close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

3097.РАЗРАБОТКА ТВЕРДОФАЗНОГО ИММУНОФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА ДЛЯ ПРЯМОГО ОБНАРУЖЕНИЯ АНТИГЕНОВ ВИРУСА КЛАССИЧЕСКОЙ ЧУМЫ СВИНЕЙ

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
H-sf&ic
На правах рукописи
УДК 619:616.98:578.833.31:616-074
Васильев Александр Павлович
Разработка твердофазного иммуноферментного анализа для
прямого обнаружения антигенов вируса классической чумы
свиней
03.00.06 - Вирусология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Покров - 2005
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийском
научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микрбиологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВиМ
Россельхозакадемии)
Научные руководители:
доктор ветеринарных наук,
профессор
Куриннов Виктор Васильевич
доктор биологических наук,
профессор
Стрижаков Александр Анатольевич
Официальные оппоненты:
доктор ветеринарных наук,
старший научный сотрудник
Диев Вячеслав Иванович
доктор биологических наук,
старий научный сотрудник
Новиков Борис Валентинович
Ведущая организация:
ГНУ Всеросийский научно исследовательский институт экспериментальной
ветеринарии
Защита состоится 23 июня 2005 г. в 13 часов 30 минут на заседании дис­
сертационного совета Д 006.003.01 при Государственном научном учрежде­
нии Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной ви­
русологии и микробиологии Россельхозакадемии по адресу: 601120, г. Пкров,
Владимирской области, ГНУ ВНИИВВиМ. Тел/факс: (09243)62125.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института.
Автореферат разослан <1д(С> »_
2005 г.
Учёный секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук -
В.Я^С«&укова
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
3
I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
1.1. Актуальность
Несмотря на многолетние усилия, прилагаемые для ликвидации клас­
сической чумы свиней (КЧС), болезнь продолжает представлять серьезную
угрозу свиноводству во всем мире. Благоприятная эпизоотическая ситуация в
России, значительное сокращение числа вспышек классической чумы свиней
(9 - в 2002 г. и 6 - в 2003 г.) привели к относительному благополучию страны
по КЧС, однако угроза спорадических вспышек болезни, в том числе в круп­
ных свинокомплексах, постоянно существует.
Различные формы течения болезни, циркуляция вируса различной па­
тогенное™ на фоне вакцинированного поголовья свиней, вторичные инфек­
ции приводят к многообразию клинических симптомов, патологоанатомических изменений, что затрудняет постановку точного диагноза на классиче­
скую чуму свиней и оценку истинной эпизоотической ситуации.
Для проведения лабораторных исследований на КЧС применяется ме­
тод выделения вируса в культуре клеток с последующей идентификацией
иммунофлуоресценцией, который в настоящее время считается эталонным
(OIE, 2000), но его использование возможно только в хорошо оснащенных,
вирусологических лабораториях
или научных учреждениях
(Вишняков
И.Ф.,1986).
Для прямого обнаружения вируса непосредственно в патологическом
материале используются реакция прямой иммунофлуорешенции и полимеразная цепная реакция (ПЦР), однако первый метод обладает невысокой чув­
ствительностью (26-77%) и субъективностью (Куриннов В.В. и соавт. 1993;
Ressang A. and Boer J., 1971), а метод ПЦР, хотя и признан весьма полезным
диагностическим инструментом, особенно при исследовании аутолизированных или цитотоксических проб, пока используется для исследования ограни­
ченного количества проб и в основном для филогенетических исследований
полевых изолятов вируса (Stadejek T. I996).
ЦНБ МСХА
фонд научной литературы
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
4
В ведущих лабораториях Европейского Союза и США для обнаруже­
ния антигена вируса КЧС разработаны несколько вариантов иммуноферментного анализа под разными коммерческими названиями: CHEKiT® CSFVIRUS (DR.BOMMELI AG, Швейцария), Herd Chek CSFV Ag, (IDEXX,
США), SERELISA HCV Ag (RHONE MERIEUX, Франция), однако сведения
об их диагностической оценке ограничены. В России были выполнены рабо­
ты по разработке метода прямого обнаружения специфического антигена ви­
руса, основанного на ингибиции рекомбинантного белка Е2 непрямым жидкофазным блокирующим вариантом ИФА (Бъядовская О.П. и соавт., 2002),
но в ветеринарных лабораториях метод пока не используется.
Таким образом, в связи с очевидной необходимостью решения пробле­
мы мониторинга и ликвидации болезни на территории России, необходим
дополнительный, доступный и чувствительный метод прямого обнаружения
антигена вируса КЧС в патологическом материале для использования в ре­
гиональных лабораториях, и особенно, при вспышках КЧС в промышленных
свинокомплексах.
1.2. Цель и задачи исследований.
Основной целью исследований являлась разработка метода твердофаз­
ного иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител для
прямого обнаружения антигенов вируса КЧС в органах и тканях зараженных
свиней.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие
основные задачи:
- получить стабильные клоны гибридом, продуцирующие моноклиналь­
ные антитела к антигенным детерминантам структурного полипептида Е2
вируса классической чумы свиней;
- отработать методы скрининга моноклональных антител и определить
их иммунологическую и полипептидную активность, специфичность, биохи­
мические характеристики;
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
5
-
определить оптимальные концентрации и условия взаимодействия
улавливающих и детектирующих моноклональных антител с антигеном ви­
руса КЧС;
- разработать метод двухсайтового ТФ ИФА для прямого обнаружения
антигенов вируса КЧС и определить диагностические объекты для исследо­
вания;
- изучить аналитическую и диагностическую чувствительность и спе­
цифичность метода двухсайтового ТФ ИФА при исследовании патологиче­
ского материала от
экспериментально заражённых вирусом классической
чумы свиней и при вспышках болезни в свинокомплексах.
1.3. Научная новизна.
Получено 9 клонов гибридных клеток, стабильно секретирующие моноклональные антитела, специфичные к антигенным детерминантам основ­
ного структурного полипептида Е2 вируса КЧС. На основе сэндвич ТФ ИФА
усовершенствован способ отбора моноклональных антител для использова­
ния в качестве улавливающих и детектирующих структурный полипептид Е2
вируса КЧС.
Разработан метод двухсайтового ТФ ИФА для прямого обнаружения
антигена вируса КЧС в лейкоцитах крови инфицированных вирусом КЧС
свиней, пригодный для лабораторной диагностики и мониторинга болезни.
1.4. Практическая значимость и реализация результатов исследо­
ваний.
На основании результатов апробации в экспериментальных условиях,
проведения экспертизы полевого патологического материала и комиссион­
ных испытаний разработанный метод двухсайтового ТФ ИФА рекомендован
для лабораторной диагностики КЧС и мониторинга болезни в свинокомплек­
сах.
Результаты исследований стали основой для изготовления Набора пре­
паратов для обнаружения вируса классической чумы свиней методом двух­
сайтового твердофазного иммуноферментного анализа на основе монокло-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
6
нальных антител. Пригодность разработанного твердофазного иммунофер­
ментного анализа для прямого обнаружения антигенов вируса классической
чумы свиней подтверждена комиссионными испытаниями и при проведении
диагностических исследований на классическую чуму свиней в ГНУ ВНИ­
ИВВиМ.
1.5. Апробация работы.
Результаты исследований, выполненных по теме диссертации, доложе­
ны и обсуждены на заседаниях учёного совета ГНУ ВНИИВВиМ в 2001-2004
г., Международной научно-практической конференции «Ветеринарные и ме­
дицинские аспекты зооантропонозов» (г. Покров 2003)
1.6. Публикации.
По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.
1.7. Структура и объём работы
Диссертация изложена на 112 страницах машинописного текста, вклю­
чает введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собствен­
ных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические предло­
жения, список литературы и приложения.
Работа содержит 20 таблиц и иллюстрирована 8 рисунками. Список ли­
тературы включает 151 источник, из которых 134 зарубежные.
1.8. Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые
на защиту:
- методы получения моноклональных антител к основному структур­
ному полипептиду Е2 вируса КЧС, оценка их пригодности в качестве диаг­
ностических препаратов для иммунохимических реакций;
- отбор и характеристика улавливающих и детектирующих монокло­
нальных антител к разным сайтам полипептида Е2 вируса, как основа разра­
ботки метода двухсайтового твердофазного иммуноферментного анализа для
прямого обнаружения вируса КЧС.
- аналитическая и диагностическая чувствительность и специфичность
метода двухсайтового ТФ ИФА, результаты его апробации при исследовании
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
7
патологического материала от экспериментально заражённых животных и
лабораторной диагностике КЧС.
1.9. Личный вклад соискателя
Основной объём исследований проведён автором самостоятельно. Изуче­
ние иммунохимических характеристик моноклональных антител проводи­
лись совместно с к.б.н., старшим научным сотрудником Анохиной Е.Г.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Материалы и методы
Вирусы. Для получения антигена вируса КЧС, скрининга гибридом и
экспериментального заражения свиней использовали вирулентные штаммы
"Ши-Мынь" и его клеточно-культуральный вариант "Ши-Мынь-51" (вирус
51-го пассажа в культуре клеток РК-15), с активностью 10 60 ККИД50/см3;
"Alfort - 187" С активностью 106'°-106-5 ККИД50/см3; аттенуированные
(вак­
цинные) штаммы "ЛК-ВНИИВВиМ" ("ЛК-65") и его трофовариант «ЛК-К» с
активностью I0 5 ' 0 ИмД^см""; полевые изоляты, выделенные при исследова­
нии патологического материала от свиней в период с 2000 по 2003 годы; рекомбинантный вирус осповакцины (Рек-КЧСА экспрессируюший полипепти­
ды вируса КЧС с активностью 10 80 ТЦД5о/см3.
Для оценки специфичности методов использовали антигенно-родственные
вирусы жвачных - вирус диареи КРС (штамм "Oregon C24V"), вирус погра­
ничной болезни овец ПБО (штамм "Moredun") и гетерогенные вирусы - вирус
болезни Ауески (штамм «Производственный»), вирус болезни Тешена
(штамм "Закарпатский").
Вирусы были получены из музея микроорганизмов ГНУ ВНИИВВиМ и
Центральной ветеринарной лаборатории (Великобритания).
Животные. Для получения иммунных спленоцитов использовали взрос­
лых мышей линии BALB/c, рожавших самок живой массой 25-30 г, выра­
щенных в питомнике "Столбовая" АМН России. До начала эксперимента жи­
вотных выдерживали в условиях карантина в течение 14 дней. Кормление
осуществляли в соответствии с рационами. Свиней крупной белой породы
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
8
рахчичного возраста (от 2 до б мес.) и пола, получали из вивария ГНУ ВНИИВВиМ.
Культуры клеток. Для культивирования вируса КЧС, вирусов болезней
Луески и Тешена использовали перевиваемые культуры клеток почки поро­
сёнка (РК-15, SK-6); вируса диареи КРС -MDBK; вируса ПВО - первичную
культуру клеток тестикул 1-2 месячных ягнят (ТЯ); рекомбинантного вируса
осповакцины (Рек-КЧС) - CV-1. Клетки получали из лаборатории "Культур
клеток с музеем клеточных штаммов" ГНУ ВНИИВВиМ
В качестве партнёра для слияния со спленоцитами иммунизированных
мышей использовали миеломную линию клеток Sp 2/0 -Ag 14.1 (Sp 2/0), де­
фектную по ГГФРТ (НИИБТ МЗ РФ).
Сыворотки. Для поддержания роста гибридных клеток и перевиваемых
клеток животных использовали фетальную сыворотку КРС производства
фирмы "Sigma" (США, Cat. № F 2442).
Диагностические препараты. Набор препаратов для иммунофлуоресцентной диагностики классической чумы свиней, изготовленный по ТУ 9388-07900008064-96, серия №5 и №6; конъюгат ПХ-поликлональные антитела КЧС,
приготовленный по методу, описанному Saunders G.C. (1976), набор препара­
тов моноклональных антител для дифференциации пестивирусов иммунопероксидазным методом (CEDITEST), любезно предоставленный доктором
Терпстра С. (ID-DLO, г. Лелистад, Нидерланды). Смесь моноклональных ан­
тител к El (gp33), Е0 (gp44/48) и Е2 (gp55) вируса КЧС были предоставлены
доктором Weiland E. (Федеральный научно-исследовательский центр вирус­
ных болезней животных, г. Тюбинген, Германия).
С целью очистки и получения антигенов вируса КЧС, культуры кле­
ток SK-6 или РК-15 выращивали в 1,5 литровых роллерных сосудах в среде
Игла (MEM) с содержанием 10% фетальной сыворотки КРС, 100 ед/см3 пе­
нициллина, 100 мкг/см3 стрептомицина. Инфицированную культуру клеток
инкубировали при 37°С в течение 16-72 часов (в зависимости от цели). Затем
содержимое роллеров дважды замораживали-оттаивали, осветляли от кле-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
9
точного детрита центрифугированием при 2000 об/мин в течение 20 мин. Ос­
ветлённую в и руссо держащую жидкость хранили при температуре минус
70°С до использования.
Титрование вируса проводили в культурах клеток с использованием
реакции прямой иммунофлуоресценции, титр вируса вычисляли по методу
Рида-Менча и выражали в клеточно-культурапьных инфекционных дозах
(ККИД 50 /см 3 ).
Иммунизация мышей. Мышей линии BALB/c, доноров спленоцитов,
иммунизировали антигенами вируса КЧС, полученными разными способами
с использованием полного и неполного адъюванта Фрейнда и без адъюванта,
сочетая сроки и способы введения по различным схемам (Стрижаков А.А.,
1994).
Контроль иммунного ответа. Для проверки результатов иммунизации
мышей и характера иммунного ответа на антиген, в сыворотках крови мышей
определяли уровень специфических антител к вирусу КЧС гистохимическим
иммуноферментным анализом (ГХ ИФА), непрямым твердофазном ИФА (ТФ
ИФА), реакцией непрямой иммунофлуоресценции (РНИФ) и РН.
Гибридизация клеток. Слияние клеток проводили по методу Kohler &
Milstein (1975) и WensvoortG. и соавт.(144). В качестве партнера для слияния
с В-лимфоцитами из селезенки мыши, иммунной к вирусу КЧС, использова­
ли миеломную линию клеток SP 2/0-Agl4.
Клонирование гибридных клеток и скрининг гибридом. Клонирование
гибридных клеток проводили в полужидком агаре. Скрининг гибридом, про­
дуцирующих вирусспецифические моноклональные антитела, проводили че­
рез 1 0 - 1 5 дней после начала клонообразования три раза с трехдневными ин­
тервалами непрямым ТФ ИФА, ГХ ИФА и РНИФ.
Анализ белков проводили в пластинчатых гелях 12x10x0.08 см в пре­
рывистой буферной системе как описано Laemmly U.K. (1970). Электропере­
нос полипептидов из полиакриламидного геля на нитроцеллюлозную мем­
брану осуществляли по методу Kyhse-Anderson (1984).
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
10
Определение белка проводили как описано Lovvry O.H.,et al. (1951)
Приготовление иммунопероксидазных
конъюгатов. Использовали мо­
дифицированный метод периодатного окисления по Tjissen P. (1980). Актив­
ность коньюгатов определяли прямым методом ТФ ИФА.
Определение функциональных свойств метода ТФ ИФА.
Для определения функциональных свойств разработанного метода ТФ
ИФА (аналитическая и диагностическая чувствительность, специфичность)
использовали рекомендации, указанные в руководстве МЭБ (Manual of
standards Diagnostic Tests and Vaccines 2000, часть 1.1.3). В качестве эталон­
ного метода, по сравнению с которым проводили расчёты диагностической
чувствительности и специфичности, использовали метод вирусовыделения в
культуре клеток РК-15 с последующей иммунофлуоресцентной идентифика­
цией (Методические указания по лабораторной диагностике классической
чумы свиней № 13-7-2/809 от 30.12.96 г.).
Диагностическую чувствительность (ДЧ) метода определяли в % по
соотношению количества положительных проб (П) к сумме положительных
и ложно-отрицательных проб (ИП+ЛО), полученных от исследуемых инфи­
цированных животных:
Диагностическую специфичность (ДС) метода определяли в % по соот­
ношению количества отрицательных проб (О) к сумме отрицательных и лож­
но-положительных всех исследуемых благополучных животных (0+ ЛП):
лСг =
Д
х
°
О+ЛП Ю0%
Статистическую обработку результатов проводили с использованием
пакета прикладных программ Statgraphics (Version 2.1.).
2.2. Результаты исследований
2.2.1. Получение антигенов вируса КЧС
Для гипериммунизации мышей и отработки методов скрининга гиб­
ридом, продуцирующих вирусспецифические МА, были получены препараты
антигенов вируса КЧС (штаммов «Ши-Мынь», «Alfort-187», «ЛК-К») и ре-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
11
комбинантного вируса осповакцины (Рек-КЧС), экспрессирующего полипеп­
тиды вируса КЧС и антигенно-родственных пестивирусов. Учитывая извест­
ные проблемы получения высокоочишенного вируса КЧС (Laude Н.,1977;
Николаева Н.,1983; Moennig V., 1990), для иммунизации мышей и скрининга
методом ТФ ИФА брали препараты антигенов в виде очищенного вируса и
осветлённых лизатов инфицированных клеток.
Для заражения культуры клеток РК-15 и наработки вируссодержащего
материала использовали клеточно-культуральный вариант «Ши-Мынь-51» и
штамм «ЛК-К» вакцинного вируса. Для очистки вируса использовали лизат
инфицированных клеток, выращенных роллерным способом. Для этого, ин­
фицированный клеточный монослой (множественность заражения 0,01-0,01
ККИД5о/кл<ггка) через 48 часов культивирования механически снимали со стек­
ла, ресуспендировали в фосфатном буферном растворе (ФБР) рН-7,6 и раз­
рушали в гомогенизаторе Даунса (3-5 циклов).
После центрифугирования разрушенных клеток при 3000 об/мин в те­
чение 20 минут, надосадок использовали в качестве антигена для гиперим­
мунизации мышей. Осадок ресуспендировали в ФБР и после обработки фре­
оном 113 вирус в полученном экстракте очищали ультацентрифугированием
в градиенте плотности сахарозы (7-35%) при 50000 об/мин в течение 2 часов
(Bekman, ротор SW-65). После центрифугирования в каждой фракции гради­
ента определяли инфекционную активность вируса.
Титр вируса в исходном вируссодержащем материале (концентрат ин­
фицированных клеток РК-15) составил 10 60 ККИД50/см3, а после концентри­
рования и очистки в градиенте сахарозы (фракциях с 19-20%-ным содержа­
нием сахарозы) составил 108'5 ККИД 50 /см 3 . Удельная активность очищенных
препаратов составила 108,8 ККИД50 на 1 мг белка, выход по инфекционности
составил 11 % и практически не зависел от используемого штамма вируса.
Очищенный вирус также использовали для иммунизации мышей BALB/c.
Рекомбинанатный вирус осповакцины (Рек-КЧС) культивировали в
перевиваемой культуре клеток CV-I во флаконах РУ или в пробирках с стек-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
12
лянными пластинками при множественности заражения 0,01-0,1 ТЦД;0/клетки в
течение 48-72 часов (до обнаружения признаков ЦПД).
Активность полученных препаратов антигенов вируса КЧС, в том
числе и рекомбинантного белка осповакцины, определяли непрямым мето­
дом ТФ ИФА с использованием смеси моноклональных антител к белкам Е1
(g P 33), Е0 (gp44/48) и Е2 (gp55).
Установлена корреляция обнаружения вирусспецифических белков
вируса КЧС в виде специфической флуоресценции цитоплазмы инфициро­
ванных клеток в зависимости от срока культивирования.
Результаты сравнительного определения инфекционной и антигенной
активности полученных препаратов вируса КЧС представлены в табл. 1.
Таблица 1
Результаты определения инфекционной и антигенной активности препаратов
вируса КЧС
Испытуемые
препараты
антигенные
ШМ-51 (лизатРК-15)
Очищенный вирус U1M-51
АИоП-187(лизатРК-15)
ЛК-К(лизатПСГК)
Осповакцина Рек - К Ч С (лнзат CV-I)
Инфекционная
активность
(1 й ККИД 5 0 /си 3 )
6,0±0,5
7.0±0,5
6.0±0,15
8,5±0,23
8,0 ±0,5
Концентрация
белка (мг/мл)
8
0,5
8
7
9
Антигенная
активность
ТФ ИФА
1:1280
1:1280
1:320
1:10240
1:640
Препараты антигенов вируса КЧС (штаммы «Ши-Мынь -51», Alfort187», «ЛК-К») и рекомбинантного вируса осповакцины Рек-КЧС использова­
ли для иммунизации мышей и отработки непрямого метода ТФ ИФА, скри­
нинга гибридом, продуцирующих вирусспецифические МА.
2.2.2. Получение гибридом, секретнрующнх МА к структурным полппептидам вируса КЧС
Гипериммунизация мышей BALB/c вирусом КЧС и контроль иммунного
ответа. 10 мышам BALB/c антигены вируса КЧС в виде экстракта клеток
РК-15, инфицированных штаммом «Ши-Мынь-51», по 0,1 см вводили от­
дельно или сочетано подкожно, внутрибрюшинно и внутриселезёночным
способами восемь раз с промежутком 14 дней. Первое введение осуществля-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
13
ли с полным адьювантом Фрейнда, второе и последующие - с неполным адьювантом Фрейнда. Бустер-дозу антигенов вводили внутриселезеночно. Луч­
шие результаты гипериммунизации получены при использовании антигенов
в виде осветлённого лизата клеток инфицированных штаммом «Шы-Мынь51», штаммом «ЛК-К» и лизата клеток CV-1, инфицированных Рек- КЧС осповакцины. Титр антител в сыворотках крови мышей после полного цикла
иммунизации был в непрямом ТФ ИФА 1:1280-1:2560, 1:640 и 1:320, соот­
ветственно. В дальнейшей иммунные спленоциты получали от мышей после
введения лизата клеток РК-15, инфицированных вирулентным вирусом КЧС
«Ши-Мынь -51».
Результаты гибридизации клеток и скрининга гибридом,
секретирую-
щих моноклональные антитела к вирусу КЧС. Слияние спленоцитов с клет­
ками мышиной миеломы SP-2/0-Ag-14.1 проводили при количественном со­
отношении 5:1. Полученные гибридные клетки выращивали в ростовой среде
ДМЕМ с содержанием 20% фетальной сыворотки КРС, селективных добавок
ГАТ и ГТ при температуре 37°С в атмосфере 95%-й влажности и 5%-й кон­
центрации С0 2 . Начало клонообразования наблюдали на 7-10 сутки после
гибридизации. В результате гибридизации было получено 512 клонов гиб­
ридных клеток. Культуральную жидкость каждого клона в объеме 0,05-0,1
см3 отбирали для скрининга, а в лунки вносили недостающее количество
ростовой среды.
Скрининг полученных гибридом, секретирующих моноклональные ан­
титела к вирусу КЧС, проводили непрямым методом ТФ ИФА, РНИФ и ГХИФА трёхкратно, исследованием культуральной жидкости каждого получен­
ного клона гибридом на седьмые сутки культивирования с промежутком 3
дня (на 7, 10, 13 сутки). Результаты скрининга представлены в табл. 2. Из
данных таблицы видно, что после проведения 3-го скрининга бьшо выявлено
только 28 клонов гибридных клеток из 512 полученных, которые продуциро­
вали моноклональные антитела к вирусу КЧС. Содержание моноклональных
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
14
Таблица 2
Результаты скрининга клонов гибридных клеток непрямым ТФ ИФА
Номер скрининга
Показатель
1-й
Получено гибридных колоний клеток всего
Количество гибридных колоний клеток, проду­
цирующих моноклональные антитела к антиге­
нам вируса КЧС
Количество гибридных колоний клеток, про­
дуцирующих антитела с не установленной спе­
цифичности или не продуцирующие антитела
% колоний клеток, продуцирующих антитела,
специфичные к антигенам вируса КЧС
|
2-й
|
3-й
512
48
34
28
464
478
484
9,4
6,6
5,5
антител к вирусу КЧС в культуральных жидкостях указанных положитель­
ных клонов было также подтверждено РНИФ и ГХ-ИФА.
В результате 3-х кратного клонирования полученных 28 клонов
гибридом в полужидком агаре получено 9, стабильно продуцирующих
моноклональные антитела к вирусу КЧС (табл. 3)
Клонированные клетки гибридом, секретирующие моноклональные ан­
титела, специфичные к антигенам вируса КЧС, выращивали в 10,0 мл флако­
нах до концентрации 100 тыс. клеток/см3 и хранили в жидком азоте до
использования.
Таблица 3
Активность вирусспецифических МА в культуральных жидкостях гибридом,
полученных после 3-го клонирования
Шифр клона
К1
К2
КЗ
К4
К5
Кб
К9
KI1
К12
Обозначение
(-) - МА не обнаружены.
Непрямой
ТФ ИФА
1:320
1:320
1:640
1:640
1:320
1:1280
1:320
1:640
1:320
Методы скрининга
ГХИФА
РНИФ
1:40
1:200
-
-
1:120
1:80
1 120
1 240
1 120
1 120
1 120
1 800
1 200
1 200
1 800
1 200
! 400
1 400
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
15
2.2.3. Получение препаративных количеств моноклональных анти­
тел, определение их активности и специфичности
Взрослым рожавшим самкам BALB/c вводили внутрибрюшинно по 0,5
3
см НАФ и затем, через 3 суток внутрибрюшинно 1-2 млн. гибридных клеток
клонов К1, К2, КЗ, К4, К5, Кб, К9, К11 и К12 в 2 см3 среды ДМЭМ. Отбор
асцитической жидкости проводили на 7-14 сутки после введения гибридом.
От каждой мыши получали от 3 до 6 см3 асцита.
Титры антител во фракции выделенных IgG асцитических жидкостей
определяли непрямым ТФ ИФА, РНИФ, ГХ ИФА и РН (табл. 4).
Нейтрализующая активность полученных моноклональных антител ус­
тановлена только для клонов К11 и КЗ (1:16).
Специфичность моноклональных антител определяли непрямыми ТФ
ИФА и ГХ ИФА с использованием антигенов (или инфицированных вируса­
ми клеток), полученных к различным штаммам и полевым изолятам вируса
КЧС (Ши-Мынь -51, ЛК - ВНИИВВиМ, Alfort-187, 782, 792, 793, 796, 797,
804), а также антигенно-родственных пестивирусов жвачных ВПБО (штамм
Moredun) и ВД КРС (штамм Oregon C 24 V), а также и гетерологичных виру­
сов: вирусов болезни Тешена (штамм Закарпатский), болезни Ауески (штамм
"Производственный"). Установлено, что моноклональные антитела 6-ти кло­
нов (К1, КЗ, К4, Кб, К9 и К12) из 9-ти испытуемых реагировали с антигенами
всех штаммов и изолятов вируса КЧС и антигенно-родственных пестивиру­
сов и не вступали в реакции с антигенами гетерогенных вирусов. Монокло­
нальные антитела клона К5 не реагировали с антигенами штамма Alfort-157,
полевых изолятов №792, 793 и антигенно-родственных вирусов; клона К11 реагировали с антигенами штамма Alfort-157, но не вступали в реакцию с ан­
тигенами полевых изолятов №792, 793 вируса КЧС и антигенно-родственных
вирусов.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
16
Таблица 4
Титр моноклональных антител к вирусу КЧС во фракции IgG ИАЖ мышей
BALB/c на 7-14 сутки после введения гибридных клеток
Шифр
клона
Методы титрования МЛ
РНИФ
ГХ ИФА
РН
К1
Непрямой
ТФ ИФА
1:1953125
1:703125
1:140625
К2
1:1953125
1:703125
1:140625
-
КЗ
1:1953125
1:703125
1:28125
1:16
К4
1:390625
1:703125
1:281150
К5
1:390625
1:28125
1:5625
Кб
1:390625
1:703125
1:140625
К9
1:390625
1: 140625
1:28125
-
KI1
1:78125
1:28125
1:28125
1:16
К12
1:390625
1: 140625
1:28125
-
Обозначение: ( - ) - антитела не обнаружены
Полипептидная
специфичность
моноклональных
антител к вирусу
КЧС. Электрофорезом в ДСН-ПААГ в восстанавливающих условиях и иммуноблоттингом установлено, что моноклональные антитела 8 изучаемых
клонов связываются с антигенными детерминантами, расположенными на
гликопротеине Е2 (gp55) вируса КЧС, моноклональные антитела клона К12
взаимодействовали с гликопротеином мм 71 кДа.
Таким образом, используемая гнбридомная технология, включающая
использование лизатов клеток РК-15 с высоким содержанием вируса КЧС
(штамм «Ши-Мынь») и трёхуровневым скринингом (непрямой ТФ ИФА, ГХ
ИФА и РНИФ) позволяет получать моноклональные антитела к основному
структурному полипептиду Е2 вируса КЧС.
2.2.4. Разработка метода двухсайтового Т Ф ИФА для обнаружения
антигенов вируса КЧС
С целью разработки двухсайтового ТФ-ИФА были наработаны препа­
ративные количества асцитов моноклональных антител (25-120 мл) всех 9
отобранных клонов (моноклональные антитела для сенсибилизации твёрдой
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
17
фазы и улавливания антигена), а также на их основе были изготовлены 9 со­
ответствующих конъюгатов с пероксидазой хрена (детектирующие моноклональные антитела) для обнаружения иммунокомплекса (АТ-АГ). В работе
использовали конъюгаты МА-ПХ с активностью в прямом варианте ТФ ИФА
не ниже 1:3200.
Определение и отбор улавливающих
и детектирующих
моноклональ­
ных антител
Для выполнения двухсайтового ТФ ИФА необходимо было подобрать
пары немеченых и меченных моноклональных антител, не конкурирующие
за сайт (ы) связывания на исследуемом антигене вируса КЧС. Решение этой
задачи выполнялось сэндвич вариантом ТФ ИФА следующим образом:
В лунки двух вертикальных рядов 96-ти луночных микропанелей вно­
сили моноклональные антитела каждой гибридомы (К1, К2, КЗ,К4, К5, Кб,
К9.К11 и К12), разведённые 0,02 М КББрН 9,6 от 1:200 до 1:25600 в объёме
0,1 см3/лунка. Концентрация общего белка в исходных немеченных МА со­
ставляла 10 мг/см3. Пластины инкубировали в течение ночи при 4°С.
После блокирования свободных сайтов связывания полистирола ФБРTween-БСА в течение 30 мин при 37°С, в лунки четных вертикальных рядов
вносили нормальный культуральный антиген, а в лунки нечетных рядов специфический культуральный антиген в разведении 1:10 ФБР-БСА (с из­
бытком по белку в 2 раза) в объёме 0,1 см3. Пластины инкубировали при 37°С
в течение 1 часа и затем, после отмывки в лунки панелей вносили по 0,1 см3
мкл коньюгатов МА-ПХ тех же клонов, взятые в рабочем разведении. После
90 мин инкубирования при 37°С вносили субстрат и через 30 минут проводи­
ли учёт.
Между каждым этапом пластины отмывали трехкратно, а перед внесе­
нием хромогенного субстрата шесть раз ФБР-Tween.
Оптимальную концентрацию улавливающих МА, используемых для
сенсибилизации микропанелей, и определение их конкуренции с детекти­
рующими антителами коньюгата МА-ПХ за связывание с антигеном опреде-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
18
ляли по результатам учёта оптической плотности (ОП). При получении по­
ложительного результата (ОП>2) в лунках, в которых концентрация улавли­
вающих (сенсибилизирующих) МА была 0,05-0,025 мг/см3 (1:200-1:400), счи­
тали, что улавливающие и детектирующие моноклональные антитела данной
пары
не конкурируют за сайты связывания антигена. Результаты подбора
пар улавливающих и детектирующих МА представлены в табл. 5.
Таблица 5
Результаты подбора пар улавливающих (сенсибилизирующих) МА и детек­
тирующих меченными МА -ПХ при обнаружении культурального антиге­
на вируса КЧС в сэндвич ТФ-ИФА
МА клонов
гибридом
(сенсибили­
зированные)
Коньюгаты МА- ПХ (меченые моноклональные антитела клонов гибри­
дом)
К1
К2
КЗ
К4
К5
Кб
К9
К1
1:200
К2
1:400
КЗ
К12
пхПА
1:400>
1:400'
К4
К5
1:200 J
Кб
1:400»
К9
1:400-
1:200 '
1:200'
1200
1:2001:400 :
1:2002
1:200 т'
1:200\
1:400"«
1:400 «
К11
К12
1:200:
1:200
liOOi
ПА
- положительный сигнал, оптическая плотность >2 (отсутствие конкуренции);
- отрицательный сигнал (конкуренция)
В результате установлено 20 пар улавливающих и детектирующих моноклональных антител, не конкурирующих между собой за связывание с
культуральным антигеном: (К1: К9-ПХ), (К2 : К9-ПХ), (К2 : ПА-ПХ), (КЗ :
К5-ПХ), (К4 : К2-ПХ), (К4 : К12-ПХ), (К5 : К1-ПХ), (К5 : К2-ПХ), (К5 : КЗПХ), (К5 : К9-ПХ), (К5 : ПА-ПХ), (Кб : К1-ПХ), (Кб : ПА-ПХ), (К9 : К2-ПХ),
(К9 : К5-ПХ), (К9 : К12-ПХ), (К12 : К1-ПХ), (К12 : К9-ПХ), (К12 : ПА-ПХ)
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
19
На основе отобранных 20 пар улавливающих и детектирующих моноклональных антител, определяли пары антител для последующего изучения
воспроизводимости двухсайтового ТФ-ИФА на микропанелях различных
фирм, определения его функциональных свойств и комплектования диагно­
стического набора препаратов для практического использования.
Для этого сравнивали результативность обнаружения культуральных
антигенов вирулентного вируса КЧС (штамм ШМ-51) и рекомбинантного
вируса осповакцины Рек-КЧС.
Было установлено, что лучшая результативность и воспроизводимость
обнаружения используемых антигенов вируса КЧС были получены при ис­
пользовании пар моноклональных антител для сенсибилизации твёрдой фазы
микропанелей производства фирм «Costar» и «Titertek» и детектирующих
меченных пероксидазой хрена моноклональных антител в следующей после­
довательности: (MA K9 - коньюгат МА К5-ПХ), (MA K5 - коньюгат МА К9ПХ) и (МА К9 - коньюгат МА К12-ПХ). Коэффициент вариации при трёх повторностях на микропанелях «Costar» и «Titertek» составил 4,8-6,8% соответ­
ственно.
В связи с тем, что моноклональные антитела клона К5 не реагировали с
антигеном вирулентного референс штамма «Alfort-157» и полевыми изолятами (п.2.2.3.), в дальнейшей работе в двухсайтовом ТФ ИФА использовали
пару МАК9-МАК12-ПХ.
Определение оптимальных условий постановка метода
1
двухсайтового
ТФ ИФА для обнаружения антигена вируса К 1С в патологическом
мате­
риале
Для определения оптимальных условий постановки метода двухсайто­
вого ТФ ИФА с целью обнаружения антигена вируса в патологическом мате­
риале от 12-ти подсвинков, инфицированных внутримышечно вируссодержащей кровью, (штамм «Ши-Мынь») в дозе 10 40 ДД50/см3, отбирали пробы
крови в динамике инфекции, а после гибели — пробы внутренних паренхима­
тозных органов.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
20
Пробы крови, отобранные каждые 5 суток после заражения, фракцио­
нировали с использованием «Ficol-Pak», отдельно получали плазму, лейкоци­
тарную фракцию и хранили до исследования при минус 70°С. Из проб внут­
ренних органов готовили 10%-ную суспензию на ФСБ.
Определение оптимальной концентрации улавливающих
MA (K9) для
сенсибилизации твердой фазы.
В работе использовали следующие антигены:
вируссодержащие
50
пробы
лейкоцитов
крови
(титр
вируса
3
10 ' ККИД5о/см ), полученные на 12 сутки после заражения поросят;
культуральный антиген вируса КЧС (штамм «Ши-Мынь—51») (титр ви­
руса 10 60 ККИД5о/см3) - положительный контроль;
проба лейкоцитов, полученная перед заражением - отрицательный ан­
тиген.
Выполнение анализа.
Моноклональные антитела клона К9 вносили по 0,1 см3 0,02 М КББ рН
9,6 в два вертикальных ряда лунок в двукратных разведениях (концентрация
белка составляла от 1,0 мг/см3 до 0,03125 мг/см3). Инкубацию пластин про­
водили при 4°С в течение 18 часов;
- блокирование свободных сайтов твёрдой фазы, внесением в лунки
отмытых панелей по 0,2 см3 ФБР-Tween-BCA в течение 30 мин при 37°С;
- внесение в лунки чётных вертикальных рядов отрицательных антиге­
нов, а в лунки нечетных рядов - вируссодержащие пробы лейкоцитов, разве­
дённые от 1:2 до 1:128 в 0,1 см3 ФБР-БСА, и инкубирование при 37°С в тече­
нии 1 час;
- внесение в лунки конъюгата МА12-ПХ в рабочем разведении и инку­
бирование в течение 60 мин при 37°С;
- внесение в лунки субстрата и инкубирование в течение 30 мин при
комнатной температуре.
- учёт результатов.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
21
Между каждым этапом пластины отмывали трехкратно, а перед внесе­
нием хромогенного субстрата - шесть раз ФБР. Учёт результатов проводили
спектрофотометрически. Результаты двухсайтового ТФ ИФА с разной кон­
центрацией улавливающих МА при обнаружении антигена вируса КЧС в
пробах лейкоцитов инфицированного поросёнка обработаны и представлены
графически на рис 1.
Оптическая
плотность
0,295
0,294
0,3
0.251 —
—.
0,249 ^ V
„„,
^
Х.Л233
44
0,2
^ \
V4
s 0,112
0,1
VV^
4
^
s
V 0,062
"~"*-«.Q.QJI
1
1
1
0,5
1
1
0,25
^4*0.061
\
^ ^ ^
О.ОЗЗЧ^ ^ ^ ^ 0 , 0 0 9
1
1
1
—
i 0
— , 0,1)03 ^
0,125
0,06
0,03
Концентрация МЛ (мг/смЗ)
'-разделение проб лейкоцитов 1:4
"""•
-разведение проб лейкоцитов 1:8
- - — - -отрицательный контроль
'-рачведение проб лейкоцитов 1:4
Рис.1. Зависимость показателей оптической плотности от концентрации улавли­
вающих моноклональных антител клона К9 (мг/см3)
Полученные данные исследований показали, что антиген вируса КЧС в
лейкоцитах крови инфицированных животных двухсайтовым ТФ ИФА обна­
ружен (ОП >2) при концентрации улавливающих (сенсибилизирующих) МА
не менее 0,5 мг/см3.
В последующих исследованиях по оценке чувствительности и специ­
фичности двухсайтового ТФ-ИФА использовали 96-ти луночные микропане-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
22
ли фирмы Titertek или COSTAR, сенсибилизированные моноклональными
антителами клона К9 в концентрации не менее 0,5 мг/см3.
2.2.5. Определение аналитической и диагностической чувствитель­
ности, специфичности двухсайтового ТФ ИФА при обнаружении анти­
гена вируса КЧС у экспериментально заражённых свиней.
Способность двухсайтового ТФ ИФА давать положительный сигнал
при исследовании проб вируссодержащих материалов, содержащих извест­
ную концентрацию инфекционного вируса (аналитическая чувствитель­
ность), и отрицательный сигнал при исследовании проб, не содержащих ви­
рус (аналитическая специфичность) определяли при проверке культуральных
антигенов вируса КЧС, проб крови и органов от экспериментально заражён­
ных свиней, антигенно-родственных вирусов, а также проб, не содержащих
вирус КЧС (гетерогенные вирусы, пробы органов и крови от незаражённых
свиней.
Чувствительность двухсайтового ТФ-ИФА при исследовании лейкоци­
тарной фракции и плазмы крови заражённых свиней составила 3.0-3.5 lg
ККИД50.1СМ3. При исследовании
культуральных антигенов вакцин
ЛК-
ВНИИВВиМ и ЛК-К и антигенно-родственных вирусов (ВД КРС и ВПБО),
также получены положительные результаты.
В результате исследования крови, органных нормальных антигенов интактных животных и культуральных антигенов гетерогенных вирусов (болез­
ней Ауески, Тешена, РРСС) получен отрицательный результат.
При определении сроков обнаружения антигена вируса КЧС установ­
лено (рис.2), что при остром течении болезни, вызваной вирулентным виру­
сом (штамм «Ши-Мынь»), антиген вируса обнаружен с 6-х суток после зара­
жения (на 2 суток позже вирусовыделения) при выраженных гипертермии и
лейкопении вплоть до гибели.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
23
4Z -
Вирсмня
\
Ы о.
н
я
о.
о
> 1
емп
\
46 -
\ ^
\
V
%
\\
X
5
й
н
и
38-
\
1 — * i —— h — * Н
1
3
4
S
6
7
—ректальная температура
"••—
^^~
•
\ /
^.-^
~—
1
"к ^ ^ ~
"•ч
•s.
1
ТФ-ИФА
^™~™ " ^ ^
N
"V.
"х^-""
1
1
Н
1
1
1
1
9
10 11 12 13 14 15 16
— ^количетво лейкоцитов тыс.ммЗ жсния
1
Рис.2. Сроки обнаружения антигена вируса КЧС (штамм «Ши-Мынь») двухсайтовым Т Ф
И Ф А в пробах лейкоцитов крови свиней в зависимости от клинического состояния и тече­
ния инфекционного процесса.
В зависимости от патогенности изолята, течения и исхода болезни ан­
тиген вируса КЧС в пробах лейкоцитов был обнаружен на 6 сутки (вирулент­
ные изоляты № 805, КМ) и 9 -10 сутки (низко-вирулентные полевые изоляты
Троицкое—02, Шувалово-03) до 12-15 суток. Обнаружение антигена двухсай­
товым ТФ ИФА коррелирует с концентрацией вируса в крови и лейкоцитов.
Так, положительный сигнал (ОП >2) получен при титре вируса не менее 3,0
ККИД50/см3, лейкопении ниже 3 тыс/мм3 и гипертермии. Диагностическая
чувствительность двухсайтового ТФ ИФА в период между 6-12 сутками по­
сле экспериментального заражения, по сравнению с методом вирусовыделения, составляет 83-91,6%.
В табл. 8 представлены результаты определения диагностической чув­
ствительности двухсайтового ТФ-ИФА при исследовании проб крови от экс­
периментально заражённых подсвинков вирусом КЧС (штамм «Ши-Мынь»),
отобранные в динамике инфекции.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
24
Таблица 8
Диагностическая чувствительность двухсаитового ТФ-ИФА в динамике ин­
фекции при исследовании фракций проб крови от 12 экспериментально зара­
жённых поросят вирусом КЧС (штамм «Ши-Мынь»)
Исследуемая
фракция крови
Лейкоциты
Сыворотка
Реакция метода
Положител ьная
Ложно-отрицательная
Чувствительность (%)
Положительная
Ложно-отрицательная
Чувствительность (%)
0
0
0
0
0
Сутки после заражения
5
7
10
4
10
9
8
2
3
33,3
83,3
75,0
2
5
7
10
7
5
16,4
41,6
58,0
12
11
1
91,6
7
5
58,0
Из данных таблицы видно, что диагностическая чувствительность
двухсаитового ТФ-ИФА варьирует, в завимости от времени отбора проб кро­
ви после заражения: на 5 сутки -33,3%, с 7 по 12 сутки составила 75-91,6%;
при исследовании сывороток -16,4, 41,6 и 58%% соответственно.
2.2.6. Апробация метода двухсаитового ТФ ИФА при вспышках
КЧС на свинокомплексах
Оценку диагностической чувствительности и диагностической специ­
фичности метода двухсаитового ТФ ТФА проводили при исследовании проб
крови (сыворотки), полученных от вынужденно убитых поросят группы доращивания при вспышке КЧС в ЗАО «Владимирское» и ЗАО «Краснодон­
ское» в 2001 году (неблагополучные свинокомплексы), и 61 пробы крови,
полученных из 3-х благополучных по чуме хозяйств. После проведения ви­
русологических исследований сыворотки были проверены ТФ ИФА. Резуль­
таты сравнительных исследований вирусовыделения и метода двухсаитового
ТФ ТФА представлены в табл. 9.
В результате исследования всех 55 проб крови, полученных из небла­
гополучных свинокомплексов методом выделения в культуре клеток РК-15,
вирус обнаружен в 32 пробах, что на 11% выше чувствительности метода
двухсаитового ТФ ИФА. По отношению к стандартному методу, диагности­
ческая чувствительность двухсаитового ТФ ИФА составила 81%, диагности­
ческая специфичность - 100%.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
25
Таблица 9
Результаты определения диагностической чувствительности и специ­
фичности двухсайтового ТФ ИФА при исследовании проб крови от вынуж­
денно убитых животных неблагополучных и благополучных по КЧС свиноводческих хозяйств
Методы обнаружения вируса:
изоляция вируса
двухсайтовый
РК-15
Т Ф ИФА
Неблагополучные по КЧС хозяйства
30
ЗАО «Владимирское»
20
16
ЗАО «Краснодонское»
25
12
10
Итого:
55
32 (58%)
26 (47%)
Диагностическая чувствительность
81%
Благополучные по КЧС хозяйства
20
ООО «Белгранкорм»
0
0
Ф Г У П «Калининградское»
25
0
0
Колхоз им. Фрунзе
16
0
0
61
0
Итого:
0
Диагностическая специфичность
100%
Наименование
свинокомплекса
Кол-во исследован­
ных проб (всею)
Таким образом, на основании результатов исследования проб органов
от незаражённых и заражённых вирусом КЧС свиней (в том числе разными
полевыми изолятами) в эксперименте и при исследовании полевых материа­
лов при вспышках КЧС в свинокомплексах, можно сделать заключение о
том, что разработанный метод двухсайтового ТФ ИФА обладает диагности­
ческой чувствительностью и специфичностью, которые позволяют рекомен­
довать его для проверки в широких производственных испытаниях для по­
следующего использования для диагностики и мониторинга болезни в круп­
ных свиноводческих комплексах.
З.ВЫВОДЫ
1. Получено 8 клонов гибридом, стабильно продуцирующих моноклональные антитела, специфичные к антигенным детерминантам основного
структурного полипептида Е2 вируса КЧС.
2. Моноклональные антитела клонов К1, КЗ, К4, Кб, К9 и К12 в виде асцитических жидкостей имеют активность от 1:78125 до 1:1953125 в непря­
мом ТФ ИФА и реагируют с вирулентным, вакцинными штаммами вируса
КЧС, а также антигенно-родственными пестивирусами (диареи крупного ро-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
26
гатого скота, пограничной болезни овец). Моноклональные антитела клонов
К2, К5 и К11 обладали избирательной способностью реагировать с референсштаммами и полевыми изолятами вируса классической чумы свиней.
3. Отобранные методом сэндвич ТФ ИФА неконкурирующие монокло­
нальные антитела клонов гибридом К9 и К12 обладали специфичностью к
разным эпитопам структурного полипептида Е2 вируса КЧС и пригодны для
его улавливания и детекции методом двухсайтового ТФ ИФА.
4. Разработан метод двухсайтового ТФ ИФА для прямого обнаружения
антигенов в лейкоцитах больных классической чумой свиней. Аналитическая
чувствительность метода составила при концентрации вируса не менее 3.0 !g
ККИД50/см3 вируса.
5. Установлено, что при исследовании проб лейкоцитов от свиней, полу­
ченных в период между 6-12 сутками после экспериментального заражения
вирусом КЧС разной патогенности, диагностическая чувствительность двух­
сайтового ТФ ИФА, по сравнению с методом вирусовыделения, составляет
83-91,6%.
6. В результате апробации при исследовании полевых материалов, по­
лученных из неблагополучных и благополучных по КЧС свинокомплексах
разработанный метод двухсайтового ТФ ИФА, по сравнению с методом ви­
русовыделения, имеет чувствительность 8 1 % и специфичность 100%.
4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
Подготовлена и утверждена директором ГНУ ВНИИВВиМ временная
нормативная документация: «Инструкция на изготовление и контроль набора
препаратов для обнаружения вируса классической чумы свиней твердофаз­
ным иммуноферментным анализом на основе моноклональных антител»,
«Технические условия на набор препаратов для обнаружения вируса класси­
ческой чумы свиней твердофазным иммуноферментным анализом на основе
моноклональных антител», «Наставление по применению набора препаратов
для обнаружения вируса классической чумы свиней твердофазным иммуно­
ферментным анализом на основе моноклональных антител».
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
27
5.СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ НО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Куриннов В.В., Цыбанов С.Ж., Бунькова Н.И., Коломыцев А.А., Стрижаков А.А., Васильев А.П., Лыска В.М, Стариков В.М. Генотипирование поле­
вых изолятов вируса КЧС домашних свиней и диких кабанов // Биологоэкологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в па­
тологии сельскохозяйственных животных и людей: Материалы международ­
ной научно-практической конференции / ВНИИВВиМ.- Покров, 2002.- С.
133-135
2. Васильев А.П., Стрижаков А.А., Куриннов В.В., Стрижакова О.М. Сравни­
тельная оценка антигенной активности препаратов классической чумы сви­
ней для получения моноклональных антител // Биолого-экологические про­
блемы заразных болезней диких животных и их роль в патологии сельскохо­
зяйственных
животных и людей: Материалы международной
научно-
практической конференции / ВНИИВВиМ.- Покров, 2002.- С. 308-309.
3. Васильев А.П. Сравнительная оценка современных методов диагностики
вируса классической чумы свиней // Ветеринарные и медицинские аспекты
зооантропонозов: Труды международной научно-практической конференции,
посвященной 45 летию института/ Покров, 2003.- С. 396-401.
4. Куриннов В.В., Сергеев В.А., Забережный А.Д., Грибенникова Т.В., Цыба­
нов С.Ж., Коломыцев А.А., Стрижаков А.А., Лыска В.М., Васильев А.П.,
Стариков A.M., Медведева Е.Ю. Вопросы клинической и лабораторной диаг­
ностики классической чумы свиней // Ветеринарные и медицинские аспекты
зооантропонозов: Труды международной научно-практической конференции
посвященной 45- летию института / Покров, 2003.-С. 375-384.
5. Коломыцев А.А., Стрижаков А.А., Куриннов В.В., Живодеров СП., Ва­
сильев А.П., Балышев В.М., Чичикин А.Ю. Классическая чума диких каба­
нов: "Экологический портрет" возбудителя // Ветеринарные и медицинские
аспекты зооантропонозов: Труды международной научно-практической кон­
ференции посвященной 45 летию института/ Покров, 2003.-С. 354-360.
6. Васильев А.П., Стрижаков А.А., Куриннов В.В. Получение и характери-
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
28
стика моноклональных антител, специфичных к антигенам вируса классиче­
ской чумы свиней // Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекцион­
ных болезней животных: Материалы международной научной конференции
молодых ученых / ФГУ ВНИИЗЖ.- Владимир, 2004.- С. 101-105.
7. Куриннов В.В., Забережный А.Д., Гребенникова Т.В., Цыбанов С.Ж., Коломыцев А.А., Стрижаков А.А., Лыска В.М., Васильев А.П., Стариков A.M.,
Медведева Е.Ю. Клиническая и лабораторная диагностика классической чу­
мы свиней // Ветеринария.- 2004.- №5.- С. 18-22.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
29
Отпечатано в типографии ГНУ ВНИИВВиМ, г. Покров, Владимирской
области
Тираж 75 экз.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа