close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

14.АБЕРРАЦИИ ХРОМОСОМ У ЛОШАДИ ПРИ НАРУШЕНИЯХ ВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИИ

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
На правах рукописи
ШАРАСЬКИНА
Ольга Геннадьевна
АБЕРРАЦИИ ХРОМОСОМ У ЛОШАДИ ПРИ НАРУШЕНИЯХ
ВОСПРОИЗВОДИТЕЛЬНОЙ ФУНКЦИИ
Специальность 06.02.01. - «Разведение, селекция, генетика и
воспроизводство сельскохозяйственных животных»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Санкт - Петербург
2006
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Работа выполнена в проблемной лаборатории кафедры ветеринарной
генетики и животноводства Санкт-Петербургской Государственной
академии ветеринарной медицины.
Научный руководитель:
доктор биологических наук,
профессор, заслуженный деятель РФ
Жигачев А.И.
(СПГАВМ)
Официальные оппоненты:
Доктор сельскохозяйственных наук,
профессор, заслуженный деятель науки РФ
кандидат биологических наук, доцент
Завертяев Б.П.
(ГНУ ВНИИГРЖ)
Митютько В.И.
(СПГАУ)
Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский
институт коневодства (ВНИИК)
Защита диссертации состоится
часов
на заседании диссертационного совета Д. 006.012.01. по защите докторских
диссертаций в ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт
генетики и разведения сельскохозяйственных животных (ГНУ ВНИИГРЖ)
Российской академии сельскохозяйственных наук по адресу: 196601,
Санкт-Петербург, г.Пушкин, Московское шоссе, 55-а.
Факс: 465-99-85
ГНУ ВНИИГРЖ.
С диссертацией можно ознакомиться а библиотеке
библ
2005г.
Автореферат разослан
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор биологических наук
/Г.Н.Сердюк/
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы
Еще не прошло и половины столетия как Levan A.& Tjio J. (1956) на
человеке, Moorhed et al. (I960) на животных успешно апробировали мето­
дику культивирования лимфоцитов периферической крови для получения
препаратов хромосом. Однако за эти годы на многих видах млекопитаю­
щих выполнены сотни исследований, позволившие на новом уровне по­
знать закономерности функционирования наследственности и изменчиво­
сти. По сути дела только с 60х годов XX века было установлено истинное
число и морфология хромосом, их репродукция у большинства продуктив­
ных (Гольдман И.Л. и др., 1969, Яковлев А.Ф., 19S5) и домашних видов
животных, а в последующем выявлены геномные и структурные аберрации
в кариотипах.
К сожалению, цитогенетических исследований на лошади крайне мало
как в нашей стране, так и за рубежом (Пименова Т.И., 1987, Жигачев А.И.,
1996, Bowling, 1997, Kuiper H.J.,2001). В тех же немногих работах, которые
были выполнены на лошади показано, что цитогенетические методы могут
найти применение, прежде всего для выяснения причины нарушения вос­
производительной способности животных (Hainan С , 1982, Жигачев А.И.,
Богачева Т.В., 1993, Bowling A.T., 1997, Kuiper H.J.,2001). Безусловно, это
имеет особую практическую ценность в племенном коневодстве, если еще
иметь в виду биологическое малоплодие и значительный интервал между
поколениями у этого вида.
По расчетам ВНИИКоневодства (Калашников В.В., 2003) научно обос­
нованная потребность в лошадях в стране превышает фактическую числен­
ность более чем втрое и составляет 6,2 млн. голов. В связи с этим значение
цитогенетических исследований в коневодстве трудно переоценить.
Научная работа выполнена в рамках отраслевой программы СХ: 042,
раздел 01.01.6 по теме «Изучение роли наследственности и факторов внеш­
ней среды в этиологии врожденных аномалий, нарушений жизнеспособно­
сти и плодовитости, животных для разработки методов профилактики от­
дельных форм патологии и повышения потенциала продуктивности»
(№ гос. регистрации 01860125237).
Цель и задачи исследований
Целью работы является изучение кариотипа, частоты и спектра абер­
раций у лошадей с нарушениями половых циклов, с фенотипическими от­
клонениями от нормы, с аномальным потомством для обоснования и разра­
ботки принципов цитогенетического мониторинга в коневодстве.
Задачи исследований:
- провести морфометрический анализ хромосом лошадей без фенотипических и физиологических отклонений;
ЦНБ МСХА
фонд науыной литературы
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2
i- изучить кариотип лошадей с нарушениями половых циклов, с фено­
типическими отклонениями от нормы, с аномальным потомством;
- определить показатели генетической нестабильности у лошадей с
фенотипическими и физиологическими нарушениями;
- выявить животных с дисбалансом половых хромосом
- выявить взаимосвязь изменений кариотипа с фенотипическими и фи­
зиологическими отклонениями от нормы.
Научная новизна
Получены данные по показателям хромосомной нестабильности у ло­
шадей с нарушениями половых циклов, с фенотипическими отклонениями
от нормы, с аномальным потомством.
Приоритетными являются данные о том, что частота хромосомных
аберраций у лошадей с физиологическими и фенотипическими отклоне­
ниями от нормы значительно выше, чем у лошадей без нарушений.
В результате отбора по фенотипу и физиологическим изменениям, вы­
явлены и описаны животные с дисбалансом половых хромосом:
64,ХХ/63,ХО — мозаика Тернера и 64,ХУ/65,ХХУ — мозаика Кляйнфельтера.
Научная и практическая значимость работы
В результате исследований получены новые данные по частной гене­
тике лошади и ветеринарной цитогенетике.
Полученные данные могут быть использованы: для выявления причин
фенотипических отклонений от нормы, нарушений физиологических функ­
ций; для цитогенетической диагностики жеребцов и кобыл перед началом
племенного использования.
Апробация работы
Основные результаты исследований рассмотрены и обсуждены на отче­
тах кафедры ветеринарной генетики и животноводства СПбГАВМ в 2002 2005гг., на научных конференциях профессорско-преподавательского соста­
ва и аспирантов СПбГАВМ в 2002 - 2005гг., на Всероссийской научнопрактической конференции «Искусственное осеменение в коневодстве - ис­
токи биотехнологии в животноводстве» (ВНИИКоневодства РАСХН, 2004).
Структура и объем работы
Диссертация изложена на 103 страницах и состоит из введения, обзора
литературы, материалов и методов исследования, результатов исследова­
ния и обсуждения, выводов, предложений и библиографического указателя
(154 названий). Работа иллюстрирована 13 таблицами и 9 рисунками.
Основные положения, выносимые на защиту:
- повышенная частота хромосомных аберраций у лошадей с физиоло­
гическими и фенотипическими отклонениями от нормы;
- мозаика Тернера 64,ХХ/63,ХО, ее связь с фенотипическими проявлениями.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
3
!
- мозаика Кляйнфельтера 64,ХУ/65,ХХУ, ее связь с фенотипическими
проявлениями.
- цитогенетический мониторинг в племенном коневодстве.
2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Цитогенетическому исследованию подверглись животные, принадле­
жащие частным владельцам и находящиеся в различных конюшнях Ленин­
градской области, с нарушениями половых циклов, отставанием в росте,
крипторхизмом и аномальным потомством. Так же цитогенетический ана­
лиз был проведен у двух фенотипически нормальных животных (жеребца и
кобылы), от которых получали здоровое потомство. Согласно клиническим
анализам все животные были здоровы, на протяжении б последних меся­
цев, до взятия крови, не болели вирусной инфекцией.
Кобыла Греция была выбрана для исследования, в связи с тем, что у
нее отмечались нерегулярные половые циклы. Кобыла не приходила в охо­
ту по 3 - 6 месяцев. Отмечались случаи, когда, придя охоту, она оставалась
в состоянии полового возбуждения по 25 - 30 дней, а затем снова следовал
длительный перерыв.
Кобыла Валенсия выбрана для исследования в связи с тем, что, по за­
явлению владельца, впервые в охоту она пришла в возрасте 8 месяцев, по­
ловые циклы нерегулярные, отмечается отставание в росте при нормальных
условиях кормления и содержания.
Кобыла Хелсора выбрана для исследования, так как у нее наблюдались
нерегулярные половые циклы. Кобыла небольшого роста (143 см в холке),
при этом у нее удлиненное тело на непропорционально коротких ногах.
Исследование кобылы Трапеза решено было провести в связи с тем,
что дважды от нее получали жеребят с признаками атаксии.
Объектом исследования кобыла Форма стала в связи с тем, что все
полученные от нее жеребята имели различные аномалии (атаксия, анофтальмия и др.)
Цитогенетическое исследование жеребца Наблуса было решено про­
вести в связи с тем, что его рост (140см в холке) гораздо ниже средних по­
казателей по породе (154см).
Жеребец Ремингтон - правосторонний крипторх. При ректальном ис­
следовании было выявлено абдоминальное расположение крипторхированного семенника.
Жеребец Аморс - правосторонний крипторх. Абдоминальный крипторхизм. За 8 лет использования в разведении от него получено 6 жеребят.
Препараты хромосом готовили из клеток периферической крови в
проблемной лаборатории ветеринарной генетики Санкт-Петербургской
государственной академии ветеринарной медицины.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4
Препараты хромосом получали путем культивирования лимфоцитов
переферической крови по общепринятой методике (Moorhead, Nowell,
Mellmanetal., 1960).
Анализ препаратов хромосом проводили под микроскопом МБИ — 15
при увеличении хЮОО в иммерсионной системе и по микрофотографиям.
Микрофотосъемку производили на микроскопе МБИ - 15 на пленки: Ko­
dak Academy200 (рис. 1), Fuji SuperialOO и 200, Kodak Professional T400CN,
Konica200. Для повышения контрастности фотоотпечатков использовали зеле­
ный светофильтр ЗС 10; ЗС 8; ЗС 1 (Федин, Барский, 1971). Проявка пленки и
печать фотографий производилась в специализированной фотомастерской.
Для изучения хромосомного набора и аберраций анализировали рав­
номерно окрашенные метафазные пластинки, по 50 — 100 метафаз на каж­
дое животное.
Измерение длины хромосом производили штангенциркулем по микрофо­
тографиям, Вычисляли относительную длину, центромерный индекс хромосом
и индекс спирализации. Классифицировали хромосомы согласно стандартной
классификации (Levari A. et al., 1964, Графодатский А.С. и др., 1988). При кариотипической оценке животных руководствовались Методическими реко­
мендациями исследования хромосом сельскохозяйственных животных (1977).
При построении кариограммы, хромосомы которые нельзя достоверно
идентифицировать при рутинной окраске располагались согласно убыва­
нию их линейных размеров.
Полученный материал обработан статистическими методами по
Г.Ф.Лакину (1980), с использованием микрокалькулятора CASIO.
Данные, полученные в ходе исследований, сравнивали с результатами
анализа уровня естественного мутирования хромосом в соматических клет­
ках лошадей, полученными Т.И.Пименовой (1987).
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Морфометрический анализ хромосомного набора лошади
без физиологических и фенотипических отклонений от нормы
Для анализа хромосомного набора лошади исследовали препараты хро­
мосом фенотипически нормальных животных, без отклонений воспроизво­
дительной функции. Анализ хромосом производился при рутинном окраши­
вании. Проанализировано 11 метафаз жеребца и 13 метафаз кобылы. Для
анализа использовались только метафазы с полным набором хромосом.
Результаты представлены в таблице 1.
Согласно морфометрическому анализу Х-хромосома в основном явля­
ется второй по величине. Хотя в некоторых метафазах Х-хромосома имела
почти такие же размеры, как и одна из пары метацентрических аутосом. В
разных клетках у одной и той же особи относительные размеры
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Хгхромосомы были различны. В среднем относительная длина Xхромосомы составила 6,34% с колебаниями от 5,54% до 7,14%. Центромерный индекс Х-хромосомы составил в среднем 42,97% с колебаниями от
42,44% до 43,5%. Эти данные позволяют отнести ее к метацентрикам.
• * * 1
*?-•' ^
v
JPil
*«s
Рисунок 1. Метафазные пластинки снятые на пленку Kodak Academy200.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
6
Достоверная идентификация У-хромосомы при рутинном окрашива­
нии невозможна. При построении кариограммы за У-хромосому принимали
один из маленьких акроцентриков, не имевших пару.
Таблица 1
Результаты морфометрического анализа хромосом лошади
без физиологических и фенотипических отклонений
На хромосомы
Относительная длина
%
I
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
30
31
X
У
7,95
5,62
5,19
4,89
4,45
3,97
3,68
3,6
3,44
3,17
2,57
2,06
1,87
4,78
4,2
3,62
3,23
2,96
2,74
2,66
2,48
2,31
2,06
1,8
1,46
1,29
1,11
0,99
0,85
0,76
0,72
6,34
1,2
(+/-)
0,7
0,59
0,58
0,32
0,13
0,18
0,12
0,12
0,15
0,17
0,13
0,12
0,14
0,32
0,11
0,25
0,16
0,12
0,2
0,12
0,29
0,15
0,28
0,16
0,24
0,17
0,21
0,46
0,24
0,35
0,3
0,8
0,3
Центромерный индекс
%
37,75
30,53
28,01
33,37
36,05
38,29
46,52
39,15
41,22
43,17
41,38
40,44
40,28
(+/-)
0.28
0,41
0,34
0,4
0,51
0,42
0,43
0,5
0,44
0,44
0,35
0,42
0,42
-
-
42,97
0,53
-
-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
7
: Анализ значений центромерного индекса показал.что его среднее зна­
чение у первой пары аутосом составило 37,75% с колебаниями от 37,47%
до 38,03%. В связи с тем, что в 66,6% случаях центромерный индекс пре­
высил значение 37,5% - первую пару аутосом можно отнести к метацентрикам (Levan et. al, 1964), но часть хромосом (33,4%) имели субметацентрическое строение.
Аутосомы с 4-й по 6-й пары имеют субметацентрическое строение, со­
гласно значениям центромерного индекса.
Аутосомы с 7-й по 13 пары относятся к метаиентрикам, т.к. их цен­
тромерный индекс значительно превышает 37,5%.
3.2. Морфометрический анализ хромосомного набора лошадей имеющих
физиологические и фенотипические отклонения от нормы
Морфометрический анализ хромосом производился для каждого ис­
следуемого животного при рутинном окрашивании. Для этого анализиро­
вались метафазы, имеющие полный диплоидный набор хромосом. Вычис­
ляли относительную длину хромосом и центромерный индекс и индекс
спирал изации.
Исследование восьми лошадей с нарушениями половых циклов, отста­
ванием в росте, крипторхизмом и двух лошадей с нормальной воспроизво­
дительной функцией и фенотипом, соответствующим породной принад­
лежности, выявило различие морфометрических показателей.
Анализ морфометрических показателей хромосом исследуемых живот­
ных не выявил значительных различий относительной длины хромосом. Вы­
явлены некоторые различия в показателях центромерного индекса, опреде­
ляющего тип строения хромосом. В основном это касается хромосом 8, 12 и
13 пар. У некоторых лошадей с нарушениями, хромосомы восьмой пары,
согласно центромерному индексу, имеют метацентрическое строение, в от­
личие от субметацентрического — у нормальных. А хромосомы 12 и 13 пары,
в отличие от метацентрического строения - у нормальных животных, имеют
субметацентрическое. Так же различия встречаются в 4,9,10 парах.
Не было выявлено отклонений в показателях центромерного индекса,
определяющего тип строения хромосомы, у кобыл Хелсора и Трапеза, а так
же у жеребца Аморс. Наибольшее количество различий в типе строения
хромосом выявлено у жеребца Ремингтон (1—5 пары, 8, 9 пары) достовер­
ность различия составила Р>0,999, а так же у кобылы Греция - недостовер­
ное различие по 6 паре, высокая степень достоверности (Р=0,99) по 8 паре,
и по 9, 10 паре (Р>0,999).
У остальных животных встречались отклонения от нормы в двух трех парах хромосом.
Вычисление индекса спирализации проводилось по двум формулам,
одна из которых была предложена Т.И.Пименовой (1987). Существенные
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
8
различия в показателях наблюдались в тех случаях, когда самой длинной
хромосомой оказывалась Х-хромосома, а не хромосома первой пары.
Т.И.Пименова предлагала использовать в вычислениях отношение суммы
показателей относительной длины 11, 12,13 к показателю длины хромосом
первой пары. В этом случае, если хромосомы первой пары оказываются
самыми крупными, показатели двух формул приблизительно одинаковы, а
если наиболее крупной оказывается Х-хромосома, то разница в значениях
формул оказывается существенной.
3.3. Структурные аберрации хромосом у лошадей с физиологическими
и фенотипическими отклонениями
Для изучения структурных изменений хромосом исследовали от 50
до 102 метафаз для каждой лошади. Учитывали количество метафаз с
аберрациями, общее число аберраций, а так же провели учет хроматидных пробелов.
Изучение структурных изменений хромосом у исследуемых лошадей
показало, что в большинстве случаев количество метафаз с аберрациями и
количество аберраций на 100 клеток у них выше, чем у животных, изучен­
ных Т.И.Пименовой (1987), у которых не наблюдалось каких-либо феноти' пических и физиологических отклонений (табл. 2).
Таблица 2
Частота и спектр структурных изменений хромосом у лошадей с физиоло­
гическими и фенотипическими отклонениями.
колметафаз с
во аберрациями
лошадь
мета­
всего
фаз
п
%
на
аберрации
парные
одиноч­
фрагмен­ кольцевые
ные фраг.
ты
пробелы
п
%
п
%
п
%
п
%
Греция
Вален­
сия
Хелсора
102
7
6,86
14
13,7
6
66,7
3
21,4
5
35,7
5
4,9
54
9
16,6
12
22,2
9
75
3
25
0
0
3
5,55
61
6
9,83
3
50
2
33,3
1
16,7
3
4,92
50
4
9,8
8
6
Форма
6
12
2
33,3
2
2
4
50
5
10
7
14
3
42,9
4
0
33,3
0
2
Трапеза
Ремин­
гтон
Наблус
33,3
57,2
I
2
58
3
5,2
5
8,62
1
20
2
40
2
40
4
6,89
63
8
12,7
14
22,2
7,3
6
10,9
6
3
3
0
21,4
0
6,35
4
35,7
50
4
55
5
3
42,9
Аморс
3
5,45
50
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
9
'' При сравнении результатов частоты структурных изменений хромосом
у коб. Греция, с данными, полученными Т.И.Пименовой (1987) при анализе
уровня естественного мутирования хромосом в соматических клетках ло­
шадей, наблюдаются некоторые различия в показателях. Данные коб. Гре­
ция сравнивали с результатами анализа лошадей полукровных верховых
пород и лошадей спортивной группы, т.к. коб. Греция является полукров­
ной помесью и используется в спорте. Наблюдаются различия по показате­
лю метафаз с аберрациями у коб. Греция (6,86%) и полукровными верхо­
выми лошадьми (3,79%) с высокой степенью достоверности (Р>0,99); при
сравнении этого же показателя коб. Греция с лошадьми спортивной группы
(5,11%), разница не так велика.
- Разница в частоте аберраций на 100 клеток достоверна (Р>0,999) у коб.
Греция (13,7) и полукровных лошадей (3,96), а так же у коб. Греция и ло­
шадей спортивной группы (6,67).
7 При сравнении результатов коб.Валенсия и данных, полученных
Т.И.Пименовой (1987) использовали данные полукровных верховых и чис­
токровных верховых лошадей, т.к. кобыла является помесью латвийской и
чистокровной верховой породы.
'• Выявлены значительные различия в количестве метафаз у коб. Вален­
сия (16,6%) и лошадей полукровных пород (3,79%), и чистокровной верхо­
вой породы (4,75%). Разница в обоих случаях значительна и достоверна
(Р>0,999).
Достоверная разница (Р>0.999) отмечается и при сравнении показате­
лей частоты аберраций на 100 клеток у коб. Валенсия (22,22) с данными
полукровных (3,96) и чистокровных (5,75) лошадей.
; Различие так же наблюдается в частоте появления пробелов у коб. Ва­
ленсия (5,55%) и лошадей чистокровной верховой породы (7,25%), однако
разница в данном случае имеет низкую достоверность (Р<0,9).
1 Так как коб. Хелсора является помесью ахалтекинской и торийской
пород, сравнение результатов структурных изменений хромосом проводил­
ся сданными лошадей ахалтекинской породы и полукровных верховых.
- Имеется разница (Р>0,95) в частоте метафаз с аберрациями коб. Хел­
сора (9,8%) и ахалтекинских лошадей (6,33%). При сравнении этого же по­
казателя у коб. Хелсора и полукровных лошадей (3,79%), разница более
значительна (Р>0,999).
При сравнении показателя частоты аберраций на 100 клеток коб. Хел­
сора (9,83) и полукровных лошадей (3,96) обнаруживается значительная
разница (Р>0,999).
•-Результаты, полученные при исследовании частоты структурных
аберраций, коб. Форма сравнивались с данными чистокровных верхо­
вых лошадей.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
10
Частота метафаз с аберрациями у коб. Форма (8%) выше таковой у
лошадей чистокровной верховой породы. Разница достоверна (Р>0,98).
Достоверное различие (Р>0,999) наблюдается в показателях частоты
аберраций на 100 клеток у коб.Форма (12) и чистокровных лошадей (5,75).
Разница наблюдается в частоте появления пробелов у коб. Форма (4%)
и лошадей чистокровной верховой пород (7,25%), с достоверностью
Р>0,95.
Результаты кариотипирования коб. Трапеза сравнивали с данными ор­
ловских рысистых лошадей.
Достоверное различие (Р>0,999) наблюдается в показателях частоты
метафаз с аберрациями коб. Трапеза (10%) и орловских рысистых лошадей
(3,82%). Такой же результат получен при сравнении показателей частоты
аберраций на 100 клеток. У коб .Трапеза (14) этот показатель превышает
таковой у орловских рысистых лошадей (4,39).
Разница в частоте пробелов у коб.Трапеза (2%) и орловских рысистых
лошадей (3,09%) недостоверна (Р<0,9).
При сравнении показателей жер.Ремингтон с данными полукровных
верховых лошадей и лошадей спортивной группы, обнаружено: достоверное
различие (Р>0,999) в частоте аберраций на 100 клеток жер.Ремингтон (8,62) и
полукровных (3,96). Достоверная разница (Р>0,98) наблюдается при сравне­
нии этого же показателя с данными лошадей спортивной группы (6,67).
Различие в показателях частоты метафаз с аберрациями жер. Реминг­
тон (5,2%) с данными полукровных лошадей (3,79%) недостоверно (Р<0,9).
Этот показатель у Ремингтона очень близок к таковому у спортивных ло­
шадей (5,11%).
Жер. Наблус относится к арабской чистокровной породе лошадей. В
работе Т.И.Пименовой (1987) исследование арабских лошадей не проводи­
лось, поэтому показатели частоты хромосомных аберраций жер.Наблус
сравнивали с показателями чистокровных верховых, ахалтекинских и по­
лукровных лошадей. Частота метафаз с аберрациями у жер. Наблус (12,7%)
значительно превышает таковую у чистокровных верховых (4,75%), ахал­
текинских (6,33%), полукровных лошадей (3,79%) с высокой степенью дос­
товерности (Р>0,999).
Частота аберраций на 100 клеток так же оказалась значительно выше у
жер. Наблус (22,22) чем у чистокровных верховых (5,75), ахалтекинских
(11,39) и полукровных верховых (3,96) лошадей (Р>0,999).
Значительная разница в частоте пробелов (Р>0,9) наблюдалась у
жер.Наблус (6,35%) и ахалтекинских лошадей (3,8%). С чистокровной вер­
ховой (7,25%) и полукровной (5,68%) разница незначительна и недостовер­
на (Р<0,9).
При сравнении результатов частоты и спектра аберраций жер. Аморс,
использовали данные полукровных верховых лошадей. Различие наблюла-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
11
ется в показателях частоты метафаз с аберрациями и частоты аберраций на
100 клеток (Р>0,999), у жер. Аморс значение этих показателей выше, чем у
полукровных лошадей.
При разделении исследованных лошадей по группам: крипторхи, ко­
былы с неполноценными половыми циклами, кобылы с аномальным (атак­
сия) потомством; обнаружена достоверная разница в частоте аберраций на
100 клеток между крипторхами и кобылами с неполноценными половыми
циклами, у которых этот показатель значительно выше (табл. 3). В целом
же, у крипторхов, самые низкие показатели структурных мутаций по срав­
нению с другими групппами изученных животных, за исключением часто­
ты пробелов (6,17%).
Таблица 3
Частота структурных изменений хромосом у лошадей различных групп
группа
животных
кол-во
мета­
фаз
крипторхи
кобылы
с нарушен.
половых
циклов
кобылы с
аномальн.
потомством
метафаз с аберрац.
аберрации
пробелы
п
%
Всего
на 100
клеток
п
%
113
7
6,25±1,05
11
9,77±1,14
3,5
6,17±0,72
217
22
10,1±2,88
32
15,25±3,66
3,6.
,5,12±0,13
100
9
9,0 ±1,0
13
13,0±1,0
1,5
3,0±1,0
разница крипторхи - коб.с
нарушением половых
циклов
разница крипторхи - кобы­
лы с аномальным
потомством
разница кобылы
с нарушением половых
циклов — коб. с аномальным
потомством
* - разница недостоверна
** - Р>0,95 •«
3,9*
5,48**
1,05*
2,75*
3,23*
3,17*
1,15*
2,25*
2,12*
При сравнении этих же показателей в группах «животные с нормаль­
ным ростом» и «животных с отставанием в росте», у последних метафаз с
аберрациями оказалось достоверно больше (табл. 4). Таким образом, мож-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
12
но предположить, что задержка в росте так же может быть обусловлена
повышенной частотой аберраций.
Таблица 4
Частота структурных изменений хромосом у лошадей
с нормальным ростом и с отставанием в росте
группа
животных
лошади с
отставанием в
росте
лошади с
нормальным
ростом
разница
•*- Р>0,95
**» . р=о,9
кол-во
метафаз
метафаз с
аберрациями
п
%
178
23
12,9
±1,9
315
23
7,3
±0,8
5,6**
аберрации
пробелы
на 100
клеток
п
%
32
18,09
±4,13
10
5,6
±0,4
38
11,84
±0,98
15
4,7
±0,7
Всего
6,25***
0,9
При анализе структурных аберраций в метафазах некоторых лошадей
были обнаружены кольцевые хромосомы. Причем, у лошадей с дисбалан­
сом половых хромосом, их частота составила 40% - у жер. Ремингтон,
35,71% - у коб. Греция от общего количества структурных аберраций. Это
самые высокие показатели из всех полученных. Т.И.Пименова (1987) в
своих исследованиях кольцевых хромосом не обнаружила.
Цитогенетический анализ хромосом кобыл, от которых неоднократно
получали потомство с атаксией и другими аномалиями, выявил высокую
частоту структурных аберраций по сравнению с уровнем спонтанного хро­
мосомного мутирования у лошадей, приведенный Пиминовой Т.И. (1987).
По остальным показателям эти лошади не имеют существенных различий.
3.4. Геномные мутации у лошадей с физиологическими
и фенотипическими нарушениями
Для определения анеуплоидии нами изучались клетки с числом хромо­
сом 2п ± 2, т.е. с набором от 62 до бб хромосом. Анализ геномных наруше­
ний проводился для каждой лошади отдельно. Частота гипердиплоидных,
гиподиплоидных и полиплоидных клеток представлены в таблице (табл. 5).
Для определения геномных нарушений у коб.Валенсия исследовалось
49 диплоидных метафаз с 2п±2. Из них анеуплоидными оказались 4 (8,16%)
клетки. Эти клетки были представлены гиподиплоидами, 4,8% клеток с 2п1 и 4,8% клеток с 2п-2.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
13
Таблица 5
Частота геномных мутаций у лошадей
лошадь
Греция
Вален­
сия
Хелсора
Форма
Трапеза
Ремин­
гтон
Наблус
Аморс
кол-во
метафаз
под­
робно
про­
смотр.
анеуплоидные
кол-во
метафаз
2п=б4
85
п
53
%
62,35
-п
32
%
37,65
п
29
%
34,1
гиперди­
плоидных
метафаз
2п+1
п
%
0
0
49
45
91,84
4
8,16
2
4,08
0
0
51
43
40
47
42
39
92,16
97,68
97,5
4
1
1
7,84
2,32
2,5
3
1
1
5,88
2,32
2,5
1
0
0
1,96
0
0
50
39
77
11
22
2
4
9
18
52
48
49
46
94,23
95,84
3
2
5,77
4,16
1
2
1,92
4,16
2
0
3,84
0
анеуплоидных мета­
фаз 2гИ7-2
гиподиплоидных ме­
тафаз 2п-1
При построении кариограмм из метафаз с 2п = 63, обнаружили, в од­
ном случае отсутствие одного маленького акроцентрика, и в другом - от­
сутствие одного большого метацентрика, предположительно Х-хромосомы.
Гипердиплоидных клеток, как и полиплоидных у коб.Валенсия не об­
наружено.
Из 51-й диплоидной метафазы коб. Хелсора 4 (7,84%) оказались с из­
мененным набором. Из них в Зх клетках (5,88%) наблюдалось отсутствие
одной хромосомы, т.е. диплоидный набор этих клеток составил 2п-1. При­
чем в двух клетках отсутствовали большие метацентрики, а в одной — ма­
ленький акроцентрик. Была так же обнаружена одна клетка (1,96%) с ги­
пердиплоидным набором 2п+1. Лишней оказалась хромосома средней ве­
личины, метацентрического строения.
У коб.Форма анализировали 42 метафазы, с целью обнаружения анеуплоидных клеток. Была обнаружена только одна клетка (2,32%) с числовым
нарушением. В метафазе с геномным нарушением отсутствовала одна акроцентрическая аутосома средней величины. Гипердиплоидных клеток у
коб. Форма обнаружено не было.
Из всех исследованных клеток коб. Трапеза только 40 оказались с на­
бором хромосом 2п±2. Из которых, только одна клетка (2,5%) была анеуплоидной с недостающей одной хромосомой. При раскладке гиподиплоидной метафазы по парам гомологов обнаружено, что недостает одной субме-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
14
тацентрической хромосомы средней длины.!Гипердиплоидных и полипло­
идных клеток у коб. Трапеза не обнаружено.
При исследовании пятидесяти двух метафаз экер .Наблус, было обнару­
жено 3 (5,77%) с анеуплоидным набором. Из которых, одна метафаза (1,92%)
была гиподиплоидной, с отсутствующей акроцентрической аутосомой сред­
него размера. Две клетки (3,84%) содержали лишние хромосомы 2п=65. В
одном случае лишней оказалась маленькая акроцентрическая хромосома, а в
другом — тоже метацентрик, но несколько большего размера.
У жер. Аморс было проанализировано 48 метафаз с набором 2п±2.
Анеуплоидные метафазы составили 4,16%. Все они были представлены
гипоплоидами с хромосомным набором 2п-1, всего 2 клетки. При раскладке
хромосом из гиподиплоидных метафаз по парам гомологов выявлено от­
сутствие маленьких акроцентриков в обоих случаях.
У двух исследованных лошадей были обнаружены существенные чи­
словые изменения кариотипа.
У коб. Греция было проанализировано 85 метафаз с набором 2п±2. Ко­
личество анеуплоидных метафаз составило 37,65%, из которых 90,6% при­
шлось на гиподиплоиды. Основное количество гиподиплоидных метафаз
составили клетки с набором 2п-1, т.е. содержащие по 63 хромосомы. Таких
клеток обнаружено 34,1% от общего числа исследованных метафаз.
Для построения кариограммы использовали равномерно окрашенные
метафазные пластинки с нормальным диплоидным набором (2п = 64) и ме­
тафазы с неполным набором (2п = 63). Кариограмму составляли, опираясь
на морфометрические показатели хромосом.
При построении кариограммы и раскладке хромосом по парам гомоло­
гов для коб.Греция из метафаз с пшодиплоидным набором (2п = 63), была
обнаружена только одна полозач Х-хромосома (рис. 2). Второй крупный
метацентрик отсутствовал. В клетках с нормальным набором (2п = 64), обе
Х-хромосомы присутствовали.
В нашем случае кобыла мозаика имела, в общем, нормальный фено­
тип, единственным, что выделяет ее из основной массы лошадей — доста­
точно высокий рост (172 см) в холке. Нерегулярность и неполноценность
половых циклов у данной кобылы является характерной картиной для дан­
ного типа хромосомного дисбаланса. Не исключена возможность фертильности данной кобылы, но успешное использование в воспроизводстве од­
нажды не гарантирует последующее плодотворное осеменение.
У леер. Ремингтон было исследовано 50 метафаз с набором 2п±2. Из
них с числовыми нарушениями оказалось 11 клеток (22%). В двух метафазах (4%) наблюдалось отсутствие хромосом 2п-1. В обеих отсутствовали
метацентрические хромосомы средней длины.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
15
Si 16 h n i» si i r
II t&
f|
ill
11 »t
flu
•*
*$ 31
«* 0£
*%
Л ft ft Л
* *
М
«v •>
*• '•
* •
л л
:i
АЛ
**
*>
Рисунок 2. Хромосомы коб. Греция, 63.ХО.
В девяти клетках (18%) хромосомный набор оказался гипердиплоидным (рис. 3). В каждой такой метафазе присутствовала одна лишняя хромо­
сома. При построении кариограммы из гипердиплоидных метафаз, обнару­
жили присутствие лишней, достаточно крупной, метацентрической хромо­
сомы. Можно предположить, что это дополнительная половая Xхромосома. В случае с жер. Ремингтон можно говорить о мозаицизме
64,XY/65,XXY, так называемая мозаика Кляйнфельтера.
ВД
ж»
ЛА
АР
«и
пл
**
**
«*
г»л
*••
в«-
«<
ttm
ят
йп
{А«1
«• »
ем
А*»
»• .
«к.
Рисунок 3. Хромосомы жер. Ремингтон, 65.XXY.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
16
В литературе лошадей с таким кариотипом до сих пор описано не бы­
ло. У людей мозаицизм с такой комбинацией половых хромосом встречает­
ся в 10% случаев синдрома Кляйнфельтера. Возможно, что такое состояние
встречается чаще. Так, Paulsen и соавторы (1968) при обследовании шести
индивидов 46,ХУ/47,ХХУ, у которых был выявлен мозаицизм в тестикулярной ткани, обнаружили, что только у трех из них мозаицизм выявлялся
в лимфоцитах (Симпсон Дж., 1985).
Возможно, что у лошадей может наблюдаться такая же картина, и
именно поэтому до сих пор не было обнаружено и описано случаев
64,ХУ/65,ХХУ.
В клинической картине у 46.ХУ/47.ХХУ реже, чем у 47.ХХУ индиви­
дов встречается гинекомастия, азооспермия, недоразвитие яичек. Уровень
тестостерона выше у 46,ХУ/47,ХХУ пациентов, а в биоптате яичек обнару­
живаются зрелые формы сперматозоидов (Симпсон Дж., 1985). Таким обра­
зом, недоразвитие одного из семенников у нашего жеребца, его нормальное
половое поведение, вполне соответствует клинической картине, характерной
для такой мозаики. При работе с данной лошадью хозяевами отмечалась не­
которая «туповатость», неусидчивость, что так же может являться следстви­
ем хромосомного нарушения. У людей с синдром Кляйнфельтера отмечает­
ся умственная отсталость, низкий коэффициент интеллекта (Simpson, 1979).
Полиплоидных клеток у исследуемых животных обнаружено не было.
ВЫВОДЫ
1. В норме кариотип лошади содержит 64 хромосомы: 13 пар мета- и
субметацентрических, 18 пар акроцентрических, пара половых хромосом.
Первая пара, как правило, самая крупная мета- или субметацентрического
строения. Вторая и третья пара— крупные субметацентрики. Хромосомы 4
— 6 пары субметацентрического строения. Хромосомы 7 - 1 3 пары - метацентрического строения. Х-хромосома — крупный метацентрик второй или
первый по величиине. У-хромосома — маленький акроцентрик.
2. При сплошном окрашивании достоверно можно определить первую
(крупный метацентрик), вторую (крупный субметацентрик) пару хромосом,
четырнадцатую пару (крупный акроцентрик) и половую Х-хромосому. Ру­
тинное окрашивание дает возможность анализировать геномные и некото­
рые структурные нарушения.
3. У лошадей с физиологическими и фенотипическими отклонениями
от нормы, хромосомная нестабильность оказалась значительно выше, чем у
лошадей в норме. Частота клеток с аберрациями колебалась от 5,2% до
16,6%. Уровень аберраций на 100 клеток находился в пределах от 8,62 до
22,22. У некоторых животных обнаружены кольцевые хромосомы. Поли­
плоидных клеток не выявлено.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4. У кобыл с нарушениями половых циклов частота хромосомных
аберраций оказалась самой высокой по сравнению с жеребцамикрипторхами (Р>0,95) и кобылами с аномальным потомством. Частота
метафаз с аберрацииями составила 10,15+/-2,88%. Уровень аберраций на
100 клеток- 15.25+/-3.66.
5. В группе лошадей с отставанием в росте частота хромосомных
нарушений выше, чем у животных с нормальным ростом (Р>0,95). Частота
клеток с аберрациями у лошадей с отставанием в росте составляет 12,9+/1,9%, уровень аберраций на 100 клеток - 18,09+/-4,13.
6. Выявлена кобыла с дисбалансом половых хромосом, 2п=
64,ХХ/63,ХО. Соотношение клеток в кариотипе: 64,63% - содержат
нормальный 64,ХХ набор, 35,37% - с отсутствием Х-хромосомы (63.ХО).
Кобыла имела фенотипические отклонения от нормы в росте — высота в
холке 172 см., против 163 — 165 см. в среднем по породе и нарушения
половых циклов.
7. Выявлен жеребец — с аномальным кариотипом, 2п= 64.ХУ/65.ХХУ.
Клеток с нормальным мужским кариотипом — 81,25%, клеток с лишней Xхромосомой - 18,75%. Жеребец - абдоминальный крипторх, с нормальным
половым рефлексом, плохо обучаемый в работе.
ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ
1. Лошадей, имеющих отклонения в росте и развитии, с нарушениями
половых циклов, рекомендуется проверять на наличие хромосомных
аберраций.
2. Осуществлять цитогенетическую аттестацию жеребцов, перед их
использованием в воспроизводстве и кобыл перед зачислением в
производящий состав.
СПИСОК РАБОТ ОПУБЛИКОВАНЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:
1. Шараськина О.Г. Особенности кариотипа лошади и использование
цитогенетического анализа в диагностике бесплодия //Мат. 58-й науч. конф.
молодых ученых и студентов СПбГАВМ. - СПб. - 2004. - С. 81 - 82.
2. Жигачев А.И., Шараськина О.Г. Практическое значение
цитогенетических исследований в коневодстве //Учен. зап. Витебской гос.
академии вет. медицины. - Витебск. - 2004. - Т.40, ч.2. - С. 84 - 86.
3. Жигачев А.И., Богачева Т.В., Шараськина О.Г. Цитогенетический
мониторинг при разведении племенных лошадей //Сборник докл. научн.практич. конференции и координац. совещания, поев. 100-летию со дня
рождения Скаткина П.Н. «Искусственное осеменение в коневодстве —
истоки биотехнологии в животноводстве». — Дивово. - 2004. - С. 73 — 76.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Подписано в печать 06.12.2005
Формат 60 х 84 1/16. Бумага офсетная
Объем I п.л. Тираж 100 экз. Заказ Ms 39
Издательство СПбГАВМ, Черниговская, 5.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
56
Размер файла
486 Кб
Теги
воспроизводительную, функции, аберрации, хромосом, нарушения, лошадь
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа