close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

4975.ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛОВЫХ КЛЕТОК СЕМЕННИКОВ КРОЛИКОВ КАК МИШЕНЕЙ ДЛЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

код для вставкиСкачать
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
J~M4U?
На правах рукописи
НОВГОРОДОВА ИННА ПЕТРОВНА
ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛОВЫХ КЛЕТОК
СЕМЕННИКОВ КРОЛИКОВ КАК МИШЕНЕЙ
ДЛЯ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
03.00.23 - БИОТЕХНОЛОГИЯ
03.00.13 - ФИЗИОЛОГИЯ
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Дубровины-2004
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Работа
выполнена
в
отделе
биотехнологии
Всероссийского
государственного научно-исследовательского института животноводства.
Научные руководители: доктор сельскохозяйственных наук,
академик РАСХН Лев Константинович Эрнст;
доктор биологических наук,
профессор Наталия Анатольевна Зиновьева
Официальные
доктор биологических наук, профессор
оппоненты:
Лев Петрович Дьяконов;
доктор биологических наук, профессор
Юрий Дмитриевич Клинский
Ведущее учреждение:
Научно-исследовательский институт пушного
звероводства и кролиководства
им. В.А. Афанасьева
Защита диссертации состоится
200-1 :vv .
10.00 часов, на заседании диссертационного совета Д.006 С >
Всероссийском
государственном
научно-исследовательском
.•.:•. ,
животноводства.
142132, Московская обл.,
Адрес института:
Подольский р-н, п. Дубровицы ,.-'
тел. (27) 651163
С
диссертацией
можно
животноводства.
ознакомиться
_,
в
библиотеке
п
-•-'-/
Ч'..гг-
2004 года.
Автореферат разослан «
Ученый секретарь
диссертационного совета, у^ C.^f ^\
кандидат биологических н4ук(^^е5'^^1#^ ? '^
•• „ •
/О
^ ^
В.П. Губанова
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.
1.1. Актуальность темы. Изучение процессов созревания и
дифференцировки половых клеток семенников животных представляет
огромный интерес для сравнительной эмбриологии, биологии развития,
медицины и биотехнологии [М.М. Иванова и др., 2000]. Использование клеток
гонад животных в биотехнологии рассматривается в качестве перспективного
приема получения трансгенных сельскохозяйственных животных. Несмотря на
наличие целого ряда методов доставки генетической информации в
эмбриональные линии животных [Л.К. Эрнст, НА. Зиновьева, 2002], интерес к
использованию клеток семенников сохраняется, вследствие их природной
способности поглощать чужеродную ДНК (чДНК) и переносить ее в яйцеклетку
посредством оплодотворения {F. Gandolfi, 1998].
Среди
популяции
клеток
сперматогенного
эпителия
интерес
исследователей в настоящее время сфокусирован на использовании стволовых
клеток сперматогоний (СКС). Именно уникальное свойство многократного
самообновления СКС открывает широкие возможности реализации потенциала
этих клеток при получении трансгенных животных [R. Brinster et a!., 1998].
Популяция диплоидных СКС постоянно обновляется, в результате
инициируется комплексный процесс дифференцировки этих клеток. Все это
приводит к появлению высоко специализированных половых клеток - спермиев.
Одна СКС способна сформировать 4096 сперматид [А. Могепа et a/., 1996; I.
Dobrinski et at., 2000; С. Mairet et al., 2000]. Понимание молекулярных
механизмов, сопутствующих транспорту экзогенной
ДНК спермиями в
яйцеклетки, способствует прогрессу исследований в данной области и послужит
основой для массового переноса генов у различных видов животных.
Стволовые клетки сперматогоний млекопитающих, представляющие
большой интерес для таких наук, как биотехнология, клеточная и генная
инженерия, являются на сегодняшний день удобной моделью при проведении
различных геномных манипуляций у млекопитающих.
1.2. Цель и задачи исследований. Целью диссертационной работы
явилась характеристика половых клеток семенников кроликов как мишеней для
генно-инженерных исследований. Для достижения поставленной цели были
решены следующие задачи:
- изучить гистологические особенности семенников у разновозрастных
самцов кроликов;
- дать характеристику популяций клеток сперматогенного эпителия в
зависимости от стадии развития;
- выявить наиболее оптимальные сггадаи__для__выдеяения—СКС и
проведения с ними генно-инженерных исследований; Ц Ц Б М С Х А
] фонд н а г н о и литературы!
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
2
- определить эффективность генетической трансформации клеток
семенников кролика in vitro с использованием ретровирусных векторов;
- изучить эффективность трансформации клеток семенников кроликов in
vivo.
1.3. Научная новизна работы. В ходе выполнения диссертационной
работы впервые подробно изучены гистологические особенности семенников
самцов кроликов, находящихся на различных физиологических стадиях
сперматогенеза. Дана характеристика популяций клеток сперматогенного
эпителия семенных канальцев в динамике. Показана возможность генетической
трансформации клеток сперматогенного эпителия кроликов in vivo с
использованием ретровирусных векторных систем.
1.4. Практическая ценность работы. Практическая значимость
диссертации заключается в определении возраста самцов кроликов, при
котором в семенниках наблюдается максимальное количество стволовых клеток
сперматогоний - перспективных клеток-мишеней для генно-инженерных
исследований.
Изучена
эффективность
генетической
трансформации
сперматогоний кролика in vivo ретровирусными генными конструкциями,
содержащими гены инсулина и гормона роста человека.
1.5. Основные положения, выносимые на защиту:
• Соотношение клеток разных типов в семенных канальцах самцов
кроликов изменяется в зависимости от возраста животных;
• В сперматогенном эпителии семенных канальцев самцов кроликов
постоянно присутствуют стволовые клетки сперматогоний, число которых
изменяется в процессе онтогенеза;
• Сперматогоний семенных канальцев самцов кроликов могут быть
трансформированы in vivo с использованием ретровирусных векторов;
• Эффективность генетической трансформации сперматогоний in vivo
зависит от генной конструкции и типа ретровирусного препарата.
1.6. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены:
• на научно-методической конференции аспирантов и молодых ученых,
ВГНИИЖ, п. Дубровицы, июнь 2003г;
• на международной научно-практической конференции «Повышение
конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения»,
РАМЖ, п. Быково, июль 2003г;
• на 3-й международной конференции «Современные достижения и
проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных», ВГНИИЖ, п.
Дубровицы, ноябрь 2003г;
• в научном отчете ВГНИИЖ, 2003 г;
• на научной конференции отдела биотехнологии ВГНИИЖ, август 2004 г;
• на международной научной конференции, посвященной 75-летию
ВГНИИЖ, сентябрь, 2004 г.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
г
1.7. Публикация результатов исследований. По материалам
диссертации опубликовано 6 научных работ.
1.8. Структура и объем работы. Диссертация изложена на 141 странице,
содержит 12 таблиц, 35 рисунков (в т.ч. 25 фотографий), состоит из следующих
разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований,
результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические
предложения и список литературы. Список литературы включает 267
библиографических источников, в том числе 234 на иностранных языках.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
Экспериментальные
исследования
проводили
в
лаборатории
молекулярной генетики и цитогенетики сельскохозяйственных животных отдела
биотехнологии ВГНИИ животноводства в 2001-2004гг.
В качестве объекта исследований были взяты разновозрастные самцыкролики помеси пород шиншилла и белый великан, содержащиеся на
экспериментальном физиологическом дворе ВИЖ в количестве 72 голов.
Исследования проводили по схеме, представленной на рисунке 1.
Материал тканей семенников отбирали в зависимости от возраста: при
полостной внутрибрюшинной операции или односторонней кастрации кроликов.
Отбор тканей семенников проводили, начиная с10-дневного до 12-недельного
возраста с интервалом 7 дней и с 3-х до 6 месяцев - с интервалом 14 дней.
Гистологические препараты семенников кроликов готовили по общепринятой
гистологической методике Б. Ромейса [1953].
Микроскопию гистологических препаратов проводили с помощью
микроскопа «Opton» (Германия), объектив х40, окуляр х15 с использованием
системы цифровой визуализации изображений (ООО «Система для
микроскопии и анализа»).
Для трансформации клеток семенников кроликов использовали
ретровирусные генные конструкции, включающие ген инсулина человека под
контролем промотора цитомегаловируса, и ген гормона роста человека под
контролем промотора вируса саркомы Рауса (предоставлены к.б.н. И.К.
Фоминым, Белорусский НИИ переливания крови, г. Минск). В качестве клетокупаковщиц использовали линию АМ12. Схема используемых генных конструкций
представлена на рисунке 2.
Перед
введением
в
семенники
кроликов
клетки-упаковщицы
предварительно оценивались на наличие рекомбинантной вставки методом
ПЦР. Трансфекцию клеток-мишеней семенников кроликов in vitro проводили
путем совместного их культивирования с клетками-упаковщицами или
посредством добавления к культуре клеток семенников культуральной жидкости,
содержащих ретровирусный вектор pX-lns.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Характеристика половых клеток семенников кроликов
как мишеней для генно-инженерных исследований
Л
3_
Отбор проб тканей семенников от
разновозрастных самцов (п=57)
X
X
X
ф
=£
о
СМ
ГО
х
ю
SF 9
5
X
X
со
X
О»
Трансфекция in vitro
(0=3)
Получение КК семен­
ников (п=3)
I
J—,_J-
cf
3
8
X
2
см
см
Приготовление гистологических
препаратов семенников
Окраска гематотоксилинэозином
Окраска по
Фелыину
Введение рек. век. в семенники кроликов in vivo (n=12)
Отбор проб тканей семенни­
ков через 7-14 дней
Морфологическая
оценка клеток
Анализ трансформации
клеток семенников
Выявление оптималь­
ного возраста для
проведения биоинже­
нерных манипуляций
Иммуногистохимические
исследования
Анализ интеграции чДНК
в клетках сперматогониях
кроликов
Изучение морфологии сперматогенеза кроликов
Определение возраста с max
количеством сперматогоний
Определение отн. количества
ДНК клеток сперматогенного
эпителия
Рис.1. Схема исследований.
Статистическая обработка
данных
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
5
pX-RSVhgh
бООЬо
900
LTR
410
1530
360
800
600
RS\'|
hgh
SV
neo
LTR
Г
1 1
s
1
1
E ES
В
S
S
pX-ins
600bD
LTR
500
360
800
600
| ins
SV
neo
LTR
900
1
1
s
E
(St-X)
S
Рис. 2. Схема используемых генных конструкций. RSV - промотор
вируса саркомы Рауса; SV - промотор ранних генов вируса SV40; пео - ген
неомицинфосфотрансферазы из транспозона Тп5.
В - BamHI, Е - EcoRI, S - Sad, SI - Sail, X - Xhol.
Трансформацию клеток семенников кроликов in vivo проводили генной
конструкцией, включающей ген гормона роста человека, на самцах в возрасте 9
недель (п=6) и генной конструкцией, содержащей ген инсулина человека, - на
животных в возрасте 8 недель (п=6).
Ретровирусные векторы вводили в паренхиму семенников кроликов
(множественное введение 5-8 инъекций на семенник). В качестве источника
конструкций использовали взвесь клеток-упаковщиц в среде DMEM, с
предварительно заблокированным митозом митомицином С, и супернатант,
полученный
при
культивировании
линии
клеток,
продуцирующих
рекомбинантные ретровирусы, освобожденный от флотирующих клеток и их
остатков высокоскоростным центрифугированием, дополненные полибреном из
расчета 8 мкг/мл, в количестве, соответственно, 1 млн и 0,5 мл (105) на
семенник. В зависимости от используемого вирусного препарата для каждой из
генных конструкций были сформированы две опытные группы: 1 - введение
клеток-упаковщиц (п=3), 2 - введение культуральной жидкости (п=3).
Экспрессию рекомбинантных генов в клетках семенников кроликов
определяли иммуногистохимическим методом при помощи набора Novocastra
(Sigma, США). Клетки, синтезирующие рекомбинантный вирус, окрашиваются в
красно-коричневый цвет.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
6
3.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.
3.1. Гистологические исследования семенников кроликов.
3.1.1.
Изучение
морфологии
сперматогенеза
кроликов
выявление возраста с максимальным числом сперматогоний.
и
Гистологические исследования семенников кроликов проводили в 19
возрастных категориях (от 10 дней до 12 месяцев) на самцах в количестве 56
голов.
Исследования срезов семенников кроликов в возрасте 10-ти дней
указывают на то, что основную массу клеток в семенных канальцах составляют
мелкие с небольшим темным ядром клетки Сертоли, число которых составляет
16,7±0,44. Кроме того, в канальцах обнаруживаются крупные первичные
половые клетки (гоноциты) -11,6±0,52 (фото 1).
В возрасте 14-30 дней (фото 2) выявлены сперматогоний типа А со
светлой крупной цитоплазмой, заметны делящиеся формы сперматогоний в
стадиях профазы и метафазы, число которых изменяется от 7,0±0,41 до
13,1±0,55, число клеток Сертоли изменяется незначительно - от 23,1±0,61 до
23,2+0,75.
На срезах семенников самцов 5-недельного возраста начинают
отмечаться некоторые изменения, наблюдается размножение сперматогоний.
Семенные канальцы представлены двумя типами сперматогоний: тип А и
промежуточный. Число сперматогоний типа А достигает 12,6±0,36,
промежуточных дифференцирующихся сперматогоний - 7,3+0,42. Число клеток
Сертоли уменьшается до 20,2+0,58 (фото 3).
Канальцы кроликов 7-недельного возраста представлены тремя типами
сперматогоний: тип А (10,7+0,32), промежуточный (8,7±0,52) и В (6,6±0,36).
Происходит дальнейшая физиологическая гибель (апоптоз) некоторого числа
клеток Сертоли (13,6+0,45) (фото 4).
С 10-и недельного возраста в семенных канальцах визуализируются
сперматоциты первого порядка (11,2±0,47) (фото 5), а с 3,5 месяцев сперматоциты второго порядка (13,9±0,70) и сперматиды (22,4±0,89) (фото 6).
В канальцах кроликов 5,5-месячного возраста сперматогенные клетки
достигают уровня развития поздних грушевидных сперматид и зрелых спермиев
(фото 7). Число клеток сперматогенного эпителия в этом возрасте колеблется в
следующих пределах: сперматогоний типа А - 5,2±0,41, промежуточные 4,6±0,28, тип В - 4,4±0,28; сперматоциты первого порядка - 65,8±0,94 и второго 18,9±0,37, сперматиды - 72,4+0,52, спермии - 51,5±0,61 и клетки Сертоли 7,2±0,58.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
7
В возрасте 6-ти и 12-ти месяцев (фото 8) число клеток слерматогенного
эпителия значительно не изменяется, и, соответственно, составляет:
сперматогонии типа А - 4,7±0,ЗЭ и 4,8+0,38, промежуточные - 4,4±0,31 и 5,0+0,38,
тип В - 3,9+0,65 и 3,7+0,32, сперматоциты первого порядка - 65,8+0,72 и
65,9+0,80, второго - 19,2±0,44 и 18,8±0,44, сперматиды - 76,1±0,89 и 74,5±0,61,
спермии - 91,1±0,71 и 91,4+0,59 и клетки Сертоли - 6,7±0,27 и 6,4±0,45.
Данные о распределении клеток сперматогенного эпителия семенников
кроликов в динамике представлены на рисунке 3.
возраст
|
I
Рис. 3. Морфологический состав клеток сперматогенного
эпителия семенных канальцев кроликов в динамике.1 - сперматогонии, 2 сперматоциты 1-го порядка, 3 - сперматоциты 2-го порядка, 4 - сперматиды,
5 - спермии, 6 • клетки Сертоли.
Как проиллюстрировано на рисунке 3, в возрасте 6-11 недель
сперматогонии являются основным типом клеток семенных канальцев самцов
кроликов. Максимальное их число выявляется в семенниках кроликов в возрасте
9 недель. С 10-и недельного возраста в семенных канальцах визуализируются
сперматоциты первого порядка, а с 3,5 месяцев - сперматоциты второго порядка
и сперматиды. В возрасте 5,5 месяцев в семенных канальцах кроликов впервые
выявляются спермии, число которых увеличивается к достижению животными
возраста 6-и месяцев и остается практически неизменным в возрасте 12-и
месяцев.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Морфологическая характеристика тканей семенников у разновозрастных
кроликов представлена в таблице 1. Из данных таблицы 1, следует, что в
период с 10-и дневного до 12-и недельного возраста наблюдается относительно
постоянное число семенных канальцев на единице площади ткани семенника
при постепенном увеличении среднего числа клеток на поперечном срезе
канальца с 28,3 до 56,9. В последующий интервал с 3,5 до 6 месяцев,
соответствующий периоду полового созревания, отмечается уменьшение числа
семенных канальцев с 142,9 до 30,6 на 1 мм2.
Табл. 1. Морфологическая характеристика тканей семенников.
Возраст
кроликов
10 дн
14 дн
21 дн
30 дн
5нед
бнед
7нед
8нед
9нед
Юнед
11 нед
12нед
3,5 мес
4мес
4,5 мес
| 5 мес
| 5,5 мес
6 мес
12 мес
Среднее число
семенных
канальцев
на 1 мм , п
208,2+0,34
179,6±0,44
165,3±0,33
159,2±0,44
159.2+Д38
173,5±0,36
169,4±0,44
179,6±0,41
183,7±0,35
165,3+0,40
161,2+0,29
167,3+0,34
142,9±0,38
104,1+0,40
95,9±0,32
87,7+0,39
65,3+0,26
30,6+0,17
|
28,6±0,17
Среднее число клеток Доля сперматогенной
ткани в семенном
сперматогенного
эпителия в семенном
канальце, %
канальце, п
28,3+0,59
61,3±0,088
61,7+0,088
30,1 ±0,93
61,0±0,089
33,2±0,91
61,0+0,089
36,3±1,05
40,1±1,04
65,8±0,086
68,0±0,085
37,8±0,51
39,6+0,77
63,3±0,088
40,7±1,35
61,3±0,088
40,1±1,02
62,5+0,088
51,8+1,42
63,7+0,087
56,5±1,33
60,2+0,089
56,9±1,26
56,8±0,090
101,7±1,35
58,8±0,089
116,2±1,83
56,8±0,090
163,1+1,5
56,5+0,090
163,9±1,62
58,1±0,090
230,0±1,76
58,8±0,089
271,9±0,98
53,0±0,091
270,5±1,26
55,5±0,090
Эти изменения вызваны увеличением числа клеток сперматогенного
эпителия в канальцах, и, как следствие, увеличением объема канальцев. Доля
сперматогенной ткани у исследуемых возрастных групп кроликов значительно
не изменяется.
Существенное внимание в наших исследованиях было уделено СКС,
относящимся к дифференцирующимся сперматогониям типа А. Как показано на
рисунке 4, с 10-ти дневного до 4-х недельного возраста сперматогонии типа А
являются единственным типом сперматогонии, имеющихся в семенных
канальцах кроликов.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
9
возраст
Рис. 4. Распределение сперматогонии разных типов на поперечных
срезах семенных канальцев разновозрастных кроликов.
Их число в зависимости от возраста варьирует и достигает максимального
значения в возрасте 4-х недель (в среднем 13,1 клеток). С 5-недельного
возраста происходит уменьшение числа сперматогонии типа А (12,6) и к 6-ти
месяцам уменьшается в 2,7 раза по сравнению с 4-х недельным возрастом.
Сперматогонии промежуточного типа и типа В идентифицируются в семенниках
кроликов, начиная с 5-и и 7-и недель, соответственно.
3.1.2.
Определение относительного количества ДНК ядер клеток
сперматогенного эпителия.
Одной из задач проведенных исследований было определение
относительного количества ДНК ядер клеток сперматогенного эпителия у
разновозрастных самцов-кроликов. Этот показатель является критерием
пролиферативной
активности
клеток.
Ядра
клеток
семенников
характеризовались различными величинами относительного количества ДНК.
В результате экспериментов было установлено (рисунок 5), что
относительное количество ДНК ядер клеток сперматогенного эпителия самцов в
возрасте от 10 дней до 9 недель заметно увеличивается: у сперматогонии типа
А в 1,5 раз (от 589 до 884) и с 5 недель у промежуточного типа -1,9 раз (от 326
до 634).
Для этих типов клеток в 9-недельном возрасте содержание ДНК является
максимальными, что говорит о высокой пролиферативной активности клеток.
Относительная плотность сперматогонии тта В от 7 до 9-недельного возраста
изменяется незначительно (от 292 до 328), а в 3,5 месяца достигает
максимальной величины (547,8+0,4).
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
10
Содержание ДНК в клетках Сертоли с 10-дневного до 8-недельного
возраста снижается от 422,8±0,3 до 272,3±0,6, а к 9-неделям увеличивается в
1,6 раз, по сравнению с предшествующим периодом.
При анализе рисунка 5 выявлено, что в 4-месячном возрасте наибольшей
пролиферативной активности достигают показатели сперматоцитов первого
порядка и клеток Сертоли, соответственно, 499,4+0,5 и 708,3±0,4.
дней дней день нед.
нед.
нед,
•"О^Спермат.типа А
I ~*~Сперматоциты 1 порядка
[ ""
Спермии
нед.
мед.
нед.
нед.
нед.
кед.
мес.
~*~Спермат. промеж.типа
>•'**Сперматоциты 2 порядка
— *-Клатки Сертоли
мес.
мес.
мес. мес.
мес
мес.
* "Спермат. типа В
~*""Слерматиды
Рис. 5. Показатели относительного количества ДНК ядер клеток
сперматогенного эпителия у разновозрастных самцов-кроликов.
С 5,5-месячного возраста в семенных канальцах представлены все типы
клеток сперматогенного эпителия. В этом возрасте отмечена наибольшая
пролиферативная активность сперматоцитоа второго порядка (432,1±0,4). В 6 и
12 месяцев показатели относительного количества ДНК ядер сперматид
(43,9+0,9 и 40,5+0,7) и спермиев (58,9±0,8 и 59,4±0,5) являются наименьшими.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
11
Фото 1. Семенные канальцы 10-дневного кролика. 1 - первичные
половые клетки (гоноциты), 2 - клетка Сертоли. Фиксация: жидкость Бузна.
Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: объектив х40, окуляр х15.
Фото 2. Семенные канальцы 30-дневного кролика. 1 - сперматогония,
2 - клетка Сертоли. Фиксация: жидкость Бузна. Окраска: гематоксилин-эозин.
Увеличение: объектив х40, окуляр х15.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
12
Фото 3. Семенные канальцы 5-недельного кролика. 1 - сперматогония
типа А, 2 - сперматогония промежуточного типа, 3 - клетка Сертоли.
Фиксация: жидкость Буэна. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение:
объектив х40, окулярх15.
Фото 4. Семенные канальцы 7-недельного кролика. 1 - сперматогония
типа А, 2- сперматогония промежуточного типа, 3 - сперматогония типа В,
4 - клетка Сертоли. Фиксация: жидкость Буэна. Окраска: гематоксилин-эозин.
Увеличение: объектив х40, окуляр х15.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Фото 5. Семенные канальцы 10-недельного кролика. 1
сперматогония типа А, 2 - сперматогония промежуточного типа, 3 сперматогония типа В, 4 - сперматоцит 1 порядка, 5 - клетка Сертоли.
Фиксация: жидкость Буэна. Окраска: гематоксипин-зозин. Увеличение:
объектив х40, окуляр х15.
Фото 6. Семенные канальцы 3,5-месячного кролика. 1
сперматогония, 2 - сперматоцит 1 порядка, 3 - сперматоцит 2 порядка, 4 сперматида, 5 - клетка Сертоли. Фиксация: жидкость Буэна. Окраска:
гематоксилин-эозин. Увеличение: объектив х40, окуляр х15.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
14
Фото 7. Семенные канальцы 5,5-месячного кролика.
1 - сперматогония, 2 - сперматоцит 1 порядка, 3 - сперматоцит 2 порядка, 4 сперматида, 5 - спермии, 6 - клетка Сертоли. Фиксация: жидкость Буэна.
Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: объектив х40, окуляр х15.
УТЯ
ш
1
A
W"%*
Фото 8. Семенные канальцы 12-месячного кролика. 1 сперматогония, 2 - сперматоцит 1 порядка, 3 - сперматоцит 2 порядка, 4 •
сперматида, 5 - спермии, 6 - клетка Сертоли. Фиксация: жидкость Буэна.
Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение: объектив х40, окуляр х15.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
IS
Фото 9. Срезы семенников кроликов при иммуногистохимических
исследованиях (контроль). Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение:
объектив х40, окуляр х10.
(Г
*>
«i
г.* V. -</
j-
"t' V M
••
' -£«№*•.'•
'
-
"
.
.
•
•
'
•
> ' '
'•'
Фото 10. Срезы семенников кроликов с трансформированными
клетками (опыт, 7 день). В семенном канальце 2 трансформированных
сперматогония (клетки указаны стрелками). Окраска гематоксилин-эозин.
Увеличение: объектив х40, окуляр х10.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
16
Фото 11. Срезы семенников кроликов с трансформированными
клетками (опыт, 7 день). В семенном канальце 3 трансформированных
сперматогония (клетки указаны стрелками). Окраска гематоксилин-эозин.
Увеличение: объектив х40, окуляр х10.
Фото 12. Срезы семенников кроликов с трансформированными
клетками (опыт, 7 день). В центре семенной каналец с 3-я
трансформированными сперматогониями. В левом верхнем углу 4-и
трансформированные клетки и нижнем - 1 (клетки указаны стрелками).
Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение: объектив х40, окуляр х15.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
17
Фото 13. Срезы семенников кроликов при иммуногистохимических
исследованиях (контроль). Окраска гематоксилин-эозин. Увеличение:
объектив х40, окуляр х10.
Фото 14. Срезы семенников кроликов с трансформированными
клетками (опыт, 7 день). В семенном канальце один трансформированный
сперматогоний (клетки указны стрелками). Окраска гематоксилин-эозин.
Увеличение: объектив х40, окуляр х10.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
18
Фото 15. Срезы семенников кроликов с трансформированными
клетками (опыт, 14 день). В семенном канальце 2 трансформированных
сперматогония (клетки указаны стрелками). Окраска гематоксилин-эозин.
Увеличение: объектив х40, окуляр хЮ.
Фото 16. Срезы семенников кроликов с трансформированными
клетками (опыт, 14 день). В семенном канальце 3 трансформированных
сперматогония (клетки указаны стрелками). Окраска гематоксилин-эозин.
Увеличение: объектив х40, окуляр хЮ.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
19
3.2. Получение
семенников кроликов.
и
характеристика
культуры
клеток
тканей
Экспериментальными данными было установлено, что возраст от 10-и
дней до 9-и недель является оптимальным для проведения различных
биоинженерных манипуляций у кроликов, так как в этот период генеративные
клетки семенных канальцев представлены только сперматогониями и
наблюдается их наиболее высокая пролиферативная активность. Именно,
поэтому, в результате проведенных исследований была изучена культура
клеток семенников, полученная от самцов в возрасте 8 недель в трех
последовательных пассажах.
При анализе клеточной популяции были выявлены пять типов клеток,
отличающиеся по морфологии: половые клетки - сперматогонии округлой
формы с крупным сферическим ядром и достаточно узкой цитоплазмой, клетки
Сертоли неправильной формы с крупным ядром и размытой формой
цитоплазмы,
клетки
Лейдига
неправильной
формы,
а
также
фибробластоподобные клетки, имеющие веретенообразную форму и маленькие
сферические миоидные клетки.
В зависимости от пассажа процентное отношение клеток в культуре тканей
семенников изменялось (рисунок 6). Наиболее многочисленной группой клеток
культуры семенников в трех пассажах были клетки Сертоли. В третьем пассаже
по сравнению с первым, значительно увеличилось число фибробластоподобных
клеток - в 3 раза. Клетки Лейдига и миоидные клетки в третьем пассаже
отсутствовали.
Рис. 6. Число клеток культуры семенников в зависимости от
пассажа, %. КС • клетки Сертоли, КЛ - клетки Лейдига.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
20
Было установлено, что в процессе культивирования происходила
постепенная утеря сперматогонии. Так, если в первом пассаже на их долю
приходилось 29%, то в третьем пассаже их число уменьшилось в 6 раз. По всей
видимости, для поддержания сперматогонии в культуре требуется введение в
среды дополнительных ростовых факторов.
3.3. Трансфекция клеток семенников кроликов ретровирусными
векторными системами in vivo.
Следующим этапом в работе явилось изучение эффективности
генетической трансформации половых клеток семенников кроликов in vivo. С
этой целью были сформированы группы животных в зависимости от
используемой генной конструкции и типа ретровирусного препарата
(культуральная жидкость или клетки-упаковщицы) (таблица 2).
Табл. 2. Инъецирование ретровирусных векторных систем в
семенники кроликов in vivo.
Генная конструкция
Группа
Препарат
Количество животных
Возраст
Линия клеток-упаковщиц
Объем суспензии, мл
Концентрация клеток
pX-RSVhGH
2
1
«Ж
кк
3
3
9-10 нед
9-10 нед
AM 12
АМ12
0,5
0,5
1 млн
10s КОЕ/мл
pX-lns
1
КК
3
8 нед
АМ12
0,5
1 млн
2
КЖ
3
8 нед
АМ12
0,5
10* КОЕ/мл
Анализ наличия трансформированных клеток проводили через 7 и 14 дней
после инъекции с использованием иммуногистохимических исследований.
3.3.1. Изучение эффективности генетической трансформации клеток
семенников кроликов in vivo генной конструкцией pX-RSVhGH.
При анализе интеграции рекомбинантной генной конструкции, содержащей
гормон роста человека (hGH), in vivo положительные сигналы наблюдались в
пробах тканей семенников, отобранных от самцов через 7 дней. В
гистологических срезах семенников, отобранных от кроликов, которым вводили
супернатант и у животных на 14 день после инъекции, клеток с характерным
красно-коричневым окрашиванием выявлено не было.
В образцах срезов семенников, взятых от животных первой группы (7-ой
день после инъекции): положительные сигналы были обнаружены в 12 из 20
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
21
проанализированных срезах. Число трансформированных клеток в одном
семенном канальце колебалось от 1 до 4 (фото 9-12). Число окрашенных
сперматогонии, встречающихся на одном срезе, достигало 11.
При иммуногистохимических исследованиях гистосрезов семенников
кроликов трансформированными были только сперматогонии. Ни в одном из
семенных канальцев не было выявлено трансформированных клеток Сертоли.
По всей видимости, это связано с активной пролиферацией сперматогонии в
этот период и, наоборот, с низкой пролиферативнои активностью клеток
Сертоли.
Анализ полученных результатов показал, что минимальное число
трансформированных канальцев составило от 0,33±0,03 до 1,85±0,08. Среднее
значение трансформированных канальцев составило 1,17+0,16, в то время как
среднее значение для всех канальцев - 0,70±0,16.
При инфицировании клеток семенников in vivo клетками-упаковщицами,
продуцирующими рекомбинантный ретровирус pX-RSVhGH, максимальная
величина частоты генетической трансформации сперматогонии составила 5,8%,
минимальная -1,9%.
Согласно результатам, представленным в таблице 3, показатель
эффективности
генетической
трансформации
при
использовании
ретровирусного вектора pX-RSVhGH достигал 2,7*10"3.
Табл. 3. Эффективность генетической трансформации клеток
семенников кроликов in vivo генной конструкцией pX-RSVhGH.
1 группа
2 группа
КК
КЖ
Число трансформированных сперматогонии
80
-
Среднее число клеток в семенном канальце
48,6
-
Число семенных канальцев на срезе
605,0
Показатели
-
Общее число клеток на срезе
29,4*10
3
-
Эффективность трансформации клеток
2,7*10"3
-
Полученные нами результаты свидетельствуют о возможности успешной
трансформации клеток семенников кролика in vivo с использованием
ретровирусной генной конструкции pX-RSVhGH, содержащей ген инсулина
человека.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
22
3.3.2. Изучение эффективности генетической трансформации клеток
семенников кроликов in vivo генной конструкцией pX-lns.
Иммуногистохимическое исследование семенников кроликов через 7 и 14
дней после введения генной конструкции инсулина выявило наличие
рекомбинантной ДНК у опытных животных, как при использовании клетокупаковщиц, так и культуральной жидкости.
Через
7
дней
после
инъекции
клеток-упаковщиц
число
трансформированных канальцев колебалось от 0,38 до 1,32%, а при
инфицировании клеток-мишеней вирусным препаратом - от 0,21 до 0,64%.
Результаты, полученные на 14 день составили, соответственно, от 0,50 до
2,59% и от 0,38 до 0,93%.
У самцов на 7 день после инъекции клеток-упаковщиц соответствующее
окрашивание клеток наблюдалось в 9-и из 20-и проанализированных срезах.
Число трансформированных клеток в одном семенном канальце варьировало от
1 до 3 (фото 13-16). В одном из срезов были выявлены 7 окрашенных
сперматогоний в разных канальцах. При инъецировании супернатанта очаги
окрашивания наблюдались в 4-х срезах, при этом число трансформированных
клеток в одном семенном канальце варьировало от 1 до 2.
Анализ, проведенный через 14 дней после инъекции, показал наличие
трансформированных сперматогоний при введении клеток-упаковщиц в 9-и
срезах из 20. При этом в одном из срезов было обнаружено 14
трансформированных клеток. При введении культуральной жидкости
наибольшее число окрашенных клеток на одном срезе составляло 5.
Максимальная частота интеграции сперматогоний в трансформированных
семенных канальцах через 7 дней после инъекции клеток-упаковщиц достигала
4,1+0,1%, минимальная - 3,2±0,1%. Показатели частоты интеграции при
использовании супернатанта варьировали от 3,4±0,1 до 4,0+0,1%. В результате
данных, полученных через 14 дней, были выявлены колебания частоты
интеграции сперматогоний при генетической трансформации клеткамиупаковщицами от 3,3±0,1 до 4,0+0,1%. При инфицировании клеток-мишеней
вирусным препаратом
максимальная
величина составила
3,5±0,1%,
минимальная -3,3+0,1%.
Сравнительный анализ эффективности трансформации клеток семенников
кроликов in vivo при использовании вектора, содержащего ген инсулина, выявил
различия в способности клеток, упаковывающих рекомбинантный ретровирус,
инфицировать клетки-мишени в зависимости от используемого вирусного
препарата.
Как следует из данных таблицы 4, инъекция клеток, упаковывающих
ретровирусные векторы, в семенники кроликов обуславливала более высокую
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
23
частоту генетической трансформации по сравнению с использованием
культу ральной жидкости.
В результате проведенных экспериментов было установлено, что число
трансформированных сперматогоний при практически одинаковом среднем
числе клеток в семенных канальцах при инъецировании клеток-упаковщиц, как
на 7 (33 клетки), так и на 14 день (67 клеток) после инъекции было в 3 раза
выше, чем при использовании супернатанта (соответственно, 11 и 23 клетки).
Табл. 4. Показатели частоты генетической трансформации
клеток-мишеней генной конструкцией pX-lns.
через 7 дней
Параметры
через 14 дней
1 группа
2 группа
1 группа
2 группа
КК
КЖ
КК
КЖ
33
11
67
23
Среднее число клеток в семенных
канальцах
29,4
28,3
29,3
29,2
Среднее число семенных
канальцев на срезе
497,9
535,4
559,1
517,7
16,4*103
4,1*10"*
15,1*103
1,5*10""
Число трансформированных
сперматогоний
Общее число клеток на срезе
Эффективность трансформации
3
14,6*10
15,2*10°
1
2,26*1 (Г
3
0,72*1 (Г
Так, при использовании клеток-упаковщиц на 7 день эффективность
трансформации клеток семенников кроликов первой группы составила 2,26*10"3
и, была в 3,1 раза выше, по сравнению с показателем, полученным при
инъекции культуральной жидкости (0,72*10"3).
На 14 день после инъекции, частота генетической трансформации при
использовании клеток-упаковщиц составила 4,1*10"3, что было в 2,7 раз выше по
сравнению с использованием супернатанта (1,5*10'3).
Анализ полученных данных в зависимости от времени после инъекции
показал, что частота генетической трансформации была неодинаковой и
увеличивалась к 14 дню в 1,8 раз при использовании клеток-упаковщиц и 2,0
раза при введении культуральной жидкости. Эффективность трансформации
сперматогоний происходила за счет увеличения их числа, что еще раз
доказывает наиболее высокую пролиферативную активность этого типа клеток и
способность инфицирования именно стволовых клеток сперматогоний.
Таким образом, полученные данные позволяют считать наиболее
эффективным введение экзогенной ДНК в виде клеток-упаковщиц, так как при
его использовании получен лучший результат.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
24
3.3.3.
Сравнительный
анализ
эффективности
генетической
трансформации клеток семенников кроликов in vivo при использовании
генных конструкций pX-RSVhGH и pX-lns.
Сравнительный анализ эффективности генетической трансформации
клеток семенников кроликов в зависимости от генной конструкции показал, что
вектор, несущий ген инсулина человека, оказался наиболее способным при
переносе ДНК в половые клетки кроликов, по сравнению с вектором, несущим
ген гормона роста человека (таблица 5).
Так, на 14 день после инъекции клеток-упаковщиц pX-RSVhGH,
трансформации сперматогоний не наблюдалось ни в одном из семенных
канальцев. Напротив, при использовании линии клеток-упаковщиц pX-lns,
интеграция генных конструкций в клетках семенников была выявлена, как на 7,
так и на 14 день после введения. При инъекции в семенники культуральной
жидкости pX-RSVhGH трансформации клеток вообще не наблюдалось.
Хотя частота интеграции генной конструкции pX-RSVhGH в сперматогоний
кроликов in vivo была ниже по сравнению с pX-lns (3,0% и 3,5%), но частота
генетической трансформации, наоборот, была выше на 17,3%, что
обуславливалось увеличением числа трансформированных канальцев, как на
трансформированных, так и на всех срезах, соответственно, в 2,2 и в 1,6 раза.
Табл. 5. Сравнительный анализ эффективности генетической
трансформации клеток семенников кролика In vivo генными
конструкциями pX-RSVhGH upX-lns.
Частота интеграции*, %
pX-RSVhGH
pX-lns
Группы животных
KK
КЖ
7дн.
14 дн. 7дн.
14 дн.
3,0
3,5
3,6
3,4
3,5
Число трансформиров.
канальцев от числа
канальцев во всех срезах, %
pX-RSVhGH
0,70
-
-
-
pX-lns
0,32
0,63
0,08
0,22
1,16
-
-
-
0,71
1,36
0,41
0,62
Показатели
Конструкция
Число трансформиров.
pX-RSVhGH
канальцев от числа канальцев
в трансформ, срезах, %
pX-lns
Общая эффективность
(частота генетической
трансформации)
pX-RSVhGH
pX-lns
2,7*10"3
3
-
3
-3
2,3*10" 4,1*10" 0,7*10
1,5*10"3
* число трансформированных клеток от числа клеток в трансформ.
канальцах, выраженное в %.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
25
Сопоставляя данные об общей эффективности генной конструкции pX-lns
на 7-ой и 14-ый дни после инъекции, следует отметить увеличение частоты
генетической трансформации на 14-ый день после инъекции в 1,8-2,1 раза, что
при практически равной частоте интеграции было обусловлено увеличением
доли трансформированных канальцев на срезах.
Таким
образом, полученные
нами данные
показывают,
что
эффективность генетической трансформации клеток семенников кроликов
зависит от генной конструкции, типа используемого препарата и времени после
инъекции в семенники.
ВЫВОДЫ.
1. Установлено, что в период с 14-и дневного до 12-и недельного возраста
наблюдается относительно постоянное число семенных канальцев на единице
площади ткани семенника (от 159,2±0,38 до 183,7±0,35 на 1 мм2) при
постепенном увеличении среднего числа клеток на поперечном срезе канальца
с 28,3±0,59 до 56,9±1,26. В возрасте от 3,5 до 6 мес. происходит уменьшение
числа семенных канальцев с 142,9±0,38 до 30,6+0,17 на 1 мм2. Эти изменения
вызваны увеличением числа клеток сперматогенного эпителия в канальцах от
101,7±1,35 до 271,9±0,98. Доля сперматогенной ткани у исследуемых
возрастных групп кроликов значительно не изменяется.
2. Показано, что в возрасте от 10 дней до 4-х недель в семенных
канальцах кроликов наряду с клетками Сертоли присутствует единственный тип
генеративных клеток - сперматогонии типа А. В зависимости от возраста их
число варьирует и достигает максимального значения в возрасте 4-х недель (в
среднем 13,1+0,55 клеток в 1 канальце). Наибольшее число сперматогонии
промежуточного типа отмечается в возрасте 6-и недель (9,2±0,47), а типа В - в
11 недель (11,4±0,59). С 10-и недельного возраста в семенных канальцах
визуализируются сперматоциты первого порядка, а с 3,5 месяцев сперматоциты второго порядка и сперматиды. Максимальное число
сперматоцитов первого порядка наблюдается в возрасте 5,5-6 месяцев
(65,8±0,94). Число сперматоцитов второго порядка и сперматид достигает
максимальных значений в 6-и месячном возрасте (соответственно, 19,2+0,44,
76,1±0,89). В возрасте 5,5 месяцев в семенных канальцах кроликов впервые
выявляются спермин, число которых увеличивается к 6-и месячному возрасту
(91,1+0,71) и остается практически неизменным
в возрасте 12 месяцев
(91,4+0,59).
3. Выявлено, что оптимальным периодом для проведения генноинженерных исследований является возраст от 10 дней до 9 недель, когда
сперматогонии являются единственным типом генеративных клеток в семенных
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
26
канальцах самцов кроликов. Максимальное число сперматогоний отмечается в
период 8-9 недель, когда на их долю приходится, соответственно, 65,7 и 71,3%.
Установлено, что в период от 10 дней до 9 недель сперматогоний
характеризуются наибольшей пролиферативной активностью, что является
одним из определяющих факторов для успешного переноса генов посредством
рекомбинантных ретровирусных векторов.
4. В результате исследований полученной и охарактеризованной нами
первичной культуры клеток семенников кроликов в возрасте 8-и недель,
установлено, что в процессе культивирования
происходит
потеря
сперматогоний. Если на их долю в первом пассаже приходится 29,2%, то в
третьем пассаже их число снижается в 6 раз и составляет 1,8%. Показано, что
частота генетической трансформации первичной культуры клеток семенников in
vitro при использовании клеток-упаковщиц была ниже З.СПО"4.
5. Выполнена трансформация сперматогоний кролика in vivo генными
конструкциями pX-lns и pX-RSVhGH, несущими, соответственно, гены инсулина
и гормона роста человека. Клетки, трансформированные pX-RSVhGH,
выявлялись только на 7-ой день после инъекции клеток-упаковщиц в семенники
кроликов с частотой 2,7*103. Частота генетической трансформации
сперматогоний вектором pX-lns на 7-ой день после введения клеток-упаковщиц
или культуральной жидкости составляла, соответственно, 2,3*10"3 и 0,7*10'3.
Показано увеличение эффективности трансформации сперматогоний кролика на
14-ый день после инъекции в 1,8-2,1 раза, соответственно, до 4,1*10"3и 1,5*10"3.
Полученные результаты свидетельствуют о возможности успешного внедрения
генных конструкций в сперматогоний кролика in vivo посредством
рекомбинантных ретровирусов.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
Для получения оптимальных результатов по генетической трансформации
сперматогоний кролика при генно-инженерных исследованиях рекомендуем
использовать самцов в возрасте от 10-и дней до 9-и недель, когда в семенных
канальцах семенников присутствует наибольшее число клеток этого типа и
отмечается их наиболее высокая пролиферативная активность.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
27
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ.
1. Ендовицкая И.П. (Новгородова И.П.). Гистологические исследования
сперматогенеза кроликов // материалы международной научно-практической
конференции
по
проблеме;
«Повышение
конкурентоспособности
животноводства и задачи кадрового обеспечения». - РАМЖ, п. Быково. - 2003 г. В.9.-С.173-174.
2. Ендовицкая
И.П.
(Новгородова
И.П.).
Изучение
развития
сперматогенеза у кроликов // Материалы 52-ой научной конференции молодых
ученых и аспирантов: «Молодые ученые - животноводству страны». - ВИЖ, п.
Дубровицы. - 2004. - С.62-64.
3. Ендовицкая И.П. (Новгородова И.П.), Изучение сперматогенеза
кроликов Oryctolagus cuniculus // 3-я международная научная конференция
«Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных
животных». - ВИЖ, п. Дубровицы. - 2003 г. - С. 106-108.
4. Ендовицкая И.П. (Новгородова И.П.). Изучение сперматогенеза
кроликов посредством анализа гистологических препаратов срезов семенных
канальцев // Школа-практикум: «Методы исследований в биотехнологии
сельскохозяйственных животных». - ВИЖ, п. Дубровицы. - 2003 г. - В.2. - С.27-34.
5. Ендовицкая И.П. (Новгородова И.П.), Л.К. Эрнст. Использование
спермиев и сперматогоний в получении трансгенных животных // Достижения
науки и техники АПК. - 2003 г. - №10. - С.20-23.
6. Ендовицкая И.П. (Новгородова И.П.), Зиновьева Н.А., Эрнст Л.К.
Эффективность трансформации сперматогоний у кроликов // Материалы
междунар. научно-практической конферен. к 75-летию ВИЖа: «Прошлое,
настоящее и будущее зоотехнической науки / Труды ВИЖа. - В.62. - Т.З. Дубровицы. - 2004. - С. 180-185.
Copyright ОАО «ЦКБ «БИБКОМ» & ООО «Aгентство Kнига-Cервис»
Издательство РУЦ ЭБТЖ
142132, Московская обл.. Подольский р-н, л. Дубровицы
Тел. (8-27) 65-14-07, 65-14-24
Сдано в набор 2.09.2004
Заказ N» 2 3 Тираж 100 эхз.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
11
Размер файла
761 Кб
Теги
кроликов, клеток, генной, характеристика, инженерная, исследование, половых, мишеней, 4975, семенников
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа