумблер «температура» соответственно температуре исследуемого раствора. Записать показания стрелки
прибора по нижней шкале рН (-2±14), которая считается шкалой
грубой настройки. Затем тумблер «пределы измерений» поставить в положение, соответствующее значению рН, найденному
по нижней шкале. После установки неподвижно стрелки прибора
записать величину рН по верхней шкале (точная настройка),
прибавив ее показания, например, 1,15 - к первой цифре найденного «предела измерений», например «6», если был выбран
«предел измерений» 6±10. Следовательно, 6 + 1,15 = 7,15 - это
и есть рН исследуемого раствора.
Задание:
1. Определить рН крови, желчи, молока, мочи, мышц
и яйца и сделать вывод о реакции среды объекта.
16
2. Сравнить найденные в опыте значения рН для крови,
желчи, молока, мышц и яйца с их показателями для здоровых
животных.
Вопросы для самоподготовки по теме 2
1. Понятие о сН и рН, единицы измерения.
2. Ионное произведение воды, константа диссоциации. Вывод формул. Взаимосвязь сН и сОН, рН и рОН.
3. Характеристика реакции среды но величине сН и рН:
кислая, нейтральная, щелочная.
4. Колориметрический метод определения рН. Его сущность, разновидности, точность; применение в животноводстве.
Прибор Михаэлиса.
5. Электрометрический метод определения рН - сущность,
точность, применяемый прибор, использование в практике.
6. Величина рН тканей и жидкостей организма животных.
7. Биологическая роль и регуляция реакции среды в организме животных.
ТЕМА 3. БУФЕРНЫЕ СИСТЕМЫ
В процессе обмена веществ в животном организме непрерывно образуется большое количество различных кислых и щелочных продуктов, однако значение рН крови, лимфы, тканевой
жидкости животных характеризуется значительной устойчивостью и постоянством. Так, например, рН крови различных млекопитающих и птиц - 7,2 - 7,5; рН крови лягушки - 7,8 и т. д.
В регуляции реакции среды участвует весь организм животного в целом. Большая роль в этом процессе принадлежит
так называемым буферным системам. Буферные системы представляют собой в большинстве случаев смесь слабой кислоты и
ее соли, образованной сильным основанием, или смесь слабого
основания и его соли, образованной сильной кислотой.
Буферные системы способны противодействовать изменению рН раствора при добавлении кислоты или щелочи, а также при разбавлении раствора.
Механизм действия буферной системы рассмотрим на примере ацетатной буферной смеси, состоящей из уксусной кислоты
СН3СООН и уксуснокислого натрия СH3COONa.
17
Если к такой системе добавить немного сильной кислоты
НСl, то анионы СН3СОО- будут связывать водородные ионы
в слабодиссоциирующие молекулы уксусной кислоты:
СНзСООNа + НСl = СНзСООН + NaCl,
что можно представить в ионном виде:
СН3СОО- + Н+ = СНзСООH.
Поэтому концентрация водородных ионов (p H) в буферном растворе остается почти неизменной.
При добавлении небольшого количества щелочи (например,
NaOH) к той же буферной системе происходит реакция нейтрализации между уксусной кислотой и NaOH:
СНзСООН + NaOH = CH3COONa + Н2О;
или в ионном виде:
H+ + OH- = H2O
Казалось бы, что в результате удаления из раствора ионов
+
Н кислотность его должна уменьшиться, но этого практически
не происходит, так как уменьшение концентрации водородных
ионов в растворе вызывает сдвиг равновесия реакции диссоциации слабой уксусной кислоты в сторону распада ее на ионы:
СНзСООН ⇄ СН3СОО- + Н+
В результате этого количество водородных ионов вновь пополняется, и значение рН раствора заметно не изменяется.
Таким образом, при добавлении кислоты к буферному раствору концентрация водородных ионов (рН) будет сохраняться
в нем почти неизменной до тех пор, пока не окажется связанной
вся соль; при добавлении щелочи рН не изменится до тех пор,
пока не будет израсходована вся кислота буферной смеси. После этого буферное действие прекращается, и при дальнейшем
прибавлении кислоты или щелочи наступает резкое изменение
рН раствора. Чем выше концентрация кислоты и соли в буферном растворе, тем дольше он противостоит изменению рН,
тем больше его буферная емкость. (Буферная емкость измеряется количеством грамм-эквивалентов кислоты или щелочи, которое необходимо добавить к 1 л буферного раствора, чтобы изменить его рН на единицу.)
При разбавлении раствора водой соотношение компонентов не
18
изменяется и рН буферного раствора остается постоянным.
Работа 9. Приготовление ацетатных буферных растворов
и установление зависимости величины их рН
от соотношения компонентов
Налить в 3 пробирки соответственно 0,1н растворы
СН3СООН и CH3COONa в следующих количествах: в 1-ю - 0,2
и 9,8 мл, во 2-ю - 5 и 5 мл, в 3-ю - 9,8 и 0,2 мл.
Добавить в каждую пробирку по 2 капли универсального
индикатора, растворы взболтать и, сравнив их окраску (смотреть
через горлышко пробирки, но не сбоку ее!) для универсального
индикатора, найти значения рН полученных буферных смесей.
Растворы не выливают, а используют в работах 10, 11, 12, 13.
Задание:
1. Приготовить 3 ацетатных буферных раствора, определить величину их рН и сделать вывод о их реакции.
2. Рассчитать соотношение между компонентами в каждом
из этих растворов.
3. На основании 1 и 2-го пунктов сделать вывод: зависит ли
величина рН буферных растворов от соотношения между их
компонентами.
4. При установлении зависимости величины рН от соотношения между их компонентами сделать вывод о практическом
применении этого свойства.
Работа 10. Изучение действия на буферный раствор
небольшого количества кислоты
В буферный раствор 1 из работы 10 прилить 3 капли
0,1н раствора НСl, взболтать и определить его рН с помощью
цветной таблицы.
Задание:
1. Выполнить опыт, определить рН буферного раствора после добавления в него кислоты.
2. Написать реакцию взаимодействия ацетатного буфера
с небольшим количеством НС1.
3. На основании опыта сделать вывод, изменяет ли величи19
ну рН буферного раствора действие на него небольшого количества кислоты.
4. Указать, какое значение имеет этот вывод для практики животноводства.
Работа 11. Изучение действия на буферный раствор
большого количества кислоты
В тот же буферный раствор 1 из работы 9 прилить еще 5 мл
0,1н НС1, перемешать и определить рН.
Задание:
1. Выполнить опыт, определить величину рН буферного раствора после добавления в него кислоты.
2. Сделать заключение об изменении его величины рН,
сравнив найденную величину рН с ее первоначальным значением
(см. работу 9, пробирка 1).
3. Написать реакцию взаимодействия буферного раствора
с большим количеством НСl.
4. Как следует учитывать вывод пункта 2 задания в практике
животноводства?
Работа 12. Изучение действия небольшого количества
щелочи на буферный раствор
В буферный раствор 3 из работы 9 добавить 3 капли 0,1н
раствора NaOH, взболтать и определить рН смеси.
Задание: 1. Выполнить опыт и определить рН буферного раствора после добавления в него щелочи.
2. Сделать вывод об изменении его величины рН, сравнив
найденную величину рН с ее первоначальным значением (см. работу 9, пробирка 3).
3. Указать значение этого вывода для практики животноводства и ветеринарии.
4. Написать реакцию взаимодействия буферного раствора
с небольшим количеством щелочи.
Работа 13. Изучение действия на буферный раствор
большого количества щелочи
20
В тот же буферный раствор 3 из работы 9 прилить еще 5 мл
0,1н раствора NaOH, взболтать и найти рН смеси.
Задание:
1. Выполнить опыт, определить рН буферного раствора после
добавления в него большого количества щелочи.
2. Сделать вывод об изменении его рН, сравнить найденную
и первоначальную величину рН буферного раствора.
3. Указать прикладное значение этого вывода.
4. Написать реакцию взаимодействия буферного раствора
с большим количеством кислоты.
Работа 14. Влияние разбавления водой буферного
раствора на величину его рН
Приготовить 3 пробирки с ацетатным буферным раствором,
налить в каждую по 1 мл 0,1н раствора СН3СООН и CH3COONa.
1-й раствор оставить неразбавленным (контроль), 2-й - разбавить
в 2 раза, для чего прилить к нему 2 мл воды, а 3-й разбавить
в 3 раза, добавив в него 4 мл воды.
Затем в 1-ю пробирку внести 2 капли универсального индикатора, во 2-ю - 4, в 3-ю - 6. Растворы взболтать и, сравнивая их
окраску (рассматривать пробирки сбоку!) с цветной шкалой, определить их рН.
Задание:
1. Выполнить опыт, определить величину рН буферных растворов и указать их реакцию.
2. Сделать вывод о влиянии разбавления буферных растворов водой на величину их рН (если она не изменяется, то почему?).
3. Какое значение имеет это свойство буферных растворов
в практике?
Работа 15. Определение резервной щелочности крови
по Неводову
Щелочной резерв крови - это ее способность нейтрализовать
значительное количество поступающей кислоты при сохранении
рН на постоянном уровне.
21
Щелочной резерв определяют по количеству мг кислоты, связанной 100 мл крови, до момента резкого сдвига ее рН.
Ход опыта
В две колбочки налить по 10 мл 0,01н раствора НС1.
В 1-ю колбочку (опыт) добавить 0,2 мл крови. Во 2-ю колбочку
(контроль) прилить 2 капли 0,1% спиртового раствора фенолфталеина, оттитровать из микробюретки 0,1 н раствором NaOH до появления розового окрашивания и записать количество мл израсходованной щелочи. Содержимое колбочки 1 оттитровать 0,1н
раствором NaOH до появления помутнения, т. е. одного из признаков коагуляции белков крови.
Расчет
Было взято 10 мл 0,01н раствора НС1, что равно 1 мл 0,1н
раствора НС1. На титрование колбочки 1, например, пошло 0,78
мл 0,1 н раствора NaOH. Следовательно, кровь связала 1 - 0,78 =
0,22 мл 0,1 н раствора НС1. Отсюда щелочной резерв крови, выраженный мг NaOH на 100 мл крови, равен: .
4 · (0,22 · 100):0,2 = 440 мг%.
Задание:
1. Выполнить опыт и определить щелочной резерв крови животной (корова, лошадь, свинья и др.).
2. Полученный результат сравнить с физиологическим показателем щелочного резерва крови подопытного животного.
3. Сделать вывод в плане взаимосвязи найденной величины
щелочного резерва крови с физиологическим состоянием животного, его возрастом, характером кормления, продуктивностью
и т. д.
Вопросы для самоподготовки по теме 3
1. Буферные растворы (понятие, принцип образования, виды, свойства - роль средней соли, действие кислот и щелочей, разбавление водой).
2. Главный неорганический буфер крови. Его образование
в организме (вследствие каких реакций и как?), свойства и механизм действия (через схемы-формулы), биологическая роль.
22
3. Щелочной буфер. Его образование в организме (из чего
и как?), свойства и механизм действия (через схемы-формулы),
биологическая роль.
4. Ацетатный буфер (и ему подобные органические буферные
растворы). Образование в организме (откуда берутся компоненты раствора?), свойства и механизм действия (через схемыформулы), биологическая роль.
5. Фосфатный буфер. Образование в организме, свойства
и механизм действия (через схемы-формулы), биологическая роль,
применение в практике животноводства.
6. Белковые буферные растворы. Их образование в организме, свойства и механизм действия (через схемы-формулы), биологическая роль.
7. Гемоглобиновый буфер. Место его образования и функционирования, свойства и механизм действия (через схемыформулы), биологическая роль.
8. Буферная емкость и щелочной резерв крови, других тканей
и жидкостей. Понятие, значение в поддержании постоянства реакции среды.
9. Ацидоз и алкалоз. Понятие, причины, влияние на протекание биохимических реакций и процессов, жизнедеятельность
клеток, тканей и органов.
10. Использование буферных смесей в практике животноводства и ветеринарии. Примеры.
ТЕМА 4. КОЛЛОИДНЫЕ РАСТВОРЫ
Коллоидные растворы – это гетерогенные системы, состоящие из дисперсной фазы и дисперсионной среды. Дисперсная фаза
– это коллоидные частицы размером в диаметре от 1 до 150 нм,
дисперсионная среда – это растворитель (в живом организме – это
вода).
Важным фактором, способствующим устойчивости коллоидных растворов, препятствующим коагуляции, является электрический заряд коллоидных частиц. Заряды появляются вследствие избирательной адсорбции на поверхности коллоидных частиц одноименно заряженных ионов или диссоциации таких высокомолеку23
лярных амфотерных электролитов, как белки. Одноименно заряженные частицы данной коллоидной системы отталкиваются друг
от друга, и это препятствует соединению их в более крупные агрегаты и выпадению в осадок.
Другим важным фактором устойчивости коллоидных систем
является взаимодействие между коллоидными частицами и растворителем, т.е. между дисперсной фазой и дисперсионной средой.
В одних коллоидных системах, например, в водных растворах белков, коллоидные частицы связывают большое количество растворителя – воды. Такие коллоиды называются гидрофильными; они
являются относительно устойчивыми и при определенных условиях образуют студнеобразные вещества (студни или гели).
В других коллоидных системах, например, в водных растворах гидратов металлов, коллоидные частицы не притягивают, не
связывают значительное количество воды. Такие коллоиды называются гидрофобными и являются неустойчивыми, легко коагулирующими при снижении электрического заряда частицами.
Есть два метода получения коллоидных растворов:
1. Конденсационный или полимеризации (путем укрупнения
молекул истинного раствора). Например, синтез молекул белков,
гликогена и т.п.
2. Дисперсионный или дробления (из грубодисперсных систем).
Работа 16. Получение гидрофобного коллоидного раствора
гидроксида железа Fe(OH)3
Получение гидрозоля протекает по уравнению:
FeCl3 + 3H2O⇄ Fe (OH)3 + 3HCl (гидролиз)
Гидроксид железа нерастворим в воде. Образующиеся молекулы Fe(OH)3 конденсируются, слипаясь друг с другом и формируя
коллоидные частицы размером в диаметре от 1 до 150 нм.
Поверхностные молекулы агрегата Fe(OH)3 вступают в химическое взаимодействие с НСl:
Fe (OH)3 + HCl = FeOCl + 2H2O.
Молекулы FeOCl являются электролитом стабилизатором
и диссоциируют на ионы FeO+, выполняющие роль потенциало24
пределяющих ионов и ионов Cl-, являющихся противоионами.
nFeOCl ⇄ FeO ++ Cl-.
Строение мицеллы гидрозоля гидроксида железа можно представить следующей схемой:
{m[Fe (OH)3] n FeO+ (n-x)Cl-}X+´ ClНаличие заряда на поверхности мицеллы препятствует дальнейшему слипанию частиц и выпадению их в осадок. Заряд мицеллы определяется внутренним ионным слоем.
Ход опыта
Налить в колбочку 40 мл дистиллированной воды, нагреть до
кипения на спиртовке или электроплитке и влить в нее 4 мл 2% истинного (ионно-дисперсного) раствора FeCl3. Образуется краснокоричневый золь железа. Нагревание прекращают. Раствор используют в работе 17.
Задание:
1. Выполнить опыт, получить золь железа.
2. Написать последовательно реакции, приводящие к образованию коллоидного раствора гидроксида железа из НОН и ионов
истинного раствора FeCl3.
3. Изобразить схему строения сформировавшейся коллоидной
частицы, указав ее составляющие: ядро, ионный и диффузный слои.
4. Сделать вывод, как возникает заряд на коллоидных частицах
гидроксида железа и какова его роль.
Работа 17. Получение гидрофильного коллоидного
раствора белка
При образовании коллоида из белка происходит обыкновенное растворение последнего в воде. При этом видимые невооруженным глазом частицы белка (кристаллы), состоящие из
большого числа молекул, под действием воды исчезают, превращаются в невидимые вследствие их дробления (дисперсионный метод) на отдельные молекулы. Последние вступают с водой
в органическую связь и становятся гидрофильными коллоидными частицами.
25
Ход опыта
В пробирку налить 5 мл воды (t = +40-50°C), опустить
в нее маленький кусочек белка желатина (можно использовать
также бычий альбумин, казеин и другие белки) и, периодически
встряхивая, растворить его. Раствор использовать в работе 18.
Задание:
1. Выполнить опыт, получить коллоидный раствор белка
желатина.
2. Написать реакцию взаимодействия желатина (считая, например, что это кислый белок) с водой, приводящую к образованию коллоидной частицы.
3. Указать, как возникает заряд на коллоидных частицах
и какова его роль.
4. Нарисовать схему строения гидрофильной коллоидной
частицы.
Работа 18. Диализ коллоидных растворов
Диализ — это очистка коллоидов от примесей с помощью
ППМ. Он основан на том, что коллоидные частицы через
ППМ не проходят, так как они в диаметре больше ее пор, а все
остальные (ионы), имеющие диаметр меньше 1 нм, проходят.
Поэтому, используя ППМ как молекулярное сито, вымывают из
коллоида, с помощью ее и многократно меняемой воды, посторонние частицы.
Ход опыта
Около 2 мл золя железа из работы 17 налить в целлофановый мешочек и опустить его в мензурку с 5 мл дистиллированной воды.
Аналогичное проделать с раствором желатина из работы
17. Через 30 - 40 мин мешочки вынуть из мензурок.
В 1-ю мензурку добавить 2 капли 1% раствора AgNO3 (аналогичный анализ проделать с дистиллированной водой - контрольная проба на ион С1-).
Во 2-ю мензурку и оставшуюся с раствором желатина пробирку (контроль) прилить по 5 мл 20% раствора NaOH и по
2 капли 1% раствора CuSO4 (реактивы биуретовой пробы на
26
белок). Растворы осторожно взболтать. Образовавшаяся красно-фиолетовая окраска свидетельствует о наличии белка
в жидкости.
Задание:
1. Зарисовать диализатор, обозначив его составляющие.
2. Отметить, появляется ли красно-коричневое окрашивание воды в 1-й мензурке. Если нет, то почему?
3. Отметить, какая проба на ионы С1- в 1-й мензурке. Если положительная, то объяснить, почему.
4. Написать реакцию ионов С1 - с Аg+ .
5. Отметить, какова биуретовая реакция во 2-й мензурке
(сравнить ее с контролем). Если отрицательная, то почему?
Объяснить.
Работа 19. Изучение механизма коагуляции золя
железа
Коагуляция — это уменьшение степени дисперсности
коллоидных частиц под действием физико-химических факторов. При этом частицы дисперсной фазы становятся в диаметре больше 150 нм, т. е. они переходят в зону грубых растворов.
Причины коагуляции - ионы электролитов, рН, температура, радиация и др.
Ход опыта
В три колбочки налить по 10 мл золя железа. Затем в каждую колбочку добавить из соответствующей бюретки по каплям раствор электролита до исчезновения блеска коллоидного раствора. Количество мл израсходованного электролита
записать в таблицу.
Задание:
1. Зная заряд коллоидных частиц, сделать вывод 1-й, какие ионы электролитов вызвали коагуляцию.
2. На основе полученных в опыте данных определить, сколько
мл каждого из электролитов было бы израсходовано на коагуляцию, если бы концентрация их была 0,001 М.
27
№ опыта
Электролит
коагулянт
Концентрация
электролита, М
1
2
3
NaCl
Na2SO4
K3Fe (CN)6
6
0,005
0,001
Расход электролита
на коагуляцию, мл
исходной кон- в пересчете
центрации
на 0,001 М
3. Опираясь на 1-й вывод и найденные в расчетах величины расхода 0,001 М электролитов, доказать, почему на коагуляцию
одинакового объема коллоида их пошло разное количество.
4. Указать стадии и признаки коагуляции.
Работа 20. Изучение защитного действия гидрофильных
коллоидов (эмульсоидов)
Отличительной чертой коллоидных систем является их неустойчивость, ведущая во многих случаях к выделению осадков. При
этом осадки имеют химический состав дисперсной фазы. Причиной неустойчивости золей является непостоянство их дисперсности.
При добавлении к такому раствору электролита коллоидные
частицы теряют заряд и происходит коагуляция суспензоидов.
Эмульсоиды в отличие от суспензоидов более устойчивы, так
как обладают двумя факторами устойчивости:
1) зарядом частиц и
2) водной оболочкой частиц.
Для коагуляции гидрофильных коллоидов необходимо, кроме
нейтрализации заряда частиц, разрушить окружающую их водную
оболочку добавлением водоотнимающих средств (спирта, ацетона,
танина). Водоотнимающие вещества, разрушая водную оболочку
гидрофильных частиц, превращают их в гидрофобные, после чего
происходит процесс коагуляции в присутствии электролита.
Прибавление гидрофильного золя к гидрофобному повышает
устойчивость последнего по отношению к электролитам вследствие
адсорбции гидрофильных частиц на поверхности гидрофобных —
защитное действие. Гидрофильные коллоиды при этом как бы передают свои свойства гидрофобным частицам.
28
Различные гидрофильные коллоиды обладают различной защищающей способностью, поэтому возникла необходимость определения их защитной силы. Мерой защитного действия является
золотое число.
«Золотое число» есть минимальное количество миллиграммов cуxoгo гидрофильного вещества, которое нужно прибавить
к 10 мл коллоидного раствора золота, чтобы задержать переход
красного цвета этого золя в фиолетовый под действием 1 мл 10%
раствора поваренной соли.
«Золотое число» показывает границу двух концентраций защищающего коллоида, из которых одна создает защиту, а другая
вызывает коагуляцию, внешне выражающуюся в переходе красной
окраски в фиолетовую. Вместо определения «золотого числа» часто
приводят определение «рубинового» и «железного» чисел путем наблюдения начала коагуляции Fe(ОН)3.
Ход опыта
Налить в 8 пробирок по 1 мл дистиллированной воды.
В 1-ю пробирку внести 1 мл 1% раствора белка желатина (гидрофильный коллоид). Перемешать и 1 мл смеси перенести во 2-ю
пробирку. Перемешать и 1 мл смеси из 2-й пробирки перенести
в 3-ю и т. д. Из 8-й пробирки 1 мл смеси, как лишний, вылить.
Получаем различное разведение желатина: в 1-й пробирке оно
равно 1/2, во 2-й - 1/4, в 3-й - 1/8 и т. д.
Налить во все пробирки по 1 мл 1% золя железа и перемешать содержимое пробирок.
Через 3 мин прилить во все пробирки по 0,2 мл 0,1 М рас29
твора A12(S04)3 и отметить номер пробирки, в которой произошла
коагуляция.
Расчет
Если осадок образовался, например, в 3-й пробирке, то предел защитного действия желатина находится во 2-й пробирке, где
разведение 1/4. Следовательно, «железное число» желатина равно:
0,01 : 4 = 0,0025 г, или 2,5 мг. 0,01 г - количество желатина в 1 мл 1%
раствора, взятого в опыт.
Задание:
1. Выполнить опыт и найти «железное число» желатина.
2. Дать точное определение «железного числа», исходя из данных опыта.
3. Объяснить механизм защитного действия раствора желатина.
Вопросы для самоподготовки по теме 4
1. Понятие о коллоидных растворах, дисперсной фазе и дисперсионной среде. Классификация коллоидов и их место среди
других растворов. Представители в организме животных.
2. Получение гидрофобного коллоида, возникновение
и роль заряда на его частицах, схема их строения.
3. Образование эмульсоида (белка), возникновение и роль
заряда на частицах его дисперсной фазы.
4. Оптические свойства коллоидов (опалесценция, эффект
Тиндаля - Фарадея, помутнение и изменение цвета при коагуляции), с чем они связаны и их практическое значение.
5. Кинетические свойства коллоидов (броуновское движение, диффузия, осмотическое давление), с чем они связаны
и их использование в практике.
6. Электрические свойства коллоидов, с чем они связаны,
прикладное значение.
7. Диализ и электрофорез. Понятие и значение в жизни
животных и практике.
8. Коагуляция суспензоидов (понятие, причины, стадии,
признаки, роль).
9. Коагуляция эмульсоидов (понятие, причины, стадии,
30
признаки, значение в жизни животных и практике животноводства).
10. Денатурация, обратимая и взаимная коагуляция (понятие, значение в биологии и практике).
11. Коллоидная защита, ее сущность, «железное число»,
использование в практике.
12. Гели - понятие, образование и желатинирование; старение, набухание - понятие и биологическое значение.
13. Значение коллоидов в строении и функционировании
клеток, тканей и органов.
ЧАСТЬ II
Биохимия сельскохозяйственных животных
TЕMA 5. АДСОРБЦИЯ И АБСОРБЦИЯ
Адсорбция — поглощение одного вещества поверхностью
другого (адсорбента) за счет свободной поверхностной энергии.
Наибольшей способностью к адсорбции обладают системы
с большим запасом свободной поверхностной энергии – коллоидные системы. Адсорбция может быть молекулярной и ионной.
При молекулярной адсорбции на адсорбенте осаждаются целые
молекулы другого (адсорбируемого) вещества, тогда как при ионной - только ионы (анионы или катионы). По этому признаку адсорбенты делят на аниониты и катиониты. Роль анионитов и катионитов могут выполнять специальные искусственные смолы,
несущие на своей поверхности определенный электрический заряд.
Нередко адсорбированные вещества могут проникать в глубину адсорбента - такое явление называют абсорбцией. Если адсорбированное вещество вступает в химическую реакцию с адсорбентом, явление носит название хемосорбция. При хемосорбции образуются новые вещества с отличными от исходных свойствами.
Адсорбция широко представлена в окружающей нас природе. Так, усвоение питательных веществ из окружающей среды
начинается с адсорбции этих веществ на поверхности простей31
ших организмов, усвоение питательных веществ клетками высших организмов начинается адсорбцией этих веществ из внутренней среды поверхностью клеточной цитоплазмы. На явлении
избирательной адсорбции основано применение многих лекарственных веществ в медицине и ветеринарии, например, применение активированного угля внутрь при метеоризме.
Явление адсорбции положено в основу хроматографии —
разделение смеси веществ на составные компоненты, с последующим их проявлением.
Работа 21. Адсорбция органических красок животным углем
В две пробирки насыпать по 0,5 г животного угля. В 1-ю налить 10 мл 0,01% раствора фуксина, а во 2-ю - 10 мл 0,01% раствора метиленовой сини. Пробирки сильно встряхнуть в течение
2 мин. Затем растворы профильтровать через бумажные фильтры.
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. Отметить, как изменился цвет растворов фуксина и метиленовой сини после их смешивания с углем и фильтрации.
Работа 22. Определение количества уксусной кислоты,
адсорбированной животным углем
В колбочку отмерить из бюретки точно 20 мл 0,1н раствора
СН3СООН. Добавить 10 капель 0,5% раствора фенолфталеина
и оттитровать 0,1н раствором NaOH до появления розовой окраски, не исчезающей в течение 1-2 мин. Расход раствора NaOH записать.
Во 2-ю колбочку налить точно 25 мл 0,1н раствора
СН3СООН, внести 0,5 г животного угля и встряхнуть в течение
3 мин. После раствор отфильтровать через бумажный фильтр.
Отмерить пипеткой точно 20 мл фильтрата, прибавить к нему 10
капель раствора фенолфталеина и оттитровать 0,1н раствором
NaOH до появления розовой окраски. Расход раствора NaOH
записать.
Задание:
1. Выполнить опыт.
32
2. По разности NaOH, пошедшей на титрование 20 мл
СН3СООН до и после смешивания ее с углем, установить количество СН3СООН, адсорбировавшейся на животном угле.
Вопросы для самоподготовки по теме 5
1. Адсорбция и абсорбция (понятие, сущность).
2. Адсорбтив, адсорбент, элюция (понятия).
3. Виды адсорбции.
4. Количественное определение адсорбции.
5. Биологическое и практическое значение адсорбции.
ТЕМА 6. ХИМИЯ И ОБМЕН БЕЛКОВ
Белки - макромолекулы, состоящие из одной или нескольких
полипептидных цепей. Каждая полипептидная цепь построена из
большого числа аминокислотных остатков, соединенных в цепи
ковалентной пептидной связью.
Линейная полипептидная цепь имеет следующую структуру:
-CO-CH-NH-CO-CH-NH-CO-CH-NHR3
R4
R5
По химической структуре белки делятся на простые (протеины, состоят только из a-аминокислот, например, коллаген,
эластин и др.) и сложные (протеиды, состоят из a-аминокислот
и других компонентов, например, хромопротеиды, нуклеопротеиды, многие ферменты и др.). В состав белков входит до 22
аминокислот.
По биологической ценности белки бывают: полноценные
(содержат полный набор незаменимых аминокислот) и неполноценные (в них отсутствует одна или несколько незаменимых аминокислот).
По происхождению они могут быть животными, растительными, микробными и искусственными (получены путем органического синтеза), в организме животных - мышечными (актомиозин и др.), кровяными (гемоглобин, глобулины и др.), молочными (казеиноген и др.), печеночными (гемокупреин и др.)
33
и т. д.
Белки обладают амфотерностью, имеют различную М. м. (от
6000 и более), им присущи все свойства гидрофильных коллоидов (оптические, кинетические, электрические).
Работа 23. Определение изоэлектрической точки (ИЭТ)
белка
Вследствие наличия способных к ионизации групп (концевых групп -СООН и -NH2, а также боковых групп дикарбоновых
и диаминокислот) молекулы белков обладают электрическим зарядом - положительным и отрицательным. В кислой среде белки
имеют суммарный положительный заряд:
R-CH-COO- + H+ ⇄ R-CH-COOH
NH3+
NH3+
в щелочной среде - отрицательный:
R-CH-COO- + ОН- ⇄ R-CH-COO- + Н2О
NH3+
NH3+
При определенном значении рН среды величина положительных и отрицательных зарядов становится одинаковой, и суммарный заряд белка оказывается равным нулю. Значение pH, при
котором белок имеет минимальный электрический заряд, называют изоэлектрической точкой (ИЭТ). В этом состоянии белки
наименее устойчивы и легко выпадают в осадок, имеют наименьшее значение вязкости, растворимости, степени гидратации
и электропроводности, неспособны передвигаться к электрическим полюсам. Каждый белок имеет свое значение ИЭТ: казеин –
4,6-4,7, сывороточный глобулин – 5,4, протамины – 10-12 и т.д.
Находясь в ИЭТ, белки легко коагулируют, чаще всего при
добавлении водоотнимающих средств (спирт, ацетон и др.). Последние разрушают их водную оболочку, частицы белка слипаются и выпадают в осадок. Это свойство белков используют для
выделения их из биологического материала.
34
Ход опыта
Опыт состоит из 2 этапов:
1. Приготовление буферных растворов с определенной величиной рН.
В пять пробирок наливают растворы и воду в количествах
(мл), указанных в таблице.
Вещество
0,1Нраствор
СН3СООН
0,1 Н раствор
СН3СООNa
1 Н раствор
СН3СООН
Вода
рН буфера
1
Номера пробирок
2
3
4
5
1
1
1
1
1
0,5
0,5
1
2
-
-
-
-
-
1,6
1,9
5,6
1,5
5,0
1
4,7
4,1
0,4
3,5
В итоге получается 5 ацетатных буферных растворов с различной величиной рН.
2. Определение ИЭТ белка.
В каждый буфер, полученный в 1-м этапе, налить точно по
1 мл раствора белка. После этого в пробирку 3 добавить (при
встряхивании) из бюретки этиловый спирт до очень легкого помутнения (признак коагуляции) раствора. Отметить расход этанола. Затем такое же его количество влить в остальные пробирки.
По истечении 30 мин определить раствор с максимальным
помутнением. Величина рН этого буферного раствора будет соответствовать ИЭТ белка. Затем в этот раствор добавить воду до
исчезновения его помутнения.
Задание:
1. Выполнить опыт и определить ИЭТ исследуемого белка.
2. Сделать заключение об устойчивости к коагуляции белка
в состоянии ИЭТ.
3. Написать схему действия буфера на белковую молекулу
в плане приведения ее в ИЭС.
35
4. Объяснить, почему в пробирке, куда добавили воду, исчезли признаки коагуляции. Как называется это явление?
Работа 24. Определение количества белка в сыворотке
рефрактометрическим методом
В норме у здоровых животных в сыворотке крови содержится 60 - 80 г/л (6 - 8%) белка. Это состояние называется нормопротеинемия.
При гиперпротеинемии количество белка в сыворотке
больше 80 г/л, а при гипопротеинемии - меньше 60 г/л.
Отклонения от нормы в содержании белка в сыворотке крови (гипер- и гипопротеинемия) могут быть по алиментарной причине (alimentum - пища), связанной с избытком или недостатком
его в рационе, несбалансированностью последнего по аминокислотам, особенно незаменимым, а также вследствие нарушений
обмена веществ или болезней (инфекционные, инвазионные, кровопаразитарные).
Для определения количества белка в сыворотке крови используются различные рефрактометры: РЛ-2, ИРФ-22 и АМ-2
(анализатор молока) и др.
Сущность метода заключается в нахождении показателя
светопреломления сыворотки и пересчете его через формулу
в количество белка в ней.
Ход опыта
Вначале при работе с рефрактометрами производят настрой
по дистиллированной воде. Для этого на нижнюю призму рабочего столика рефрактометров РЛ-2, ИРФ-22/и АМ-2 наносят 1 каплю дистиллированной воды и опускают верхнюю призму столика. Вращая винт окуляра вправо или влево у ИРФ-22 и вдвигая
и выдвигая окуляр по направляющей у РЛ-2 и АМ-2, наводят
резкость на шкалу. Затем, вращая нижний винт у АМ-2, перемещая вверх - - вниз рычаг справа у РЛ-2 и вращая винт слева
у ИРФ-22 (рядом с зеркальцем - осветителем шкалы, которое надо открыть!), вводят в поле зрения две тени: у РЛ-2 и АМ-2 темноватую вверху и светло-серую внизу; у ИРФ-22 они располагаются наоборот. При наличии на границе между тенями радуги
36
ее удаляют с помощью компенсатора. Затем, смотря в окуляр,
у ИРФ-22 винтом слева устанавливают границу между тенями
строго в поле зрения на перекрест, а у РЛ-2 и АМ-2 устанавливают соответственно рычажком справа и винтом снизу три черточки строго на границу между тенями и снимают показатель преломления (Д). Для дистиллированной воды при + 20°С он равен
1,3320.
Аналогичным образом поступают при определении показателя преломления сыворотки крови.
После каждого анализа призмы столика вытирают насухо
мягкой салфеткой.
В исследованиях (особенно научных) обязательно учитывают поправки для показателя преломления на температуру, если
она в рабочем столике отклоняется от + 20°С.
Расчет количества белка производят по формуле
Д - (1,3320 + 0,0027)
C=
´ 10 ,
0,00172
где С — количество белка (г/л);
Д — показатель преломления сыворотки крови;
0,00172 — величина, на которую увеличивается показатель
преломления при повышении содержания белка в сыворотке на
1%;
10 — коэффициент пересчета белка в г на 1 л сыворотки.
Задание:
1. Освоить методику работы по определению показателя
преломления воды на предоставленных рефрактометрах.
2. Найти показатель преломления сыворотки крови лошади,
коровы, птицы.
3. Рассчитать содержание белка в сыворотке крови подопытного животного и в случае отклонения от нормы сделать
вывод о причинах явления и мерах, которые следует предпринять, чтобы привести этот показатель в норму.
Работа 25. Определение белка по методу Лоури
Метод основан на измерении интенсивности окраски белков
с помощью фотоэлектроколориметра или спектрофотометра.
Метод очень чувствительный, так как позволяет определять от
37
одного до нескольких мкг белка в пробе. При этом белки образуют окрашенные комплексы при одновременном протекании биуретовой реакции (см. работу 19) и реакции восстановления белками реактива Фолина (смесь фосфорно-вольфрамовой и фосфорно - молибденовой кислот образует с белками комплексное
соединение синего цвета).
Для определения готовят следующие реактивы: А - 2% раствор углекислого натрия в 0,1н растворе NaOH; Б - 0,5% раствор
сульфата меди в 1 % растворе лимоннокислого натрия; перед
употреблением смешивают реактивы Б и А в соотношении 1:50 и
получают реактив В;
Фолина - Чокальтеу - в 700 мл дистиллированной воды растворить 100 г вольфрамата натрия и 25 г молибдата натрия. Затем
прилить 50 мл 85% раствора ортофосфорной кислоты и 100 мл
концентрированной НСl. Смесь осторожно кипятить с обратным
холодильником 10 - 12 ч. Потом добавить в нее 150 г сульфата
лития, 50 мл воды и 5 - 6 капель брома. Снова прокипятить 10 15 мин без обратного холодильника для удаления избытка брома.
После охлаждения довести объем раствора до 1000 мл. Он должен быть прозрачным (в противном случае его отфильтровать
через стеклянную вату), ярко-желтого цвета. Раствор Фолина оттитровать 0,1н раствором NaOH по фенолфталеину и на основании результатов титрования развести водой до 1н концентрации.
Хранить в темной посуде.
Ход опыта
К 0,1 мл сыворотки крови прилить 9 мл реактива В, перемешать и оставить стоять на 10 мин при комнатной температуре.
Потом к смеси прилить 0,9 мл реактива Фолина - Чокальтеу, перемешать. Через 30 мин провести фотоколориметрию (или спектрофотометрию) при длине волны 750 нм, сравнивая исследуемый раствор с контролем, в который вместо сыворотки взять
0,1 мл дистиллированной воды, прилить все остальные реактивы.
На ФЭКе или СФ найти оптическую плотность исследуемого раствора.
38
Расчет содержания белка произвести по калибровочному
графику, который надо построить заранее, используя стандартный раствор бычьего альбумина. На оси абсцисс указывают
содержание белка в пробе (мкг), на оси ординат - оптическую
плотность (Д) исследуемого раствора.
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. Определить содержание белка в сыворотке крови и сравнить его с нормой для этого животного. В случае отклонения от
нормы указать предполагаемые причины, последствия и пути их
устранения.
Работа 26. Разделение белков сыворотки крови
на фракции с помощью сульфата аммония
В сыворотке крови находятся белки: альбумины и глобулины (a, b, g). Поскольку для разделения белков сыворотки используют соли, как правило, щелочных и щелочноземельных металлов (NaCl, Na2SO4, MgSO4 и др.), то метод получил название
высаливания. Сущность его заключается в том, что при добавлении к сыворотке крови соли происходят дегидратация и разряжение белковых молекул, вследствие чего они выпадают в осадок,
который можно отфильтровать. Но если к осадку добавить воду,
то белок вновь приобретает коллоидные свойства. Этот процесс
называется обратимой коагуляцией. Отмыв ионы-коагулянты путем диализа, можно получить чистую фракцию белка. Таким образом, сочетая обратимую коагуляцию белков возрастающей
концентрацией электролита и последующий диализ коагулянтов,
можно получить из сыворотки крови различные фракции белков.
Ход опыта
В пробирку налить 2 мл сыворотки крови и 2 мл насыщенного раствора (NH4)2SO4. Перемешать содержимое пробирки.
Получается полунасыщенный раствор (NH4)2SO4, под действием
которого выпадают в осадок глобулины. Их отфильтровать,
смыть в чистую пробирку через прокол фильтра водой до исчезновения признаков коагуляции.
39
В фильтрат, где остались альбумины, добавить, постоянно
перемешивая, тонко измельченный порошок (NH4)2SO4 до полного насыщения и выпадения альбуминов в осадок. Затем, добавляя
к осадку воду, добиться его растворения, т. е. исчезновения признаков коагуляции. После этого раствор прокипятить. Образуются хлопья из альбуминов. К ним прилить 10 мл воды, энергично
встряхнуть и отметить, что с ними произошло.
Задание:
1. Выполнить опыт и получить отдельно глобулины и альбумины.
2. На чем основано разделение белков сыворотки крови или
вытяжки из ткани на фракции с помощью коагуляции?
3. Сделать вывод, почему глобулины коагулируют при действии полунасыщенного (50%) pacтвopa (NH4)2SO4, a альбумины
- насыщенного раствора (NH4)2SO4.
4. Объяснить, почему при добавлении к осадкам глобулинов
и альбуминов воды они возвращаются в коллоидное состояние.
Как называется этот процесс и где он находит применение в биологии и практике?
5. Что произошло при действии высокой температуры на
раствор альбуминов? Как называется это явление и где его можно
применить в биологии и практике?
Работа 27. Разделение смеси аминокислот методом
распределительной хроматографии на бумаге
Метод основан на различии адсорбционных свойств и растворимости аминокислот в системе органический растворитель/вода при их продвижении по хроматографической бумаге.
Метод применяют для качественного и количественного определения аминокислот в белках тканей, органов, кормах и свободных аминокислот в биологических жидкостях.
Распределительная хроматография может быть нисходящая,
восходящая и круговая.
При восходящей хроматографии полоска бумаги с нанесенной на нее каплей раствора аминокислот погружается в ванночку
с растворителем, находящуюся на дне камеры (рис.5). Раствори40
тель при этом движется снизу вверх, увлекая с собой аминокислоты. Они движутся по бумаге с различной скоростью, зависящей
от их физико-химических свойств.
Рис. 5. Восходящая хроматография аминокислот
в пробирке:
1 – полоска хроматографической бумаги, 2 – место
нанесения образца, 3 - растворитель
При достижении фронта растворителя линии
финиша,
бумажку
вынимают
из
хроматографической камеры, просушивают и опрыскивают раствором нингидрина, с которым
аминокислоты образуют комплексы, окрашенные
в лиловый цвет.
Ход работы
Взять полоску хроматографической бумаги размером 1´10
см. Расположить ее на чистом листе обыкновенной бумаги и, отступя 1 см от нижнего края полоски, провести простым карандашом линию старта. Обозначить в ее середине диаметром 1 мм
кружок, куда нанести микропипеткой 0,05-0,01 мл приготовленной смеси аминокислот. Пятно подсушить на воздухе. Затем полоску за противоположный край подвесить на крючок пробки
хроматографической камеры, подтянуть за проволочку к пробке,
с которой опустить в камеру до соприкосновения с растворителем (3), но чтобы линия старта была выше его. Если бумажка не
достает до поверхности растворителя, то ее опустить, надавливая
на проволоку в пробке, которой надо плотно закрыть камеру. Последнюю поставить в термостат при 35 - 40°С, находящийся под
вытяжным шкафом. При достижении фронта растворителя линии
финиша бумажку вынуть (камеру опять закрыть плотно пробкой),
подвесить на крючок и подсушить при 105°С в сушильном шкафу. После этого хроматограмму взять за верхний край и смочить,
протягивая в 0,1% спиртовом растворе нингидрина, налитом
в чашку Петри или часовое стекло, и снова подвесить на крючке
41
в сушильный шкаф. При реакции с нингидрином проявляющиеся
пятна аминокислот приобретают лиловую окраску. Опытную
хроматограмму сопоставить со стандартной, на которой нанесены
известные аминокислоты. Одноименные аминокислоты на этих
хроматограммах располагаются на равном расстоянии от линии
старта и финиша.
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. Зарисовать хроматографическую камеру (рис. 5).
3. Определить, какие аминокислоты находятся в исследуемом
растворе. Написать их структурные формулы и указать биороль.
4. Объяснить принцип и технологию хроматографического метода разделения аминокислот.
Работа 28. Определение количества аминокислот
в растворе по азоту аминогрупп методом
формольного титрования по Серенсену
Моноамино-монокарбоновые аминокислоты, содержащие
одновременно основную аминную и кислую карбоксильную
группы, в водных растворах показывают нейтральную реакцию.
На основании этого считают, что в аминокислотах аминогруппа
и карбоксильная группа нейтрализуют друг друга.
Таким образом, аминокислоты в водных растворах обладают характером внутримолекулярных солей, и, следовательно, непосредственно титровать карбоксильные группы аминокислот
щелочью невозможно.
При взаимодействии аминокислот с формальдегидом аминогруппа реагирует с последним и образуются производные аминокислот; при этом аминогруппы теряют свои основные
свойства:
NH2
N = CH2
R — СН + СНОН ®
СООН
R — СН
+ H2O,
COOH
метиленаминокислота
42
карбоксильные же группы в метиленаминокислотах сохраняются без изменения и в этом случае могут быть оттитрованы
щелочью:
N = CH2
N = CH2
R — СН
+ NaOH ® R — СН
COOH
+ H2O
COONa
Количество титруемых при этом карбоксильных групп эквивалентно количеству связанных формальдегидом аминных
групп. Таким образом, результат титрования указывает на содержание аминных групп.
Метод основан на блокировании аминогруппы (-NH2) аминокислоты формальдегидом и оттитровывании оставшейся свободной карбоксильной группы (-СООН) щелочью. По расходу
последней определяют количество азота NH2-группы, а по нему
рассчитывают содержание аминокислоты в растворе или белке.
Этим методом можно определить только содержание нейтральных аминокислот.
Ход опыта
Налить в колбочку 10 мл формольной смеси (состоит из 30 40% раствора формалина и нескольких капель 0,1% раствора фенолфталеина) и оттитровать ее (в ней могут быть кислотные примеси) 0,1н раствором NaOH до слабо-розовой окраски, не учитывая количество щелочи.
Затем в эту же колбочку влить 10 мл исследуемого раствора
аминокислоты и оттитровать ее содержимое 0,1н раствором
NaOH до ярко-красного цвета. Отметить расход 0,1н раствора
NaOH на титрование и произвести вычисление.
Расчет. Во-первых, надо найти количество мг азота NH2групп в 10 мл исследуемого раствора аминокислоты. Для этого
количество мл 0,1н раствора NaOH, пошедшего на титрование
раствора аминокислоты (например, 5 мл), следует умножить на
1,4 мг (это количество мг азота, соответствующее 1 мл 0,1н рас43
твора NaOH).
5 ´ 1,4 = 7 мг азота аминогрупп в 10 мл исследуемого раствора аминокислоты.
Зная М. м. исследуемой аминокислоты, можно по найденному количеству азота ее NH2-групп определить содержание
аминокислоты. Например, определяемая аминокислота глицин
(NН2СН2СООН). Его М. м. равна 75 мг/моль, а количество азота
в нем 14 мг. Следовательно, 14 мг азота образуют 75 мг глицина,
а 7 мг азота (вычислено выше) образуют Х мг глицина. Отсюда:
7 ´ 75
= 30,3 мг глицина в 10 мл раствора.
X =
14
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. Определить количество мг азота NH2-групп в 10 мл раствора аминокислоты.
3. Написать структурную формулу, вычислить М. м. исследуемой аминокислоты и по содержанию азота ее аминогрупп вычислить количество аминокислоты в 10 мл раствора.
4. Указать биороль аминокислоты.
5. Объяснить принципы и технологию опыта. Написать реакцию аминогруппы аминокислоты с формальдегидом.
Работа 29. Изучение действия пепсина на переваривание
белка
Пепсин - это простой белок-фермент М. м. 35000, который
вырабатывается главными (фундальными) клетками дна сычуга
жвачных животных, железистого желудка птиц и желудка моногастричных животных в виде пепсиногена (профермент) М. м.
42000. От последнего под действием НСl (или ранее образованного пепсина) отщепляется полипептид-блокатор, и он превращается в активный фермент пепсин, который при рН 1,5 - 2,5 (создает НС1) разрушает пептидные связи ( — СО — NH — ) белков
в желудке. Пепсин гидролизует белки мышц, молока, яиц, крови,
растительные белки (исключение составляют роговые белкикератины и некоторые другие) до высоко- и низкомолекулярных
полипептидов незначительных количеств аминокислот.
44
Ход опыта
Налить в 3 пробирки по 3 мл 0,01 М раствора НСl, а в 4-ю 3 мл дистиллированной воды. В 1-ю пробирку внести белок кератин (несколько кусочков шерстинок), а в остальные по равному
небольшому кусочку белка фибрина. Затем в 1, 2 и 4-ю пробирки
прилить по 1 мл 0,2% раствора пепсина, а в 3-ю - 1 мл дистиллированной воды.
Все пробирки поставить для инкубации в водяную баню или
термостат при 37 - 40°C. По истечении 30 - 40 мин пробирки вынуть и посмотреть, что произошло в них с белком. Пробы можно
встряхнуть.
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. Отметить пробирку, где произошло растворение (гидролиз) белка. Сделать вывод - почему?
3. Указать, в каких пробирках белок не растворился и почему.
4. Объяснить роль НСl в процессе гидролиза белка.
5. Написать схему гидролиза белка.
6. Как назвать кератин и фибрин по отношению действия на них пепсина?
Работа 30. Определение содержания мочевины в сыворотке
крови по реакции с диацетилмонооксимом
Мочевина - главный конечный продукт обмена белков
у млекопитающих. На ее долю приходится до 80% азота мочи
и около 50% остаточного азота крови. Количество мочевины
в крови и моче увеличивается при распаде тканевых белков, лихорадке, избытке белков в рационе, а уменьшение экскреции мочевины наблюдается при белковом голодании, болезнях печени
и т. д.
Метод основан на способности мочевины образовывать
с диацетилмонооксимом в кислой среде комплексное соединение
красного цвета, интенсивность окраски которого пропорциональна количеству мочевины.
45
Ход опыта
В центрифужную пробирку (опыт) налить 0,8 мл дистиллированной воды, 0,2 мл сыворотки крови, 1 мл 10% раствора
трихлоруксусной кислоты и перемешать. В другую пробирку
(стандарт) налить 0,8 мл воды, 0,2 мл стандартного (100 мг/%)
раствора мочевины, 1 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты
и перемешать. Обе пробы отцентрифугировать при 1500 об/мин
в течение 10 мин. В две другие пробирки взять соответственно по
0,5 мл центрифугата, добавить в каждую по 2,5 мл воды, 0,6 мл
2% раствора диацетилмонооксима и 2,4 мл смеси кислот (75 мл
85% Н3РО4 + 25 мл концентрированной H2SO4 + 70 мл воды).
Поместить на 20 мин в кипящую водяную баню. Затем охладить
водопроводной водой. После этого измерить экстинкцию исследуемой и стандартной проб на фотоэлектроколориметре при
длине волны 500 - 560 нм (зеленый светофильтр) в кювете толщиной 1 см против контроля, состоящего из 0,6 мл 2% раствора
диацетилмонооксима, 2,4 мл смеси кислот и 3 мл воды.
Содержание мочевины определить по формуле
Соп =
e оп ´ Сст
e ст
,
где Соп – содержание мочевины в сыворотке крови, мг%;
Сст - концентрация мочевины в стандартном растворе
(100 мг%);
eоп - экстинция исследуемой пробы;
eст - экстинция стандартной пробы.
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. Определить количество мочевины в сыворотке крови
подопытного животного.
3. Сравнить полученные показатели с нормальным содержанием мочевины и в случае отклонения указать предполагаемые
причины.
4. Написать схему и указать роль синтеза мочевины в организме.
46
Вопросы для самоподготовки по теме 6
1. Белки. Понятие. Классификация по строению, происхождению в природе и организме, функции.
2. Свойства и биороль белков. Представители, пример.
3. Гидролиз протеинов и протеидов и его продукты (начальные, промежуточные и конечные), примеры.
4. Классификация аминокислот: биологическая (незаменимые и заменимые), химическая (кислые, щелочные, нейтральные), структурная (ациклические, циклические) – понятия, примеры.
5. Строение и характеристика аминокислот, участвующих
в построении животных белков.
6. Структура белковых молекул и основные связи в них между аминокислотами (примеры в виде схем-формул).
7. Специфичность белков, понятие, значение в биологии
и практике.
8. Нуклеиновые кислоты. Понятие, виды, роль.
9. Продукты гидролиза нуклеиновых кислот, их химическая
природа и роль.
10. Нуклеотиды и нуклеозиды. Понятие и отличие по строению и роли. Примеры.
11. ДНК. Химсостав, строение (развернутая схема-формула
фрагмента), роль. Принцип комплементарности в построении молекулы ДНК. Пример.
12. РНК. Химсостав, строение (развернутая схема-формула
фрагмента). Виды РНК.
13. Матричная (информационная) РНК. Понятие, химсостав,
строение (развернутая схема-формула фрагмента), действующая
структурная формула, синтез мРНК и биороль. Виды и роль триплетов (кодонов).
14. Транспортная (т) РНК. Понятие, химсостав, строение
(развернутая схема-формула фрагмента), действующая структурная форма, синтез тРНК и биороль. Адапторный участок тРНК
(антикодон, антитриплет), понятие, строение, роль. Акцепторный участок тРНК, понятие, строение, роль.
15. Рибосомальная (р) РНК. Понятие, химсостав, строение
47
(развернутая схема-формула фрагмента), синтез рРНК и ее биороль.
16. Синтез ДНК и различных РНК. Механизм (изобразить
через схемы-формулы) и значение этих процессов.
17. Синтез белка в клетке. Этапы (изобразить через схемыформулы) и значение этих процессов.
18. Мутации нуклеиновых кислот и белков. Понятие, принципы, роль в биологии и животноводстве.
19. Биологическая ценность белков, азотистый баланс (понятие, виды).
20. Механизм переваривания белков у животных. Ферменты, их действие, продукты гидролиза.
21. Всасывание аминокислот и распределение по организму.
22. Нормо-, гипо- и гиперпротеинемия (понятия, причины,
обнаружение). Последствия и возможные пути устранения гипои гиперпротеинемии.
23. Превращения аминокислот в клетках (промежуточный
обмен), виды, роль.
24. Дезаминирование аминокислот (понятие, виды, схемы,
ферменты, роль).
25. Декарбоксилирование аминокислот (понятие, схема,
ферменты, роль).
26. Переаминирование аминокислот (понятие, схема, ферменты, роль).
27. Гниение белков в толстом отделе кишечника (на примере триптофана, фенилаланина, тирозина, цистеина). Схема
и роль процесса. Обезвреживание образующихся при этом ядов.
28. Утилизация пуриновых и пиримидиновых оснований
(синтез мочевой кислоты, аллантоина и других веществ). Схемы
и роль процессов.
29. Пути обезвреживания избытка аммиака в организме животных (синтез мочевины, образование амидов аминокислот
и др.). Схемы, место протекания и роль процессов.
30. Патологии и возможные пути регуляции белкового обмена.
48
ТЕМА 7. ФЕРМЕНТЫ (ЭНЗИМЫ)
Большинство химических реакций в живых организмах протекает с участием ферментов. Ферменты являются мощными
биологическими катализаторами, ускоряющими течение самых
разнообразных химических процессов. По своей природе ферменты - специфические белки, простые или сложные. Все ферменты подразделяются по типам катализируемых реакций на
6 классов: 1) оксидоредуктазы; 2) трансферазы; 3) гидролазы;
4) лиазы; 5) изомеразы; 6) лигазы (синтетазы). Каждый из названных классов в свою очередь делится на подклассы и подподклассы.
В настоящее время выделено и изучено огромное количество ферментов, многие из которых получены в кристаллической
форме. Активность одних ферментов (простых) определяется
только структурой самого белка, других (сложных) - присутствием кофакторов, прочно связанных с белковой молекулой (простетических групп) или слабо связанных (коферментов).
Активность ферментов зависит от природы фермента, рН
среды, температуры и других условий. Замечательной особенностью ферментов является специфичность их действия.
Работа 31. Приготовление раствора фермента a-амилазы
(КФ 3.2.1. 1) слюны
Амилаза вырабатывается в клетках слюнных желез и через
их протоки поступает в ротовую полость, где и проявляет свое
действие на крахмал, расщепляя его до декстринов и мальтозы.
Ход опыта
В мерную пробирку выделить 1 мл слюны. Прилить 9 мл
дистиллированной воды. Перемешать. Получится раствор амилазы слюны в соотношении 1:10, т. е. в каждом мл разбавленного
раствора слюны будет содержаться 0,1 часть амилазы от ее концентрации в слюне, находящейся в ротовой полости, т. е. неразбавленной.
Задание:
49
1. Приготовить рабочий раствор амилазы слюны.
2. Объяснить, какие железы синтезируют амилазу слюны.
Работа 32. Обнаружение в слюне амилазы и определение
специфичности ее действия
Для обнаружения в том или ином объекте (материале) фермента и установления специфичности его действия используют
соответствующий предполагаемому энзиму субстрат.
(С6Н10О5)n
nН2О
амилаза
декстрины
nН2О
амилаза
мальтоза
Амилаза слюны является эндоамилазой. Этот фермент, гидролизуя кислородные мостики между остатками глюкозы, расщепляет крахмал сначала на высокомолекулярные частицы - амилодекстрины, которые по своим свойствам и химическому строению приближаются к крахмалу. Затем происходит дробление
амилодекстринов на частицы меньшей молярной массы - эритродекстрины. Последние подвергаются расщеплению на мальтодекстрины, которые по свойствам приближаются к мальтозе.
О ходе ферментативного гидролиза крахмала судят по изменению окраски, возникающей при добавлении раствора йода
в инкубационную среду. Крахмал дает с йодом синее окрашивание, декстрины в зависимости от длины цепочки - фиолетовое
или красновато-коричневое; в пробирке, где гидролиз прошел
полностью, и образовалась мальтоза, цвет инкубационной среды
сохраняет слабо-желтую окраску раствора йода.
Ее отсутствие в инкубируемой смеси свидетельствует о наличии в исследуемом материале амилазы.
Специфичность - действие фермента только на определенный субстрат (или катализ определенной реакции).
Ход опыта
Налить в две пробирки по 2 мл 0,1% раствора крахмала. Затем в 1-ю пробирку прилить 1 мл воды, а во 2-ю - 0,5 мл разбавленной слюны. Содержимое пробирок перемешать.
Поставить пробирки в водяную баню или термостат при
50
37°С на 10 мин.
По истечении этого времени пробирки вынуть и внести
в каждую по капле 1% раствора йода. Отметить окраску растворов.
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. По окраске проб определить, есть ли в слюне фермент
амилаза.
3. Отметить, на какой субстрат этот энзим способен действовать (т.е. его специфичность).
Работа 33. Изучение влияния рН среды на активность
амилазы слюны
Для большинства ферментов имеется определенное значение рН, при котором их активность максимальна. Понижение или
повышение значения рН от оптимальной точки для таких ферментов понижает их активность. Таким образом, влияние рН на
активность фермента может выступать в качестве регулятора
ферментативной активности внутри клетки. Для амилазы величина рН оптимума действия находится в пределах 6,8-7,0.
Ход опыта
В три пробирки налить по 2 мл 0,1% раствора крахмала. Затем в 1-ю добавить 1 мл 0,1% раствора НСl, во 2-ю - 1 мл дистиллированной воды и в 3-ю - 1 мл 0,1% раствора NaOH. После этого
во все пробирки внести по 0,5 мл разбавленной слюны, взболтать
их содержимое и поставить в водяную баню или термостат при
37°С.
По истечении 10 мин пробирки вынуть, внести в каждую по
1 капле 1 % раствора йода и отметить окраску растворов.
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. По окраске растворов сделать вывод о влиянии на активность амилазы реакции среды: какая является оптимальной?
3. Где в практике животноводства и ветеринарии можно использовать это свойство ферментов, в т. ч. амилазы?
51
Работа 34. Изучение влияния температуры на активность
энзимов
На активность ферментов оказывает влияние температура:
низкая температура снижает активность, а с ее повышением от
минимальной до оптимальной активность ферментов увеличивается. Высокие температуры (для большинства ферментов выше
60°С) ингибируют (денатурируют) ферменты.
Оптимальной температурой для действия большинства ферментов является температура тела (36 - 40°С) животных.
Ход опыта
В три пробирки налить по 0,5 мл разбавленной слюны. Затем 1-ю пробирку поставить в стакан со льдом (или холодильник), 2-ю – в термостат или водяную баню при температуре 37°C,
а 3-ю прокипятить и охладить под водопроводной водой до комнатной температуры. Во все пробирки влить по 1 мл 0,1% раствора крахмала. 3-ю пробирку поставить также в термостат или
водяную баню для инкубации. По истечении 10 мин в пробирки
внести по 1 капле 1% раствора йода и отметить окраску.
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. Сделать выводы о влиянии температуры на активность
амилазы:
а) низкой (1-я пробирка);
б) оптимальной (2-я пробирка);
в) высокой (3-я пробирка).
3. Объяснить механизм действия температуры на активность
энзимов.
4. Указать, где в практике ветеринарии и животноводства
можно использовать это свойство ферментов.
Работа 35. Изучение действия активаторов и ингибиторов
на активность ферментов
Большое влияние на активность ферментов оказывают активаторы и ингибиторы - ионы металлов или органические вещества, иногда довольно сложного состава. В роли активаторов фер52
ментов часто выступают различные микроэлементы и водорастворимые витамины - незаменимые факторы питания.
Металлы в роли активаторов в одних случаях могут непрочно связываться с ферментами, в других - входить в их белковую
структуру, составляя так называемые истинные металлоэнзимы.
Среди веществ, вызывающих торможение какого-либо фермента, большое значение имеют специфические ингибиторы, которые по характеру действия подразделяются на обратимые и необратимые.
В свою очередь ингибиторы, вызывающие обратимое торможение, разделяют на конкурентные (конкурирующие с субстратом за активный центр фермента) и неконкурентные. Так,
например, малонат является конкурентным ингибитором сукцинатдегидрогеназы, ЭДТА - неконкурентный ингибитор; йодацетамид, диизопропилфторфосфат (ДФФ) - необратимые ингибиторы. В качестве специфических ингибиторов выступают такие соединения, как антибиотики, гербициды, инсектициды, кормовые
добавки и др.
Изменяя активность ферментов с помощью активаторов
и ингибиторов, добиваются выздоровления животных и увеличения их продуктивности.
Ход опыта
Налить в 5 пробирок по 2 мл 0,1% раствора крахмала. Затем
добавить в 1-ю пробирку (контроль) 1 мл воды, во 2, 3 и 4-ю - по
1 мл соответственно 0,1%, 1% и 4% растворы NaCl, в 5-ю - 1 мл
1% раствора СuSО4. Влить во все пробирки по 0,5 мл разбавленной слюны, перемешать содержимое каждой пробирки и поставить их в термостат или водяную баню при 37°С.
По истечении 10 мин пробирки вынуть, внести в каждую по
1 капле 1% раствора йода и отметить окраску раствора.
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. Сделать заключение, какое вещество или ион выступают
в качестве активатора или ингибитора амилазы.
3. Какое влияние оказывает на действие амилазы разная
концентрация NaCl?
53
4. Указать, где в практике животноводства и ветеринарии
можно использовать активирование и ингибирование ферментов.
5. Объяснить механизм активирования и ингибирования
ферментов.
Вопросы для самоподготовки по теме 7
1. Ферменты (энзимы). Понятие, химическая природа. Простые и сложные ферменты (определение, пример).
2. Проферменты (понятие, значение в функционировании
клеток, переход в ферменты - пример).
3. Изоферменты (изозимы) - понятие, примеры, роль.
4. Субстрат (понятие, роль) и названия ферментов (на чем
основаны - примеры).
5. Коферменты (коэнзимы) - понятие, классификация по
строению и функции. Характеристика коферментов (НАД,
НАДФ, ФМН, ФАД, ТПФ, KoASH, Ко Q, биоцитин, ФП, ТГФК,
липоевая кислота, гем и др.) по строению и роли в клетках организма.
6. Свойства ферментов (белково-коллоидные, влияние температуры, реакции среды, активаторов, ингибиторов, специфичность действия - понятие), роль в биологии и практике.
7. Активные центры простых и сложных энзимов (понятие,
примеры). Каталитическая сила ферментов и единицы ее выражения.
8. Механизм действия ферментов в клетке (теории промежуточных соединений, адсорбционная, их сущность, примеры).
9. Классификация ферментов (на чем она основана?) и характеристика классов (оксидоредуктазы, трансферазы, гидролазы, лиазы, изомеразы, лигазы (синтетазы). Представители и схемы реакции в плане их действия.
10. Использование ферментов в животноводстве и ветеринарии.
11. Биоокисление (понятие, виды, современная теория).
12. Схемы анаэробного и аэробного окисления, примеры
процессов и роль.
13. Окислительное фосфорилирование и свободное окисление (понятие, роль в клетках и организме, переключение и регу54
ляция).
14. АТФ - важнейший макроэрг клеток (его строение, образование, роль). Другие макроэрги (пример).
15. Значение энергетических процессов для организма.
ТЕМА 8. УГЛЕВОДЫ И ИХ ОБМЕН
Углеводы являются полигидроксиальдегидами или полигидроксикетонами либо образуют эти вещества в результате гидролиза. Слово «углеводы» означает, что большинство обозначенных им веществ имеет эмпирическую формулу (СН2О)n, хотя
встречаются углеводы с другим соотношением водорода и кислорода, чем в воде.
Углеводы присутствуют во всех живых организмах. Особенно много их в растениях. Все углеводы подразделяются на
моносахариды, олигосахариды и полисахариды.
Среди моносахаридов наиболее распространены гексозы
(глюкоза, галактоза, фруктоза, манноза) и пентозы (рибоза, дезоксирибоза, арабиноза, ксилоза и др.).
Олигосахариды состоят из коротких цепей, образованных
моносахаридными единицами, соединенными ковалентными связями - это дисахариды, трисахариды и т.д. К ним относятся сахароза, лактоза, мальтоза и др.
Полисахариды - высокомолекулярные углеводы, состоящие
из большого количества моносахаридов. К ним относятся крахмал, гликоген, целлюлоза, пектиновые вещества и др.
Работа 36. Изучение механизма переваривания углеводов
и определение активности a-амилазы
(КФ 3.2.1.1.) слюны
Во время нахождения в ротовой полости легкопереваримые
полисахариды подвергаются расщеплению амилазой слюны. Так,
при гидролизе крахмала образуются в порядке уменьшения М. м.
амило-, эритро-, ахро-, мальтодекстрины и дисахарид мальтоза,
которые дают с йодом соответственно синюю, красную, желтую,
а мальтодекстрины и мальтоза - бесцветную окраску.
От наличия и активности амилазы слюны и других фермен55
тов (мальтаза, лактаза и др.) поджелудочной железы зависят усвоение углеводов и, следовательно, здоровье и продуктивность
животных.
Ход опыта
В мерную пробирку выделить 1 мл слюны, прилить 9 мл
дистиллированной воды и перемешать. Получится рабочий раствор, содержащий в 1 мл 1/10 мл слюны (и, естественно, амилазы), так как слюна разведена в 10 раз.
В 10 пронумерованных пробирок налить по 1 мл дистиллированной воды. Добавить в 1-ю пробирку 1 мл разведенной слюны, перемешать содержимое путем 2-кратного втягивания и выпускания пипеткой жидкости и перенести 1 мл ее во 2-ю пробирку.
Содержимое 2-й пробирки перемешать указанным выше
способом и 1 мл смеси перенести в 3-ю пробирку и т. д. до 10-й
пробирки, из которой вылить 1 мл раствора. В итоге получится
10 пробирок с различным количеством слюны (и, следовательно
амилазы): каждая последующая пробирка содержит фермента
в 2 раза меньше, чем предыдущая. Таким образом, в 1-й пробирке
содержание амилазы равно 1/20, во 2-й - 1/40, в 3-й - 1/80, в 4-й 1/160, в 5-й - 1/320, в 6-й - 1/640, в 7-й - 1/1280, в 8-й - 1/2560,
в 9-й - 1/5120 и в 10-й - 1/10240 от ее количества в 1 мл неразбавленной слюны.
Налить во все пробирки еще no 1 мл дистиллированной воды. Влить во все пробирки, начиная с 10-й, по 2 мл 0,1% раствора
крахмала, перемешать и поставить в термостат или водяную баню при + 37°С.
Через 15 мин пробирки вынуть, быстро охладить водопроводной водой, добавить в каждую по 1 капле 1% раствора йода
и перемешать.
Установить, в какой пробирке появилось синее окрашивание, свидетельствующее о наличии нерасщепленного крахмала,
и произвести вычисление активности амилазы.
56
Расчет
За 1 единицу действия (ЕД) амилазы условно принимают
1 мл 0,1% раствора крахмала, гидролизованного амилазой из 1 мл
слюны за 15 мин при оптимальных условиях.
Следовательно, если полное расщепление крахмала произошло в 4-й пробирке, в которой содержание амилазы составляло 1/160 часть от ее количества в 1 мл неразведенной слюны, то
1 мл последней должен гидролизовать в 160 раз больше крахмала, чем его количество в этой пробирке. Отсюда активность амилазы равна 2´160 = 320 ЕД, где 2 - количество мл 0,1% крахмала,
используемого в опыте,
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. Определить активность a-амилазы слюны.
3. По найденной величине активности энзима рассчитать,
сколько (г, кг) сухого крахмала способна расщепить амилаза всей
слюны (2000 мл) человека за сутки.
4. Записать реакцию и схему гидролиза крахмала и по окраске растворов в пробирках определить продукты расщепления
полисахарида.
5. Указать, какие условия необходимы для действия амилазы слюны и как они соблюдались в опыте.
Работа 37. Определение количества глюкозы в крови
по методу Хагедорна – Иенсена
Глюкоза - один из основных моносахаридов крови, где содержание ее в норме (нормогликемия) составляет у овцы и козы –
40-65 мг%, коровы – 60-80, свиньи – 80-100, лошади – 90-100,
кролика – 100-120 и птицы – 130-260 мг%.
Гипогликемия (содержание глюкозы меньше ее нижнего показателя нормы) наблюдается при родильном парезе, недостаточно полноценном кормлении, например, мало легкоперевариваемых углеводов и т. д., увеличении концентрации инсулина и недостатке адреналина.
Гипергликемия (содержание глюкозы больше ее верхней
57
границы нормы) может быть при сахарном диабете (причина недостаток инсулина), тяжелых нефритах (воспаление почек),
лихорадочных процессах и других случаях.
Глюкоза - главный энергетический материал в клетках, а ее
метаболиты (особенно гликолиза) используются как строительный материал (в процессах синтеза жиров, белков и других веществ).
Поэтому определение глюкозы в крови имеет важное значение в плане оценки здоровья животных и продуктивности.
Метод основан на способности глюкозы (и других редуцирующих сахаров) восстанавливать в щелочном растворе железосинеродистый калий (ферроцианид калия Кз[Fе(СN)6] в железистосинеродистый (ферроцианид калия К4[Fе(СN)6] по уравнению:
2К3 [Fe(CN)6] + С6Н12О6 + 2КОН ®
® 2K4[Fe(CN)6] + C6H1207
Образующуюся K4[Fe(CN)6] переводят в осадок сульфатом
цинка:
2K4[Fe(CN)6] + 3ZnSO4 ® K2Zn3[Fe(CN)6]2 + 3K2S04.
Избыток К3[Fe(CN)6] восстанавливают йодидом калия:
2K3[Fe(CN)6] + 2KJ ® J2 + 2K4[Fe(CN)6].
Образующийся йод оттитровывают тиосульфатом:
J2 + 2Na2S2O3 ® Na2S2O4 + 2NaJ
Из приведенных уравнений следует, что между количеством
сахара и количеством израсходованного на титрование тиосульфата имеется обратная зависимость (табл.1).
Ход опыта
Налить в две пронумерованные пробирки по 5 мл 0,45%
раствора ZnSO4 и по 1 мл 0,1 н раствора NaOH. При этом образуется коллоидный раствор гидроксида цинка, который в дальнейшем участвует в осаждении белков крови.
В 1-ю пробирку (опыт) влить 0,1 мл крови. Микропипетку
промыть, набирая и выпуская жидкость пробирки.
Обе пробирки поставить на 3 мин в кипящую водяную баню
для денатурации белков. Укрепить в специальной держалке колбы (1 - опыт и 2 - контроль) и вставить в них воронки со слегка
58
утрамбованными комочками ваты (фильтр). Отфильтровать содержимое пробирок в соответствующие колбы. Каждую пробирку 2 раза ополоснуть по 3 мл дистиллированной водой, сливая
растворы через фильтр (воронку) в соответствующую колбу. Дать
раствору с фильтров хорошо стечь. Прилить непосредственно
в колбы точно по 2 мл титрованного раствора K3Fe(CN)6 и поместить их в кипящую водяную баню на 15 мин. Охладить колбы водопроводной водой и прилить в каждую по 3 мл тройного хлорцинк-йодистого раствора и 2 мл 3% раствора СНзСООН. Добавить
в колбы по 2 капли 1% раствора крахмала и осторожно оттитровать
содержимое каждой колбы из микробюретки (сначала колбу 2,
потом - 1) 0,005 н раствором Na2S2O3 до исчезновения синей окраски.
Используя данные по расходу Na2S2O3, произвести расчет
глюкозы с помощью следующей таблицы.
Пример расчета. Предположим, на титрование колбы
с кровью (опыт) пошло 0,82 мл, а колбы без крови (контроль) 1,99 мл 0,005н раствора Na2S2O3. По таблице находим, что числу
0,82 -соответствует 0,209 мг, а числу 1,99 - 0,002 мг сахара.
Из количества сахара, найденного для крови (0,209 мг), вычесть количество «сахара», которое соответствует восстанавливающему действию реактивов (0,002 мг), получаем 0,207 мг.
Следовательно, в 0,1мл взятой для исследования крови содержится 0,207 мг глюкозы, а в 100 мл крови 207 мг. Для перевода
в единицу системы СИ ммоль/л нужно х мг% умножить на коэффициент 0,0555.
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. Определить количество глюкозы в 100 мл крови опытного
животного.
3. Сделать вывод.
59
Содержание глюкозы в крови при определении по Хагедорну -- Иенсену
0,005н
Nа2S2 О3
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
1,7
1,8
1,9
0,00
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
0,08
0,09
0,385
0,355
0,331
0,310
0,290
0,270
0,251
0,232
0,213
0,195
0,177
0,159
0,141
0,124
0,106
0,088
0,070
0,052
0,034
0,017
0,382
0,352
0,329
0,308
0,288
0,268
0,249
0,230
0,211
0,193
0,175
0,157
0,139
0,122
0,104
0,086
0,068
0,050
0,032
0,015
0,379
0,350
0,327
0,306
0,286
0,266
0,247
0,228
0,209
0,191
0,173
0,155
0,138
0,120
0,102
0,084
0,066
0,048
0,031
0,014
0,376
0,348
0,325
0,304
0,284
0,264
0,245
0,226
0,208
0,190
0,172
0,154
0,136
0,119
0,101
0,083
0,065
0,047
0,029
0,012
0,373
0,345
0,323
0,302
0,282
0,262
0,243
0,224
0,206
0,188
0,170
0,152
0,134
0,117
0,099
0,081
0,063
0,045
0,027
0,010
0,370
0,343
0,321
0,300
0,280
0,260
0,241
0,222
0,204
0,186
0,168
0,150
0,132
0,115
0,097
0,079
0,061
0,043
0,025
0,008
0,367
0,341
0,318
0,298
0,278
0,259
0,240
0,221
,202
0,184
0,166
0,148
0,131
0,113
0,095
0,077
0,059
0,041
0,024
0,07
0,364
0,338
0,316
0,296
0,276
0,257
0,238
0,219
0,200
0,182
0,164
0,146
0,129
0,111
0,093
0,075
0,057
0,039
0,022
0,005
0,361
0,336
0,314
0,294
0,274
0,255
0,236
0,217
0,199
0,181
0,163
0,145
0,127
0,110
0,092
0,074
0,056
0,038
0,020
0,003
0,358
0,333
0,312
0,292
0,272
0,253
0,234
0,215
0,197
0,179
0,161
0,143
0125
0,108
0,090
0,072
0,054
0,036
0,019
0,002
Работа 38. Обнаружение гликогена в тканях животных
Гликоген - животный полисахарид, состоит из остатков глюкозы. В качестве энергетического (в основном) материала он откладывается в запас в органах и тканях. Самое большое его количество находится в печени (2-10%), которая считается депо гликогена, и мышцах (0,5-2%). Его распад происходит путем фосфоролиза (преимущественно в клетках) и гидролиза (в пищеварительном тракте). В последнем случае из гликогена образуются
декстрины и мальтоза. Раствор йода окрашивает гликоген
в
красно-бурый цвет различной интенсивности и оттенков.
60
Ход опыта
В центрифужную пробирку (предварительно взвешена!) поместить 2 г печени, взятой у только что убитого животного (гликоген быстро подвергается ферментативному расщеплению),
и залить ее 2 мл 60% раствора КОН. Поставить на 1 ч в кипящую
водяную баню, перемешивая периодически ее содержимое стеклянной палочкой. Затем пробирку вынуть из бани, охладить водопроводной водой, влить в нее 10 мл этанола и поместить в емкость со льдом на 20-30 мин. Выпавший осадок гликогена отделить путем центрифугирования при 3000 об/мин в течение
5-10 мин. Надосадок слить, а осадок растворить в 2 мл 15% раствора КОН, добавить в него 10 мл этанола, вновь охладить и отделить также центрифугированием. Надосадок слить. Пробирку
с осадком гликогена взвесить и, вычтя из полученного показателя
первоначальный вес пробирки, найти массу гликогена. После
этого проделать качественную реакцию на гликоген, для чего
осадок растворить в 5 мл дистиллированной воды и добавить
к нему 1 каплю 1% раствора йода.
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. Выделить гликоген из печени и сделать вывод о его количестве в ткани этого органа.
3. Подтвердить наличие гликогена по реакции с йодом.
Вопросы для самоподготовки по теме 8
1. Основные углеводы (моно-, ди- и полисахариды), встречающиеся в организме, а также используемые в кормлении и лечении животных. Их характеристика и биороль.
2. Переваривание и всасывание углеводов у животных с одно- и многокамерным желудком (реакции, ферменты). Усвоение
клетчатки.
3. Гидролиз и фосфоролиз полисахаридов (крахмал и гликоген). Место протекания в организме, схемы и роль процессов.
4. Содержание сахара в крови (нормо-, гипо- и гипергликемия - понятие, причины, последствия) и его регуляция.
5. Синтез гликогена (схема и роль процесса).
61
6. Гликолиз (понятие, виды, место протекания в природе
и организме животных, схемы-реакции с (пояснениями, роль
процесса).
7. Пути использования лактата и пирувата в клетках животных (схемы и роль процессов).
8. Цикл трикарбоновых кислот Кребса (понятие, место протекания в природе и организме животных, схемы-реакции с пояснениями, роль процесса).
9. Пентозофосфатный путь превращения углеводов. Схема
и роль процесса.
10. Нарушения и регуляция обмена углеводов у животных.
ТЕМА 9. ЛИПИДЫ И ИХ ОБМЕН
К липидам относятся природные органические соединения,
не растворимые в воде, а растворимые в неполярных органических растворителях (хлороформе, эфире, бензоле и др.).
Липиды выполняют в организме важнейшие биологические
функции: они входят в состав клеточных мембран, играют важную роль в функционировании нервной системы, являются запасными веществами, в форме которых депонируется метаболическое топливо, выполняют защитную роль. Некоторые из этих
веществ выполняют функции светочувствительных пигментов,
гормонов и т.д.
Липиды подразделяются по химическому строению на следующие группы:
1. Жирные кислоты.
2. Триацилглицеролы.
3. Воска.
4. Фосфоглицериды: а) фосфатидилэтаноламин; б) фосфатидилхолин; в) фосфатидилсерин; г) фосфатидилинозитол;
д) кардиолипин.
5. Сфинголипиды: а) сфингомиелин; б) цереброзиды;
в) ганглиозиды.
6. Терпены, стеролы и их эфиры с жирными кислотами.
62
Работа 39. Изучение растворимости жира
Растворимость - это способность частиц растворяемого вещества распределяться среди молекул растворителя, зависит от
многих факторов: природы растворяемых веществ и растворителя, температуры, давления, примесей и т. д. Показателем растворимости является прозрачность раствора, его равномерная окраска и др. В организме универсальный растворитель - вода.
Ход опыта
В три пробирки внести по 5 капель подсолнечного масла.
В 1-ю прилить 2 мл воды, во 2-ю - 2 мл этанола, в 3-ю -2 мл хлороформа. Смесь в пробирках хорошо встряхнуть и отметить растворимость жира.
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. Определить (указав на наиболее характерный признак)
в чем жир хорошо растворим, в чем плохо, а в чем совсем нерастворим.
3. Где свойство растворимости жира в определенных растворителях можно использовать в практике ветеринарии животноводства?
Работа 40. Определение кислотного числа жира
Кислотное число свидетельствует о содержании в жире свободных жирных кислот, которые могут образовываться при его
разложении, например, при хранении и т. д. Оно равно количеству мг 0,1 н раствора КОН, пошедшего на нейтрализацию свободных жирных кислот в 1 г жира.
Ход опыта
В две колбочки налить по 1 г подсолнечного масла разного
срока хранения, добавить по 10 мл смеси спирта с эфиром (1:2)
и хорошо перемешать. Внести в каждую колбочку по 3 капли
0,1% раствора фенолфталеина и быстро оттитровать 0,1н раствором КОН до розовой окраски, не исчезающей 1 мин.
63
Кислотное число определить по формуле:
а ´ 5,6 ´ в
КЧ =
,
с
где Кч - кислотное число;
а - количество мл 0,1 н раствора КОН, используемого на
титрование пробы;
5,6 - количество мг КОН, содержащихся в 1 мл 0,1 н раствора КОН;
в - коэффициент поправки на 0,1 н раствора КОН;
с - навеска жира, мг.
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. Определить кислотное число 1 и 2-й колб и сделать заключение, какое масло хранилось более длительно.
3. Написать реакцию нейтрализации любой жирной кислоты
гидроксидом калия.
Работа 41. Исследование эмульгирования жира
Эмульгирование жира заключается в снижении с помощью
различных эмульгаторов (соли парных желчных кислот, белки,
фосфатиды, мыла, гидрокарбонаты Na и К и другие вещества)
поверхностного натяжения жировых капель и распад их вследствие этого на массу более мелких капелек. Благодаря этому процессу молекулы жира последних становятся доступнее для действия липазы и гидролиза в пищеварительном тракте.
Ход опыта
В 1-ю пробирку налить 1 мл дистиллированной воды, во 2-ю
- 1 мл желчи, в 3-ю - 1 мл 1% раствора альбумина, в 4-ю - 1 мл
1% раствора NaHCO3, в 5-ю – 1 мл 1% раствора мыла и в 6-ю 1 мл 1% раствора фосфатида. Затем во все пробирки внести по
5 капель подсолнечного масла, энергично встряхнуть, оставить на
5 мин и провести наблюдение в плане образования и сохранения
эмульсии.
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. Отметить, в каких пробирках и почему образовалась
64
эмульсия и какова ее дисперсность. Назвать эмульгаторы.
3. В какой пробирке не произошло эмульгирования жира
и почему?
4. Указать биологическую роль и практическое значение
эмульгирования жиров.
Работа 42. Изучение механизма переваривания липидов
и определение активности панкреатической
липазы (КФ 3. 1. 1. 3)
Липаза синтезируется в поджелудочной железе и по ее протоку, поступает в 12-перстную кишку. В ней и других отделах
тонких кишок энзим гидролизует жир на глицерин и жирные кислоты.
По количеству щелочи, израсходованной на титрование образующихся вследствие гидролиза жира жирных кислот, определяют активность липазы.
Ход опыта
В три колбы налить по 10 мл молока и по 8 мл воды. Затем
в 1-ю колбу добавить 0,5 мл воды, во 2-ю и 3-ю - по 0,5 мл желчи.
Внести в колбы по 10 капель 1% раствора фенолфталеина и нейтрализовать содержимое каждой колбы с помощью пипеткикапельницы 0,1 н раствором NaOH (не учитывая его количества)
до розовой окраски. При этом происходит нейтрализация свободных жирных кислот, всегда имеющихся в пробе, а жир остается
в качестве субстрата липазы.
Влить в 1-ю и 2-ю колбы по 1 мл вытяжки панкреатической
липазы. Поставить все три колбы в термостат при +37°С. Через
15 мин быстро оттитровать содержимое колб (где исчезла окраска) 0,05 н раствором NaOH до слабо-розового цвета или окраски
(если она есть) 3-й колбы. Расход NaOH записать в таблицу. Процесс титрования повторить два раза с промежутком 15 мин, т.е.
через 30 и 45 мин с момента добавления липазы. Результаты внести в таблицу.
65
Колбы
1
2
3
Расход (мл) 0,05н р-ра
NaOH на титрование
через мин:
Состав инкубируемой смеси, мл
молоко
вода
желчь
липаза
10
10
10
0,5
-
0,5
0,5
1
1
-
15
30
45
всего
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. Написать реакции:
а)
гидролиза
арахидоно-дистеарина,
линолеводипальмитина, линоленово-диолеина и назвать получившиеся
продукты, дать им характеристику с позиций биологической ценности;
б) нейтрализации образовавшихся жирных кислот щелочью.
3. Рассчитать активность липазы, принимая условно за 1 ЕД
1 мл 0,05 н раствора NaOH, израсходованного на титрование
жирных кислот, образовавшихся в результате действия энзима
в течение 1 ч при оптимальных условиях (по 2-й колбе).
4. Сравнив данные по расходу NaOH на титрование 1-й
и 2-й колб, сделать вывод о роли желчи в действии липазы при
гидролизе жира.
5. Изобразить графически в виде кривых характер гидролиза
жира, откладывая на оси абсцисс время, а на оси ординат – расход NaOH на титрование за 15, 30, 45 мин, т.е. нарастающим итогом. Обосновать кривые графика теоретически с использованием
данных опыта.
Работа 43. Определение количества общего холестерола
в сыворотке крови по методу Илька
Холестерол является циклическим непредельным одноатомным высокомолекулярным спиртом. С жирными кислотами об66
разует жиры-холестериды. Связанный холестерол может быть
в фосфолипидах, комплексе с белками. Содержание его равно 7080% от общего (всего) холестерола, а на свободный холестерол
приходится до 20-30%. Холестерол используется для синтеза витаминов группы Д, желчных кислот, половых гормонов, гормонов коры надпочечников и других веществ. Метод основан на образовании изумрудно-зеленой окраски холестерола с реактивом
Илька (ледяная уксусная кислота, уксусный ангидрид и концентрированная H2SO4 в соотношении 1:5:1) и последующим колориметрическом определении на ФЭК или СФ оптической плотности (Д) раствора в сравнении с контролем.
Ход опыта
Налить в сухую пробирку 4 мл реактива Илька, добавить
0,2 мл негемолизированной сыворотки крови, энергично (не менее 10 раз) встряхнуть и поставить в темное место (термостат)
при 37°С.
По истечении 20 мин определить Д опыта против контроля
(4,2 мл реактива Илька) на ФЭКе при длине волны 630—690 нм
(красный светофильтр), используя кюветы толщиной слоя 5 мм.
По калибровочной кривой найти количество холестерола в пробе
и произвести расчет его содержания.
Построение калибровочной кривой
Приготовить стандартный раствор (2 мг/мл) холестерола
и налить его в 5 пробирок: соответственно 0,25, 0,5, 1,0, 2,5
и 3 мл. Выпарить в водяной бане досуха, добавить в каждую пробирку по 4,2 мл реактива Илька и произвести колориметрирование. Затем построить график, откладывая на оси абсцисс количество холестерола в пробе, а на оси ординат - оптическую плотность.
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. Определить содержание холестерола в 100 мл сыворотки
крови подопытного животного.
3. Сравнить полученный показатель с его нормой для этого
67
животного и в случае отклонения указать предполагаемые причины и последствия.
4. Написать структурную формулу холестерола.
Работа 44. Обнаружение ацетоновых тел в биологических
жидкостях
Ацетоновыми, или кетоновыми телами называют b-гидроксимасляную кислоту, ацетоуксусную кислоту и ацетон.
Они являются продуктами неполного окисления жирных
кислот и накопления их в организме, но особенно появление
и обнаружение ацетона в крови, молоке, моче свидетельствуют
не только о явной патологии обмена липидов, но и о нарушении
в определенной степени метаболизма углеводов и даже белков.
СН3
СН3
СН2 - 2Н+е
СН
СН2
СН
СООН
масляная
кислота
СН3
СН3
СН3
+НОН СНОН - 2Н+е С=О - СО2 С=О
СООН
кротоновая
кислота
СН2
СООН
b-гидроксимасляная
кислота
СН2
СН3
ацетон
СООН
ацетоуксусная
кислота
Опыт 1. Обнаружение ацетона в моче
Проба основана на образовании йодоформа из реакции ацетона с йодом в присутствии щелочи. При положительной реакции
образуется желтоватая муть раствора и чувствуется специфический запах йодоформа.
Налить в 2 пробирки по 3 мл мочи от различных животных.
Прибавить в каждую по 5 капель 10% раствора NaOH и 5 капель
реактива Люголя (10 г йода, 20 г КJ растворяют в 100 мл воды).
Растворы встряхнуть и отметить выявленные изменения.
Задание:
1. Выполнить опыт.
68
2. Сделать заключение о наличии ацетона в пробах мочи.
3. Написать реакцию образования йодоформа.
Опыт 2. Обнаружение ацетона и ацетоуксусной кислоты
в моче (проба Ланге)
Проба основана на появлении вишнево-фиолетового окрашивания (в виде кольца на границе двух растворов) вследствие
реакции определяемых веществ, ледяной уксусной кислоты, нитропруссида натрия и концентрированного раствора аммиака.
Налить в 2 пробирки по 3 мл мочи от различных животных.
Прилить в каждую по 1 мл ледяной уксусной кислоты и по 0,5 мл
10% нитропруссида натрия и перемешать.
Потом, держа пробирки под углом 45°, осторожно, по стенке наслоить в каждую по 1 мл концентрированного раствора аммиака. Пробирки осторожно, не встряхивая, поставить в штатив
и отметить обнаруженные изменения.
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. Сделать вывод о наличии в пробах мочи ацетона и ацетоуксусной кислоты.
3. Написать схему образования ацетоновых тел.
Опыт 3. Обнаружение ацетоновых тел с помощью
индикаторных таблеток
Каплю исследуемой мочи нанести на индикаторную таблетку. Через 30 с сравнить появляющееся фиолетовое окрашивание
(положительная реакция) со стандартной шкалой.
Задание: выполнить опыт и сделать заключение о наличии
ацетоновых тел в пробах мочи различных животных.
Опыт 4. Обнаружение ацетоновых тел с помощью
индикаторной бумаги
Конец индикаторной бумаги опустить в исследуемую пробу
мочи.
Через 1 мин сравнить окраску бумаги со стандартной шкалой, учитывая, что в случае отрицательной реакции цвет бумаги
69
останется без изменений или приобретет кремовый оттенок от
увлажнения.
Задание: выполнить опыт и сделать вывод о содержании
ацетоновых тел в пробах мочи разных животных.
Вопросы для самоподготовки по теме 9
1. Липиды и липоиды (понятие, свойства, классификация,
биороль).
2. Холестерол (строение, роль, производные).
3. Желчные кислоты (представители, строение, роль).
4. Фосфолипиды (строение, представители, роль).
5. Сфинголипиды (строение, представители, роль).
6. Нейтральные жиры (строение, переваривание, всасывание
продуктов гидролиза, роль желчных кислот в этих процессах).
7. Жирные кислоты (высшие, низшие, заменимые, незаменимые, предельные, непредельные), строение, представители,
роль.
8. Пути использования глицерина и жирных кислот
(b-окисление - схема и др.) в клетках. Роль процессов.
9. Ацетоновые тела (представители, причины и схема их образования, пути устранения).
10. Регуляция обмена липидов у животных с целью сохранения их здоровья и повышения продуктивности.
ТЕМА 10. ГОРМОНЫ
Гормоны - это биологически активные вещества, синтезируемые железами внутренней секреции и выделяющиеся в кровь
или лимфу. Через посредство ферментов они в ничтожно малых
количествах оказывают регулирующее влияние на течение физиолого-биохимических процессов в клетках, тканях и органахмишенях. По химической природе это белки (СТГ, ТТГ и др),
пептиды (АКТГ, глюкагон и др.), производные амино- (адреналин, тироксин и др.) и жирных (простагландины) кислот, стероидные соединения (половые гормоны, кортикостероиды).
70
Работа 45. Изучение влияния адреналина на содержание
сахара в крови животного
Адреналин синтезируют из тирозина и фенилаланина клетки
мозгового слоя надпочечников. Из них он кровью доставляется
в печень (и другие места), где увеличивает синтез циклической
АМФ. Последняя активирует фосфоролиз гликогена, вследствие
чего увеличивается содержание сахара в крови - гипергликемия.
Сущность работы заключается в определении количества
сахара в крови подопытного животного до и после введения ему
адреналина.
Ход опыта
1. Определение количества сахара в крови подопытного животного (кролик, корова и др.) до введения адреналина.
Взять из ушной вены кролика (или яремной вены коровы)
кровь в пробирку, куда предварительно внести антикоагулянт гепарин (в зависимости от чистоты препарата 1 мг на 20-100 мл
крови). Кровь перемешать во избежание свертывания и все дальнейшие операции выполнять в соответствии с методикой работы
37.
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. Определить количество сахара в крови животного до введения адреналина и сделать заключение о его содержании.
3. Определить количество сахара в крови животного после
введения адреналина и сделать заключение о его содержании.
4. Произвести сравнение данных по количеству сахара до
и после введения адреналина и сделать вывод о влиянии гормона
на уровень глюкозы в крови.
5. Написать структурную формулу адреналина.
Вопросы для самоподготовки по теме 10
1. Гормоны (понятие, химическая природа, классификация,
механизм действия, значение в регуляции обмена веществ).
2. Строение и биологическая роль гормонов гипоталамуса,
гипофиза, щитовидной, паращитовидной, поджелудочной, вилоч71
ковой (зобной) и половых желез, эпифиза и надпочечников.
3. Использование гормонов в животноводстве и ветеринарии.
ТЕМА 11. ВИТАМИНЫ
Витамины - физиологически активные вещества, принимающие разнообразное участие в обмене веществ живых организмов непосредственно или в составе сложных ферментов в виде коферментов и простетических групп.
Витамины - органические вещества с разнообразным строением молекул и различными физико-химическими свойствами.
Все витамины подразделяются на две большие группы: жирорастворимые (A, D, E, K) и водорастворимые (витамины группы В,
аскорбиновая кислота) .
Определение их в организме и кормах имеет существенное
значение, так как от них зависят здоровье и продуктивность животных. Недостаток витаминов в организме (гиповитаминоз)
и избыток (гипервитаминоз) имеют отрицательные последствия.
Работа 46. Обнаружение витамина А в жире
Витамин А (ретинол, антиксерофтальмический витамин) находится главным образом в организме животных. В растениях
обнаружены его предшественники (провитамины) - каротины,
при гидролизе которых в организме из них образуется витамин А.
Проба с H2SO4. В три сухие пробирки внести соответственно вазелиновое масло, подсолнечное масло и препарат витамина
А - по 2 капли. Добавить в каждую пробирку под вытяжным
шкафом по 1 мл хлороформа. Перемешать и очень (!) осторожно
внести по 1 капле концентрированной H2SO4. Появление краснофиолетового окрашивания, переходящего в красно-бурое, свидетельствует о наличии витамина А в пробе.
Проба с треххлористой сурьмой. В три сухие пробирки
внести соответственно вазелиновое масло, подсолнечное масло
и препарат витамина А - по 2 капли. Добавить в каждую под вытяжным шкафом около 1 мл 33% хлороформного раствора сурьмы. Появление синего окрашивания свидетельствует о наличии
ретинола.
72
Задание:
1. Выполнить опыт-пробу с H2SO4 или с треххлористой
сурьмой.
2. Определить ретинол в вазелиновом масле, подсолнечном
масле и препарате витамина А и сделать вывод о его наличии
в них.
3. Указать практическое значение качественных проб на витамин А.
4. Написать схему образования из b-каротина ретинола
и отметить биороль последнего.
Работа 47. Обнаружение витамина Д в жире
Витамин Д (кальциферол, антирахитический витамин) содержится в организме животных. Здесь же он может образоваться
под действием ультрафиолетовых лучей из провитаминов 7-дегидрохолестерола (витамин Д3) и эргостерола (витамин Д2).
Бромхлороформная проба. В три сухие пробирки внести
соответственно вазелиновое масло и препарат витамина Д - по
2 капли и по 2 капли (под вытяжным шкафом) раствора брома
в хлороформе (1:60).
При наличии витамина Д появляется зеленовато-голубая окраска раствора.
Анилиновая проба. В три сухие пробирки внести соответственно вазелиновое масло, подсолнечное масло и препарат витамина Д - по 2 капли. Добавить в каждую пробу по 10 капель
хлороформа и по 1 капле анилинового реактива (15 частей анилина + 1 часть концентрированной НCl). Очень осторожно нагреть. При наличии витамина Д желтая эмульсия приобретает
красный цвет.
Задание:
1. Выполнить опыт с бромхлороформной или анилиновой
пробой.
2. Определить кальциферол в вазелиновом масле, подсолнечном масле и препарате витамина Д, сделать заключение о его
наличии в них.
3. Указать прикладное значение качественных проб на ви73
тамин Д.
4. Написать схемы образования витаминов Д2 и Д3 из их
провитаминов и отметить биороль кальциферолов.
Работа 48. Обнаружение витамина С в биоматериале
Витамин С (аскорбиновая кислота, антицинготный витамин)
синтезируется в организме животных (кроме морской свинки,
обезьяны и человека). Животные испытывают большую необходимость в витамине во время беременности, при различных заболеваниях и т.д. В этих случаях особенно, как и вообще, потребности в нем организма должны покрываться за счет его поступления с растительным кормом, лучше зеленым.
Ход опыта
Взять кусочек растительного материала (силос, лист капусты, картофель и т. д.), растереть его в ступке. Залить дистиллированной водой. Перемешать. Отфильтровать. Налить в 1-ю пробирку (контроль) 1 мл дистиллированной воды, во 2, 3 и 4-ю - по
1 мл фильтрата. В 3-ю добавить 0,1 н раствора НСl, а в 4-ю 5 капель 0,1 н раствора NaOH, обе прокипятить и охладить водопроводной водой. Затем в каждую пробирку внести по 1 капле
свежеприготовленного 1% раствора красной кровяной соли –
К3Fе(СN)6 и по 1 капле 1% раствора FеС13.
При наличии витамина С в пробе появляется синее окрашивание, а при стоянии образуется осадок берлинской лазури.
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. Определить и сделать вывод, есть ли витамин С в исследуемом материале.
3. Как влияют высокая температура и реакция среды на сохранность аскорбиновой кислоты?
5. Написать строение витамина С и схему его разложения.
74
Работа 49. Определение количества витамина С
в сыворотке крови с помощью 2,6-дихлорфенолиндофенола
(краска Тильманса)
Метод основан на способности витамина С, окисляясь, восстанавливать щелочной раствор 2,6-дихлорфенолиндофенола, который при этом обесцвечивается. По окончании реакции недиссоциированные молекулы 2,6-дихлорфенолиндофенола окрашивают кислый раствор пробы (добавлена НСl) в розовый цвет.
Ход опыта
Налить в 1-ю колбу (опыт) 1 мл сыворотки крови и 3,5 мл
дистиллированной воды, а во 2-ю (контроль) - 4,5 мл дистиллированной воды. Добавить в обе колбы по 0,5 мл 0,1 н раствора
НСl и оттитровать их содержимое осторожно из микробюретки
0,001 н раствором 2,6-дихлорфенолиндофенола до розовой окраски, не исчезающей 30 с. Для расчета использовать формулу:
Х = 5 · (Оп - К) · П · 0,088 · 100,
где Х - количество мг витамина С в 100 мл сыворотки крови;
5 - степень разведения сыворотки в исследуемой пробе;
Оп - расход краски на титрование исследуемой пробы, мл;
К - расход краски на титрование контрольной пробы, мл;
П - коэффициент поправки на титр краски;
0,088 - количество мг аскорбиновой кислоты, соответствующее 1 мл 0,001 н раствора краски;
100 - коэффициент пересчета на 100 мл сыворотки (мг%).
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. Определить количество аскорбиновой кислоты в пробе
сыворотки крови.
3. Сравнить полученный показатель с его нормальным содержанием у подопытного животного и в случае отклонения указать предполагаемые причины и возможные пути нормализации
обеспеченности животного витамином С.
Вопросы для самоподготовки по теме 11
1. Витамины (понятие, классификация, основные свойства
75
классов, номенклатура, распространение в животных и растительных объектах).
2. А-, гипо- и гипервитаминозы (понятия, причины, последствия, возможные пути устранения, примеры) .
3. Связь витаминов с ферментами и другими белками (какие
витамины, примеры).
4. Провитамины и антивитамины (понятия, примеры, место
их в метаболизме витаминов, примеры).
5. Жирорастворимые витамины (А, Д, Е, К), их строение,
наиболее характерные свойства, роль в организме, использование
в животноводстве и ветеринарии.
6. Водорастворимые витамины (В1, В2, В6, В12, В15, РР, Н, Вс,
ПАБК, С, пантотеновая кислота, инозит, холин и др.), их строение, наиболее характерные свойства, роль в обмене веществ, использование в животноводстве и ветеринарии.
ТЕМА 12. МИНЕРАЛЬНЫЕ ВЕЩЕСТВА И ВОДА
В организме животных находится 60-75% воды и обнаружено около 70 (из 107 известных) химических элементов, содержание которых колеблется от 1/1000% (макроэлементы Na, Са и др.)
до 1/1млн. % (микроэлементы J, Zn, Co и др.) и меньше 1/1млн. %
(ультрамикроэлементы Аu, U, Ra и др.).
Биологическая роль многих веществ 1 и 2-й групп в разной
степени установлена. Она весьма значительна и разнообразна.
Поэтому определение их содержания в тканях, органах и биологических жидкостях важно с позиций не только их метаболизма,
но и состояния здоровья и продуктивности животных.
Работа 50. Определение количества кальция в сыворотке
крови по де Ваарду
В норме количество кальция в сыворотке крови сельскохозяйственных животных колеблется от 10-13 мг% (у коров) до 2326 мг% (у коз). Повышение содержания кальция в крови (гиперкальцинемия) наблюдается при увеличении синтеза паратиреоидина, гипервитаминозе Д, деструктивных процессах в кости и т.
д. Гипокальцинемия (уменьшение количества кальция в крови)
76
наблюдается при родильном парезе, рахите, остеомаляции, недостатке элемента в рационе и т. д.
Метод основан на осаждении кальция из сыворотки крови
в виде оксалата кальция и последующего титрования щавелевой
кислоты, образующейся вследствие растворения осадка.
Ход опыта
В центрифужную пробирку 1 (опыт) налить 2 мл дистиллированной воды и 2 мл сыворотки крови.
Во 2-ю центрифужную пробирку (контроль), равную по
массе 1-й, влить 4 мл дистиллированной воды.
Добавить в обе пробирки по 1 мл 4% раствора щавелевокислого аммония – (COONH4)2, встряхнуть и оставить на 30 мин для
осаждения кальция.
Затем пробы отцентрифугировать в течение 5 мин при
1500 об/мин. Надосадочную жидкость из пробирок слить, а их
края протереть фильтровальной бумагой.
Налить в пробирки по 4 мл 2% раствора аммиака, слегка
встряхнуть и вновь отцентрифугировать в течение 5 мин при
1500 об/мин. Надосадочную жидкость слить.
В пробирки добавить по 2 мл 1 н раствора H2SO4, размешать
осадок стеклянными палочками и, не вынимая их, погрузить пробы в горячую водяную баню на 2 мин для растворения осадка, из
которого при реакции с H2SO4 образуется щавелевая кислота.
Оттитровать пробы (сначала 1-ю, потом 2-ю) из микробюретки 0,01 н раствором КМn04, помешивая палочками еще горячий раствор, до появления розового окрашивания, не исчезающего в течение 1 мин. Количество оттитрованной щавелевой кислоты при этом равно содержанию кальция в пробе. Произвести
расчет по формуле:
Х=0,2 · (а—в) · 50,
где X - количество мг кальция в 100 мл сыворотки крови;
0,2 - количество мг кальция, соответствующее 1 мл 0,01н
раствора КМnО4;
а - количество мл КМnО4, израсходованное на титрование
пробы с сывороткой крови;
77
в - количество мл КМnО4, пошедшее на титрование контрольной пробы;
50 - коэффициент пересчета на 100 мл сыворотки.
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. Определить количество кальция в сыворотке крови подопытного животного.
3. Сравнить полученный показатель с содержанием кальция
для этого животного в норме и в случае отклонения указать
предполагаемые причины и возможные пути исправления количества элемента в крови к норме (нормокальцинемия).
4. Указать биологическую роль кальция.
Примечание. Для того чтобы перевести содержание Са
в единицы системы СИ, надо найденную его величину в мг% умножить на коэффициент 0,2495, получим количество Са в моль/л.
Работа 51. Определение содержания кальция в сывороткe крови комплексонометрическим методом
Метод основан на непосредственном титровании двунатриевой солью этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА; трилон
Б) ионов кальция, связанных с мурексидом (окрашен в розовый
цвет), который, отделяясь от кальция вследствие титрования
ЭДТА, окрашивает раствор в фиолетовый цвет. По расходу
ЭДТА на титрование ведут расчет количества кальция.
Ход опыта
Налить в 1-ю колбу (опыт) 1 мл сыворотки крови и 24 мл
дистиллированной воды, а во 2-ю колбу (контроль) - 25 мл дистиллированной воды.
В обе колбы прилить по 2 мл 10% раствора КОН и внести по
несколько кристалликов (на кончике скальпеля) мурексида. Раствор приобретает розовый цвет.
Содержимое колб оттитровать 0,01 н раствором ЭДТА до
фиолетового окрашивания раствора. Расчет произвести по формуле:
78
Х = (а— в) · 0,2 · 100,
где: X - количество мг кальция в 100 мл сыворотки крови;
а - количество мл ЭДТА, израсходованное на титрование
пробы сыворотки крови;
в - количество мл ЭДТА, израсходованное на титрование
контрольной пробы;
0,2 - количество мг кальция, эквивалентное 1 мл 0,01 н раствора ЭДТА;
100 - коэффициент пересчета в мг%.
Работа 52. Определение количества неорганического
фосфора в сыворотке крови
Содержание неорганического фосфора в сыворотке крови
сельскохозяйственных животных в норме колеблется от 3 - 4 мг%
(свиньи) до 6,5 – 7,0 мг% (телята). Понижение его уровня наблюдается при гиповитаминозе Д, остеомаляции, недостатке в кормах
и т. д.
Сущность метода заключается в образовании комплексной
фосфорномолибденовой кислоты, восстанавливаемой с помощью
витамина С, эйконогена и других веществ (восстановители)
в продукты, придающие раствору синюю окраску (молибденовая
синь). Ее интенсивность пропорциональна количеству фосфора.
Ход опыта
Налить в пробирку (опыт) 3 мл дистиллированной воды,
1 мл сыворотки крови, 1 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты, встряхнуть и отфильтровать через обеззоленный фильтр.
Взять 1 мл фильтрата, добавить к нему 0,5 мл молибденового реактива, 0,5 мл 1% раствора аскорбиновой кислоты и 3 мл
дистиллированной воды. Встряхнуть содержимое. Образуется
синяя окраска раствора.
Одновременно приготовить контроль, для чего налить
в пробирку 0,2 мл 20% раствора трихлоруксусной кислоты, 0,5
мл молибденового реактива, 0,5 мл 1% раствора аскорбиновой
кислоты и 3,8 мл дистиллированной воды. Через 10 мин провести
колориметрию растворов на ФЭКе при длине волны 630—690 нм
79
(красный фильтр) в кюветах шириной 1 см.
Используя калибровочную кривую, построенную ранее со
стандартным раствором фосфора, рассчитать его количество
в исследуемой пробе сыворотки крови.
Построение калибровочной кривой
Из КН2РО4 приготовить стандартный раствор с содержанием фосфора 0,02 мг/мл. Налить его в 7 пробирок (соответственно
0,10; 0,15; 0,20; 0,25; 0,30; 0,35 и 0,40 мл) и довести дистиллированной водой до 0,8 мл. Затем в каждую пробирку влить 0,2 мл
20% раствора трихлоруксусной кислоты, 0,5 мл молибденового
реактива, 0,5 мл 1% раствора аскорбиновой кислоты и 3 мл дистиллированной воды. Встряхнуть содержимое пробирок и через
10 мин произвести их колориметрию против контроля (его приготовление см. выше!). Для построения графика отложить на оси
абсцисс количество мг фосфора в пробе, а на оси ординат - ее оптическую плотность (Д).
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. Определить количество мг фосфора в исследуемой пробе
и сделать пересчет на 100мл сыворотки крови (в мг%) подопытного животного.
3. Сравнить полученный результат с содержанием фосфора
у этого животного в норме и при отклонении, указать предполагаемые причины и последствия.
Вопросы для самоподготовки по теме 12
1. Вода, ее количество, распределение и состояние в организме, образование в клетках (пример реакций), биороль в метаболизме (подтвердить формулами, реакциями, схемами, процессами), регуляция содержания, выделение из организма.
2. Макро- и микроэлементы (понятие, представители, поступление в организм, механизм усвоения, участие в химии клеток, тканей и органов, выделение из организма).
3. Использование
минеральных
веществ
и
воды
в животноводстве и ветеринарии.
80
ТЕМА 13. КРОВЬ
Кровь – это непрозрачная тканевая жидкость, красного цвета, в количестве 7 – 15% от массы тела. Она имеет определенный
состав клеток и различных веществ, изменения в содержании которых отражаются на состоянии организма, и, наоборот, заболевания приводят к изменению показателей крови.
Работа 53. Определение активности каталазы
(КФ 1.11.1.6) в крови по Баху и Зубковой
Каталаза разлагает перекись водорода, которая считается
клеточным ядом, на воду и кислород:
2H202 ® 2H20+02-.
Фермент содержится в большом количестве в эритроцитах,
предохраняя гемоглобин от окисляющего действия Н2О2. Повышение активности каталазы наблюдается при пернициозной анемии, а снижение - при туберкулезе, вирусном гепатите, лейкозе
крупного рогатого скота и т. д.
Сущность метода заключается в том, что об активности каталазы судят по количеству разрушенной перекиси водорода.
Ход опыта
Приготовить раствор крови 1:1000. Для этого отмерить
в пробирку 10 мл дистиллированной воды, прибавить 0,01 мл
крови и перемешать.
Отмерить в две колбы по 7 мл дистиллированной воды
и внести в каждую по 1 мл приготовленного раствора крови.
Содержимое 1-й колбы (контроль) прокипятить в течение
2 мин и охладить водопроводной водой до комнатной температуры.
Влить в каждую колбу точно по 2 мл 1% раствора Н2О2,
а через 30 мин – по 5 мл 10% раствора Н2SО4. (Для визуального
наблюдения за работой каталазы в пробирку с оставшейся кровью прилить 2 мл 1% раствора Н2О2.).
Оттитровать содержимое колб 0,1 н раствором КМnО4 до
появления розового окрашивания и произвести расчет активности
фермента по формуле
81
А = (К - О) · 0,7,
где А – активность каталазы (каталазное число) в ЕД. За 1 ЕД
принимают 1 мг Н2О2, разрушенной каталазой из 1 мкл крови за
30 мин при оптимальных условиях;
К – количество мл 0,1 н раствора КМnО4, израсходованное
на титрование контроля;
О – количество мл 0,1 н раствора КМnО4, израсходованное
на титрование опыта;
1,7 - количество мг Н2О2 в 1 мл ее 0,1 н раствора, равное соответственно 1 мл 0,1 н раствора КМnО4.
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. Определить активность каталазы в крови подопытного
животного и сделать вывод о соответствии ее нормальному показателю.
3. В случае отклонения активности каталазы от нормы указать предполагаемые причины.
4. По наблюдению за происходящим в пробирке с кровью
отметить характерный признак работы каталазы.
Работа 54. Обнаружение гемина в крови
В красные кровяные клетки крови (эритроциты) входит белок гемоглобин. Он состоит из простого белка (протеин глобин)
и гема (небелковая часть).
Гем является сложным соединением, состоящим из 4 пиррольных колец и содержащим двухвалентное железо.
При действии на гемоглобин кислотой гем отщепляется
и в присутствии хлористого натрия переходит в гемин, в котором
железо уже трехвалентное. Кристаллы гемина имеют характерную ромбическую форму и бурый цвет.
Ход опыта
Нанести на предметное стекло каплю крови. Высушить ее
при комнатной температуре (или очень слабом нагревании). На
высушенное пятно крови нанести 1-2 капли ледяной уксусной
кислоты, в 100 мл которой растворено 0,3 г NaСl или КСl. На82
крыть покровным стеклом и осторожно слегка нагреть на слабом
пламени до закипания (но не до кипения).
Рассмотреть препарат под микроскопом.
Задание:
1. Получить кристаллы гемина.
2. Найти и зарисовать их вид под микроскопом.
3. Написать структурные формулы гема и гемина.
4. Указать, какое практическое значение может иметь эта
работа.
Работа 55. Спектральный анализ гемоглобина
и его производных
В крови имеются такие производные гемоглобина (Нb), как:
а) оксигемоглобин (Нb02) - соединение Hb с кислородом,
б) карбоксигемоглобин (СОНb) - соединение Нb с угарным
газом,
в) метгемоглобин (MtHb) - продукт окисления Нb, в котором
железо уже трехвалентное. Он появляется при отравлении.
Обнаружение указанных окрашенных веществ (пигменты)
в крови имеет клиническое значение в диагностике заболеваний
и в других случаях.
Принцип метода основан на использовании специального
прибора (спектроскоп), который разлагает видимый свет, проходящий через окрашенный раствор, и проходящий свет дает характерный для каждого вещества спектр поглощения.
Ход опыта
1. Обнаружение НbО2. Дефибринированную кровь развести
пятью объемами воды и наблюдать в спектроскоп. Затем кровь
постепенно разбавлять и вновь наблюдать в спектроскоп. По мере разведения крови, начиная с 0,1% концентрации, при толщине
слоя в 1 см становятся видны 2 полосы поглощения между фраунгоферовыми линиями Д и Е. Это и есть характерный спектр
поглощения НbО2.
Фраунгоферовы линии - это узкие полосы поглощения веществ, которые содержатся в атмосфере солнца в виде паров
83
и поглощают определенные лучи света, испускаемого раскаленной солнечной массой. На основании длин волн, соответствующих фраунгоферовым линиям, была построена шкала, дающая
возможность точно определить положение в спектре полос поглощения различных веществ.
2. Обнаружение Нb. В выпущенной из кровеносного сосуда
крови не может быть восстановленного Нb. Поэтому для изучения спектра поглощения Нb необходимо сначала получить Нb из
НbО2. Для этого к раствору НbО2 (см. пункт 1) прилить несколько
капель реактива Стокса (состоит из 1 части сернокислого железа,
2 частей виннокаменной кислоты, растворенных в 15 частях
подщелоченной аммиаком дистиллированной воды).
Восстановленный Нb дает только одну широкую полосу поглощения между линиями Д и Е.
3. Обнаружение MtHb. Для его получения дефибринированную кровь развести пятью объемами воды, добавить несколько капель железосинеродистого калия и взболтать. Жидкость
приобретет красно-бурую окраску, а в спектре появляются три
полосы поглощения: одна резкая в красной части спектра и две
между линиями Д и Е. В хорошем спектроскопе можно видеть
и четвертую полосу в синевато-зеленой части спектра.
Задание:
1. Выполнить опыты.
2. Определить в крови Hb, HbO2, MtHb и зарисовать их
спектры поглощения.
Вопросы для самоподготовки по теме 13
1. Что такое цельная, дефибринированная, гепаринизированная кровь?
2. Биологическая роль крови.
3. Состав крови (основные компоненты).
4. Что такое сыворотка и плазма крови?
5. Основные белки крови и их роль (Нb, альбумины, глобулины, фибриноген и др.).
6. Физико-химические свойства крови (осмотическое давление, рН, вязкость, буферность).
84
ТЕМА 14. МОЛОКО
Молоко является секретом молочной железы. Химический
состав молока у различных животных неодинаков. В нем содержится вода (68 - 90'%), белки (0,9 - 5,1%), липиды (1,0 - 17,1%),
углеводы (2,8 - 6,5%), минеральные вещества (0,5 - 1,5%). В молоке обнаружены витамины, ферменты. Их состав и количество
зависят от здоровья животных, их породы, возраста, условий
кормления, ухода, содержания и т. д.
Работа 56. Определение общей кислотности молока
по Тернеру
В молоке имеются кислые продукты (белки, аминокислоты,
другие органические кислоты). Общая кислотность показывает
общее количество кислотреагирующих веществ в растворе. Для
молока она выражается в градусах Тернера (°Т), т. е. в количестве
мл 0,1 н раствора NaOH, необходимого для нейтрализации кислот
в 100 мл молока. Свежее молоко крупного рогатого скота имеет
кислотность 15 - 18°Т, кобылы и ослицы - около 6°Т.
Вследствие молочнокислого гликолиза кислотность молока
может повышаться. Это может быть при неправильном хранении
молока, болезнях животных и т. д. Увеличение кислотности отрицательно сказывается на использовании молока.
Ход опыта
Налить в колбу 10 мл молока, 20 мл дистиллированной воды, прибавить 3 капли 2% раствора фенолфталеина и оттитровать
0,1 н раствором NaOH до розового окрашивания, не исчезающего
в течение 2 мин.
Количество мл израсходованной щелочи умножить на 10.
Получаем кислотность молока в градусах Тернера.
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. Определить кислотность молока и сделать вывод о его качестве.
3. При повышении кислотности указать предполагаемые
причины и возможные пути их устранения.
85
Работа 57. Определение редуктазы молока
Редуктазная проба используется (наряду с другими) для определения качества молока и служит показателем наличия в нем
бактерий, содержащих редуктазу. Этот энзим обладает способностью с помощью реакции восстановления обесцвечивать метиленовую синь (МС). По скорости обесцвечивания МС судят об активности фермента и, следовательно, о количестве содержащихся
в молоке микробов: чем их больше, тем быстрее происходит
обесцвечивание и наоборот.
Определено, что если обесцвечивание происходит в течение
20 мин и ранее, то в 1 мл молока содержится 20 млн. бактерий.
Такое молоко очень плохого качества.
Обесцвечивание в течение от 20 мин до 2 ч указывает на содержание от 4 до 20 млн. бактерий в 1 мл молока. Это плохое молоко.
Обесцвечивание в течение 2 - 2,5 ч свидетельствует о содержании от 500 тыс. до 4 млн. бактерий. Такое молоко расценивается как удовлетворительное.
Хорошее молоко содержит бактерий меньше 500 тыс./мл,
которые обесцвечивают МС не раньше 5,5 ч.
Микробы в молоко могут поступать при болезнях, в т. ч.
молочной железы, несоблюдении санитарии при доении, хранении и транспортировке молока.
Ход опыта
В пробирку налить 1 мл раствора МС (5 мл насыщенного
раствора МС в 195 мл дистиллированной воды) и 20 мл молока.
Перемешать, залить слоем вазелинового масла или закрыть пробкой (для создания анаэробных условий) и поставить в водяную
баню при 38°С. Отметить время, в течение которого произошло
обесцвечивание молока.
Задание:
1. Выполнить опыт.
2. Определить количество бактерий в 1 мл молока.
3. По этому показателю сделать заключение о качестве молока.
86
4. В случае плохого качества молока указать предполагаемые причины этого явления и возможные пути их устранения.
Работа 58. Определение количества лактозы в молоке
с помощью рефрактометра
Лактоза - основной сахар молока, его содержание в среднем
у коровы 4,9%, козы - 4,4% и кобылы - 6,5%. Дисахарид состоит
из остатков D-глюкозы и D-галактозы.
Сущность метода заключается в нахождении коэффициента
преломления обработанного специальным методом молока и определении количества лактозы.
Ход опыта
В пробирку поместить 5 мл сыворотки молока и добавить
5-6 капель 4% раствора СаСl2. Закрыть. Перемешать содержимое.
Поставить в кипящую водяную баню. По истечении 10 мин охладить водопроводной водой.
Взять 1 каплю сыворотки и поместить на нижнюю призму
рефрактометра. Определить коэффициент преломления и, пользуясь таблицей, рассчитать количество лактозы.
Задание:
1. Выполнить анализ.
2. Определить коэффициент преломления, а по нему - количество лактозы в молоке подопытного животного.
3. В случае отклонения содержания лактозы от ее нормы для
этого животного указать предполагаемые причины.
4. Написать структурную формулу лактозы.
87
Количество лактозы (%) в зависимости от коэффициента
преломлений (пД)
пД Лактоза
пД Лактоза
пД Лактоза
1,3390
3,01
1,3404
3,70
1,3418
4,38
1,3391
3,06
1,3405
3,72
1,3419
4,44
1,3392
3,11
1,3406
3,77
1,3420
4,49
1,3393
3,16
1,3407
3,82
1,3421
4,54
1,3394
3,21
1,3408
3,87
1,3422
4,59
1,3395
3,26
1,3409
3,93
1,3423
4,64
1,3396
3,31
1,3410
3,98
1,3424
4,69
1,3397
3,36
1,3411
4,03
1,3425
4,74
1,3398
3,46
1,3412
4,08
1,3426
4,79
1,3399
3,47
1,3413
4,13
1,3427
4,84
1,3400
3,52
1,3414
4,18
1,3428
4,89
1,3401
3,57
1,3415
4,23
1,3429
4,95
1,3402
3,62
1,3416
4,28
1,3430
5,00
1,3403
3,67
1,3417
4,33
1,3431
5,05
Вопросы для самоподготовки по теме 14
1. Понятие «молоко» с точки зрения физико-химической
биологии.
2. Химический состав молока разных животных.
3. Основные белки молока. Их биосинтез и роль.
4. Углеводы молока. Метаболизм лактозы и роль.
5. Липиды молока, их синтез, роль.
6. Витамины молока.
7. Вода и минеральные вещества молока.
8. Отличие молока от молозива.
88
Рекомендуемая литература.
а) основная литература:
1. Малахов Л. Т., Вишняков С. И. Биохимия сельскохозяйственных животных. - 1984.
2. Хмельницкий Р. А. Физическая и коллоидная химия:
Учебник для сельскохозяйственных вузов. - М.: Высш. шк., 1988.
3. Хазипов Н. 3., Аскарова А. Н. Биохимия животных: Учебник для студентов вузов. - 2-е изд., переработ. и доп. – Казань,
1999.
4. Чечеткин А. В., Головацкий И. Д. и др. Биохимия сельскохозяйственных животных: Учебник для студ. зооинж. и ветерин. факультетов сельскохозяйственных вузов. - М.: Высш. шк.,
1982.
б) дополнительная литература:
1. Березов Т. Т., Коровкин Б. Ф. Биологическая химия:
Учебник. 3-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2002.
2. Кузьмичева В. Н. Нуклеиновые кислоты и синтез белка. Воронеж, 1996.
3. Мецлер Д. Биохимия. Т. 1 – 3 - 1980.
4. Страйер Л. Биохимия. Т.1 – 3 - 1985.
5. Журналы «Зоотехния», «Ветеринария».
89
ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение
Организация учебного процесса по биохимии
Правила работы и техники безопасности в лаборатории
биохимии
ЧАСТЬ I. Основы физической и коллоидной химии
Тема 1. Осмотические явления в живых системах
Работа 1. Изучение осмоса и определение осмотического давления (ОД) с помощью естественной полупроницаемой мембраны (ППМ)
Работа 2. Определение ОД раствора криоскопическим (косвенным) методом
Работа 3. Изучение механизма действия растворов
различного ОД на клетки крови
Вопросы для самоподготовки по теме 1
Тема 2. Реакция среды
Работа 4. Определение реакции среды с помощью
лакмусовой бумаги
Работа 5. Определение реакции среды с помощью
универсальной индикаторной бумаги
Работа 6. Определение реакции среды бесцветных
растворов с помощью прибора Михаэлиса
Работа 7. Определение рН слабоокрашенных и
слабомутных растворов с помощью прибора Михаэлиса
Работа 8. Определение рН растворов и биологического материала электрометрическим (потенциометрическим) методом
Вопросы для самоподготовки по теме 2
Тема 3. Буферные системы
Работа 9. Приготовление ацетатных буферных
растворов и установление зависимости величины их рН
от соотношения компонентов
Работа 10. Изучение действия на буферный раствор небольшого количества кислоты
90
1
2
3
5
5
5
7
8
10
11
13
13
14
15
16
17
17
19
19
Работа 11. Изучение действия на буферный раствор большого количества кислоты
Работа 12. Изучение действия небольшого количества щелочи на буферный раствор
Работа 13. Изучение действия на буферный раствор большого количества щелочи
Работа 14. Влияние разбавления водой буферного раствора на величину его рН
Работа 15. Определение резервной щелочности
крови по Неводову
Вопросы для самоподготовки по теме 3
Тема 4. Коллоидные растворы
Работа 16. Получение гидрофобного коллоидного
раствора гидроксида железа Fe(OH)3
Работа 17. Получение гидрофильного коллоидного
раствора белка
Работа 18. Диализ коллоидных растворов
Работа 19. Изучение механизма коагуляции золя
железа
Работа 20. Изучение защитного действия гидрофильных коллоидов (эмульсоидов)
Вопросы для самоподготовки по теме 4
Часть II. Биохимия сельскохозяйственных животных
Тема 5. Адсорбция и абсорбция
Работа 21. Адсорбция органических красок животным углем
Работа 22. Определение количества уксусной кислоты, адсорбированной животным углем
Вопросы для самоподготовки по теме 5
Тема 6. Химия и обмен белков
Работа 23. Определение изоэлектрической точки
(ИЭТ) белка
Работа 24. Определение количества белка в сыворотке рефрактометрическим методом
Работа 25. Определение белка по методу Лоури
91
20
20
20
21
21
22
23
24
25
26
27
28
30
31
31
32
32
33
33
34
36
37
Работа 26. Разделение белков сыворотки крови на
фракции с помощью сульфата аммония
Работа 27. Разделение смеси аминокислот методом распределительной хроматографии на бумаге
Работа 28. Определение количества аминокислот
в растворе по азоту аминогрупп методом формольного
титрования по Серенсену
Работа 29. Изучение действия пепсина на переваривание белка
Работа 30. Определение содержания мочевины
в сыворотке крови по реакции с диацетилмонооксимом
Вопросы для самоподготовки по теме 6
Тема 7. Ферменты (энзимы)
Работа 31. Приготовление раствора фермента
a-амилазы (КФ 3.2.1. 1) слюны
Работа 32. Обнаружение в слюне амилазы и определение специфичности ее действия
Работа 33. Изучение влияния рН среды на активность амилазы слюны
Работа 34. Изучение влияния температуры на активность энзимов
Работа 35. Изучение действия активаторов и ингибиторов на активность ферментов
Вопросы для самоподготовки по теме 7
Тема 8. Углеводы и их обмен
Работа 36. Изучение механизма переваривания
углеводов и определение активности a-амилазы (КФ
3.2.1.1.) слюны
Работа 37. Определение количества глюкозы в
крови по методу Хагедорна – Иенсена
Работа 38. Обнаружение гликогена в тканях животных
Вопросы для самоподготовки по теме 8
Тема 9. Липиды и их обмен
Работа 39. Изучение растворимости жира
Работа 40. Определение кислотного числа жира
92
39
40
42
44
45
47
49
49
50
51
52
52
54
55
55
57
60
61
62
63
63
Работа 41. Исследование эмульгирования жира
Работа 42. Изучение механизма переваривания
липидов и определение активности панкреатической
липазы (КФ 3.1.1.3)
Работа 43. Определение количества общего холестерола в сыворотке крови по методу Илька
Работа 44. Обнаружение ацетоновых тел в биологических жидкостях
Вопросы для самоподготовки по теме 9
Тема 10. Гормоны
Работа 45. Изучение влияния адреналина на содержание сахара в крови животного
Вопросы для самоподготовки по теме 10
Тема 11. Витамины
Работа 46. Обнаружение витамина А в жире
Работа 47. Обнаружение витамина Д в жире
Работа 48. Обнаружение витамина С в биоматериале
Работа 49. Определение количества витамина С
в сыворотке крови с помощью 2,6-дихлорфенолиндофенола
(краска Тильманса)
Вопросы для самоподготовки по теме 11
Тема 12. Минеральные вещества и вода
Работа 50. Определение количества кальция в сыворотке крови по де Ваарду
Работа 51. Определение содержания кальция
в сывороткe крови комплексонометрическим методом
Работа 52. Определение количества неорганического фосфора в сыворотке крови
Вопросы для самоподготовки по теме 12
Тема 13. Кровь
Работа 53. Определение активности каталазы (КФ
1.11.1.6) в крови по Баху и Зубковой
Работа 54. Обнаружение гемина в крови
Работа 55. Спектральный анализ гемоглобина
и его производных
93
64
65
66
68
70
70
71
71
72
72
73
74
75
75
76
76
78
79
80
81
81
82
83
Вопросы для самоподготовки по теме 13
Тема 14. Молоко
Работа 56. Определение общей кислотности молока по Тернеру
Работа 57. Определение редуктазы молока
Работа 58. Определение количества лактозы в молоке с помощью рефрактометра
Вопросы для самоподготовки по теме 14
Рекомендуемая литература
94
84
85
85
86
87
88
89
Подписано в печать 11.03.2009 г. Формат 60х801/16
Бумага кн.-журн. Усл. п.л. 0,87. Гарнитура Таймс.
Тираж 200 экз. Заказ №3925
Федеральное государственное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Воронежский государственный аграрный университет имени К.Д. Глинки»
Типография ФГОУ ВПО ВГАУ 394087, Воронеж, ул. Мичурина, 1
Информационная поддержка: http://tipograf.vsau.ru
Отпечатано с оригинал-макета заказчика. Ответственность за содержание
предоставленного оригинал-макета типография не несет.
Требования и пожелания излагайте авторам данного издания.
95
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа