close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

2077.Генетические основы современной селекции

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Министерство образования и науки Российской Федерации
_____
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение
высшего профессионального образования
«Калмыцкий государственный университет»
Л.Г. Моисейкина, П.М. Кленовицкий
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СОВРЕМЕННОЙ СЕЛЕКЦИИ
Учебно-методическое пособие
Рекомендовано УМО вузов РФ по образованию
в области ветеринарии и зоотехнии в качестве
учебно-методического пособия для студентов
специальности 31.07.00 «Зооинженерия»
Элиста 2012
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ББК П531(2Рос.Калм)я73+П531я73
УДК 636.082.2(470.47)(075.8)
М 748
М 748 Моисейкина, Л.Г.
Генетические основы современной селекции [Текст]: учеб.-метод.
пособие / Л.Г. Моисейкина, П.М. Кленовицкий. – Изд. 2-е. – Элиста: Издво Калм. ун-та, 2012. – 63 с.
ISBN 5-230-20144-4
Печатается по решению редакционно-издательского совета
ФГБОУ ВПО «Калмыцкий государственный университет»
В учебно-методическом пособии изложены основные понятия по основам
генетики современной селекции, методика использования ее достижений в селекционной работе.
Учебно-методическое пособие предназначено для студентов зооветеринарных специальностей, аспирантов и научных сотрудников.
Рецензент:
зав. кафедрой генетики, разведения и биотехнологии в животноводстве
Московской государственной академии ветеринарной медицины
и биотехнологии им. К.И. Скрябина,
доктор с.-х. наук, профессор А.В. Бакай
ISBN 5-230-20144-4
© ФГБОУ ВПО «КалмГУ», 2012 г.
© Авторы, 2012 г.
2
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
СОДЕРЖАНИЕ
Введение............................................................................................................. 4
Селекция и генетика ....................................................................................... 5
Тема 1. Генетическое равновесие ............................................................... 13
1.1 Расчет частот генотипов и аллелей в популяции ................................... 13
1.2 Анализ генетического равновесия ........................................................... 14
Тема 2. Влияние мутаций и миграций на генетическую структуру
популяций ............................................................................................................. 18
2.1 Вероятность сохранения единичной мутации ........................................ 21
2.2 Влияние повторных мутаций на структуру популяций......................... 23
2.3 Влияние миграций на структуру популяций .......................................... 24
2.4 Вероятность сохранения рецессивных мутаций в латентном
состоянии................................................................................................................ 25
Тема 3. Влияние отбора на структуру популяций .................................. 26
Тема 4. Влияние скрещивания и подбора на структуру популяций... 31
Тема 5. Генетический контроль происхождения .................................... 33
Тема 6. Генетические расстояния............................................................... 37
Тема 7. Цитогенетическая характеристика животных ......................... 43
Тема 8. Приготовление препаратов хромосом ........................................ 49
8.1 Приготовление препаратов....................................................................... 49
8.1.1. Получение препаратов из костного мозга и селезенки ............... 51
8.1.2. Получение препаратов из лимфоцитов животных....................... 52
8.1.3. Приготовление препаратов хромосом из костного мозга при
прижизненном взятии пункции ..................................................... 53
8.1.4. Получение препаратов из ранних эмбрионов............................... 54
8.2 Окраска препаратов ................................................................................... 54
8.3 Анализ хромосомных препаратов............................................................ 56
Приложение 1................................................................................................... 59
Приложение 2................................................................................................... 60
Рекомендуемая литература.......................................................................... 62
3
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ВВЕДЕНИЕ
Интенсификация животноводства невозможна без углубленного использования достижений современной биологии. В настоящее время достигнуты
значительные успехи в изучении наследственного аппарата сельскохозяйственных и других культурных форм животных. По данному вопросу опубликован ряд монографий и методических рекомендаций, но эти работы ориентированы, главным образом, на круг специалистов, хорошо знакомых с проблемами генетики и селекции.
Настоящее учебное пособие предназначено для студентов, начинающих
свое знакомство с современными вопросами сельскохозяйственной биологии,
ставит своей целью привить им определенный навык исследований и ознакомить их с основными методами генетического анализа, и умений применить
генетические приемы в практических целях.
В период становления генетики культурных форм животных в ее развитии
наметилось два направления. Первое, связанное с именами А.С. Серебровского и Д. Фолконера, было ориентировано на разработку методов генетического
анализа количественных признаков и уделяло значительное внимание менделевским закономерностям. Второе, основоположником которого по праву
считается Дж. Лаш, полностью базировалось на оценке генотипа в целом.
Многие годы второе направление оставалось главенствующим в селекции
животных. Первое же, в силу малого числа известных у животных менделирующих признаков, играло вспомогательную роль, сводящуюся к изучению
наследственных заболеваний и контролю происхождения. В связи с бурным
развитием методов молекулярной биологии, послуживших основой для детального изучения генома, идеи А.С. Серебровского и Д. Фолконера обрели
базу для своего развития.
Дальнейшее развитие получили и идеи классической генетики количественных признаков, которые нашли свое отражение в разработке методов индексной селекции и наилучшего линейного прогнозирования (BLUP). Решение их требует соответствующего программного обеспечения и детальное изложение их принципов более важно для математиков и программистов. Для
селекционеров же они представляют интерес лишь в виде конкретного программного продукта.
4
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
СЕЛЕКЦИЯ И ГЕНЕТИКА
В последнее десятилетие в генетике животных получило широкое распространение применение методов молекулярно-биологического анализа и использование менделирующих генетических маркеров в селекции. Термин сигналь (английский его синоним – маркер вошел в научный обиход гораздо
позднее) ввел в двадцатые годы выдающийся русский генетик А.С. Серебровский (1970). Под этим термином он понимал аллеломорф менделирующего
гена (дискретный признак), сцепленный с группой аллелей, определяющих
проявление интересующего исследователя признака, как правило, полигенного, и тем самым выступающий в качестве своеобразной метки, позволяющей
проследить наследование данной группы аллелей. В более широком смысле
маркер – это любая наследуемая модификация структурных генов (аллеля),
анонимных нуклеотидных последовательностей или их материальных носителей – хромосом, с которыми сцеплена группа «аллеей интереса».
В простейшем случае в качестве маркера можно рассматривать признак,
«замкнутый сам на себя», к таковым относятся генные мутации, приводящие к
возникновению наследственной патологии. Собственно говоря, маркером может служить любой аллель любого гена, имеющего дискретное проявление:
масть, комолость и т.п., но число таких генов не велико и использование их в
качестве маркеров маловероятно, хотя они часто определяют признаки, являющиеся стандартом породы. Однако еще в конце минувшего столетия были
открыты наследственные признаки, которые имели полное право претендовать на роль сигналей.
В 1900 году чешский медик К. Ландштейнер открыл существование групп
крови (АВО) у человека. Длительное время этот факт не привлекал особого
внимания генетиков, хотя имел большое прикладное значение. Только после
объяснения Ф. Бернштейном (1924) характера наследования групп крови появилась отправная точка для развития иммуногенетических исследований.
Так что же открыли К. Ландштейнер и Ф. Берншгейн, К. Ландштейнер
впервые обнаружил антигенные различия в крови у человека, а Ф. Бернштейн
доказал, что эти различия обусловлены двумя аллелями одного локуса. Таким
образом, была показана генетическая природа систем групп крови. В настоящее время под системой групп крови понимают совокупность антигенов, контролируемых одним локусом. Число аллелей, контролирующих систему, может быть более двух.
В сложных системах, например, В- и С-системах у крупного рогатого скота, антигенные факторы контролируются несколькими тесно сцепленными
сублокусами, расположенными на 12-й и 18-й хромосомах. С-система состоит
из двух серий аллельных детерминант. Анализ рекомбинаций между фланкирующими аллелями показал, что длина участка хромосомы, занимаемого этой
системой, составляет 0,3 сантиморгана (сМ). Тогда как размер В-системы равен 0,7 сМ. У свиней сцеплены локусы Н- и С-групп крови. Кроме того, Jлокус сцеплен с генами SLA (главного комплекса гистосовместимости). Час5
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
тота кроссинговера между локусами J- и SLA- составляет 9,8 сМ. Расстояние
между локусом F-системы групп крови и геном эпистатической белой масти у
свиней равно 16,7 сМ.
Все известные системы групп крови у сельскохозяйственных животных
локализованы на аутосомах. Так, Н-система у свиней, тесно связанная с геном
чувствительности к синдрому злокачественной гипертермии (MHS), локализована на 6-й хромосоме, здесь же находится и S-система. Ген F-системы у
свиней локализован на 17-й хромосоме, а В- и J-системы на 7-й. У крупного
рогатого скота гены групп крови A, L, S и Z локализованы на 15, 3, 21 и 10-й
хромосомах. Хромосомная локализация F-системы у этого вида пока неизвестна. У овец локализация групп крови пока не определена. У лошадей известна хромосомная локализация двух систем: А- на 20-й и К- на 2-й хромосомах.
С развитием иммуногенетических методов был обнаружен ряд новых систем крови у человека и животных. В настоящее время известно 12 систем
групп крови у рогатого скота, 17 у свиней, 8 у овец, 9 у лошадей и 14 у птиц.
Таким образом, число известных систем групп крови оказалось меньше числа
хромосом. И хотя эти генетические структуры позволяют маркировать часть
хромосом, значительная часть генома остается немеченой. Напрашивалось естественное решение – использовать в качестве маркеров структурные гены, не
связанные с иммунной системой, однако это было связано с трудностями технического порядка.
Длительное время основным методом картирования хромосом у высших
животных с длительным циклом репродукции оставался генетикопопуляционный анализ. Исследования его позволили обнаружить тесное сцепление генов казеина молока у крупного рогатого скота. Этот метод широко
применяется в генетике человека и основан на оценке достоверности отклонений частоты рекомбинации между двумя генами от 50%, т.е. частоты, ожидаемой при отсутствии сцепления. Данный тест носит название lod-score test.
Дальнейшему развитию работ в области картирования хромосом у высших
животных значительно способствовали разработки в области генетики соматических клеток. Разработка гибридомной техники явилась новым шагом в
этом направлении. Гибридизация соматических клеток является уникальной
системой для анализа взаимодействия генов и их хромосомной локализации,
так как позволяет создавать межвидовые гибриды. В основе этого способа локализации генов лежат следующие три свойства: способность соматических
клеток в определенных условиях сливаться, образуя гибридные клетки (гибридомы); нестабильность кариотипа гибридом – утеря части хромосом в ходе
культивирования; возможность отбора клеточных колоний, несущих ген интереса на селективных средах. Анализируя дифференциальную структуру
хромосом в отобранных культурах можно определить хромосомную локализацию интересующего нас гена на основании особенностей кариотипа.
После разработки метода гибридизации in situ проблема хромосомной локализации генов у животных была практически решена.
6
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Этот метод позволил сделать значительный шаг вперед в изучении хромосомной локализации генов. За несколько лет были получены данные о генном
составе хромосом основных видов сельскохозяйственных животных. Преимущество этого метода перед хромосомным анализом гибридом заключается
в том, что он позволяет определить хромосомную локализацию любой заданной нуклеотидной последовательности.
В последние годы в качестве хромосомных маркеров нашли применение
различные сателлитные ДНК. К настоящему времени число их у различных
видов достигает сотен. Интерес к использованию сателлитной ДНК для маркирования хромосом связан с тем, что ее выделение и идентификация более
просты в сравнении с выделением и идентификацией ДНК структурных генов,
при этом для отдельных классов сателлитов характерны как их хромосомная
специфичность, так и специфичность локализации на хромосоме. Высокий
полиморфизм этих систем позволяет надеяться на эффективность использования их в качестве маркеров. К отрицательным свойствам этих маркеров относятся их анонимность (отсутствие фенотипического и генотипического проявления) и высокая видовая специфичность.
Сейчас в качестве генетических сигналей используются как различные
структурные гены, кодирующие определенные белки, так и фрагменты высокоповторяющейся ДНК. В литературе по генетике принято называть маркерами первого и второго типа. На основании этих данных получены сведения о
генетической структуре хромосом животных различных видов.
В качестве инструмента при определении локализации генов генетиками
широко используются различные структурные изменения хромосом (транслокации разных типов). В прикладной цитогенетике анализ кариотипа является
основным методом раннего выявления вариантов генетической патологии,
связанных с его аномалиями. Таким образом, хромосомные перестройки также являются своеобразными генетическими маркерами. Но это маркеры простейшего типа, «замкнутые на себя» т.е. информация, получаемая с их помощью минимальна, хотя и может иметь большое практическое значение.
Исследованиями ряда ученых было показано, что использование избирательных окрасок, выявляющих зоны ядрышковых организаторов (ЯОР) и
структурного гетерохроматина (NOR и С-окраски) позволяет выявить полиморфизм по этим хромосомным структурам. В частности, у свиней отмечен
породный полиморфизм по числу активных ЯОР. Описаны также случаи
структурного полиморфизма ЯОР и С-блоков. Однако частота встречаемости
подобных С и NOR вариантов невелика, и возможность их практического использования ограничена.
Таким образом, различные хромосомные варианты а также хромосомные
структуры могут служить генетическими маркерами, но область их применения строго ограничена – это сфера профилактики генетической патологии;
анализ филогенетических связей и построение генных карт. В отличие от хромосомных маркеров сигнали I и II типа могут быть использованы не только
при диагностике генетической патологии и анализе филогенетических связей.
7
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Вполне реально использование для их маркирования стабильных аллельных
групп или главных генов, влияющих на продуктивные качества животных.
Становление метода сигналей связано с работами по изучению генной карты у дрозофилы. Еще в ранних исследованиях Т. Моргана и Г. Меллера при
изучении таких генов, как vortex, Notch, eosin, было отмечено, что их фенотипическое проявление сильно меняется при комбинации с другими генами.
Опыты показали, что не сами гены vortex, Notch, eosin влияют на проявление
указанных признаков, а какие-то другие, локализованные в тех же хромосомах, выявить влияние которых стало возможным, благодаря их сцепленности
с сигнальными генами.
Основные принципы маркерзависимой селекции – метод сигналей – впервые были сформулированы и детально разработаны А. С. Серебровским и его
школой в 20-40 годы (А.С. Серебровский, 1970). Теоретической предпосылкой
для разработки метода сигналей явилась хромосомная теория наследетвенности, сформированная Т. Морганом и его учениками, основные положения которой можно свести к следующему: гены расположены в хромосомах в линейной последовательности и вероятность того, что в результате рекомбинации произойдет изменение сочетания разных аллелей двух генов пропорциональна расстоянию между ними на хромосоме.
Поясним сущность использования сигналей на следующем условном примере. Пусть на одной из хромосом локализован ген, аллели которого имеют
четкое фенотипическое выражение, обозначим их как S и s. Предположим, что
с этими аллелями тесно сцеплена группа генов, влияющих на какой-то количественный признак, и, что доминантные аллели вносят больший вклад, чем
рецессивы. Для простоты рассмотрим два крайних варианта групп сцепления:
SABC.. и sabc.., очевидно, что потомки, унаследовавшие первую группу сцепления, будут превосходить по величине данного признака остальных. В общем случае, в каждой хромосоме обычно бывает несколько генов, влияющих
на определенный признак, различающихся по силе и направлению действия.
Однако прямое определение силы действия гена является трудной задачей,
поэтому А.С. Серебровский предложил метод расчета аллосилы и аллобаланса. Обозначив силу действия доминантного и рецессивного аллелей как I s и
I S , он предложил в качестве оценки аллосилы i следующее уравнение:
i = Is − IS
(1)
Аллобаланс хромосомы в этом случае определяется как сумма аллосил,
локализованных на ней аллелей:
D = ∑i
(2)
Аллосила генов, сцепленных с маркером, по А. С. Серебровскому, задается
следующим выражением:
j = i( 1 − 2c ) ,
(3)
где j – сигнальная аллосила гена;
с – расстояние гена от маркера в единицах перектеста (морганах т.е. в %).
8
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Сигнальный аллобаланс в этом случае рассчитывается как сумма сигнальных аллосил:
d =∑ j
(4)
Метод сигналей был успешно применен при анализе качественных признаков у дрозофилы. Однако в те годы и даже в более позднее время в силу малой
изученности генома высших животных метод сигналей не нашел практического применения в селекции животных.
Лишь в результате создания высокоэффективных методов молекулярногенетического анализа появилась реальная возможность использования генетических маркеров в селекции. В последнее десятилетие исследования в области молекулярной генетики ориентированы на детальное изучение геномов
животных. В рамках этих работ возник ряд проектов по картированию хромосом быка, свиньи и овцы (С. Бендиксен, П. Улвсков, 1997).
В настоящее время оформились два направления, основанные на использовании методов молекулярной генетики в селекции: выявление полиморфизма
структурных генов (маркеры первого типа), связанного с генетическими заболеваниями или продуктивными особенностями животных (Л. Оливер и др.,
1995; Ю. П. Фомичев, Н. С. Марзанов, 1998), и использование полиморфизма
анонимных нуклеотидных последовательностей (маркеры второго типа) в
маркерзависимой селекции (М. Гортари и др., 1997).
Классическим примером применения маркеров первого типа является использование групп крови для контроля за селекционным процессом, начатое
еще в 70-е годы П. Ф. Сороковым и продолженное его учениками. При иммуногенетическом исследовании потомков голштинского скота оказалась, что
некоторые редкие аллели В-системы эритроцитарных антигенов, внесенные в
популяцию в результате использования быка Мастера и его потомков, маркируют повышенный уровень молочной продуктивности.
В последние годы возрос интерес к изучению полимофизма белков молока
с целью улучшения его технологических качеств. В первую очередь, это касается полиморфизма молочного каппа-казеина. Показано, что для производства
твердых сыров пригодно только молоко от коров, несущих В-аллель каппаказеина.
В качестве примера использования генетических маркеров в селекции
можно привести использование «главного гена», влияющего на повышение
плодовитости у овец. Меринос бурула (Австралия) типичный представитель
нон-пепин и является одной из самых плодовитых пород. Братья Сиерс вели
отбор только самок, а бараны были приобретены (без учета типа рождения) в
других племенных хозяйствах.
При таком характере племенной работы повышение плодовитости до 1,94
не могло быть следствием повышения частоты благоприятных аллелей локусов, имеющих небольшое влияние на многоплодие. Объясняется это постепенным увеличением частоты встречаемости особей, являющихся носителями
гена (или же дупликации, нехватки или плотной группы сцепления), оказывающее основное влияние на плодовитость (Л. Пайпер, 1987).
9
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Позднее аналогичная генетическая структура была выявлена и у овец других пород в Новой Зеландии, Исландии, Франции, Бангладеш, Индонезии и
Польше. Разумеется, само название бурула и его синонимы, используемые
разными авторами, является псевдонимом, за которым скрывается генетическая структура, механизм проявления которой не до конца понятен. Но это не
имеет значения т.к. важен конечный эффект. Использование «гена» бурула
повышает плодовитость овец на 8%.
Большой интерес для селекции овец представляет и второй «главный ген»,
получивший название кэллипэг в США или каррвелл в Австралии. Эта генетическая структура связана с мясной продуктивностью: выход мяса повышается на 32%. В настоящее время оба этих «гена» используются в коммерческих стадах овец разных стран мира. Носители бурула используются при создании новых многоплодных пород овец: многоплодный меринос в Венгрии,
кайфер в Австралии, булизи в Канаде и др.
Для селекции свиней по мясным качествам представляет интерес изучение
полиморфизма по гену гормона роста (GH), генов семейства MYOD, связанных с приростом и качеством мяса, лептина и рецептора лептина (LEP и LEPR)
и других (И. Дворжак и И. Булла, 1998). С репродуктивными признаками у
свиней связаны гены эстрогенового рецептора (ESR), I и II подсемейств цитохрома Н450 (CYP19, СУР21) а также супероксид дисмутазы 2 (SOD2).
В свиноводстве также представляет интерес выявление животных, несущих рецепторы к антигену К-88 E.coli. Ряд штаммов кишечной палочки, несущие антиген К-88, вызывают диарею новорожденных, часто сопровождающуюся высоким отходом поросят. Животные, несущие рецептор к этому антигену, и происходящие от матерей, имеющих этот рецептор, устойчивы к вирулентным штаммам E.coli (К. Сельвуд, 1979).
Ген, аналогичный по фенотипическому проявлению бурула, был выявлен у
свиней породы мэйшан. Оказалось, что различие в многоплодии у них связано
с полиморфизмом по гену эстрогенового рецептора (ESR): матки с генотипом
ВВ превосходят по многоплодию животных, гомозиготных по аллелю АА, в
среднем на 0,9-1,5 поросенка. Аллель В был также выявлен у коммерческих
североамериканских пород свиней, ведущих свое происхождение от крупной
белой породы. Полагают, что он был внесен в эту породу с «кровью» мэйшан.
По данным Н. А. Зиновьевой (1999), этот аллель с частой от 0,04 до 0,15
встречается и у российских свиней.
Классическим примером использования генетических маркеров стало раннее определение пола цыплят. В настоящее время для сортировки цыплят по
полу служит ряд генов-маркеров, сцепленных Z-хромосомой, позволяющих
создать аутосексные линии. Наиболее широко при этом применяют три пары
аллелей: В/b – полосатость и сплошная окраска; S/s – серебристая и золотистая окраска оперения; К/k — быстрая и медленная оперяемость. Особенностью аутосексных кроссов является то, что доминатые аллели должны находиться у самок, а самцы должны быть гомозиготны по рецессивному гену.
Основываясь на применении гена В/-, известные селекционные фирмы созда10
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ли несколько кроссов: «Б-390», Старкросс и А-браун. Суточные петушки этих
кроссов имеют белое пятно на затылке. В дальнейшем у них формируется полосатое оперение. У курочек светлое пятно отсутствует, оперение взрослой
птицы черное с золотистой гривой. Петушки четырехлинейного аутосексного
кросса «Хайсекс коричневый» имеют светло-желтую окраску, курочки, в основном, коричневые.
Различия в скорости оперения, обусловленные действием сцепленного с
полом гена К, были использованы в мясном кроссе «Бройлер-6». При скрещивании петухов линии 8 этого кросса, несущих аллель К, с курами линии 9 (носителями аллеля k) получают курочек с медленной скоростью оперения.
Скрещивая кур линии 89 (K/k) с петухами линии 67 (k-генотип), получают
медленнооперяющихся петушков. Маховые перья в суточном возрасте развиты слабо, а кроющие длиннее или равны маховым.
Эти различия позволяют во много раз повысить скорость сортировки по
полу и снизить травмирование цыплят. Но преимущественно используются
кроссы, основанные на различиях в окраске. Это связано с тем, что доминантный аллель К оказывает отрицательное влияние на интенсивность яйцекладки,
скорость полового созревания и жизнеспособность кур (Лоу и др., 1981), а
также снижается репродуктивная функция у петухов.
В птицеводстве генетиков и селекционеров в последние годы привлекла
возможность использования ряда менделирующих признаков.
Исследованиями выявлено, что для кур с розовидным гребенем, определяемым геноформулой R/R, характерны пониженные воспроизводительныые
качества, тогда как аллель r (листовидная форма гребня) выявляется у кур с
повышенной репродукцией. По менделевскому типу наследуется и устойчивость кур к лимфоидному лейкозу (Криттенден, 1974). При этом, выделяются
два уровня генетической резистентности: клеточная резистентность к вирусной инфекции и резистентность к развитию опухоли у инфицированных птиц.
Ограниченность кормовых ресурсов в мире обусловила интерес к сцепленному с полом гену карликовости (dW) и гену голошеести (Na). Введение dW
гена в популяцию птицы позволило создать линии кур с достаточно высокой
яйценоскостью при пониженном, за счет снижения массы тела, потреблении
корма (Нинг Янг и др., 1996; Тайксер и др., 1996). Использование гена голошеести Na совместно с dW способствовало повышению оплаты корма.
К маркерам первого типа относятся и различные генные мутации, приводящие к значительным потерям. Это синдром дефицита лейкоцитарной адгезии крупного рогатого скота, приводящий к гибели молодняка в результате
иммунного дефицита, лейкоз, скрепи, губкоподобная энцефалопатия (известная еще как «болезнь бешеных коров»), синдром палевой экссудативной свинины и, многие другие. Современные методы молекулярной генетики позволяют с абсолютной гарантией выявлять в стадах гетерозиготных носителей
этих аномалий. Однако проблема борьбы с наследственными заболеваниями
при всей ее значимости на сегодняшний день является лишь одним из направлений в современной генетике животных.
11
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Маркеры второго типа получают все большее распространение в силу своей относительной простоты и дешевизны исследований. Но основной причиной, привлекшей к нему пристальное внимание исследователей является их
высокий генетический полиморфизм. Эти элементы генома характеризуются
высокой вариабельностью и образуют семейства множественных псевдоаллелей, что позволяет говорить о перспективности использования их и качестве
сигналей при селекции по количественным признакам, для маркирования, так
называемых локусов количественных признаков – QTL (англ, qualitative trait
loci). Однако возможности его пока сильно ограничены в силу того, что очень
часто не известно, входят ли гены «интереса» в единую группу синтении с исследуемым маркером. В частности, у свиней пока известны лишь сателлитные
последовательности, маркирующие на 4-й хромосоме комплекс генов,
влияющих на рост животных, (А. Арчибальд и др., 1998) и на 15-й хромосоме
RN регион, связанный с оплатой корма и качеством мяса (Торстен и др., 1998).
Резюмируя изложенное, можно утверждать, что генетика качественных
признаков, дополненная аппаратом молекулярно-биологического анализа, играет важную роль в решении селекционных задач. И все же встает вопрос –
почему такое значение придается биологическим основам маркерной селекции? Какая связь между локализацией генов, кодирующих разные белки, и селекцией? Ответ прост, несмотря на существование генетического контроля
продуктивных признаков, «генов продуктивности», как таковых, в природе
нет. Фактически количественный признак формируется в результате взаимодействия всех генов организма, кодирующих ферменты, структурные белки,
регуляторные (гормоны, медиаторы и др.) полипетиды и рецепторные белки, в
том числе обеспечивающие адгезию – межклеточное взаимодействие. Но у
всех видов гены, отвечающие за синтез сходных по назначению белков, во
многом идентичны по своему нуклеотидному составу. Их можно рассматривать как своеобразные «аллели» (Это собственно и является материальной основой закона гомологических рядов Н.И. Вавилова). Определенная часть генов может кодировать продукт, участвующий в ряде ключевых процессов, и,
следовательно, оказывать более сильное влияние на формирование признака.
Это так называемые «главные» гены. Если они образуют тесную группу сцепления с маркером, возникает эффект условной плейотропии (А.С. Серебровский, 1970), лежащий в основе маркерной селекции. Например, говоря о QTL,
мы имеем в виду не с-гены в обычном представлении, а с-группу тесно связанных аллелей, т.е. своеобразную генетическую систему.
12
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ТЕМА 1
ГЕНЕТИЧЕСКОЕ РАВНОВЕСИЕ
1.1. Расчет частот генотипов и аллелей в популяции
Основой анализа генетического равновесия является вычисление частот
генотипов и аллелей, их образующих. Для нахождения частоты встречаемости
определенного генотипа в популяции подсчитывают число несущих его животных -m. Частота генотипа может быть выражена как в абсолютном (m), так
и в относительном (p=m/N) виде. Однако для расчета частоты аллелей обычно
используют абсолютные величины. Частоту аллелей вычисляют по следующей формуле:
( 2mii + ∑ mij )
Pi =
,
(1.1)
2N
где Pi – частота i-того аллеля;
mii – частота гомозиготных носителей данного аллеля;
∑ mij – сумма частот гетерозиготных носителей;
N – численность популяции.
В том случае, если ген представлен только двумя аллелями, уравнение
принимает следующий вид:
( 2mii + mij )
Pi =
.
(1.2)
2N
Для частот, рассчитанных по формулам 1.1 и 1.2, справедливо следующее
равенство:
∑ Pi = 1
Разберем расчет частоты аллелей на следующем примере:
У крупного рогатого скота красной горбатовской породы выявлено три аллеля гена трансферрина (TF): A, D и Е. Число животных с генотипами равно:
АА-10; AD-24; АЕ-1; DE-1; DD-16; ЕЕ
Рассчитать частоту аллелей.
Pi – частота аллелей A, D и Е.
mii – число гомозиготных носителей аллелей АА, DD и ЕЕ =10, 16, 1.
mij – число гетерозиготных животных с генотипами AD, AE, DE, число которых равно 24, 1 и 1.
N – сумма всех генотипов = (10 + 24 + 1 + 1 + 1 + 16) = 53.
Частота аллеля А будет равна:
( 2m AA + m AD + m AE ) 2 ⋅ 10 + 24 + 1 45
PA =
=
=
= 0.424
2N
2 ⋅ 53
106
Частота аллеля D:
( m DD + m AD + m EE ) 2 ⋅ 16 + 24 + 1 57
PD =
=
=
= 0.538
2N
2 ⋅ 53
106
13
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Частота аллеля Е:
( m EE + m AE + m DE ) 2 ⋅ 1 + 1 + 1
4
PE =
=
=
= 0.038
2N
2 ⋅ 53
106
∑ Pi = 0.424 + 0.538 + 0.038 = 1
Расчет частоты аллелей A, D и Е выполнен верно.
Выполнить самостоятельно следующие задания:
Задание 1
У крупного рогатого скота красной горбатовской породы выявлено два аллеля гена постальбумина (PALB): А и В. Число животных с генотипами равно:
АА- 4; АВ- 14; ВВ -24. Рассчитать частоту аллелей.
Задание 2
У крупного рогатого скота красной горбатовской породы выявлено два аллеля гена посттрансферрина (РТF): А и В. Число животных с генотипами равно: АА – 18; АВ – 14; ВВ – 12. Рассчитать частоту аллелей.
Задание 3
У овец кавказской породы в М-системе выявлено 2 аллеля. Число животных с генотипом М aa − 6 ; М ab − 39 ; М bb − 53 . Рассчитать частоту аллелей.
1.2. Анализ генетического равновесия
В 1908 г. Г. Харди и В. Вайнберг независимо друг от друга сформулировали основной закон популяционной генетики, названный их именами который
гласит: «В популяции, в которой скрещивания осуществляются случайно, при
условии равновесия, не нарушаемого ни отбором, ни мутациями, и при высокой ее численности соотношение генов и генотипов из поколения в поколение
остается абсолютно постоянным». Соотношение частот генотипов в этой ситуации описывается уравнением, получившим название уравнение ХардиВайнберга:
1 = ( p A + qa ) 2 при этом p + q = 1
(1.3)
В традиционном виде это уравнение принято записывать так:
2
p 2AA + 2 pq Aa + qaa
=1
Например:
У крупного рогатого скота ген каппа-казеина, влияющий на технологические свойства молока, представлен двумя аллелями: А и В. Для производства
твердых сыров пригодно только молоко, содержащее казеин ВВ. В таблице 1.1
приведены данные о числе животных разных генотипов по каппа-казеину в
выборках, полученных из популяций черно-пестрого, швицского и красного
горбатовского скота.
14
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 1.1
Частота различных генотипов каппа-казеина у крупного рогатого скота
(Н.А. Зиновьева и др., 1999; Ю.А. Столповский и др., 1999)
Порода
Генотипы
АА
АВ
ВВ
Черно-пестрая
17
28
20
Швицкая
17
45
85
Красная горбатовская
20
26
8
Частота генотипов каппа-казеина у скота черно-пестрой породы
2
2
p AA
= 17 , pq AB = 28 , q BB
= 20 (табл. 1.1). Частота аллелей из уравнения
1.2 составит:
p=
( 2 m AA + m AB )
( 2 ⋅ 17 + 28 )
62
=
=
= 0.477
2n
2( 17 + 28 + 20 ) 130
( 2mBB + m AB ) ( 2 ⋅ 20 + 28 )
=
q=
= 0.533
2n
130
Частота теоретических генотипов для данной популяции равна:
2
2
p AA
+ 2 pq AB + q BB
= 0.477 2 + 2 ⋅ 0.477 ⋅ 0.533 + 0.533 2 = 0.228 + 0.499 + 0.273 = 1
Теоретическая численность животных составляет,
AA = 0.228 ⋅ 65 = 15 AB = 0.499 ⋅ 65 = 32 , BB = 0.273 ⋅ 65 = 18 .
Следовательно, теоретическая и фактическая численность животных не
совпадает. Однако следует выяснить закономерна ли разница между фактической и теоретической частотой или она зависит от случайных факторов.
Для этого, по методу хи-квадрат рассчитаем соответствие.
Критерий хи-квадрат используется для проверки гипотез путем сравнения
фактического распределения с теоретическим. Использование ошибок выборочных показателей и сравнение двух вариационных рядов основаны на нулевой гипотезе ( H 0 ), которая предполагает, что между сравниваемыми выборками нет достоверных различий. Нулевая гипотеза опровергается или остается
в силе. Критерием оценки этих суждений является уровень достоверности – Р.
Вычисление критерия соответствия хи-квадрат также основано на принципах нулевой гипотезы. Критерий хи-квадрат используют при сравнении частот
двух эмпирических рядов или сравнении эмпирических рядов с теоретическими при гибридологическом анализе, при проверке различных гипотез, при
оценке эффективности применения лекарственных средств, закономерности
распределения частот в популяциях и др. Критерий хи-квадрат – показатель
приближенный. Он применим для выборок численностью 20 особей и более.
Его нельзя использовать, когда частоты выражаются в относительных величинах. Критерий хи-квадрат вычисляется по формулам
( O - E) 2
2
(1.4)
χ =
E
15
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2
1

( O - E) - 2 
,
(1.5)
χ2 =
E
где О – наблюдаемое число особей;
Е – теоретически ожидаемое число особей;
1
– поправка Йетса.
2
Если n и ожидаемые величины велики, то можно пользоваться формулой
1.4 без поправки.
Подставив в формулу 1.4 фактические и теоретические частоты, получим:
О
Е
О-Е
(O − E ) 2
(O − E ) 2
E
17
28
20
∑ = 65
15
32
18
∑ = 65
2
-4
2
4
16
4
0,27
0,5
0,22
∑ = 0.99
( O - E) 2
Полученная
представляет собой величину хи-квадрат. В данном
E
примере он равен 0,99.
При оценке согласия принято пользоваться тремя уровнями значимости:
Р=0,05; Р=0,01; Р=0,001, для которых в приложении 1 приведены стандартные
значения хи-квадрат. Если вычисленные значения хи-квадрат больше стандартного, находящегося в графе Р=0,01 и тем более в графе Р=0,001, то следует считать, что гипотеза не согласуется с полученными в опыте данными. Если вычисленная величина хи-квадрат меньше табличной, находящаяся в графе
Р=0,01, но больше той, которая находится в графе Р=0,05, согласие наблюдаемых данных с ожидаемыми являются сомнительным. Однако это не дает право отбросить нулевую гипотезу. Если вычисленная величина хи-квадрат
меньше табличной графы Р=0,05, то соответствие наблюдаемых данных с
ожидаемыми считаются установленным.
Величина хи-квадрат зависит от числа степеней свободы. Поэтому для каждого значения вероятности (Р) дано несколько значений хи-квадрат, расположенных в приложении 1 под определенным уровнем значимости. В рассматриваемых нами примерах число степеней свободы (v) на единицу меньше
числа классов. В задаче имеются два класса, число степеней равно 1. Следовательно, для решения задачи нужно использовать из приложения 1 уровни вероятности и строку «v=l». В этой строке стоят три значения хи-квадрат: 3,8;
6,6; 10,8. Вычисленные значения хи-квадрат значительно меньше табличных.
Следовательно, частота генотипов по каппа-казеину соответствует теоретически ожидаемому и находится в генетическом равновесии.
16
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Задание 1
По данным табл. 1.1:
1. Расчитать частоты аллелей.
2. Найти теоретическую численности животных разных генотипов.
3. Записать данные по следующей форме (табл. 1.2).
4. Рассчитать по методу хи-квадрат соответствие теоретических и фактических частот. Указать, находятся ли исследованные популяции в генетическом равновесии.
5. Дать характеристику обследованным популяциям.
Таблица 1.2
Порода
Частоты аллелей
Частоты генотипов
Генотипы
Теоретическая
Фактическая
Задание 2
У свиней ген рилизинг-кальциевого канала (CRC), связанный со стрессустойчивостью, представлен двумя аллелями: N и n. Гомозиготы nn чувствительны к стрессу и характеризуются худшим качеством мяса (палевая экссудативная свинина – PSE синдром).
Таблица 1.3
Встречаемость различных генотипов CRC у свиней
(Н.А. Зиновьева и др., 1998, 1999; Н.Г. Букаров и др., 1999)
Порода
Генотипы
NN
Nn
nn
Чешский ландрас
348
261
49
Датский ландрас
158
15
2
Крупная белая (Словакия)
83
36
4
Улучшенная крупная белая
1687
185
4
Дюрок
24
31
1
Пьетрен
19
16
17
Крупная белая (Россия)
26
15
0
По данным табл. 1.3:
1. Рассчитать частоты аллелей.
2. Найти теоретическую численность животных разных генотипов.
3. Записать данные по форме (табл. 1.2).
4. Расчитать по методу хи-квадрат соответствие теоретических и фактических частот. Указать, находятся ли исследованные популяции в генетическом
равновесии.
5. Дать характеристику обследованным популяциям.
17
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Задание 3
У овец ген бета-глобулина представлен двумя аллелями: А и В. Оба аллеломорфа, предположительно, нейтральны (табл. 1.4).
По данным табл. 1.4:
1. Рассчитать частоты аллелей.
2. Найти теоретическую численность животных разных генотипов.
3. Записать данные по форме (табл. 1.2).
4. Рассчитать по методу хи-квадрат 1 соответствие теоретических и фактических частот. Указать, находятся ли исследованные популяции в генетическом равновесии.
5. Дать характеристику обследованным популяциям.
Таблица 1.4
Встречаемость различных генотипов бета-глобулина у овец
(В.В. Бочкарев, 1998)
Порода
Генотипы
АА
АВ
ВВ
Ромни-марш
135
89
17
Цигайская
12
13
0
Синтетическая популяция
122
35
3
ТЕМА 2
ВЛИЯНИЕ МУТАЦИЙ И МИГРАЦИЙ НА ГЕНЕТИЧЕСКУЮ
СТРУКТУРУ ПОПУЛЯЦИЙ
Генетическая структура популяций изменяется в результате появления в
них нового генетического материала. Существует два механизма, обеспечивающих этот процесс: мутационные изменения и обмен генетической информацией между популяциями – миграции. Давление мутаций является основным источником возникновения новых аллелей. Миграции (импорт, экспорт,
племенная продажа) являются одним из предрасполагающих условий для распространения и закрепления генетических вариантов в породе или группе
родственных пород. Классическим примером роли миграционных процессов в
изменении генетической структуры популяций является распространение
синдрома дефицита лейкоцитарной адгезии в породах черно-пестрого корня.
В начале 80-х лет у крупного рогатого скота было описано наследственное
заболевание, получившее название синдрома гранулоцитопатии, болезни Такахаши-Хагемозера или дефицита лейкоцитарной адгезии – BLAD (Bovine
Leucocyta Adheasion Deficiancy). Заболевание обусловлено точковой мутацией
в гене, кодирующем бета субъединицу бета-два интегрина (CD 18). В результате мутации произошла замена кодона аспаргиновой кислоты в позиции 128
18
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
на триплет, кодирующий глицин. Интегрины являются поверхностными клеточными белками, запускающими процесс адгезии. Лейкоцитарные интегрины обеспечивают процессы миграции, регенерации, дифференцировки и иммунного ответа.
Таблица 2.1
Частота встречаемости гена BLAD в популяциях черно-пестрого скота
по ряду стран мира (В.М. Игнатьев, 1999)
Половозрастная
Исследовано
Частота носительСтрана
группа
животных
ства (%)
Германия
быки
3076
6,4
Дания
телята
1991
22,6
быки
2025
14,1
США
коровы
1559
17,0
быки
377
4,0
Чехия
коровы
61
6,0
Польша
быки
1680
5,0
Украина
быки
190
3,0
быки
161
5,6
Россия
коровы
15
6,7
Мутация, затрагивающая CD18 и получившая обозначение D128G, в гомозиготном состоянии приводит к резкому снижению устойчивости телят к бактериальным инфекциям. Впервые это заболевание было зарегистрировано у
прямых потомков выдающихся быков голштинской породы. Быка голландского происхождения Осборндейла Айвенго 1189870, родившегося в 1952 г.,
считали выдающимся производителем. Спустя 40 лет, когда стало известно,
что он является носителем гена BLAD, его потомство оказалось широко распространенным в черно-пестрых и красно-пестрых породах скота. В таблице
2.1 приведены данные о распространении BLAD-синдрома у скота чернопестрого корня в ряде стран мира.
Наибольшая частота встречаемости BLAD – синдрома отмечена в Дании.
Второе место по распространению гена дефицита лейкоцитарной агдезии в
этом списке занимают США. Среди красно-пестрого скота эта аномалия
встречается реже: 1,9% среди 484 исследованных быков.
В результате генеалогического анализа было установлено, что основным
распространителем BLAD в мире, в том числе на Украине и в России, оказался голштинский бык американского происхождения, внук Осборндейла Айвенго 1189870-Карлин М. Айвенго Белл 1667366, занимавший 12 место в сотне лучших быков США. В. М. Игнатьев (1999), на основании анализа родословных носителей BLAD установил, что в Россию мутантный ген был занесен через потомков Карлин М. Айвенго Белла. Два из них Билл 187 и Диез
1843 были его сыновьями, а Жордан 48 и Сад 11 внуками через Билл Тройя
1882797 и Джесси 1842389. К линии Осборндейла Айвенго 1189870 относится
19
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
и Шейк 15632. унаследовавший мутантный ген через отца Ю. М. Георга
338561 (Рис. 2.1).
Осборндейл
Айвенго
1189870
Пенстейт
Карлин М.
Диез 1843 *
Айвенго Стар Айвенго Белл Билл 187 *
1441440
1667366
Билл Трой Жордан 48*
1882797
Джесси Сад 11*
Но-на-ме Ю.М.Георг
1842389
Фонд Мат 338561
Шейк 15632 *
1392858
* быки-производители носители BLAD
Рис. 2.1. Схема родословной быков-производителей, носителей гена BLAD
в Российской Федерации
Носителями BLAD оказазались и представители линий Силинг Траджуп
Роккита 252803 – Жест 759 и Уес Идеала 933122 – Код 189. Жест 759 родился
1 августа 1983 в ФРГ от Жеста 502259 и Никол 3265711. Удой матери Жеста
759 за 305 дней лактации составил 9518 кг при жирномолочности 4,19%. Удой
ее матери – Нини 534969 составил 7891 кг при 4,47 % жира. Отец матери –
Пенстейт Айвенго Стар 1441440 является прямым потомком Особорндейл
Айвенго 1189870 и носителем BLAD.
Силинг
Трайджун
Рокит 252803
Силинг
Рокмэн
275932-
Райбрук
Старлайт
308691-241211
Жест
502259
Жест 750
МЧП-2538
Рис. 2.2. Схема родословной быков-производителей, носителей гена BLAD
в Российской Федерации
Код 189 родился в Канаде 11 июня 1984 г. Его отец – Литфильд Колумбус
ЕТ 172657 происходил из линии Бутмейкера и являлся лидером в списке 100
лучших быков. Индекс его племенной ценности превышал 500 кг. Мать –
Эден Дейри Гламорас Айви 9696068 – имела продуктивность за 305 дней лактации 11399 кг и 4,1% жира. Отцом ее был Особорндейл Айвенго 118970. Код
189, как и Жест 759, унаследовал ген BLAD от Особорндейл Айвенго 1189870
по материнской линии.
Уес
Скуй Эстэм Скуй Вели Пакламар
Идеал
Сам
Феста
Бутмакер
Л. Колумб
Код
933122
1344345
Дубль
1450228
1724657
189
Рис. 2.3 Схема родословной быков-производителей, носителей гена BLAD
в Российской Федерации
20
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таким образом, все быки, являющиеся носителями гена D28G поступили
из-за рубежа. Наибольшее количество племенного материала поступо из Канады (быки Билл 187, Код 189, Жордан 48, Шейк 15632), из США (Диез 1843,
Сад 11), из Германии (Жест 650). Миграция гена BLAD в популяциях Российского скота осуществляется в процессе приобретения замороженного семени и
эмбрионов и закупки животных.
Быки-производители имеющие ген BLAD, часто являются улучшателями
по молочной продуктивности, что способствует распространению BLAD в
популяциях скота черно-пестрого корня.
В результате испытания по качеству потомства в России Код 189 отнесен к
категории Б1, а Билл 187 к А2. Остальным быкам присвоена категория А1.
Цифры, полученные по Украине и России, в силу малой изученности поголовья на носительство BLAD, позволяют дать лишь предварительную оценку.
Но и они указывают на опасность распространения аллеля D128G в стадах
этих стран и необходимость знания селекционерами генетических процессов,
протекающих в популяциях.
Целью данного занятия является изучение факторов, влияющих на судьбу
мутаций в популяции, и изменения ее генетической структуры под воздействием мутационного давления, а также и миграций, и влияния числа потомков,
и объема популяции на их проявление.
2.1. Вероятность сохранения единичной мутации
Вновь возникшая мутация находится в абсолютном большинстве случаев в
гомозизотном состоянии. Вероятность сохранения ее в последующем зависит
от числа потомков. При стабильной численности популяции и отсутствии полигамии, через несколько сотен поколений она, как это было показано
Р.Фишером (1936), полностью исчезнет. Зависимость между числом потомков
и вероятностью сохранения мутации, в общем случае, задается распределением Бернулли. Чтобы избежать сложных расчетов, воспользуемся тем фактом,
что вероятность утери мутации в зависимости от числа потомков задается
простым уравнением:
k
 1
Q=  ,
(2.1),
2
где k – число потомков носителя мутации.
Отсюда вероятность сохранения этой мутации находим из выражения:
k
1
P = 1−  
(2.2).
2
Вероятность сохранения единичной мутации зависит от смены поколений
и количества потомков. Рассчитаем
21
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
 2 
 3 
G( s ) = 1 −    
1 − s 
 3 
k
(2.3).
где G(s) – искомая вероятность;
s – вероятность утери мутации в предыдущем поколении.
Между s и G(s) существует простая связь: s для Fi равна 1 – G(s), для
F0 s = 0 .
Отсюда вероятность утери мутации в 1 поколении. По условию G ( s )0 = 1
и s=0, тогда при одном потомке (k=l) вероятность сохранения мутации в F1 ,
равна:
1
 2 
1
 3 
2 1



 = 1−   =
G ( s )1 = 1 − 
3
1 − 0 
3
 3


,
s=
2
3.
2
4 5
2
G ( s )1 = 1 −   = 1 − =
9 9 и т.д.
3
Дня двух потомков (k=2)
Для второго поколения при k=l,
s = 1 − G ( s )1 = 1 −
1
3,
s=
2
3 . Тогда
1
 2 
2
 
2
 3 
6 1
3




 = 1−
= 1− =
G (s) 2 = 1 − 
7 7
7
 2  
 
 1 − 9  
9


Для
s=
k=2
2
4
9,
2
 2 
 2 
2
 3 
 3 
 18 








G(s) 2 = 1 −
= 1−
= 1−
= 1 −   = 0.387
2
4 

  23  
 23 
  4 
−
1




−
1


  27  
  27  






  9 
 3 




2
 3 
Задание 1
Рассчитайте вероятность сохранения мутации при числе потомков 1, 2, 5,
10, 20, 50 и 100 в первом, втором, третьем, четвертом и пятом поколениях.
Представьте результаты в виде таблицы (табл. 2.2).
22
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 2.2
Зависимость вероятности сохранения мутации в ряде поколений
от числа потомков
Поколение
Число потомков
1
2
10
20
50
100
Задание 2
Из уравнений 2.2 и 2.3 следует, что вероятность сохранения единичных
мутаций в потомстве пропорциональна числу потомков ее носителя. Эта закономерность важна в селекционном плане. Для сельскохозяйственных животных характерна полигамия, имеющая наибольшее выражение при использовании искусственного осеменения.
Средняя нагрузка на производителя в молочном скотоводстве составляет
1000-1500 маток в год. Для того, чтобы ответить на вопрос, как может повлиять наличие мутации у производителя на структуру популяции, рассмотрим
следующий пример:
В популяции численностью 20000 коров используется 10 производителей.
Один из них несет мутацию в гомозиготном состоянии.
1. Чему равна частота носителей мутантных генотипов и мутантного аллеля в F?
2. Как изменятся эти частоты, если число производителей уменьшится до
5, при условии сохранения среди них мутанта?
2.2. Влияние повторных мутаций на структуру популяции
Выше мы рассмотрели проблему сохранения единичной мутации и тем самым ответили на вопрос о роли вновь возникающих мутаций в изменении генетической структуры популяций. Но любая популяция на протяжении всей
своей истории подвержена постоянному мутационному давлению. Чтобы выяснить как при этом меняется структура популяции, рассмотрим динамику
частоты отдельного аллеля. Пусть Р – частота исходного аллеля А, обозначим
0
вероятность мутирования A в а через m, вероятностью обратной мутации в
силу ее малой величины можно пренебречь. Отсюда доля мутантного аллеля
может быть найдена из следующего уравнения:
Q0 = mP0
[2.4]
Тогда в поколении n частота мутантного аллеля будет равна
Q = 1 − P0 ( 1 − m ) n
[2.5].
Сопоставляя частоты Qi и Qn при известном m, можно рассчитать число
поколений, необходимое для достижения частоты Qn . Эта зависимость описывается уравнением:
[ln(1 − Qn ) − ln(1 − Qi)]
n=
m
[2.6]
23
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Пусть частота аллеля
A − P0 = 0.9 , а вероятность его мутирования
m = 10 −4 , тогда Q0 = 0.9 ⋅ 10 −4 = 9 ⋅ 10 −5 . Рассчитаем частоту мутантного аллеля в 4 поколении по формуле [2.5]:
Qn = 1 − 0.9(1 − 10 −4 ) 4
Чтобы вычислить какое число поколений нужно для того чтобы частота
аллеля увеличилась вдвое, т.е. Qi = 0,1 и Qn = 0,2, при принятых условиях,
подставляем имеющиеся значения в уравнение [2.6]:
[ln(1 − 0.2) − ln(1 − 0.1)] = 0.117783 = 1177.8
n=
10 − 4
10 − 4
Для решения задач раздела, при отсутствии вычислительной техники, воспользуйтесь таблицами натуральных логарифмов (приложение 2).
Задание 1
Предположим, что исходно существовал лишь аллель А, т.е. P0 = 1 , a
m = 10 −5 . Сколько поколений должно пройти, чтобы частота мутантного аллеля а оказалась равна 0,001; 0,003; 0,01?
Задание 2
Возможно ли изменение частот аллелей в результате только мутационного
давления (при m = 10 −5 или m = 10 −4 , время смены поколений принять равным 5 годам) частот аллелей в следующих случаях:
1. В 1968 г. в костромской породе аллель B1 I 1 P1' отсутствовал, а в 1992 г.
частота его составила 0,029.
2. У той же породы аллель Q' в 1968 г. встречался с частотой 0,0003, а в
1992 г. его частота составила 0,0033.
2.3. Влияние миграций на структуру популяции
В практике животноводства важную роль играет обновление племенного
материала (покупка племенного молодняка, спермы и эмбрионов как в пределах страны, так и по импорту). Этот процесс можно рассматривать как миграцию генетического материала.
В генетике популяций изменение частот аллелей в результате миграции
описывается уравнением:
Pn = P + ( 1 − m ) n ( p0 − P ) ,
[2.7]
где p0 – исходная частота аллеля в популяции-реципиенте;
Р – частота аллеля в донорской популяции;
Pn – частота аллеля в популяции-реципиенте, спустя n поколений;
n – число поколений;
m – доля животных, поступивших из донорской популяции.
24
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Задание 1
Рассчитать частоты мутантного аллеля гена CRC в стаде чешских ландрасов в 1, 2 и 3 поколениях в результате завоза племенного молодняка из Дании,
если доля мигрантов будет составлять 0,001, 0,01, 0,05 и 0,1. Частоты аллелей
определить на основании данных, приведенных в таблице 1,3.
Задание 2
Рассчитать частоты мутантного аллеля гена CRC в стаде датских ландрасов в 1, 2 и 3 поколениях в результате завоза племенного молодняка из Чехии,
если доля мигрантов будет составлять 0,001, 0,01, 0,05 и 0,1. Частоты аллелей
определить на основании данных, приведенных в таблице 1.3.
2.4. Вероятность сохранения рецессивных мутаций
в патентном состоянии
Многие из вновь возникших мутаций оказывают отрицательное влияние на
организм и могут существовать лишь в гомозиготном состоянии. Рассмотрим
факторы, способствующие их сохранению в скрытом состоянии. Частота появления гомозигот в Харди-Вайберговской популяции равна квадрату частоты
встречаемости данного аллеля:
Paa = q 2
[2.8]
Вероятность того, что в популяции численностью N не будет выявлено ни
одного гомозиготного носителя этого аллеля находится из уравнения Бернулли и имеет следующий вид:
Q = (1 − Paa ) N
[2.9].
Величина Q имеет следующий смысл: она указывает на тo, в каком проценте выборок численностью N не встретится ни одного животного с генотипом аа. Поясним это на следующем примере пусть q = 0.1 , N = 100 ,
Paa = 0.01 , Q = ( 1 − 0.01 ) 100 = 0.366 , т.е. из 1000 выборок по 100 голов в 366
может не быть ни одной гомозиготы аа.
Задание 1
Рассчитать вероятность отсутствия гомозигот для указанных в таблице 2.4
частот рецессивного аллеля и численности популяций.
25
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 2.4
Вероятность отсутствия гомозигот в зависимости от частоты встречаемости
аллеля и численности популяций
Численность популяции
Частота аллеля (q)
50
100
1000
5000
0,001
0,01
0,05
0,10
0,20
0,25
0,30
0,50
Задание 2
1. Рассчитать вероятность отсутствия гомозигот по аллелям А и В гена
PALB у красного горбатовского скота, используя данные задания 1 (раздел
1.1).
2. Рассчитать вероятность отсутствия гомозигот по аллелям А и В гена PTF
у красного горбатовского скота, используя данные задания 2 (раздел 1.1).
3. Рассчитать вероятность отсутствия гомозигот по аллелям А и D и Е гена
TF у красного горбатовского скота, используя данные задания 3 (раздел 1.1).
Задание 3
1. Рассчитать вероятность отсутствия гомозигот по мутантному аллелю гена CRC у свиней пород улучшенная крупная белая и пьетрен для стад численностью по 50 и 100 голов. Частоты аллеля рассчитать, исходя из данных, приведенных в таблице 1.3.
2. Рассчитать вероятность отсутствия гомозигот по аллелю BLAD в обследованных популяциях Дании, США, России и Украины, основываясь на данных, приведенных в таблице 2.1.
ТЕМА 3
ВЛИЯНИЕ ОТБОРА НА СТРУКТУРУ ПОПУЛЯЦИЙ
В зависимости от селективной ценности частота аллелей в популяции может изменяться под действием искусственного или естественного отбора. Эффективность отбора зависит от частоты аллеля и интенсивности отбора. Существует несколько вариантов отбора:
1. Отбор против рецессивных гомозигот;
2. Отбор против доминантных аллелей и при отсутствии доминирования;
26
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
3. Отбор против гомозигот;
4. Отбор против гетерозигот.
Наибольший интерес для животноводов представляют первые два варианта отбора. Отбор против рецессивных гомозигот служит основным инструментом при профилактике большинства генетических дефектов. Второй вариант отбора имеет место при различных вариантах наследования, связанных с
полным доминированием и различными отклонениями от него.
В соответствии с законом Харди-Вайнберга исходные частоты задаются
случайной комбинацией гамет. Интенсивность селекционного давления характеризуется параметром s, величина которого лежит в интервале от 0 до 1.
При проведении всех расчетов, исходную генерацию считают нулевой.
При отборе, Направленном против рецессивных генов, частоты генотипов
задаются следующими уравнениями:
p2
[3.1];
PAA =
( 1 − sq )
2 pqp
[3.2];
PAa =
( 1 − sq )
q2 (1 − s )
Paa =
,
[3.3].
( 1 − sq )
где р и q – частоты аллелей в исходном поколении.
В случае отбора при различных вариантах доминирования эти уравнения
принимают вид:
PAA =
PAa =
p2 (1 − s )
( 1 − s + sq )
2 pq( 1 − s )
( 1 − s + sq )
q2
Paa =
( 1 − s + sq )
[3.4];
[3.5];
[3.6].
Для того, чтобы вычислить частоты генотипов, надо определить соответствующие частоты аллелей. Разберем схему расчета на следующем примере.
Пусть в исходной популяции р = 0,5; q = 0,5 и s = 1. Отбор идет против рецессивных гомозигот. Подставляя исходные значения в соответствующие уравнения, находим:
0.25
0.25 1
=
= ;
( 1 − 1 ⋅ 0.25 ) 0.75 3
0.50
0.50 2
PAa =
=
= ;
( 1 − 1 ⋅ 0.25 ) 0.75 3
0.25( 1 − 1)
Paa =
=0
( 1 − 1 ⋅ 0.25 )
PAA =
Новые частоты аллелей находятся из уравнений:
27
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
p ' = PAA +
q ' = PAa +
1
2 PAa
1
2 PAa
[3.7];
[3.8].
1
1 1 2 1 1 2
= + ⋅  = + =
2 p Aa 3 2  3  3 3 3 .
1
1 1
= 0+ =
q ' = p aa +
2 p aa
3 3
2
1
p' =
q' =
3,
3.
В нашем примере
При прекращении действия отбора популяция, в соответствии с законом
Харди-Вайнберга-Пирсона, переходит в равновесное состояние, характеризующееся новым соотношением генотипов. В данном случае они будут равны:
p ' = p AA +
2
4
2
PAA =   =
9
3
2 1 4
PAa = 2 ⋅ ⋅ =
3 3 9
2
1
1
Paa =   =
9
3
4 4 1
PAA + PAa + Paa = + + = 1
9 9 9
Проверяем:
При s = 0,5 получаем:
0.5 2
0.25 2
PAA =
=
=
(1 − 0.5 ⋅ 0.25) 0.875 7
2 ⋅ 0.5 ⋅ 0.5
0. 5
1
PAa =
=
=
(1 − 0.5 ⋅ 0.25) 0.875 7
0.5 2 (1 − 0.5) 0.125 1
Paa =
=
=
(1 − 0.5 ⋅ 0.25) 0.875 7 .
Проверяем правильность решения:
2 4 1
PAA + PAa + Paa = + + = 1
7 7 7
Новые частоты аллелей:
2 4
2 2 4
p' = +   / 2 = + =
7 7
7 7 7
q' =
28
1 2 3
+ =
7 7 7
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
При прогнозировании последствий отбора против рецессивных гомозигот
априори допускается, что естественный отбор различает все генотипы животных. Фактически же селекционеру различить доминантных гомо- и гетерозигот по фенотипу не удается. С внедрением метода молекулярно-генетического
типирования определение геноформулы любого животного стало реальностью. Зная истинную геноформулу, селекционер волен вести отбор против
нежелательного аллеля как по первому, так и по второму варианту. В этом
разделе мы используем данные, полученные методом молекулярногенетического типирования, но при решении примеров будем полагать, что
отбор ведется только против рецессивных гомозигот.
Однако в некоторых случаях появляются отклонения от правила. Часто
ошибочно считают, что частота гамет, несущих рецессивный аллель, всегда
может быть определена как корень квадратный из Раа. Однако следующее равенство:
[3.9];
q = Paa
справедливо лишь для популяции, находящейся в состоянии генетического
равновесия. Поэтому использование уравнения [3.9] может привести к ошибочному результату. Поясним это на следующем примере: Пускай имеются
два аллеля А и а, кроме того, аллель А в гомозиготном состоянии обладает летальным действием и особи с генотипом АА не рождаются. В этом случае соотношение фенотипов будет следующим:
2 AA : 1аа .
Используя уравнение 3.1 мы приходим к ошибочному заключению, что
частота рецессивного аллеля а равна корню квадратному из 1/3. Фактически
же она задается уравнением 3.8 и в данном случае равна 2/3, т.е. в 1,3 раза
выше, чем это следует из уравнения 3.9.
Задание 1
Используя данные табл. 1.3:
1. Рассчитать частоты рецессивного аллеля CRC и частоты генотипов, при
s=l в 1, 2, 3 и 4 генерациях для пород свиней.
2. Указать, для каких пород давление отбора более эффективно и как оно
связано с исходной частотой аллеля.
Задание 2
Используя данные табл. 1.3:
1. Рассчитать частоты рецессивного аллеля CRC и частоты генотипов, при
s=0,5 в 1, 2, 3 и 4 генерациях для пород свиней.
2. Указать для каких пород давление отбора более эффективно и как оно
связано с исходной частотой аллеля.
Задание 3
Используя данные табл. 1.3:
1. Рассчитать частоты рецессивного аллеля CRC и частоты генотипов, при
s=0,25 в 1, 2, 3 и 4 генерациях для пород свиней.
29
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2. Указать для каких пород давление отбора более эффективно и как оно
связано с исходной частотой аллеля.
Задание 4
Используя данные табл. 1.1:
1. Рассчитать частоты аллеля В каппа-казеина и частоты генотипов, при
отборе против аллеля A (s=l) в 1, 2, 3 и 4 генерации для пород крупного рогатого скота.
2. Указать для каких пород давление отбора более эффективно и как оно
связано с исходной частотой аллеля.
Задание 5
Используя данные табл. 1.1:
1. Рассчитать частоты аллеля В каппа-казеина и частоты генотипов, при
отборе против аллеля A (s=0,5) в 1, 2, 3 и 4 генерациях для пород крупного рогатого скота.
2. Указать для каких пород давление отбора более эффективно и как оно
связано с исходной частотой аллеля.
Задание 6
Используя данные табл. 1.1:
1. Рассчитать частоты аллеля В каппа-казеина и частоты генотипов, при
отборе против аллеля A (s=0,25) в 1,2, 3 и 4 генерациях для пород крупного
рогатого скота.
2. Указать для каких пород давление отбора более эффективно и как оно
связано с исходной частотой аллеля.
Задание 7
Используя данные табл. 1.4.
1. Рассчитать частоты аллеля А бета-глобулина и частоты генотипов, при
отборе против него (s=l) в 1, 2, 3 и 4 генерациях для пород овец.
2. Указать для каких пород давление отбора более эффективно и как оно
связано с исходной частотой аллеля.
Задание 8
Используя данные табл. 1.4:
1. Рассчитать частоты аллеля А бета-глобулина и частоты генотипов, при
отборе против него (s=0,5) в 1, 2, 3 и 4 генерациях.
2. Указать для каких пород давление отбора более эффективно и как оно
связано с исходной частотой аллеля.
Задание 9
Используя данные табл. 1.4:
1. Рассчитать частоты аллеля А бета-глобулина и частоты генотипов, при
отборе против него (s=0,25) в 1, 2, 3 и 4 генерациях для пород овец.
30
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2. Указать для каких пород давление отбора более эффективно и как оно
связано с исходной частотой аллеля.
ТЕМА 4
ВЛИЯНИЕ СКРЕЩИВАНИЯ И ПОДБОРА
НА СТРУКТУРУ ПОПУЛЯЦИЙ
Скрещивание и подбор также являются инструментами направленного изменения генетической структуры стада. В отличие от отбора и миграционных
процессов, при которых структура популяции изменяется в результате элиминации или интродукции генетического материала, их влияние основано на направленном сочетании имеющихся в стаде генотипов с новыми генетическими формами.
Соотношение частот генотипов при скрещивании и подборе в общем виде
задается следующим уравнением:
[4.1],
1 = ( p + q )( p1 + q1 ) ,
где р и q – частоты аллелей в исходной популяций;
p1 и q1 – частоты аллелей в сочетающейся с ней группе.
Полагая p1 = p + d и соответственно q1 = p − d , находим уравнения для
расчета частот аллелей и генотипов, характеризующих новую популяцию:
1
p' = p + ⋅ d
[4.2];
2
1
q' = q − ⋅ d
[4.3];
2
'
PAA
= p( p + d )
[4.4];
'
Paa
= q( q − d )
[4.5];
'
PAa
= 2 pq + d ( qp )
[4.6].
Разберем это на следующем примере:
В группе маток частота аллелей равна р=0,6, a q=0,4. У закрепленных за
ними производителей эти частоты составляют: р=0,8 и q=0,2. Рассчитаем частоты аллелей и генотипов у потомков этих родителей. Первоначально находим
d = 0.8-0.6 = 0.2 отсюда:
p ' = 0 .6 + 0 .1 = 0 .7 ;
q' = 0.4 − 0.1 = 0.3 ;
'
PAA
= 0.6 ( 0.6 + 0.2 ) = 0.48 ;
'
Paa
= 0.4( 0.4 − 0.2 ) = 0.08 ;
31
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
'
PAa
= 2 ⋅ 0.6 ⋅ 0.4 = 00.2( 0.4 − 0.6 ) = 0.44 .
Рассмотрим, как изменится структура популяции в F2 . Исходно р=0,7;
'
'
q=0,3; р1=0,8, q1= 0,2; d=0,l. Тогда р'=0,75 и q'=0,25; PAA
= 0.56 ; Paa
= 0.06
'
и PAa
= 0.38 . Как видим, генетическое равновесие нарушено.
При спаривании животных исходной группы с гомозиготной формой, при
отсутствии полного доминирования, задача решается в рамках рассмотренных
уравнений при p1 = 1 .
Задание 1
У коров костромской породы отсутствовал аллель B1O3Y2A'2E'3Q'P'Q'Y'.
При скрещивании этих коров была использована группа быков швицкой породы, несущих этот аллель с частотой 0,329 (А.В. Баранов , 1998).
1. Расчитать теоретическое значение частоты этого аллеля у коров 1/2, 3/4
и 5/8 кровности по швицкой породе.
2. Привести теоретические значения частот гомо- гетерозигот по этому аллелю. Фактически его частота составила: 0,164; 0,354 и 0,122. Можно ли объяснить эту динамику частот как результат скрещивания?
Задание 2
Аллель G3O1T1Y2E'3F2' , отсутствующий у костромской породы в той же
группе быков, встречался с частотой 0,316.
1. Расчитать теоретическое значение частоты этого аллеля у коров 1/2, 3/4
и 5/8 кровности по швицкой породе.
2. Привести теоретические значения частот гомо- и гетерозигот по этому
аллелю. Фактически его частота составила: 0,159; 0,240 и 0,268. Можно ли
объяснить эту динамику частот как результат скрещивания?
Задание 3
В стаде учхоза «Костромское» частота аллелей эритроцитарной Bсистемы: B1O3Y2A'2E'3Q'P'Q'Y' и G3O1T1Y2E'3F2' – у полукровных швицких коров составила 0,115 и 0,300. Чему теоретически равна частота этих аллелей у
использованных для скрещивания швицких быков?
Задание 4
1. По данным таблицы 1.3 рассчитать частоту доминантного и рецессивного аллелей гена CRC у потомства чешских ландрасов, если их скрестить с
хряками той же популяции, несущих доминантный аллель.
2. Приведите новые частоты генотипов.
3. Рассчитайте генетическую структуру новой популяции при отсутствии
отбора и подбора.
32
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Задание 5
1. По данным таблицы 1.3 рассчитать частоту доминантного и рецессивного аллелей гена CRC у потомства датских ландрасов, если их скрестить с
хряками той же популяции, несущих доминантный аллель.
2. Приведите новые частоты генотипов.
3. Рассчитайте генетическую структуру новой популяции при отсутствии
отбора и подбора.
Задание 6
1. По данным таблицы 1.3 рассчитать частоту доминантного и рецессивного аллелей гена CRC у потомства чешских ландрасов, если их скрестить с датскими ландрасами, несущих доминантный аллель.
2. Приведите новые частоты генотипов.
3. Рассчитайте генетическую структуру новой популяции при отсутствии
отбора и подбора.
4. Проследите динамику структуры популяции при заданном варианте
подбора до 3 поколения.
Задание 7
1. По данным таблицы 1.1 рассчитать частоту A и B аллелей каппаказеина у потомков коров черно-пестрой, швицкой и красной горбатовской
пород, если их скрестить с быками, гомозиготными по аллелю B.
2. Приведите новые частоты генотипов.
3. Рассчитайте генетическую структуру новой популяции при отсутствии
отбора и подбора.
4. Проследите динамику структуры популяции при заданном варианте
подбора до 3 поколения.
ТЕМА 5
ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОНТРОЛЬ ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Генетический контроль селекционного процесса – одна из старых, но не
утративших своего значения, проблем прикладной генетики. История его становления связана с развитием иммуногенетики животных. Первоначально эта
проблема сводилась к генетической экспертизе происхождения и исключению
ложных родителей. Поясним суть этого процесса на примере несколько далеком от животноводства, но достаточно наглядном.
У человека карий цвет глаз доминирует над голубым, и, следовательно, у
голубоглазых родителей не может родиться кареглазый ребенок. Этот факт
столь широко известен, что Ж. Сименон использовал его в одном из своих детективов. Но вот в обратном случае сделать столь категоричный вывод невозможно. Кареглазые родители могут нести доминантный ген как в гомозигот33
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ном, так и гетерозиготном состоянии, и их ребенок может иметь другой цвет
глаз.
Здесь мы сталкиваемся с проблемой зависимости точности экспертного заключения от числа генетически детерминированных признаков. Очевидно,
что чем больше генов и их аллельных форм вовлечено в экспертную систему,
тем точнее результат экспертизы. На эффективность ее оказывает влияние и
генетическая структура популяции: чем выше частота встречаемости аллеля в
стаде, тем менее информативно его использование в экспертной системе.
Наиболее информативными являются редкие аллели, но число их невелико,
что снижает эффективность их использования, что подтверждаются данными
Н.С. Марзанова (табл. 5.1).
Таблица 5.1
Эффективность применения систем групп крови и полиморфных
белков у овец для контроля достоверности происхождения
с учетом популяционных частот аллелей (Н.С. Марзанов, 1991)
Система
Число аллелей Эффективность системы Общая эффек тивност ь
А
В
С
D
М
2
8
3
2
4
Tf
Hb
Са
Gc белок
14
3
2
2
Группа крови
0,07
0,44
0,13
0,03
0,07
Полиморфные белки
0,44
0,13
0,03
0,05
0,48
0,55
0,57
0,59
0,77
0,80
0,81
0,82
В связи с тем, что число генетически детерминированных признаков с четко выраженными фенотипическими различиями у животных невелико, до разработки методов иммуногенетической паспортизации, эта проблема в животноводстве оставалась открытой. Но иммуногенетический подход, несмотря на
то, что эксперт оперирует десятками аллелей, не обладает стопроцентной точностью, т.к. тот или иной аллель характерен не для отдельной особи, а для
группы животных. Поэтому более информативными являются редкие и уникальные аллели. Интерес в этом плане представляют, не только группы крови,
но и другие высокополиморфные системы, в том числе сателлитные ДНК.
Хотя при решении прикладных задач в животноводстве этого порой и достаточно, но с развитием молекулярной биологии появились методы, позволящие дать индивидуальную характеристику генотипа. Речь идет о так называемой генетической дактилоскопии (фингерпринт или по-русски «отпечатки
пальцев»). Как для каждого человека, исключая однояйцевых близнецов, не34
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
повторим папиллярный узор на пальцах, так для каждой особи типичен свой
генетический «узор», выявляемый методом фингерпринта, причем каждый
элемент этого узора генетически детерминирован и получен от одного из родителей, что позволяет использовать его при оценке достоверности происхождения.
При использовании классических признаков за основу берется либо внешнее проявление контролирующих их аллелей, либо идентификация их с помощью специфических реагентов (выявление групп крови) или же, в случае
полиморфизма сателлитов, анализ специфических нуклеотидных последовательностей методом электрофореза. При фингерпринте мы имеем дело не с
генами, как с таковыми, в данном случае полиморфизм связан с особенностями нуклеотидного состава всей ДНК, содержащей определенные последовательности, узнаваемые различными ферментами рестрикции (рестриктазами),
разрезающими в этих зонах молекулу ДНК. Число таких зон (сайтов или точек) рестрикции и их положение в результате мутаций меняется. Поскольку
даже при низком мутационном давлении на единичный ген в одном поколении за время время существования видов накопилось огромное число мутации, особенно в зонах «молчащей» ДНК, для каждой особи характерен свой
рисунок рестрикции. Следовательно, в основе метода генетической дактилоскопии лежит полиморфизм длин рестриктных фрагментов (ПДРФ), связанный с индивидуальными особенностями расположения точек рестрикции. Для
выявления этого полиморфизма используют электрофорез.
Проведение классического фингерпринта и его анализ достаточно сложный и дорогостоящий процесс, поэтому в практике используют упрощенные
варианты ПДРФ, такой, как анализ полиморфизма нетранскрибируемого
спейсера гена 28 S рРНК у B.taurus, который упоминался в первой главе. Подобный подход используется и при анализе ПДРФ других генетических
структур.
Существует также еще один интересный метод генетической экспертизы –
дерматолифтический, в основе которого лежит изучение кожных узоров,
главным образом, носового зеркала, так как эти узоры также индивидуальны,
как отпечатки пальцев, и обусловлены генетически.
На вопрос, столь ли важно знать точное происхождение животных и исключать ложное родство, ответ дает таблица (табл. 5.2).
Из приведенных данных видно, что чем выше доля ошибочных данных,
тем сильнее отклоняется оценка производителя по потомству от истинной. Н.
Г. Букаров и др. (1998) также подтвердили, что процент ошибочных записей
влияет на оценку уровня наследуемости признака у крупного рогатого скота.
Таким образом, ошибки в записях о происхождении оказывают отрицательное
влияние на эффективность селекции. Разумеется, влияние доли ошибочных
записей на эффективность селекции носит нелинейный характер, т.к. помимо
этого на нее влияет различие в продуктивности истинных и ложных потомков,
приписываемых тому или иному предку.
35
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 5.2
Влияние уровня ошибок происхождения на объективность оценки генотипа
производителей по качеству потомства и эффективность селекции стада
по настригу шерсти (Н.С. Марзанов, 1991)
% ошибок Разница дочери- Изменение эффективности селек№
происхождесверстницы
ции в %
барана
ния
номин. истин.
всего
на 1% ошибок
9263
12,3
0,12
0,09
9,02
0,73
310
22,9
0,15
0,26
42,32
1,85
842
20,7
0,02
0,12
83,30
4,02
98109
45,3
0,19
0,43
55,84
1.23
8460
41,0
0,07
0,30
90,06
2,20
81330
32,7
0,18
0,21
14,30
0,44
Среднее
28,6
49,14
1,72
Нельзя ли решить эту проблему чисто организационными мерами, не прибегая к затратам на генетическую экспертизу? Из теории управления известно,
что чем сложнее система, т.е. чем больше различных элементов она в себя
включает, и разнообразнее связи между этими элементами, тем выше вероятность возникновения ошибок в результате ее деятельности. Не случайно в
сложных технических системах предусматривается дублирование основных
узлов и цепей. Но в селекционном процессе этот принцип не осуществим в
силу уникальности составляющих его элементов. Поэтому система генетического контроля является его составным элементом.
Задание 1
Установить соответствует ли происхождение потомков сведениям, записанным в табл. 5.3 (Ларина, Муксинов, 1985).
Задание 2
В племобъединение поступили быки, записанные в родословной как потомки производителя 209 от разных матерей. В результате иммуногенетической проверки установили следующие генотипы быков в системе В групп
крови:
Производитель 209…GOY/BQK/E2I/
Потомки:
1217
. . . . . . . . OY2D/G//GOY
1615
. . . . . . . . I/G//BQK/E2I/
1421
. . . . . . . . GE3F/O//OI2D/G/
214
. . . . . . . . GOY/O1T3D/G/
224
. . . . . . . . BQK/E2I//O1I2D/G/
321
. . . . . . . . GE3/F/O//O1I2D/G/
Определить, для каких быков происхождение от производителя 209 исключается.
36
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Задание 3
При иммунологическом исследовании у курицы обнаружен антиген С1
системы групп крови С, а антигены С2, С3, С4 отсутствуют. У петуха обнаружен антиген С4, но нет антигенов С1, С2 и С3. Ожидается ли в первом поколении расщепление потомства по системе групп крови С?
Таблица 5.3
Животные
Генотипы производителей, коров и их потомства
А
В
С
F
I
L
V
и его номер
Производитель
657
Производитель
630
Мать 638
Потомок 762
Мать 593
Потомок 731
Мать 436
Потомок 604
Мать 600
Потомок 772
А2/D2 D1TE3/ FK// I2Y2
C2W/W
F/F -/-
D2/D2 O1Y2D/G//GE3/F/O/ C1R2/WX1 F/F -/D2/D2
А2/D2
D2
D2/D2
D2
D2
А2/D2
D2
O1O//I/
O1TE3/K//I/
DGKE3/O/
I2Y2/DGKE3/O
O1Y2D/G//I/G//O1TY2E3/F/
BQT
C1W/R1
W/R
C1/W
C2W/W
R2/WX1
C1R2/WX1
C1
C2R
F/F
F/F
F/V
F/V
F/V
F/V
F/F
F/F
-/-/-/-/-/-/I/-/-
-/-
S
Z
H1/- Z/-
L/- SH//H/ Z//
L/-/L/L/L/L
L
-/L
U/-/SH/
H/
SH/
H/
S
S
Z
Z
Z
Z
Z
Z
Z
Z
Задание 4
При исследовании 150 потомков двух баранов-производителей 145 и 520
от овец каракульской породы методом электрофореза в сыворотке крови обнаружено 6 фенотипов амилазы (АmА/А =3, АmА/В=15, АmА/С=9, АmВ/В=27,
АmВ/С=66, АmС/С=30). Баран 145 имел генотип АmА/В, баран 520 – АmС/С.
Можно ли определить, сколько потомков было от барана 145, а сколько – от
барана 520?
Укажите ошибочно записанных предков для каждого потомка и дайте аргументированное заключение.
ТЕМА 6
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ РАССТОЯНИЯ
Использование различных полиморфных систем позволяет контролировать
генетическую структуру популяций, пород и стад и определить степень их генетического сходства. Это позволяет оценить влияние систем разведения животных на генетическую структуру стад. Разумеется, сравнение генетической
37
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
структуры разных групп животных не является самоцелью, однако в совокупности с анализом динамики продуктивных качеств оно служит критерием выбора селекционной стратегии.
Рассмотрим основные методы сравнения генетической структуры популяций. В простейшем случае, когда число генов и их аллелей невелико (примером чему может служить белковый полиморфизм) анализ может быть ограничен прямым сравнением аллельных частот. При сравнении структур популяций по большому числу генов и их аллельных форм такой подход к решению
данной задачи трудоемок. В этом случае пользуются интегральными показателями, основанными на использовании аллельных частот. В качестве таких
показателей предложен целый ряд коэффициентов генетического сходства
или различия. Величина всех этих критериев, в зависимости от отсутствия или
наличия генетического сходства между сравниваемыми группами, лежит в интервале от 0 до 1.
Разберем лишь два из них: коэффициенты генетического сходства
А.Серебровского и М. Нея. Подробное описание критериев, предложенных
для этой цели другими авторами, и их анализ, даны в монографии
Н.С. Марзанова (1991).
Первым расчет метода оценки генетического сходства разработал
А.С.Серебровский (1970). Им было предложено два критерия для оценки генетического расстояния между популяциями, основанных на сравнении частот аллелей:
d2 = ∑ ∆i2 / m
[6.1]
(∑ ∆i2 / m),
[6.2]
d=
где m – число аллелей по которым идет сравнение;
∆i =(xi – yi), а xi и yi – частоты i-того аллеля в сравниваемых популяциях.
Формула генетического сходства по Серебровскому имеет следующий вид:
r=1–d
[6.3]
Несмотря на простоту расчетов по формуле Серебровского [6.2], при малых значениях частот она дает смещенную оценку генетических расстояний.
Поэтому для практических целей лучше всего использовать формулу М. Нея.
В 1972 г. М. Ней предложил для оценки генетического сходства использовать следующую формулу:
D = – ln IN
[6.4]
2
2
IN = ∑ ∑ xij yij /
∑∑ x ij ∑∑ y ij
[6.5]
где хij и уij – частоты i-гo аллеля, j-го локуса в сравниваемых популяциях X и
Y;
m – число локусов;
k – число аллелей в локусе.
Разберем вычисление генетического расстояния между тонкорунными породами овец (табл. 6.1).
38
M
D
R
C
B
A
Генетическая
система
Частота встречаемости групп крови у тонкорунных пород овец
Антигены Советский ГрозСтаврополь- Кавказ- Киргизмеринос
ненская ская
ская
ская
n=116
n=223
n=136
n=205
n=98
Aa
42,3
29,2
52,6
53,0
42,8
Ab
19,6
8,01
18,0
21,0
17,3
Bb
48,4
25,2
71,5
84,0
92,8
Bd
19,0
26,5
Bc
38,0
42,8
Be
23,4
8,03
16,0
25,0
12,2
Bf
91,0
78,5
Bg
33,0
Bi
49,0
58,1
Ca
31,1
0,0
20,1
44,0
45,5
Cb
42,8
97,1
46,0
97,0
97,3
Da
96,2
17,2
22,0
41,0
31,6
R
40,8
24,2
48,3
44,0
43,8
O
60,0
75,8
12,0
21,0
57,2
Ma
19,8
6,11
20,0
13,0
-
Казахский
меринос
n=28
53,5
10,7
57,0
21,4
28,5
21,7
89,2
21,4
35,7
21,4
100
39,2
50,2
50,0
-
Таблица 6.1
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Для расчетов составим вспомогательные таблицы (квадраты частот и произведения частот сравниваемых пород).
Индекс генетического сходства между породами грозненской и советский
меринос имеет следующий вид:
1.42664
1.42664
IN =
=
= 0.71037
2.0083
1.771 ⋅ 2.2774
39
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Генетическая дистанция D N = − ln I N = − ln( 0.71037 ) = 0.342
Также рассчитываем генетические дистанции между всеми исследуемыми
породами (табл. 6.3).
Для того, чтобы выяснить влияние внешней среды на селекцию тех или
иных антигенных факторов, мы сравнили свои данные по каракульской породе с данными других исследователей. Овцы каракульской породы в Узбекистане исследованы Б.А. Аббасовой (1977), а в Молдове – П.И. Люцкановым
(1988).
При анализе трех массивов овец каракульской породы из Узбекистана,
Молдовы и Калмыкии, видно, что частота встречаемости антигенов варьирует
значительно и зависит от зоны разведения (табл. 6.4)
Таблица 6.2
xij
0,423
0,196
0,484
0,234
0,311
0,428
0,198
0,408
0,600
0,962
∑
1
2
3
4
5
6
40
Расчеты генетического сходства между породами
советский меринос и грозненская
2
x ij
yij
y2ij
0,17893
0,292
0,08526
0,03842
0,0801
0,00642
0,23426
0,252
0,0635
0,05476
0,0803
0,00645
0,09672
0,0
0,0
0,18318
0,971
0,94284
0,039204
0,061
0,0037
0,16646
0,242
0,0586
0,360
0,758
0,5746
0,9254
0,172
0,0296
2,2774
1,771
xij yij
0,12352
0,0157
0,12197
0,01879
0,0
0,4156
0,0121
0,09874
0,4548
0,16547
1,42664
Таблица 6.3
Генетические дистанции между тонкорунными породами.
Код
1
2
3
4
5
Казахский меринос
1
Киргизская
2
0,125
Кавказская
3
0,038 0,035
Ставропольская
4
0,03
0,023
~0
Советский меринос
5
0,165 0,2066 0,2017 0,1606
Грозненская
6
0,1474 0,1585 0,248 0,2817 0,342
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 6.4
Частота встречаемости антигенов у овец каракульской породы
Система и антигенные
Калмыкия
Молдова
Узбекистан
факторы
n=121
n=227
n=113
А
Aa
0,19
0,70
0,29
Ab
0,07
0,15
0,31
B
Bb
0,29
0,57
0,84
Be
0,24
0,35
0,66
C
Ca
0,09
0,66
0,12
Cb
0,66
0,65
0,54
M
Ma
0,49
0,87
0,97
R
O
0,72
0,49
0,25
R
0,28
0,38
0,75
D
Da
0,62
0,39
0,87
По данным частоты встречаемости антигенных факторов у овец каракульской породы рассчитаны генетические дистанции (табл. 6.5).
Таблица 6.5
Данные генетических дистанций между овцами каракульской породы
Место разведения
Калмыкия
Молдова
Молдова
0,1632
Узбекистан
0,1669
0,1500
Задание 1
По данным таблицы 6.6.
1) рассчитать генетические расстояния между тонкорунными породами
овец по Серебровскому;
2) рассчитать генетические расстояния между этими породами по Нею.
Задание 2
По данным таблицы 6.6.
1) рассчитать генетические расстояния между грубошерстными породами
овец по Серебровскому;
2) рассчитать генетические расстояния между этими породами по Нею.
Задание 3
По данным таблицы 6.6.
1) рассчитать генетические расстояния между грубошерстными и тонкорунными породами овец по Серебровскому;
2) рассчитать генетические расстояния между этими породами по Нею.
41
42
Каракульская
Помесь гиссарская
х
алайская х джейдара
Киргизская
тонкорунная
Тяньшанская
Цигайская
Остфризская
Тексель
Алайская
Романовская
113
-
213
195
125
252
338
650
0,29
0,84
0,300,64
0,23
0,77
0,50
0,08
0,38
0,12
-
0,31
0,38
0,180,30
0,15
0,16
0,04
0,00
0,05
0,00
0,84
0,91
0,600,76
0,46
0,78
0,38
0,30
0,70
0,68
0,52
0,56
98
28
Киргизская
Казахский меринос
Ставропольская
0,08
0,43 0,17 0,93
0,54 0,107 0,57
205
n
Кавказская
Породы
0,19
0,58
0,21
0,66
-
0,12
0,52
0,08- 0,100,36 0,33
0,14 0,29
0,19 0,31
0,19 0,31
0,54 0,36
0,24 0,48
0,21 0,00
-
0,12
0,22
0,540
0,95
0,11
0,57
0,50
0,25
0,68
0,48- 0,280,63 0,44
0,38 0,52
0,46 0,36
0,36 0,52
0,58 0,41
0,65 0,32
0,64 0,34
0,97 0,87 0,75
0,89 1,0 0,74
0,080,32
0,45
0,69
0,38
0,43
0,86
0,10
0,20 0,22 0,52
0,97 0,32 0,44
0,39 0,50
0,380,79
0,35
0,85 0,62
0,35 0,67
0,75 0,74
0,49
0,875
-
-
0,49
0,46
1,00
Распространение групп крови у различных пород овец
Частота встречаемости антигенных факторов
Aa
Ab
Bb
Be
Ca
Cb
Ma Da
R
O
0,53 0,21 0,85 0,17 0,44 0,97 0,17 0,42 0,45 0,22
Б.А. Аббасова, 1977
Р.С. Гафаров, 1989
Э.К. Бороздин и др,
1992
Н.С. Марзанов и др.
1991
Гафаров, 1989
Т.А. Анфиногенова,
1986
Т.А. Анфиногенова
и др., 1986
Э.А. Ата-Курбанов,
1986
Авторы
Таблица 6.6
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ТЕМА 7
ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЖИВОТНЫХ
Изучение хромосомного набора чаще всего проводится в клетках соматических тканей. Хромосомный набор соматической клетки у высших животных
диплоидный (2п) и состоит из двух гаплоидных наборов, вносимых мужской и
женской гаметами. Поэтому хромосомы набора парные, т.е. каждая хромосома имеет своего морфологического двойника или гомолога. У млекопитающих одна пара хромосом имеет непосредственное отношение к определению
пола и называется половыми; у самки это XX а у самца XY – хромосомы. Все
остальные хромосомы называют аутосомами. Число хромосом – один из основных признаков кариотипа. В совокупности с морфологическим описанием
хромосом оно достаточно полно характеризует видовые особенности организации наследственного аппарата животных.
Морфологическое строение хромосом наиболее четко выражено в стадии
метафазы. В этот период хромосома состоит из двух нитей – хроматид, интенсивно окрашивающихся основными красителями. В определении формы хромосом большое значение имеет положение ее обязательного структурного
элемента – первичной перетяжки, в районе которой расположена центромера
– специальная структура, управляющая передвижением хромосомы. Центромерный район делит хромосому на два плеча равной или различной длины. В
зависимости от его положения определяют три типа хромосом.
1. Акроцентрические – Центромерный район расположен очень близко к
одному из концов хромосомы, как принято говорить в Терминах цитогенетики
терминально.
2. Субметацентрические – с четко выраженным неравенством плеч.
3. Метацентрические – равноплечие хромосомы.
Объективным критерием для отнесения хромосом к той или иной группе
служат их морфометрические показатели: Центромерный или плечевой индексы.
Плечевой индекс определяют как отношение длинного плеча хромосомы к
короткому. Центромерный индекс равен выраженному в процентах отношению длины короткого плеча к длине хромосомы.
К акроцентрическим хромосомам принято относить хромосомы, имеющие
Центромерный индекс менее 12,5%, у субметацентриков он находится в интервале 12,5-37,0, а у метацентриков от 37,0 до 50,0. Иногда выделяют группу
субтело или субакроцентриков с центромерным индексом от 12,5 до 25,0 %.
При описании хромосом короткое плечо обозначают буквой р, а длинное q.
К морфологической характеристике относят также наличие у хромосом
вторичных перетяжек, соответствующих зонам ядрышковых организаторов.
Помимо хромосомного числа для цитогенетической характеристики часто
используют число плеч хромосом и обозначают эту величину NF (nombre fondamentale – основное число, франц.).
Каждая хромосома гаплоидного (присущего половым клеткам) набора характеризуется своим, присущим только для нее набором генов.
43
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
У каждого вида свой набор хромосом, характеризующийся их числом, размерами и морфологией, т.е. свой уникальный вариант упаковки наследственной информации. Сохранение его является необходимым условием, обеспечивающим нормальное развитие и жизнедеятельность организмов данного вида.
Совокупность хромосом, присущую для организмов определенного вида,
принято обозначать термином кариотип. При этом подразумевается использование этого термина в широком смысле. Данный термин идентичен редко
используемому термину кариом.
В узком смысле термин кариотип означает совокупность хромосом соматической клетки особи определенного вида, включающую их количественные,
морфометрические характеристики и описание дифференциальной их структуры, а также другие индивидуальные характеристики, в том числе наличие и
локализацию вторичных перетяжек.
Несмотря на стабильность хромосомного числа отклонения от него встречаются как у отдельных особей и практически у каждого животного в определенной части клеток, для некоторых специализированных тканей и органов появление клеток с измененным числом хромосом (речь идет о полиплоидии) является нормой. Поэтому, говоря о числовых вариациях кариотипа, всегда надо
различать конституционную изменчивость, т.е. наличие одной и той же аномалии во всех клетках организма, и о соматической изменчивости, когда аномалии затрагивают часть клеток и, как правило, затрагивают разные хромосомы.
Отклонение от диплоидного числа может быть двух типов; умножение
полного хромосомного набора – полиплоидия, и умножение или уменьшение
числа хромосом в случае добавления или утери нескольких хромосом набораанеуплоидия. В случае утери хромосом говорят о гипоплоидии, а при увеличении числа хромосом о гиперплоидии. В зависимости от числа утерянных
гомологов (один или два) различают моносомию или нулисомию данному гомологу, аналогично при появлении дополнительных хромосом – трисомию
или тетрасомию. Возможно сочетание в одной клетке гипоплоидии и гиперплоидии по разным парам хромосом. Если при этом число хромосом равно диплоидному, клетку называют псевдодиплоидной. В общем случае явление
анеушюидии и полиплоидии объединяют термином гетероплоидия.
Жизнеспособные полиплоидные организмы у высших животных не известны, так как эта аномалия приводит к гибели на ранних стадиях развития.
Анеуплоидия же не является абсолютно летальной, поэтому в популяциях отмечают появление таких особей с частотой 1 на 1000-10000. У всех видов
сельскохозяйственных животных описаны случаи моносомии и трисомий по
половым хромосомам, но случаи анеуплоидии по аутосомам, известные у
крупного рогатого скота, неизвестны у свиней. Говоря о количественных нарушениях хромосомного числа, необходимо отметить такой вариант, как мозаицизм, когда в части клеток наблюдается гипо- или гиперплоидия по одной
и той же хромосоме.
К изменению числа хромосом приводят и так называемые Робертсоновские транслокации или центрические слияния, заключающиеся в том,
44
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
что две акроцентрические хромосомы сливаются короткими плечами. В результате возникает новая метацентрическая или субметацентрическая хромосома, а диплоидное число хромосом уменьшается на единицу. Но в отличие от
анеушюидии NF в этом случае остается постоянным. Считают, что Робертсоновские транслокации являются одним из механизмов эволюционного изменения кариотипа.
К структурным аномалиям относят реципрокные транслокации, т.е. обмен
участками плеч между двумя хромосомами.
При описании Робертсоновских и реципрокных транслокаций придерживаются определенных правил нотации. Робертсоновская транслокация обозначается символом Rt, через дробь указывают номера хромосом, вовлеченных в
перестройку. Так запись Rt 59, XX, 1/29 означает, что обследованное животное (корова) несет транслокацию робертсоновского типа, в которую вовлечены 1 и 29 хромосомы, 59 в данном случае диплоидное число, XXхромосомная формула пола (в данном случае не изменена). Запись Rt 60,
XXX, 1/29 означает, что помимо данной транслокации животное является
трисомиком, а 60 – псевдодиплоидное число. Иногда вместо диплоидного
числа указывают число аутосом, тогда перед хромосомной формулой пола
ставят знак «+». В случае анеуплоидии по аутосомам, после диплоидного числа и формулы пола указывают номер избыточной или недостающей хромосомы со знаком «+» или «–», соответственно.
Реципрокные транслокации обозначают символом гср, при этом указывают
номера хромосом и их плечи, вовлеченные в транслокацию. При неравном размере транслоцированных блоков (а именно только такие транслокации выявляются при однородной или рутинной окраске) хромосома, с которой транслоцирован больший блок обозначается, знаком «-», а хромосома, на которую он
перенесен знаком «+». Так запись rep 4p+;13q – означает, что произошла
транслокация между коротким плечом хромосомы 4 и длинным плечом хромосомы 13. В том случае, если перестройка выявлена с использованием дифференциальной окраски, указывают локализацию точек разрыва, знаки «+» и «-»
в этом случае опускают. Например, запись гср Iq23;6p 12 читается так: реципрокная транслокация с точками разрыва на длинном плече хромосомы 1 в
районе третьей полосы второго блока и на коротком плече хромосомы 6 в районе второй полосы первого блока. Символы Rt и гср могут быть опущены.
У животных Робертсоновские и реципрокные транслокации, как правило,
сопровождаются нарушением репродукции, эмбриональной и постнаталъной
смертностью. К числу структурных аберраций конституционного типа относятся также дупликации и инверсии, но в популяциях сельскохозяйственных животных они встречаются крайне редко и фенотипический эффект их не изучен.
Кроме структурных аномалий, которые могут появляться в части соматических клеток существуют аномалии, присущие только популяциям клеток –
это пробелы или гепы, разрывы хромосом и делеции, а также дицентрики, т.е.
аберрации исходного типа, предшествующие транс локациям, инверсиям и
дупликациям.
45
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Изучение вариабельности кариотипа соматических клеток имеет практическое значение. Во-первых, как модель при изучении действия различных повреждающих агентов (радиации, химического загрязнения и других), вовторых, изучение этих показателей позволяет оценить степень поражения генетического аппарата конкретного животного и, в-третьих, оценить вероятность возникновения генетических аномалий в потомстве данного животного.
Действительно, если аберрации возникли в одной ткани, то они с определенной вероятностью возникнут и в других, в том числе и генеративных. Следовательно, чем выше уровень изменчивости кариотипа в соматических клетках,
тем выше вероятность возникновения гамет с хромосомными аномалиями.
При построении кариотипа существует ряд правил. Принято начинать построение кариотипа с метацентрических или субметацентрических аутосом,
располагая хромосомы в порядке убывания относительного размера. При этом
хромосомы сходной морфологии объединяют в группы. Порядок расположения
хромосом в группах тот же – от большего к меньшему. Чередование групп зависит от центромерного индекса. В последнюю группу всегда входят хромосомы с
минимальным центромерным индексом. Если в кариотипе есть акроцентрики,
кроме половых хромосом, то последнюю пару образуют самые мелкие акроцентрики. Половые хромосомы, независимо от размеров и формы, выделяют в отдельную группу. При отсутствии в кариотипе двуплечих хромосом построение
его начинается с самой крупной аутосомы. Нумерацию хромосом начинают с
первой пары и заканчивают последней, без учета деления на группы.
При описании дифференциальной окраски хромосом принято делить плечи
на зоны (блоки) и полосы. Деление на зоны основано на наличии в плече регулярно воспроизводимых при дифференциальной окраске структур, не зависящих от степени спирализации. Как правило, границу зон проводят в районе
крупных положительно или негативно окрашенных полос. Дополнительное
условие проведения границ – границы стараются провести так, чтобы зоны не
слишком различались по размерам. Для идентификации полос зоны нумеруют, начиная от центромеры, затем идет нумерация полос в зоне от проксимального к дистальному концу.
Подобная система нотации позволяет указать наличие хромосомной перестройки или локализацию определенного гена на хромосомной карте. Например, запись локализации гена церуллоплазмина у свиней имеет вид 13q3213q33, это означает что данный ген локализован на длинном плече хромосомы
13 в районе 2-3 полосы 3 блока.
Для обобщенной характеристики хромосомного набора строят поликариограммы и идиограммы. На поликариограмме каждая хромосома представлена
точкой двухмерного пространства. Распределение точек на таком графике отражает реальные характеристики хромосом по количественным критериям в
нескольких кариотипах. Поликариограмма может быть построена и для отдельных хромосом. В качестве параметров при ее построении берут плечевой
или центромерный индекс и относительную длину хромосом.
Идиограмма представляет графическое изображение хромосом с учетом их
морфологической характеристики: длины, положения центромеры, вторичных
46
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
перетяжек и при дифференциальной окраске расположения положительно и
негативно окрашенных полос.
В таблице 7.1 приведены характеристики кариотипов ряда домашних животных и родственных им видов. В таблицу не включены данные о кариотипах мозоленогих, так как представители семейства Camelidae характеризуются
высокими хромосомными числами. У представителей рода Camelus: бактериана (C.bactrianus) и дромадера (C.dromaderus) диплоидное число хромосом
равно 74. Кроме того, хромосомы животных этих двух видов Довольно сложно отнести к определенным морфологическим группам, т.к. они представляют
все возможные переходы от акро- до метацентриков. В связи с чем литературные данные об основном числе у верблюдов противоречивы. Аналогичная
картина характерна и для представителей родственного им рода Lama. Для
этого рода к тому же типичен межвидовой и внутривидовой полиморфизм по
числу хромосом. У гуанако (L.huanacus) 2n = 72/74, альпаки (L.pacos) диплоидное число равно 72, а у викуньи (L.viougna) и ламы (L.giama) – 74.
Между числом плеч NF и морфологическим составом кариотипа существует следующая зависимость:
k=
(Nfa + 2 - 2n)
,
2
[7.1],
где k – число двухплечих аутосом;
Nfa – основное число для аутосом;
2n – диплоидный набор хромосом.
Анализ морфологии половых хромосом необходимо начинать с кариотипа
гомогаметного пола, в данном случае самок. Между числом плеч Х-хромосом
и числом плеч существует следующая зависимость:
( NF − NFa )
,
[7.2]
i=
2
где i – число плеч Х-хромосомы;
NF – основное число;
NFa – основное число для аутосом.
Анализ морфологии Y-хромосомы базируется на сравнении NF у самок и
самцов. Если эти величины равны, то и число плеч мужской и женской хромосом равно и определяется числом i. В том же случае, когда они не равны, пол,
имеющий большее значение NF имеет двухплечую половую хромосому, а половая хромосома, характеризующая противоположный пол акроцентрическая.
Например, у крупного рогатого скота число 2n = 60, Nfa = 58j NF – NFm =
62. Из уравнений 7.1 и 7.2 имеем k = (58 + 2 – 60)/2 = 0, i = (62-58) /2=2 и NF
для обоих полов равны, значит X и Y хромосомы у этого вида двухплечи. Для
зебу имеем, что все аутосомы акроцентрические, Х – хромосома двухплечая, a
Y – акроцентрик.
Задание 1
Используя уравнения 7.1 и 7.2, определить число двухплечих хромосом и
морфологию половых хромосом у видов, представленных в таблице 7.1.
47
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Таблица 7.1
Класс млекопитающие
СЕМЕСТВО
РОД
ВИД
BOVIDAE BOS
B.taurus к.р.с
B.poephagus як
B.indicus зебу
BIBOS
B.banteng бантенг
B.gaurus гаур
BISON
В.bison зубр и бизон
BUBALUS B.bubalis буйвол
OVIS
O.aries овца
O.arnmonmuflon муфлон
O.ammonarcar архар
O.ammonurial уриал
O.n.nivicola снежный баран
CAPRA
C.hircus коза
C.aegargus безоаров козел
C.falconeri мархул
SUIDAE
SUS
S.vitatus азиатский кабан
S.cristatus
S.scrofa европейский кабан
S.s.domestica свинья
EQUIDAE
EQUUS
E.caballis лошадь
E.przewalskiy
л.Пржевальского
E.asinus осел
E.hemionus кулан
E.quagga квагга
Е.zebra зебра
CANIDAE CANIS
C.familaris собака
ALOPEX A.lagopus песец
VULPEX V.vulpex лиса
FELIDAE
MUSTEIDAE
LEPIDAE
CASTORIDAE
FELIS
MUSTELA
F.catus кошка
M.lutreola норка европейская
M.vison норка американская
O.caniculus кролик домашний
ORICTOLAGU
S
CASTOR
C.fiber бобр речной
2N NFa NFf NFm
60
58
62
62
60
58
62
62
60
58
62
61
60
58
62
?
58
58
62
62
60
58
63
62
48
56
58
58
54
58
60
61
54
58
60
61
56
58
60
61
58
58
60
61
52/54 58
60
61
60
58
60
61
60
58
60
61
60
58
60
61
38
60
62
62
38
60
62
62
38
60
62
62
38
60
62
62
64
88
92
91
66
88
92
91
62
54/56
44
32
78
48/50
34+3/4
B
38
98
100
76
56
76
90
102
104
80
60
80
94
101
?
?
?
79
94
64
68
68
68
72
72
38
58
62
62
30
54
58
58
44
76
80
80
48
76
80
79
Примечание: NFf – число хромосомных плеч у самок; NFm – у самцов.
48
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
ТЕМА 8
ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПРЕПАРАТОВ ХРОМОСОМ
Экспериментальное исследование хромосом связано с приготовлением
препаратов, микроскопией, проведением измерений хромосом и анализа кариотипа. Основой этой работы является получение качественных препаратов
хромосом.
Источником для их получения могут служить различные ткани, в том; числе, характеризующиеся высокой митотической активностью (костный мозг,
селезенка, ткани эмбрионов) или требующие относительно длительного культивирования (фибробласты, клетки различных тканей, поддерживаемые в
культуре) и требующие использования соединений, стимулирующих митотическую активность (лимфоциты). Но, независимо от используемого объекта,
приготовление препаратов включает следующие этапы:
1. Накопление клеток на стадии метафазы
2. Обработка клеток гипотоническим раствором
3. Фиксация материала
4. Приготовление препарата
5. Окраска
8.1. Приготовление препаратов
Для приготовления препаратов хромосом, требуется следующее оборудование:
1. Термостат на 37°С.
2. Водяная баня.
3. Микроскоп с фотонасадкой или рисовальной приставкой (увеличение до
90х).
4. Центрифуга.
5. Холодильник бытовой.
6. Вытяжной шкаф.
7. Шприцы на 5,10 и 20 мл стеклянные или разовые.
8. Иглы инъекционные.
9. Термос или термоконтейнер.
10. Пробирки центрифужные 15 мл.
11. Пробки резиновые.
12. Пастеровские пипетки или автоматические пипетки на 20, 200 и 1000
мкл.
13. Мерные пипетки 1-10 мл.
14. Мерные колбы 50-250 мл.
15. Цилиндры мерные 100-500 мл.
16. Флаконы с притертыми пробками 100, 250 мл.
17. Резиновые груши или насадки к пипеткам.
18. Водоструйный насос.
19. Предметные и покровные стекла.
49
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
20. Прибор Колпина для окраски препаратов или химические стаканы 100,
200 мл.
21. Чашки Петри.
22. Часовые стекла.
23. Хлористый калий.
24. Цитрат натрия трехзамещенный.
25. Фосфат калия однозамещенный.
26. Фосфат натрия двузамещенный.
27. Ледяная уксусная кислота.
28. Серный эфир.
29. Хлороформ.
30. Метанол.
31. Спирт этиловый 70, 96 и 100%.
32. Среда Игла, 199, RPMI 1640 или DMEM.
33. Гепарин (сухой или в растворе).
34. Колхицин, колцемид или винбластин.
35. Краситель Гимза.
36. Ламинарный или настольный бокс.
При работе используются следующие фиксаторы и растворы:
1. Фиксатор Карнуа – спиртовой раствор, быстро проникает в клетки хорошо фиксирует ядерные структуры, состоит из спирта метилового (этилового
96 или 100%) – 6 частей, хлороформа – 3 части, ледяной уксусной кислоты – 1
часть
2. Смесь Лилли – видоизмененный фиксатор Карнуа:
Спирт метиловый (этиловый 96 или 100 %) – 3 части, ледяная уксусная кислота – 1 часть
3. Фосфатный буфер рН 6,8: 0,07М раствор однозамещенного фосфата калия – 1 часть, 0,07М раствор двузамещенного фосфата натрия – 1 часть
4. Стандартный солевой раствор 2xSSC; 0,03 М раствор трехзамещенного
цитрата натрия и 0,3 М хлористого натрия.
Качество посуды в значительной мере определяет эффективность культивирования биологического материала, что особенно важно при работе с клетками, поддерживаемыми достаточно длительное время в культуре. При обработке посуды необходимо учитывать два источника загрязнения – химический
и биологический.
Для удаления жировых, токсических и других органических загрязнителей
различными фирмами предложен ряд специальных детергентов. Однако хороший результат дает и использование бытовых синтетических моющих
средств, выпускаемых отечественной промышленностью.
Новую или использованную посуду замачивают в теплом растворе синтетического моющего средства на несколько часов. Затем внутреннюю поверхность
промывают, используя ершик. Пипетки промывают, пропуская через них несколько раз моющий раствор. Для этой цели используют специальные насадки
или резиновые груши, также можно использовать водоструйный насос.
50
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
После этого посуду прополаскивают 7-12 раз в проточной горячей воде и
столько же раз в дистиллированной воде. Ополаскивают деионизированной
или бидистилированной водой.
Показатель чистоты посуды – отсутствие капель воды на ее стенках, при
несоблюдении этого условия, посуду необходимо перемыть. Предметные и
покровные стекла можно дополнительно промыть в смеси этанол – концентрированная соляная кислота (99:1) и поместить в смесь Никифорова – этанол
– серный эфир (1:1).
Посуда, предназначенная для взятия крови и кожи и длительного культивирования, подлежит стериализации. Для стерилизации достаточно выдержать
посуду при 120-150°С 1-2 часа; Для посуды, используемой при работе с интенсивно делящимся материалом, стерильность не нужна. Мерная посуда сушится только на воздухе.
При работе в лаборатории следует придерживаться определенных правил
техники безопасности:
1. Работать только в перчатках;
2. Не допускать попадания на открытую кожу кислот, метанола и биологически активных веществ;
3. Не использовать в работе материал и животных из зон, неблагополучных
по антропозоонозам без заключения ветеринарноэпизоотологической службы
или СЭС;
4. Набор кислот, фиксатора и биологически активных веществ проводить
только пипетками с насадками или грушами, а также шприцами и автоматическими пипетками;
5. При попадании на кожу перечисленных веществ поверхность кожи тщательно промыть проточной водой. Кислоты и щелочи нейтрализовать.
8.1.1. Получение препаратов из костного мозга и селезенки
Рассматриваемый метод основан на прижизненном введении ингибиторов
веретена в организм животного, с последующим его убоем. Применяется для
анализа кариотипа мелких лабораторных и диких животных, а также приемлем при анализе кариотипа новорожденных поросят и ягнят. Для более крупных животных не применяют из-за большого расхода колхицина. Для приготовления препаратов хромосом из костного мозга следует:
1. Взвесить животное;
2. Ввести внутрибрюшинно колхицин в дозе 0,4-2,0 мкг/г массы тела на 40120 мин.;
3. Забить по истечении времени животное и отпрепарировать трубчатую
кость или кости (обычно бедренную);
4. Набрать в 10 мл шприц теплый гипотонический раствор при 37°С. Ввести иглу в головку кости, второй конец кости обрезать. Промыть кость гипотоническим раствором под давлением (учитывая высокую свертываемость костного мозга лучше использовать раствор цитрата натрия или добавлять в раствор гепарин), собрать жидкость в пробирку;
51
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
5. Проикубировать 30-40 минут при 37-38°С;
6. Отцентрифугировать при 100 g 10 мин., надосадочную жидкость слить;
7. Ресуспендировать осадок пипеткой или встряхиванием и перенести в
фиксатор объемом 5-Ю мл;
8. Выдержать в закрытой пробирке 10-15 мин. при 0-4°С, ресуспендировать осадок;
9. Отцентрифугировать при 100 g 10 мин., надосадочную жидкость слить;
10. Прилить свежий фиксатор (5-10 мл), ресуспендировать, повторить 2-3
раза операции пунктов 8-10;
11. Отцентрифугировать при 100 g 10 мин., надосадочную жидкость слить;
12. Добавить 0,5-2 мл свежего фиксатора, ресуспендировать;
13. С высоты 15-20 см (с вытянутой руки) нанести на стекло 2-3 капли
взвеси.
14. Оценить качество препарата, в случае необходимости, провести дополнительные обработки, как это описано выше, приготовить рабочие препараты.
Для приготовления препаратов хромосом из селезенки:
1. Взвесить животное;
2. Ввести внутрибрюшинно колхицин в дозе 0,4-2,0 мкг/r массы тела на 40120 мин.;
3. Забить по истечении времени животное и отпрепарировать селезенку;
4. Поместить селезенку в чашку Петри с гипотоническим раствором и тщательно гомогенизировать ножницами, ресуспендировать пипеткой, перенести
тканевую взвесь в центрифужную пробирку, дать отстояться крупным кусочкам, оставшуюся суспензию перенести в новую центрифужную пробирку, довести объем гипотонического раствора до 10 мл. Начиная с пункта 5, обработка клеток селезенки и костного мозга аналогична.
8.1.2. Получение препаратов из лимфоцитов животных
Данный метод основан на получении препаратов из стимулированных митогенами клеток белой крови, подходит для работы с любыми животными,
особенно крупными. Для этого следует:
1. В стерильную пробирку, содержащую 10-20 ед. гепарина на мл взять 510 мл крови. Транспортировать при 4°С.
2. Поместить пробирку с кровью в термостат на 1-2 часа при 37°С, если
СОЭ низка, отцентрифугировать при 800-1000 об/мин, сохраняя стерильность.
Для этого следует закрыть пробирку фольгой, парафином или пергаментной
бумагой.
3. Приготовить питательную среду, исходя из расчета 8 мл на образец.
Среду для всех образцов готовить в общем объеме. Добавить в среду митоген
ФГА, PWM или СоА (ориентировочная дозировка соответственно составляет:
ФГА отечественный – 5 мкг/мл, болгарский 20 мкг/мл, СоА и Р WM 20
мкг/мл). Разводить митогены на стерильной дистиллированной воде или физрастворе, допускается использовать в качестве растворителя любую из питательных сред. Точные дозировки определяются, исходя из указаний фирм52
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
изготовителей. Антибиотики вводят из расчета: пенициллин 100 ед/ мл, стрептомицин 100 мкг/мл, вместо указанных антибиотиков можно использовать антимикотик в соотношении 1:100. Разливать готовую среду следует в 50 мл
флаконы по 8 мл.
Примечание: выбор митогена зависит от вида животных для крови овец,
крупного рогатого скота и кролика лучшие результаты дает СоА для первых
двух видов, также PWM; для свиней ФГА и PWM, но не СоА.
4. Стерильной пипеткой добавьте в каждый флакон по мл плазмы с лимфоцитами, кровь от разных животных не смешивать.
5. Культивируйте 68-70 часов при температуре, близкой к температуре тела животных данного вида, можно при 37-38°С. При культивировании, начиная со вторых суток содержимое флаконов осторожно перемешивать раз в сутки.
6. На 68-70 часу ввести один из ингибиторов веретена в дозе 0,3-0,5 мкг/
мл на 40-120 мин. По окончании культивирования содержимое флаконов перенести в центрифужные пробирки. Дальнейшие обработки аналогичны обработкам костного мозга, начиная с пункта 5.
8.1.3. Приготовление препаратов хромосом из костного мозга
при прижизненном взятии пункции
Данный метод основан на накоплении клеток на стадии метафазы под действием ингибиторов веретена в кратковременной культуре интенсивно делящихся тканей, используется для прижизненного изучения кариотипа крупных
животных.
Процедура приготовления препаратов:
1. Зафиксировать животное в удобном положении, можно применить наркоз.
2. Обработать кожный покров в районе 2-3 сегмента грудной кости.
3. Пункционной иглой проколоть мягкие ткани и вращательным движением ввести ее в тело кости (для крупных животных удобнее использовать иглу
Симоняна или ИПЖ-1, для мелких иглу Кассирского или Симоняна со сменной пунктирущей частью).
4. Вынуть мандрен, присоединить щприц (20 мл) и сильным, но плавным
движением отвести поршень до упора. Набрать 0,5-1 мл пунктата, содержащего бледно-розовые гранулы костного мозга. Если пунктат не поступает,
плавно отпустить поршень и снова оттянуть до упора. Если этот прием не помог, изменить глубину введения иглы или место пункции.
5. Поместить пунктат в пробирку с питательной средой, содержащей 20-30
ед. гепарина на мл. Можно транспортировать материал при 4°С, но не более 4
часов.
6. Добавить в пробирку колхицин или колцемид в дозе 0,3-0,5 мкг/мл, поместить пробирку в термос или термостат при 37°С на 40-120 минут. Дальнейшие обработки проводят аналогично описанным выше методам.
53
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
8.1.4. Получение препаратов из ранних эмбрионов
Данный метод основан на получении препаратов из тканей с высокой пролиферативной активностью. Однако в силу своей сложности применяется
только в специальных исследованиях. Для работы используют, как правило,
эмбрионы на стадии бластоцисты. Эмбрионы извлекают после убоя, у крупных животных возможно получение материала путем вымывания хирургическим или нехирургическим методом. Время вымывания эмбрионов зависит от
продолжительности эмбрионального развития у исследуемого вида животных.
Для сельскохозяйственных животных оно находится в интервале от 10 до 20
дней с момента оплодотворения.
Приготовление препаратов включает следующие пункты:
1. Эмбрионы вымывают одной из питательных сред или сбалансированными солевыми растворами (раствор Дюльбеко и др.), подогретыми до температуры тела. Культивирование их желательно проводить ex tempore. В крайнем случае, допустима транспортировка или кратковременное хранение.
2. Из промывной среды эмбрионы переносят на часовые стекла с подогретой до 37°С средой 199 или иглу, содержащую колхицин или колцемид в концентрации 0,3-0,5 мкг/мл, и инкубируют 40-60 мин. при 37°С.
3. По окончании культивирования, среду отсасывают пастеровской пипеткой и наносят на часовое стекло подогретый до 37°С гипотонический раствор
хлорида калия. Время гипотонии при указанной температуре 30-40 мин.
4. Через 30-40 мин. раствор удаляют пастеровской пипеткой, эмбрионы заливают охлажденным фиксатором Карнуа и фиксируют 45-60 мин., постоянно
добавляя свежий фиксатор.
5. По завершении фиксации, избыток фиксатора удаляют. Материал ресуспендируют в малом объеме фиксатора пастеровской пипеткой.
6. Клеточную взвесь наносят на влажные, охлажденные предметные стекла
и высушивают одним из описанных методов.
8.2. Окраска препаратов
Рутинная (равномерная) окраска по Романовскому-Гимза. Данный метод окраски может быть использован при проведении обычного анализа: подсчета числа хромосом, анализа морфологии и выявления количественных и
структурных аномалий, в том числе, при изучении мутагенного действия различных агентов на клеточных популяциях, и с меньшей степенью надежности
(только крупные перестройки) в популяциях животных. Недостатком метода
является невозможность точной идентификации всех хромосом набора.
Для работы необходимо следующее оборудование:
1. Аппарат Колпина или химические стаканы для окраски препаратов.
2. Мерные колбы для приготовления компонентов буферного раствора.
3. Мерный цилиндр.
4. Мерные пипетки.
5. Маточный раствор красителя Гимза
6. Иммерсионное масло.
7. Микроскоп.
54
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Окраска препаратов проходит следующие этапы:
1. Подготовка красителя: к 97 мл дистилированной воды добавить 2 мл маточного раствора краски, по 0,5 мл 1,38% раствора однозамещенного фосфата
калия и 1,78% раствора двузамещенного фосфата натрия,
2. Поместить препараты в краситель на 20-40 мин. Степень окраски контролируется под микроскопом при увеличении 10-20 х.
3. Препараты сполоснуть проточной и дистиллированной водой и высушить на воздухе.
Дифференциальная окраска по Гимза (G-метод) с использованием трипсина позволяет точно идентифицировать все хромосомы набора. G-метод используют при выявлении животных-носителей различных хромосомных аномалий. Сложность его применения заключается в том, что он требователен к
качеству препаратов и условиям их обработок. Недостаток G-метода в том,
что аберрации в клеточных популяциях (пробелы, разрывы) могут маскироваться наличием светлых блоков, а сложные перестройки трудно идентифицируются, поэтому в подобных исследованиях использование его дополнительной информации не дает. Для работы необходимо то же оборудование,
что и для монохромной окраски, плюс посуда для обработки в трипсине,
спиртах и 2xSSC.
Окраска проходит следующие этапы обработки:
1. Препарат, подготовленный воздушно-сухим методом и выдержанный не
менее недели при комнатной температуре, помещается в 0,25%-ный раствор
трипсина на 10-30 с при комнатной температуре.
2. Препарат, предварительно отмытый после трипсина в растворе 2xSSC,
последовательно проводится через 70, 96 и 100% спирты.
3. Высушивается на воздухе и окрашивается красителем Гимза (4 мл маточного раствора краски плюс по 48 мл 0.07 М растворов однозамещенного
фосфата калия и двузамещенного фосфата натрия). Продолжительность окраски 10-20 минут. После ополаскивания водой высушивается. Качество окраски контролируют при увеличении 90-100х (масляная иммерсия).
Если исчерченность отсутствует, препарат следует отмыть от иммерсионного масла в серном эфире, затем от краски в 70% спирте и повторить все
процедуры. Оптимальный режим для каждой партии препаратов подбирается
эмпирически.
Окраска ядрышкообразующих районов хромосом азотнокислым серебром позволяет выявлять и оценивать активность функционально значимых
для организма структур хромосом. В зоне ядрышковых организаторов расположены гены рибосомной РНК – одной из структур, участвующих в синтезе
белка.
Для работы необходимо то же оборудование, плюс растворы азотнокислого серебра и желатины чашки Петри, термостат или шкаф с температурой до
65°С.
1. Для окраски следует: приготовить 50% раствор азотнокислого серебра
на деионизированной или бидистиллированной воде.
55
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2. Приготовить 2% раствор желатины.
3. Смешать раствор желатины с муравьиной кислотой в соотношении
100:1.
4. Нанести на препарат 2 капли раствора желатины и 3-4 капли раствора
азотнокислого серебра. Накрыть покровным стеклом. Поместив в чашку Петри на влажную фильтровальную бумагу. Чашку Петри закрыть и поместить в
термостат на 3-5 минут при 65° С. Интенсивность окраски контролируется
под микроскопом при увеличении 10-20х.
Окрашенные клетки имеют слабо-коричневый фон. Ядрышки в интерфазных клетках должны быть фиолетовой или коричневой окраски. Ядрышковые
организаторы видны, как правило, только под иммерсией. Препараты могу
быть докрашены рутинно или дифференциально. Время окраски при этом сокращается. Режим окраски подбирается эмпирически.
Выявление структурного гетерохроматина – С-метод. Сущетствует
ряд модификаций С-метода окраски хромосом, описанных в ряде руководств.
Общим для них является использование раствора щелочей. Для окраски наиболее пригодны препараты, хранившиеся не более 3 дней. Для этого:
1. Препарат нужно поместить на 30-60 мин. в 0,2 М раствор НСl при комнатной температуре.
2. Препарат переместить в 5 % (насыщенный) раствор ВаОН на 5-20 мин
при 60°С.
3. После инкубации в растворе гидроокиси бария ополоснуть в 0,2 М растворе НС1 и выдержать 60-90 мин. в стандартном солевом растворе (2xSSC)
при 60°С.
4. Отмыть в этиловом спирте (батарея восходящих спиртов – 70, 96 и
100°), высушить и окрасить по Гимза при рН 6,8 (время окраски до 10 мин.).
Окраска по Ohnuki для выявления спиральной структуры хромосом позволяет исследовать особенности укладки ДНК в хромосомах методами оптической микроскопии и идентифицировать гомологичные хромосомы. В основе
его лежит экстракция белков хромосомного матрикса при гипотонической обработке.
После культивирования материала клеточную взвесь обрабатывают в растворе Ohnuki (0,055 М раствор хлорида калия, нитрата и ацетата натрия в соотношении 4:2:1) 90-120 мин. при комнатной температуре и постоянном ресуспендировании.
Затем в течение 45 мин. проводится трехкратная фиксация в смеси Карнуа
(модификация Лилли). Первую порцию фиксатора добавляют к клеточной
взвеси в 2-3 мл раствора Ohnuki. Взвесь клеток необходимой густоты раскапывают на влажные, охлажденные стекла, высушивают на воздухе и окрашивают монохромно по Гимза.
8.3. Анализ хромосомных препаратов
Метафаза, отбираемая для анализа, должна отвечать следующим требованиям:
56
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1. Форма ее должна быть округлой или овальной. Соотношение диаметров
не должно превышать 1:2.
2. Желательно полное отсутствие накладок хромосом, если хромосомы,
вовлеченные в накладку легко идентифицируются, допустимы единичные накладки,
3. Должны отсутствовать единичные хромосомы или их группы вблизи метафазы.
4. Степень спирализации должна позволять идентифицировать форму мелких хромосом.
Для кариотипирования, анализа частоты структурных и количественных
аномалий кариотипа не менее 30 метафаз от каждого животного. Поиск метафаз ведут при увеличении 10-20х, подсчет и визуальный анализ хромосом при
увеличении 90-100х.
Число хромосом подсчитывают визуально или на схематической зарисовке
метафазы. Обычно фотографируют лишь несколько типичных метафаз. Большее число метафаз микрофотографируют только при подозрении на коституциональные аномалии.
Микрофотографирование проводят на пленку Микрат 200 или 300. Для
проявления этих пленок используют стандартный проявитель № 2. Время
проявления – 5-6 минут. Фиксаж используется любой.
Негативы печатают при максимальном увеличении, сохраняющем качество
изображения не менее, чем в двух экземплярах. Один служит контрольным
отпечатком, остальные используют для кариотипирования.
На основании визуального анализа выводится следующая характеристика
животного: частота гипо- и гипершюидных клеток, модальное число хромосом, если половые хромосомы легко идентифицируются половая формула,
частота клеток со структурными аберрациями: общая или по типам аберраций,
частота полиплоидии. В последних двух случаях число клеток увеличивают не
менее чем до 200.
Эта характеристика позволяет с высокой степенью точности дать оценку
клинического состояния животного или его племенной ценности. Критерием
оценки служит суммарная частота всех количественных и структурных аномалий. Животные с высокой степенью хромосомной изменчивости подлежат
выбраковке, или же, в случае их уникальности, спариванию с особями, у которых частота клеток с хромосомными аномалиями минимальна.
При наличии конституциональных аномалий обязательно кариотипирование. В случае необходимости подтверждения идентичности аберраций во всех
клетках или их точной идентификации кариотипирование проводят на дифференциально окрашенных препаратах.
Для определения модального числа хромосом и частоты соматических
аберраций необходимы:
1. Микроскоп.
2. Иммерсионное масло.
3. Препараты хромосом.
57
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Исследования проводят в следующем порядке:
1. Отыскать метафазу при малом увеличении, перейти на иммерсионное
увеличение, подсчитать число хромосом, выявить идентифицируемые гомологи, проверить на наличие числовых и структурных аберраций.
3. Записать характеристику клетки в протокол (табл. 8.1), проанализировать не менее 30 клеток.
4. Рассчитать частоту встречаемости различных аберраций.
Таблица 8.1
Примерная форма протокола
Число
Половые
Число аберраций
№ клетки
хромосом хромосомы
в клетке
Их описание
Для кариотипирования необходимы:
1. Две фотографии одной и той же клетки.
2. Ватман.
3. Ножницы.
4. Клей.
5. Стандартный кариотип данного вида.
Работа выполняется в следующем порядке:
1. Разрезать один из фотоотпечатков на отдельные хромосомы
2. Исходя из их морфологии и размеров, подобрать пары гомологов, если
препараты окрашены дифференциально, то и с учетом рисунка хромосомы
3. Разместить пары в соответствии со стандартным кариотипом или, исходя из изложенных ранее правил
4. Наклеить на лист ватмана вместе с контрольным отпечатком:
5. Дать заключение о наличии или отсутствии аномалий. Примечание: в
учебных целях могут быть использованы не отпечатки метафаз, а изготовленные заранее кассы разрезанных хромосом.
В случае необходимости, особенно если препараты окрашены однородно,
для идентификации хромосом может быть применен кариограммный анализ.
Для этого проведения необходимо отобрать 10-20 метафаз с одинаковой спирализацией. Степень спирализации рассчитывают как отношение суммарной
длины двух самых мелких пар гомологов к длине двух самых крупных пар и
выражают в процентах.
1. Строят систему координат: ось Х – относительная длина хромосомы, ось
Y – центромерный индекс;
2. Проводят измерение всех хромосом набора с записью данных, если метафаза не кариотипирована, хромосомам можно присвоить условные номера;
3. Рассчитывают относительные длины всех хромосом и их центромерные
индексы;
4. Наносят точки, соответствующие каждой хромосоме на график;
5. Сравнивают близость расположения на графике гомологичных хромосом.
58
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Приложение 1
Стандартные значения χ2 при разных уровнях вероятности
Уровень вероятности
Степени свободы Уровень вероятности Степени
свободы
(v=n-l)
0,05
0,01
0,001
(v=n-l)
0,05
0,01
0,001
1
3,8
6,6
10,8
26
38,9
45,6
54,1
2
6,0
9,2
13,8
27
40,1
47,0
55,5
3
7,8
11,3
16,3
28
41,3
48,3
56,9
4
9,5
13,3
18,5
29
42,6
49,6
58,3
5
11,1
15,1
20,5
30
43,8
50,9
59,7
6
12,6
16,8
22,5
32
46,2
53,5
62,4
7
14,1
18,5
24,3
34
48,6
56,0
65,2
8
15,5
20,1
26,1
36
51,0
58,6
67,9
9
16,9
21,7
27,9
38
53,4
61,1
70,7
10
18,3
23,2
29,6
40
55,8
63,7
73,4
11
19,7
24,7
31,3
42
58,1
66,2
76,1
12
21,0
26,2
32,9
44
60,5
68,7
78,7
13
22,4
27,7
34,5
46
62,8
71,2
81,4
14
23,7
29,1
36,1
48
65,2
73,7
84,0
15
25,0
30,6
37,7
50
67,5; 76,2
86,7
16
26,3
32,0
39,3
55
73,3
82,3
93,2
17
27,6
33,4
40,8
60
79,1
88,4
99,6
18
28,9
34,8
42,3
65
84,8
94,4
106,0
19
30,1
36,2
43,8
70
90,5 100,4 112,3
20
31,4
37,6
45,3
75
96,2 106,4 118,5
21
32,7
38,9
46,8
80
101,9 112,3 124,8
22
33,9
40,3
48,3
85
107,5 118,2 131,0
23
35,2
41,6
49,7
90
113,1 124,1 137,1
24
36,4
43,0
51,2
95
118,7 1 30,0 143,3
25
37,7
44,3
52,6
100
124,3 135,8 149,4
59
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Приложение 2
Таблица натуральных логарифмов от 0.001 до 0.100
P
lnP
P
lnP
P
lnP
P
lnP
.001 -6.90776 .031 -3.47377 .061 -2.79688 .091 -2.39690
.002 -6.21461 .032 -3.44202 .062 -2.78062 .092 -2.38597
.003 -5.80914 .033 -3.41125 .063 -2.76462 .093 -2.37516
.004 -5.52146 .034 -3.38140 .064 -2.74887 .094 -2.36446
.005. -5.29832 .035 -3.35241 .065 -2.73337 .095 -2.35388
.006. -5.11600 .036 -3.32424 .066 -2.71810 .096 -2.34341
.007 -4.96184 .037 -3.29684 .067 -2.70306 .097 -2.33304
.008 -4.82831 .038 -3.27017 .068 -2.68825 .098 -2.32279
.009 -4.71053 .039 -3.24419 .069 -2.67365 .099 -2.31264
.010 -4.60517 .040 -3.21888 .070 -2.65926 .100 -2.30258
.011 -4.50986 .041 -3.19418 .071 -2.64508
.012 -4.42285 .042 -3.17009 .072 -2.63109
.013 -4.34281 .043 -3.14656 .073 -2.61730
.014 -4.26870 .044 -3.12357 .074 -2.60369
.015 -4.19970 .045 -3.10109 .075 -2.59027
.016 -4.13517 .046 -3.07912 .076 -2.57702
.017 -4.07454 .047 -3.05761 .077 -2.56395
.018 -4.01738 .048 -3.03656 .078 -2.55105
.019 -3.96332 .049 -3.01594 .079 -2.53831
.020 -3.91202 .050 -2.99573 .080 -2.52573
.021 -3.86323 .051 -2.97593 .081 -2.51331
.022 -3.81671 .052 -2.95651 .082 -2.50104
.023 -3.77226 .053 -2.93746 .083 -2.48892
.024 -3.72970 .054 -2.91877 .084 -2.47694
.025 -3.68888 .055 -2.90042 .085 -2.46510
.026 -3.64966 .056 -2.88240 .086 -2.45341
.027 -3.61192 .057 -2.86470 .087 -2.44185
.028 -3.57555 .058 -2.84731 .088 -2.43042
.029 -3.54046 .059 -2.83022 .089 -2.41912
.030 -3.50656 .060 -2.81341 .090 -2.40795
60
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
P
.11
.12
.13
.14
.15
.16
.17
.18
.19
.20
.21
.22
.23
.24
.25
.26
.27
.28
.29
.30
.31
.32
.33
.34
.35
.36
.37
.38
.39
.40
Таблица натуральных логарифмов от 0.11 до 1
lnP
P
lnP
P
lnP
-2.20728 .41 -.891598
.71 -.342491
-2.12026 .42 -.867501
.72 -.328505
-2.04022 .43 -.843970
.73 -.314711
-1.96611 .44 -.820981
.74 -.301106
-1.89712 .45 -.798508
.75 -.287683
-1.83258 .46 -.776529
.76 -.274438
-1.77196 .47 -.755023
.77 -.261365
-1.71480 .48 -.733970
.78 -.248462
-1.66073 .49 -.713350
.79 -.235723
-1.60944 .50 -.693148
.80 -.223144
-1.56065 .51 -.673345
.81 -.210722
-1.51413 .52 -.653927
.82 -.198452
-1.46968 .53 -.634879
.83 -.186330
-1.42712 .54 -.616187
.84 -.174354
-1.38629 .55 -.597838
.85 -.162520
-1.34707 .56 -.579819
.86 -.150824
-1.30933 .57 -.562119
.87 -.139263
-1.27297 .58 -.544728
.88 -.127834
-1.23787 .59 -.527633
.89 -.116534
-1.20397 .60 -.510826
.90 -.105361
-1.17118 .61 -.494297
.91 -.094311
-1.13943 .62 -.478036
.92 -.083382
-1.10866 .63 -.462036
.93 -.072571
-1.07881 .64 -.446288
.94 -.061876
-1.04982 .65 -.430784
.95 -.051294
-1.02165 .66 -.415516
.96 -.040823
-.994252 .67 -.400478
.97 -.030460
-.967584 .68 -.385663
.98 -.020203
-.941609 .69 -.371064
.99 -.010051
-.916291 .70 -.356676
1.0
0
Таблица натуральных логарифмов для малых частот
P
lnP
P
lnP
.00001
-11.5129
.0001 -9.21034
.00002
-10.8198
.0002 -8.51719
.00003
-10.4141
.0003 -8.11173
.00004
-10.1266
.0004 -7.82405
.00005
-9.90350
.0005 -7.60090
.00006
-9.72117
.0006 -7.41858
.00007
-9.56702
.0007 -7.26443
.00008
-9.43348
.0008 -7.13090
.00009
-9.31570
.0009 -7.01312
61
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
Основная литература
Айала Ф. Введение в популяционную и эволюционную генетику. – М.:
Мир, 1984.
Алиханян С.И., Акифьеев А.П., Чернин Л.С. Общая генетика. – М.:
Высшая школа, 1985.
Бакай А.В., Кочиш И.И., Скрипнеченко Г.Г. Генетика. – М.: Колос, 2007.
Графодатский А.С., Раджабли С.И. Хромосомы сельскохозяйственных и
лабораторных животных: Атлас. – Новосибирск: Наука, 1988.
Ли Ч. Введение в популяционную генетику. – М.: Мир, 1978.
Мазер К., Джинкс Дж. Биометрическая генетика. – М.: Мир, 1985.
Марзанов Н.С. Иммунология и иммуногенетика овец и коз. – Кишинев:
Штиинца, 1991.
Петухов В.Л., Эрнст Л.К., Гудилин И.И. и др. Генетические основы селекции животных. – М.: Агропромиздат, 1989.
Серебровский А.С. Генетический анализ. – М.: Наука, 1970.
Смирнов В.Г. Цитогенетика. – М.: Высшая школа, 1991.
Эрнст Л.К., Зиновьева Н.А. Биологические проблемы животноводства в
XXI веке. М.: РАСХН, 2008.
Яковлев А.Ф. Цитогенетическая оценка племенных животных. – М.: Агропромиздат, 1985.
Дополнительная литература
Зиновьева Н.А., Попов А.Н., Эрнст Л.К. и др. Методические рекомендации
по использованию полимеразной цепной реакции в животноводстве. – Дубровицы: ВИЖ, 1998.
Кленовицкий П.М., Моисейкина Л.Г., Живалев И.К. Лабораторный практикум по цитогенетике животных. – Элиста: КГУ, 1997.
Кленовицкий П.М., Моисейкина Л.Г., Марзанов Н.С. Цитогенетика сельскохозяйственных животных. – Элиста: Джангар, 1999.
Кленовицкий П.М., Моисейкина Л.Г., Натыров А.К. Генетические болезни
животных. – Элиста: КГУ, 2002.
Марзанов Н.С., Моисейкина Л.Г., Марзанова Л.К. Использование групп
крови в селекции овец. – Элиста, 1999.
Моисейкина Л.Г., Турдуматов Б.М. Методы и оценки количественных
признаков в животноводстве. – Элиста: КГУ, 2001.
Правила генетической экспертизы племенного материала овец. – М.:
ФГНУ «Росинформагротех», 2003.
Эрнст Л.К., Жигачев А.И. Мониторинг генетических болезней у животных
в системе крупномасштабной селекции. – Москва, 2006.
62
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
63
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Моисейкина Людмила Гучаевна
Кленовицкий Павел Михайлович
ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СОВРЕМЕННОЙ СЕЛЕКЦИИ
Учебно-методическое пособие
Подписано в печать 11.09.12. Формат 60х84/16.
Печать офсетная. Бумага тип. № 1. Усл. п. л. 3,72.
Тираж 100 экз. Заказ 1824.
Издательство Калмыцкого университета.
358000 Элиста, ул. Пушкина, 11.
64
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
10
Размер файла
512 Кб
Теги
2077, современные, генетический, основы, селекции
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа