close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

2839

код для вставкиСкачать
???????????????????? ????????
ISSN 0131-6397
????????????????????
????????
?2/2014
(1-128)
?????? 70804
ISSN 0131-6397
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
??????????
????????
????????????????????
????
????????????????????
????????
?????
????????
????????
?2/2014
?2
2014
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
??????????
????????
????????????????????
????
????????????????????
????????
??????-?????????????
??????
???????
? ??????
1966 ????
?????
????????
????????
????? ??????? ??? ???? ? ???
?2
???? ? ??????
2014 ??????
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, № 2
СОДЕРЖАНИЕ
ОБЗОРЫ, ПРОБЛЕМЫ
Косовский Г.Ю., Корниенко Е.В., Глазко В.И. Соматическое клонирование млекопитающих: достижения, возможности, препятствия (обзор) . . . . . .
Мифтахутдинов А.В. Экспериментальные подходы к диагностике стрессов в птицеводстве (обзор) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Победнов Ю.А., Косолапов В.М. Биологические основы силосования и сенажирования трав (обзор) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Зиновьева Н.А., Мелерзанов А.В., Петерсен Е.В. и др. Использование трансгенных GAL-KO свиней в ксенотрансплантации: проблемы и перспективы .
Михайленко И.М. Автоматизированные системы управления здоровьем животных как стратегическая основа оптимизации воспроизводства в молочном
скотоводстве. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
3
20
31
42
50
РЕПРОДУКТИВНАЯ БИОЛОГИЯ
Амерханов Х.А., Абилов А.И., Ескин Г.В. и др. Содержание тестостерона и холестерина в сыворотке крови у быков-производителей в зависимости от типа
продуктивности, возраста и сезона года . . . . . . . . . . . . .
Смирнова Е.В., Нежданов А.Г., Рецкий М.И. и др. Метаболический профиль беременных коров с разным типом этологической активности . . . . . .
Середа Т.И., Дерхо М.А. Оценка роли аминотрансфераз в формировании продуктивности у кур-несушек . . . . . . . . . . . . . . . . . .
59
67
72
ФИЗИОЛОГИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ
Саруханов В.Я., Конюхов Г.В., Колганов И.М. Подход к оценке радиочувствительности свиней на основании живой массы с применением поправочного
коэффициента . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Мусаханов А.Т. Живая масса у овец казахской мясошерстной породы при сезонном содержании на пастбищах разного типа . . . . . . . . . . .
Еськов Е.К., Еськова М.Д., Спасик С.Е. Температурная зависимость изменения
массы тела и содержания в нем воды у пчел (Apis mellifera L.) при анестезии
диоксидом углерода . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
78
84
89
ВЕТЕРИНАРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ, ВЕТЕРИНАРИЯ
Ленченко Е.М., Мансурова Е.А., Моторыгин А.В. Характеристика токсигенности
энтеробактерий, выделенных при желудочно-кишечных болезнях сельскохозяйственных животных . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Шахов А.Г., Сашнина Л.Ю., Федосов Д.В. и др. Формирование кишечного микробиоценоза у телят с синдромом гипотрофии в молочный период . . .
Соболев В.Е., Жданов С.И. Цистит как вероятный этиологический фактор синдрома недержания мочи у соболей . . . . . . . . . . . . . . .
94
105
112
КОРМОПРОИЗВОДСТВО: БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ И
ТЕХНОЛОГИИ
Парахин Н.В., Осин А.А., М.В. Донская и др. Повышение продуктивности и качества семян сои за счет интенсификации азотфиксации . . . . . . .
Виличко А.К., Барышнев Ю.П., Судаков В.Л. Оборудование и технология производства витаминного зеленого корма . . . . . . . . . . . . . .
Новые книги
71, 77, 88, 104,
Научные собрания
19, 41,
118
123
126
117
Консорциум «КОНТЕКСТУМ», созданный ООО «Агентство
«Книга-Сервис», ОАО «Центральный коллектор библиотек
«БИБКОМ», ОАО «АРЗИ». «КОНТЕКСТУМ», призван решать задачи, связанные с переходом на цифровые форматы.
Информационная технология «КОНТЕКСТУМ» внедряется на базе информационнобиблиотечного и/или издательского комплекса и не требует дополнительных затрат на создание программно-аппаратной и материально-технической базы (за исключением наличия
широкополосного доступа к сети Интернет). Внедрение технологии, а также обучение
пользователей осуществляется выездными бригадами исполнителя.
В рамках консорциума разработан Национальный цифровой ресурс
«РУКОНТ»© ? межотраслевая электронная библиотека на базе технологии «КОНТЕКСТУМ» (всего 155 018 произведений).
Контакты и информация: http://rucont.ru, [email protected]
127
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
SEL?SKOKHOZYAISTVENNAYA BIOLOGIYA
[AGRICULTURAL BIOLOGY], 2014, № 2
CONTENTS
Kosovsky G.Yu., Kornienko E.V., Glazko V.I. Aspects of somatic cloning in mammalian
species: achievements, opportunities, and obstacles (review) . . . . . . .
Miftakhutdinov A.V. Experimental approaches to stress diagnostics in poultry (review)
Pobednov Yu.A., Kosolapov V.M. Biological bases of grass silage and haylage making
(review) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Zinovieva N.A., Melerzanov A.V., Petersen E.V. et al. Application of GAL-KO transgenic pigs in xenotransplantation: problems and prospects for the future . . .
Mikhailenko I.M. Computerized animal health control as the basic strategy to optimize reproduction in dairy livestock . . . . . . . . . . . . . . .
Amerkhanov Kh.A., Abilov A.I., Eskin G.V. Concentration of testosterone and cholesterol in blood serum of servicing bulls depending on their type of productivity,
age and the season . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Smirnova E.V., Nezhdanov A.G., Retsky M.I. et al. The metabolic profile of late
pregnant cows of various ethological activity types . . . . . . . . . . .
Sereda Т.I., Derkho M.A. The role of aminotrasferase activity in hen productivity . .
Sarukhanov V.Ya., Konyukhov G.V., Kolganov I.M. Estimation of radiosensitivity in pigs
using body weight and an adjusting coefficient . . . . . . . . . . . .
Musakhanov A.T. Seasonal parameters of the Kazakh meat-wool sheep body weight
under different pasturing . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Eskov E.K., Eskova M.D., Spasik S.E. Influence of temperature on body weight and
water content in honey bees (Apis mellifera L.) under an anesthesia with carbon
dioxide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Lenchenko E.M., Mansurova E.A., Motorygin A.V. Characterization of toxigenic
Enterobacteriaceae from farm animals with gastrointestinal diseases . . . . .
Shakhov A.G., Sashina L.Yu., Fedosov D.V. Intestinal microbiosis in hypotrophic milkfed calves . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
Sobolev V.E., Zhdanov S.I. Cystitis: an etiological factor for syndrome of urinary
incontinence in fur bearing animals . . . . . . . . . . . . . . .
Parakhin N.V., Osin Al.A., Donskaya M.V. et al. Elevation of soybean productivity and
grain quality due to intensification of nitrogen fixation . . . . . . . . .
Vilichko A.K., Baryshnev Yu.P., Sudakov V.L. Equipment and technology for
production of vitamin green fodder . . . . . . . . . . . . . . . .
3
20
31
42
50
59
67
72
78
84
89
94
105
112
118
123
ОАО «АГЕНТСТВО ПО РАСПРОСТРАНЕНИЮ
ЗАРУБЕЖНЫХ ИЗДАНИЙ»
Создано 1 октября 1963 года с целью дальнейшего улучшения распространения зарубежных газет и журналов и повышения качества операций, связанных с экспортом советской печати за границу.
Агентство осуществляет доставку и экспедирование печатной продукции по разным системам
распространения по России, странам СНГ и дальнего зарубежья c любого срока с соблюдением всех таможенных формальностей.
Накопленный опыт работы в области распространения периодических изданий через подписные каталоги и в розницу, автоматизированная система сбора и обработки заказов и квалифицированный персонал позволяют Агентству осуществлять комплексное обслуживание
Издателей и подписчиков. Агентство осуществляет прием подписки на журналы и газеты через Интернет-каталог.
ОАО «АРЗИ» (совместно с ООО «Агентство «Книга-Сервис» и ОАО «Центральный коллектор библиотек «БИБКОМ») ? партнер консорциума «КОНТЕКСТУМ», в рамках которого разработан Национальный цифровой ресурс «РУКОНТ»© ? межотраслевая электронная библиотека.
НАШ АДРЕС:
107996 г. Москва, ГСП, И-110
Протопоповский переулок
дом 19, корпус 17
128
Тел.: (495) 680-89-87, (495) 680-90-88
Факс: (495) 631-62-55
http://www.arzi.ru, [email protected],
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
РЕДАКЦИОННЫЙ СОВЕТ
В.И. ФИСИНИН (Москва, Россия) ? председатель (биология животных)
АЛЕКСАХИН Р.М. (Обнинск, Россия)
БАГИРОВ В.А. (Москва, Россия)
БОРИСОВА Е.М. (Москва, Россия)
БРЕМ Г. (Вена, Австрия)
ЕГОРОВ И.А. (Сергиев Посад, Россия)
ЗИНОВЬЕВА Н.А. (Дубровицы, Россия)
КАЛЬНИЦКИЙ Б.Д. (Боровск, Россия)
КОСОЛАПОВ В.М. (Лобня, Россия)
ЛАПТЕВ Г.Ю. (С.-Петербург, Россия)
ЛЮШЕН ХУАН (Китай)
ПАНИН А.Н. (Москва, Россия)
САМУЙЛЕНКО А.Я. (Щелково, Россия)
СКРЯБИН К.Г. (Москва, Россия)
СМИРНОВ А.М. (Москва, Россия)
СУРАЙ П.Ф. (Айр, Великобритания)
ФЕДОРОВ Ю.Н. (Москва, Россия)
ФЕДОРОВА Л.М. (главный редактор)
(Москва, Россия)
ШЕВЕЛЕВ Н.С. (Москва, Россия)
Журнал входит в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий в Российской Федерации (Перечень ВАК), в которых должны быть опубликованы основные научные
результаты диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук (по агрономии и лесному хозяйству, а также по биологическим наукам).
Научные редакторы Е.В. КАРАСЕВА, Л.М. ФЕДОРОВА
Корректор М.Л. ГЕНИНГ
Адрес редакции: 127434 г. Москва, Дмитровское ш., д. 11, офис 343
Телефон/факс: + 7 (499) 977-88-19, + 7 (499) 976-32-73
E-mail: [email protected] Сайт в Интернете: http://www.agrobiology.ru
Учредитель ? Российская академия сельскохозяйственных наук
Рег. № 01019 от 23 апреля 1992 года Министерства печати и информации РФ
Типография ФГУП «Агронаучсервис» Россельхозакадемии: 115598 г. Москва, ул. Ягодная, д. 12
Формат 70Ч108 1/16. Печать офсетная. Заказ
EDITORIAL BOARD
V.I. FISININ (Sergiev Posad, Russia) ? Chairman (animal biology)
ALEKSAKHIN R.M. (Obninsk, Russia)
BAGIROV V.A. (Moscow, Russia)
BORISOVA E.M. (Moscow, Russia)
BREM G. (Vienna, Austria)
EGOROV I.A. (Sergiev Posad, Russia)
FEDOROV Yu.N. (Moscow, Russia)
FEDOROVA L.M. (editor-in-chief)
(Moscow, Russia)
KALNITSKY B.D. (Borovsk, Russia)
KOSOLAPOV V.M. (Lobnya, Russia)
LAPTEV G.Yu. (St. Petersburg, Russia)
LUSHENG HUANG (China)
PANIN A.N. (Moscow, Russia)
SAMUILENKO A.Ya. (Shchelkovo, Russia)
SKRYABIN K.G. (Moscow, Russia)
SMIRNOV A.M. (Moscow, Russia)
SURAI P.F. (Ayr, Scotland, UK)
SHEVELEV N.S. (Moscow, Russia)
ZINOVIEVA N.A. (Dubrovitsy, Russia)
Address: build. 11, office 343, Dmitrovskoe sh., Moscow, 127434 Russia
Tel/fax: + 7 (499) 977-88-19, + 7 (499) 976-32-73
E-mail: [email protected] Internet: http://www.agrobiology.ru
Для цитирования: Сельскохозяйственная биология,
Sel?skokhozyaistvennaya biologiya, Agricultural Biology
© «Сельскохозяйственная биология», 2014
© Agricultural Biology, 2014
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, № 2, с. 3-19
Обзоры, проблемы
УДК 636.082:573.6.086.83
СОМАТИЧЕСКОЕ КЛОНИРОВАНИЕ МЛЕКОПИТАЮЩИХ:
ДОСТИЖЕНИЯ, ВОЗМОЖНОСТИ, ПРЕПЯТСТВИЯ
(обзор)
Г.Ю. КОСОВСКИЙ, Е.В. КОРНИЕНКО, В.И. ГЛАЗКО
Выполнен анализ результативности соматического клонирования у разных видов животных. Представлены данные о молекулярных механизмах и генетических событиях при клонировании и репрограммировании, о химерности клонов по митохондриальной ДНК и ее возможных
последствиях при внутри- и межвидовом клонировании. Обсуждаются основные проблемы, связанные с методическими трудностями, низкой эффективностью метода, большими потерями материала на всех этапах эмбрионального, натального и постнатального развития. В настоящее
время соматическое клонирование прежде всего рассматривается как возможность быстро и надежно зафиксировать в потомстве уникальные особенности особей, которые имеют хозяйственно
ценное или любое другое значение и/или могут быть утрачены из-за рекомбинаций при обычном
способе воспроизведения животных либо их исчезновении. Метод позволяет использовать любые
сочетания селекционных и трансгенных технологий: направленное встраивание in vitro, клеточный отбор и перенос ядра. Наиболее важной сферой применения обсуждаемого подхода должно
стать сельское хозяйство. Однако при неоспоримых выгодах, которые сулит клонирование при
ядерном переносе, и растущем числе успешных клонирований и клонов млекопитающих коммерческое использование этого метода пока что ограничено чрезвычайно низкой эффективностью, высокой затратностью и большими потерями материала. К тому же молекулярные и клеточные механизмы событий, происходящих при соматическом клонировании, сложны, специфичны и требуют дальнейшего углубленного изучения. Все перечисленное вынуждает исследователей, вопервых, искать более эффективные альтернативные подходы, во-вторых, сосредоточить внимание
на элементах методики, требующих совершенствования. Тем не менее, несмотря на все еще низкую эффективность (3-5 %) и меньшую распространенность метода по сравнению с прогнозами,
клонированные животные постепенно становятся неотъемлемой частью сельского хозяйства в
США и Европе. Технология соматического клонирования предоставляет большие возможности
для фундаментальных исследований генетических процессов, функциональной активности генома,
клеточной дифференцировки и пр. Широкие перспективы, открывающиеся благодаря внедрению
методик клонирования в сельскохозяйственную практику и медицину, должны получить всестороннюю морально-этическую оценку, чтобы исключить спекулятивные настроения как у сторонников,
так и у противников клонирования.
Ключевые слова: клон, соматическое клонирование, энуклеированные яйцеклетки, репрограммирование, тотипотентность, плюрипотентность, эбриональные стволовые клетки.
В ХХ веке соматическое клонирование рассматривали в качестве
подхода, обещающего общебиологический прорыв в решении многих задач в медицине (регенеративные технологии, замена поврежденных органов и тканей), в сельском хозяйстве (массовое получение высокопродуктивных животных), и даже как основу методов приобретения личного бессмертия. Большинство проектов по-прежнему нуждаются в дальнейших
научных исследованиях, но в отдельных областях уже накоплены определенные успехи. Активно развивается новое направление, когда трансгенные животные сельскохозяйственных видов становятся идеальными «биореакторами» по производству фармакологически важных белков человека
(1). Несмотря на то, что в роли биореактора крупный рогатый скот проигрывает по сравнению с козами и кроликами из-за длительного периода
полового созревания и беременности, получение в этих целях трансгенных
коров имеет очевидные преимущества вследствие несопоставимо больших,
чем у других видов млекопитающих, общих удоев (6-8 тыс. л за лактацию).
Рекомбинантные белки, необходимые для лечения человека и животных, к настоящему времени получают в основном с использованием
3
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
генетически модифицированных клеточных популяций млекопитающих (2).
Однако такой подход существенно дороже, чем использование животных
сельскохозяйственных видов (в 10-100 раз в расчете на 1 кг целевого продукта) (1). Важное значение приобретает необходимость разработки простых
и дешевых приемов создания подобных биореакторов в связи с проблемами
иммунотерапии некоторых онкологических заболеваний человека (3), инфекционных заболеваний у сельскохозяйственных животных (4). С учетом
огромной потребности в рекомбинантных белках в медицине и ветеринарии
интенсификация этих исследований требует особого внимания.
В этой области к настоящему времени сложились и развиваются
два направления ? получение трансгенной спермы с ее последующей
трансплантацией в семенники облученных животных (5) и трансплантация
ядер из генетически модифицированных клеточных популяций в энуклеированные яйцеклетки. Каждый из этих методов пока что имеет ряд недостатков и требует усовершенствований, чем обусловлена необходимость
дальнейших исследований.
Опыты по клонированию млекопитающих при помощи пересадки
ядер соматических клеток (somatic cell nuclear transfer ? SCNT) с использованием энуклеированных ооцитов в качестве цитопластов начались в
середине 1970-х годов на мышах как модельном объекте. Инициировали
их постановку эксперименты с химерами (6-8). Первые пересадки показали, что у млекопитающих в отличие от земноводных потеря тотипотентности происходит на очень ранних стадиях: у мышей ? 8 клеток (9, 10), у
овец (11) и коров (12) ? примерно 16 или 32 клеток (13). Несмотря на все
еще низкую эффективность метода (3-5 %) и его ограниченную (по сравнению с прогнозами) распространенность (14), клонированные животные
постепенно становятся неотъемлемой частью сельского хозяйства в США
(15) и Европе (16).
Значительным достижением в клонировании млекопитающих считается получение клона овец (пяти идентичных животных), при котором
донорами ядер были клетки линии TNT4 из 9-суточного зародыша овцы
(17). Из пяти родившихся ягнят двое погибли вскоре после рождения, третий ? на 10-е сут, двое оставшихся достигли 8-9-месячного возраста. Анализ микросателлитных маркеров подтвердил происхождение всех особей
от клеточной линии TNT4. Затем было опубликовано знаменитое сообщение I. Wilmut с соавт. о рождении овцы Долли (18). Работа методически во
многом повторяла предыдущее исследование, однако в ней использовали
три типа клеточных культур ? эмбриональные клетки, фибробластоподобные клетки плода и клетки молочной железы от 6-летней овцы породы
Finn Dorset, находящейся на последнем триместре беременности. Все три
типа клеточных культур имели нормальный кариотип овцы (n = 54).
Клетки ? доноры ядер пассировали в культуре, деление останавливали на
стадии G0 и ядра клеток пересаживали, используя электрослияние, в энуклеированные ооциты на стадии метафазы II. В варианте с культурой клеток молочной железы в качестве донора ядер выход морул/бластоцист был
примерно в 3 раза меньше, выход живых ягнят от числа пересаженных в
матку окончательного реципиента морул/бластоцист ? в 2 раза ниже. Всего в этой серии из 277 реконструированных яйцеклеток получили одного
живого ягненка, что указывает на очень низкую результативность (0,36 %).
Микросателлитный анализ ДНК у семи родившихся живыми ягнят подтвердил, что все три использованных типа клеточных культур способны
быть донорами ядер при клонировании. Из реконструированной яйцеклетки c ядром от культивируемой клетки молочной железы была получе4
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
на овца по кличке Долли, которая фенотипически не отличалась от овцыдонора ядра.
Успех авторов этой работы прежде всего связан с использованием
относительно длительного культивирования клеток: в результате многих
пассажей (от 3-6 до 7-9) могли быть отобраны малодифференцированные
стволовые клетки, ставшие донорами ядер. Большое значение имел, повидимому, и тот факт, что авторы синхронизировали стадии клеточного
цикла энуклеированных ооцитов-реципиентов и клеток-доноров. Предварительно они установили, что лучше пересаживать ядра донорских клеток, находящихся на стадии G1, в энуклеированные ооциты на стадии метафазы
II, поскольку слияние цитопласта с кариопластом, индуцируемое электрическим импульсом, активирует дробление энуклеированного ооцита (19).
В связи с возможными последствиями использования ядер соматических клеток взрослого организма возник вопрос о длине теломерных
участков и экспрессии теломеразы у клонов. Укорачивание теломер, представляющих собой длинные гексануклеотидные повторы (ТТАGGG)n на
концах хромосом млекопитающих, происходит при репликации ДНК и
служит одной из структурных характеристик ДНК, меняющихся в большинстве делящихся in vivo и in vitro клетках. Теломеры играют важную
роль в обеспечении стабильности, репликации и сегрегации хромосом в
митозе. Систематические потери теломерных последовательностей, составляющие 50-200 п.н. на каждое деление, могут приводить к «митотической катастрофе» (20). Достигая критической длины, теломера утрачивает
способность связываться со специальным белковым комплексом, защищающим концы линейных хромосом от межхромосомных слияний, что
приводит к разрушению генетического аппарата клетки. Однако клетки
способны синтезировать копии ТТАGGG-последовательности de novo благодаря работе фермента теломеразы, обладающей активностью РНК-зависимой ДНК-полимеразы. Теломераза экспрессируется в быстро пролиферирующих клетках (эмбриональные и некоторые генеративные), ее активность существенно увеличивается в индуцированных плюрипотентных клетках, однако не обнаруживается в большинстве соматических клеток (21).
Определение средней длины теломерного повтора у овцы Долли
(перенос ядра соматической клетки от 6-летней овцы), и двух других
(трансплантация ядер из клеток 9-суточного эмбриона и фибробластов
25-суточного плода) показало (22), что у всех клонированных особей она
была меньше, чем у контрольных животных того же возраста (у Долли в
возрасте 1 года ? на 20 % короче, оставаясь, однако, несколько больше,
чем в клетках молочной железы 6-летней овцы). Предполагается, что такая длина повторов у Долли обусловлена не только физиологическим возрастом животного-донора, но и продолжительностью культивирования донорских клеток in vitro. Показано, что состав культуральных сред также
влияет на длину теломер: клеточные пассажи в обедненной среде снижают
теломеразную активность на 30-50 % (23). Укорочение теломер наблюдалось при культивировании in vitro в клетках эмбриональных фибробластов
крупного рогатого скота и в стволовых эмбриональных клетках на поздних
этапах пассирования (24).
Большинство аномалий у клонируемых эмбрионов обусловлены
ускоренным ростом плода и плаценты, получившим название синдрома
крупных потомков (large offspring syndrome ? LOS) (25). Предполагается,
что он может быть связан с изменением эпигенетической регуляции импринтируемых генов при репрограммировании ядра соматической клетки
в энуклеированном эмбрионе. Действительно, у гибридных эмбрионов,
5
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
полученных от скрещиваний Bos indicus и B. taurus (что позволяло дифференцировать аллели по межвидовым различиям по SNP ? single nucleotide
polymorphism), после SCNT обнаруживается гипометилирование генов ?
мишеней импринтинга, и их экспрессия по обоим аллелям, что наглядно
подтверждает гипотезу о нарушении репрограммирования генетического
аппарата соматических ядер при трансплантации в энуклеированный ооцит
(26). При сравнительном анализе профилей генной экспрессии у эмбрионов, полученных методом SCNT и при оплодотворении ооцитов in vitro,
обнаружены множественные отличия по генам, продукты которых участвуют в клеточной адгезии, внутриклеточном транспорте, протеолизе, контроле клеточного цикла. В частности, изменена экспрессия импринтируемых генов, ассоциация которых с контролем клеточной пролиферации и
плацентомегалией выявлены у человека. Наблюдаемые изменения, как полагают, лежат в основе формирования различных патологий развития у
клонируемых эмбрионов (25). При получении эмбрионов методом SCTN
наблюдается медленная замена формы линкерного гистона H1 хроматина
соматических клеток на эмбриональную, что также связывают с нарушением репрограммирования при такой трансплантации ядер, в частности у
крупного рогатого скота (27).
В качестве маркера репрограммирования (дефект рисунка метилирования) рассматривали метилирование CpG сайтов в ?-сателлите (asatI-5)
крупного рогатого скота в процессе развития эмбрионов, полученных в
результате искусственного осеменения (AI), оплодотворения in vitro (IVF)
и методом SCNT. В клетка-донорах и бластоцистах, полученных методом
SCNT, метилирование по asatI-5 было существенно выше, чем в бластоцистах после IVF. При имплантации не наблюдали различий по метилированию asatI-5 в тканях трофобласта между вариантами SCNT и AI, однако
сами эмбрионы, полученные при SCNT, были гиперметилированными по
сравнению с контролем (AI) в этот период развития. После имплантации
ДНК-метилирование по asatI-5 уменьшалось в тканях плаценты у эмбрионов при AI, но не у полученных методом SCNT. В отличие от плаценты,
доля метилированных сайтов по asatI-5 оставалась высокой в тканях надпочечников, почек и в мышечной ткани в процессе развития эмбрионов.
У эмбрионов, полученных разными методами, в среднем различия по степени метилирования между тканями были меньше, чем между плацентами, однако сохранялось сравнительно избыточное метилирование в соматических тканях эмбрионов, полученных с помощью SCNT. Авторы полагают, что повышенный уровень метилирования в бластоцистах в варианте
с SCNT и в последующем в соматических тканях этих эмбрионов может
быть обусловлен либо тем, что соответствующие изменения еще не успели
произойти, либо отсутствием такого количества специифических факторов
в цитопластах ооцитов, которое необходимо для полноценного репрограммирования хроматина соматических клеток (28). Дефекты репрограммирования генетического аппарата рассматривают в качестве основной
причины низкой эффективности клонирования посредством трансплантации ядер соматических клеток в энуклеированные яйцеклетки (28).
Предполагается, что подбор более щадящих методов получения
энуклеированных ооцитов (29), их криоконсервации (30), систем культивирования эмбрионов при SCNT (31) может способствовать уменьшению
дефектов развития и повышению эффективности метода SCNT при получении полноценных животных сельскохозяйственных видов (в частности,
крупного рогатого скота) (32).
Следует отметить, что фетальные фибробласты, используемые в
6
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
подобных экспериментах, обычно претерпевают при культивировании около 30 делений, что ограничивает возможности их генетической модификации. Для преодоления проблем клеточного старения применяли повторное
клонирование: эмбрионы, развившиеся после переноса измененных ядер,
в свою очередь, использовались для получения второго поколения фетальных трансформированных фибробластов в культуре (32). Эти фетальные
клетки тоже могли претерпевать 30 клеточных делений в культуре и подвергаться второй генетической модификации.
Успеху генетических модификаций способствовала разработка методов гомологичной рекомбинации (homologous recombination ? HR, или
адресная инсерция генов ? gene-targeting, впервые осуществлена в середине 1980-х годов). С использованием эмбриональных стволовых клеточных линий (ES) и HR были созданы более 800 линий лабораторных мышей с наследуемыми изменениями, включая особей с «выбитыми» (knockouts) и «вставленными» (knock-ins) генами и тонкими генными мутациями.
Такие мыши служат моделями в исследованиях болезней человека и проблем иммунологии, генетики развития, онкогенетики, структурно-функциональной организации определенных генов. После появления овцы Долли
стало понятно, что имеющееся ограничение на получение ES клеток у домашних животных может быть снято посредством соматического клонирования и домашние животные могут использоваться в тех же исследованиях, что и линии лабораторных мышей.
Получены данные о преодолении ограничения жизни первичных
культур клеток домашних животных и успехе адресной инсерции (вставки)
гена в определенный геномный участок с помощью гомологичной рекомбинации в первичных культурах клеток овец и свиней (33). Сначала селективный маркерный ген адресовали посредством инсерции в определенный
локус в фибробластах овцы, затем трансген, несущий ?-1-антитрипсин под
контролем промотора гена ?-лактоглобулина овцы был встроен в комбинации с маркерным геном в тот же локус. Частота рекомбинаций оказалась очень высока: 66 % клеточных клонов содержали инсерцию трансгена. В результате получили двух живых ягнят (Cupid и Diana), которые были первыми клонированными овцами с адресованным трансгеном. Авторы
добились успеха и при направленном повреждении гена ?-1,3-галактозилтрансферазы в соматических клетках свиньи с использованием гомологичной рекомбинации. Такие клетки могут использоваться при трансплантации ядер с целью получения особей, клетки которых лишены остатков сахара Gal-?-1,3-Gal, что связано с возможностью преодоления гиперострого отторжения ксеногенных трансплантатов тканей.
Достигнуты успехи в использовании адресных модификаций для
повышения продукции трансгенных белков. Ряд компаний разработали и
применяют методики по получению терапевтически важных для человека
белков, секретируемых в молоко коров, овец, коз, кроликов (1).
В последние годы появились новые методы «редактирования» генома (вариантов адресного мутагенеза). В этих целях используют, например, сайт-специфичные домены белков ? активаторов транскрипции,
объединенные с нуклеазами, связывающихся с определенными участками
ДНК (34).
Наиболее важными факторами, определяющими успешность клонирования, в настоящее время считают тип клеток-доноров и происхождение ткани, синхронизацию стадии клеточного цикла клеток-доноров,
степень дифференцировки, условия культивирования, способность к пролиферации, хромосомную стабильность и эпигенетический статус клеток7
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
доноров (35). Однако вопрос о точном влиянии всего этого, а также типе
клеток, наиболее подходящем для трансплантации ядер, остается не выясненным (36). Из-за противоречивости данных пока нельзя с очевидностью
утверждать, что возраст донора и длительность культивирования клеток in
vitro сказываются на их компетентности. Возможно, такая неоднозначность обусловлена тем, что в исследованиях по клонированию применяют
разные типы клеток, протоколы их приготовления, способы ядерного переноса и активации, культуральные системы.
В дифференцировку трансплантированного ядра в энуклеированном
ооците вовлечены линкерные гистоны, поликомбинированные группы протеинов, CpG-связанные протеины и другие агенты, осуществляющие специализированную репрессию хроматина (37). Репрограммирование трансплантированного ядра, как полагают, связано с метилированием и деметилированием ДНК, регулирующим генную экспрессию (38), и координирующие изменения в организации хроматина, происходящие после ядерного переноса во время первых клеточных делений, необходимы для успешного клонирования (39).
Помимо решения биотехнологических задач, соматическое клонирование позволяет подбирать интересные сочетания ядерного и митохондриального генотипов, поскольку в результате его использования получаются химерные организмы. У овцы Долли, клонированной с использованием линии соматических клеток, и у девяти овец, полученных при ядерном переносе от зародышевых клеток, митохондриальная ДНК принадлежала почти исключительно реципиентным энуклеированным ооцитам с некоторым вкладом от соответствующих донорских клеток. Таким образом,
будучи настоящими ядерными клонами, эти особи все-таки представляли
собой генетические химеры с ядерной ДНК клетки-донора и митохондриальной ДНК реципиентных ооцитов (40). В реконструированном эмбрионе митохондриальная ДНК клетки-донора достаточно быстро исчезает
(частично или полностью) уже на ранних стадиях эмбриогенеза (41).
Внутривидовое скрещивание с использованием методов клонирования может быть способом подбора интересных комбинаций наследственного ядерного и митохондриального материала для создания новых пород у домашних животных (42). Такого рода комбинирование возможно и
на межвидовом уровне. В частности, показано (43), что цитопласт метафазного ооцита коровы при пересадке донорских ядер от животных разных видов в состоянии обеспечивать нормальную клеточную пролиферацию ооцита (во всяком случае до стадии бластоцисты). У млекопитающих
механизмы, регулирующие ранний эмбриогенез, консервативны, и цитопласт коровы в состоянии обеспечивать пролиферацию инкорпорированного дифференцированного ядра с набором хромосом донорской клетки.
Однако при переносе ядер соматических клеток гяура в энуклеированные ооциты крупного рогатого скота было обнаружено, что распределение митохондрий клеток ? доноров ядер у эмбрионов варьирует, что
может сказываться на их выживаемости и, вероятно, зависит от михондриона как яйцеклеток, полученных от разных коров, так и клеток-доноров, то есть от внутривидовой изменчивости митохондриона. Предполагается, что генетическая гетерогенность митохондриальных клонов и взаимодействия между ними могут влиять на выживаемость межвидовых эмбрионов, получаемых методом SCNT (44).
У крупного рогатого скота клонирование на основе трансплантации диплоидных ядер соматических клеток в энуклеированную яйцеклетку, несмотря на большую сложность, остается актуальным и перспектив8
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ным направлением биотехнологии. Наряду с возможностью сохранения
ценных генотипов и ускорения селекции, немаловажно то, что отпадает
необходимость проверки эмбрионов по полу.
Интенсивные работы по клонированию крупного рогатого скота
начались в 1980-х годах. В это время в США была даже создана аграрная
компания «Granada», специализировавшаяся на клонировании быстро растущих коров, однако из-за убытков вследствие того, что не удалось преодолеть синдром крупноплодия ? LOS, она вскоре прекратила деятельность. Несмотря на низкую эффективность метода, с тех пор число клонированных коров растет.
Генетические манипуляции со стволовыми зародышевыми клетками революционизировали генетические исследования. Так, на мышах использование стволовых эмбриональных клеток (ES) на поздних пассажах
клеточной линии R1 позволило получить жизнеспособное потомство (45).
Причем in vitro 29 % реконструированных ооцитов достигли стадии бластула/морула, а из 8 % от суррогатных матерей были получены новорожденные. Уже на стадии клеточного цикла G1-G2 ядра ES клеток оказались
способными обеспечить развитие реконструированной клетки. У млекопитающих сельскохозяйственных видов получение эмбриональных стволовых
клеточных линий, доступных для генно-инженерных манипуляций в культуре, крайне затруднено, вследствие чего альтернативным подходом служит
технология переноса (клонирования) ядер из культивируемых клеток взрослого организма в яйцеклетки. Например, у коров число клонов, полученных с его помощью, составляет свыше 300 гол. Более успешно и распространено клонирование с использованием ядер клеток женской репродуктивной системы: эпителиальных клеток молочной железы, кумулюсных
клеток, эпителия яйцеводов (46).
Наряду с расширением спектра клеток-доноров, используемых в
SCNT крупного рогатого скота, изучают способность ядер клеток от животных разных возрастных категорий обеспечивать полное репрограммирование. Одно из условий ядерного репрограммирования ? удаление модификаций, которым подвергался хроматин при дифференцировке и делении клетки. Ооциты млекопитающих могут восстанавливать эти изменения до состояния тотипотентности, что позволяет получать жизнеспособное потомство из ядер соматических клеток. Неполное генетическое репрограммирование генной экспрессии, связанное с частичным восстановлением структуры хроматина, приводит к нарушениями и аномалиям, наблюдаемым у клонированных эмбрионов, зародышей, новорожденных.
Жизнеспособные клоны с полным репрограммированием ядер получили с использованием фибробластов, эмбриональных клеток, клеток
взрослых животных (47-50). Доля успешно клонированных особей в варианте с клетками-донорами от взрослых животных (14 %) оказалась близкой к описанной для фетальных клеток (15 %) (47) и фолликулярных клеток (10 %) (49). В экспериментах Y. Kato с соавт. (49) родились восемь
телочек (четыре умерли почти сразу после рождения вследствие пневмонии, асфиксии от избытка амниотической жидкости, задержки родов). При
этом доля реконструированных яйцеклеток, которые развились до бластоцист, для кумулюсных клеток составила 49 %, для клеток яйцеводов ?
23 %. Эти значения выше, чем для бластоцист, которые получали ранее
при трансплантации ядер из фетальных фибробластов в энуклеированные
яйцеклетки (12 %). Возможно, клетки кумулюса обеспечивают максимальную совместимость ядра с цитоплазмой в образованной конструкции: их отростки способны проникать через зону пеллюцида и контактировать с ци9
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
топлазмой ооцита, что обеспечивает перенос молекул между ними и ооцитом. Как следствие, цитоплазматическое содержимое у клеток кумулюса и
ооцитов может быть наиболее сходным, чем и объясняется повышение
эффективности трансплантации при переносе кумулюсных ядер в энуклеированные зиготы.
Описано влияние продолжительности культивирования in vitro на
эффективность клонирования. Так, клон (6 телят) получен из фибробластов (ткань уха) 17-летнего быка японской черной мясной породы после
их длительного (3 мес) культивирования in vitro до переноса ядер (50).
Физиологическое состояние и число пассажей в культуре в значительной
степени влияли на успешность клонирования (скорость развития эмбрионов в варианте с клетками-донорами после 10-15 пассажей была выше, чем после 5 пассажей). Как и в случае SCNT у овец, предварительное
голодание клеток стало важным условием успешной трансплантации ядер.
Авторы этой работы предположили, что уменьшение эффективности клонирования при использовании клеток 5-го пассажа связано с тем, что в
этом пассаже в культуре, кроме фибробластов, еще присутствуют другие
типы клеток, например эпителиальные клетки, непригодные для клонирования, которые впоследствии вытесняются фибробластами. Как и в более
ранних экспериментах, продолжительность беременности и масса при рождении у клонированных телят оказались выше (соответственно на 9 сут и
20 %), чем в среднем по породе (50).
Согласно этим данным, фибробласты взрослых животных могут
длительно поддерживаться в культуре без утраты способности формировать клоны при ядерной трансплантации (3 мес, или 15 пассажей и 45 клеточных удвоений). Такой период достаточен для направленной генетической модификации и дальнейшей селекции клеток. В то же время в работе
D.S. Tsapali с соавт. (51) показано, что ядра от первично культивируемых
клеток взрослого животного репрограммировались успешнее, тогда как
материал, взятый из перевиваемых клеточных линий, оказался не в состоянии обеспечить развитие эмбрионов. В этой же работе наличие строгой обратной зависимости между возрастом in vivo и пролиферативной
способностью in vitro показано пока только для фибробластов человека,
полученных от донора старше 100 лет.
После удачно клонированных мышей, овец и коров появились
трансгенные козы, полученные трансплантацией ядер из трансгенных клеток плода по протоколу, разработанному для овец (35). Эмбрионы, от которых выделяли клеточные линии, получали при скрещивании нетрансгенной самки с самцом, трансгенным по гену антитромбина (AT) III человека, определяющему высокий уровень экспрессии AT человека в молоке
у лактирующих самок. Фетальные соматические клеточные линии из 3540-суточных эмбрионов подвергали старению в условиях голодания. Трансплантация ядер этих клеток в энуклеированные ооциты привела к рождению трех козлят на 230 реконструированных эмбрионов (1,3 %), которые
оказались самками. У одной из них гормонально индуцировали лактацию
и в молоке обнаружили секрецию белка человека (3,7-5,8 г/л), что сопоставимо с экспрессией AT у генно-модифицированных овец при естественном скрещивании (52).
Несмотря на интенсивные исследования, предельное значение эффективности (около 2 %) пока остается одной из проблем при SCNT у коз.
В течение последних 15 лет в мире получены клоны разных видов
животных: свиней (53), коров (54, 55), собак (56), кошек (57), мышей (58),
крыс (59), кроликов (60), лошадей (61), мулов (62), верблюдов (63), коз
10
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
(64), оленей (65) и рыб (66), и все это время неизменно поднимаются
вопросы морального, этического, медицинского и законодательного характера, связанные с применением метода (67). Перенос ядер соматических клеток (SCNT) с генетической точки зрения не приводит к появлению истинных клонов как донора яйцеклеток (у клона отсутствует ядерная ДНК такой особи), так и донора ядерного материала (в большинстве
случаев основная часть митохондриальной ДНК клона принадлежит цитопласту) (68).
Эффективность метода SCNT варьирует от 0,1-3,0 % (у мышей)
(69) до 4,0-8,0 % (у крупного рогатого скота) (70, 71). Низкая эффективность клонирования с использованием соматических клеток, как правило,
связана с большими потерями в первой половине беременности. Хотя
уменьшение потерь во время беременности и высокий процент выживших
клонов отмечали ранее при использовании ядер клеток эпителия яйцевода
(24, 32), эти положительные достижения нивелировались высокой смертностью новорожденных (50 %).
Соматический перенос ядра у животных сопряжен с вероятностью
появления нежелательных осложнений постэмбрионального развития, связанной с тем, что клетки взрослых организмов, используемые в качестве
донорских, сами по себе могут иметь мутации. Клоны, полученные от таких клеток, чаще абортируются на поздних стадиях беременности, а у телят, родившихся в срок, чаще встречались аномалии по сравнению с клонами, произошедшими из зародышевых или фетальных клеток (50, 72).
Помимо этого, наблюдалась высокая смертность клонированных телят в
первые месяцы жизни (73, 74). Описаны также случаи отдаленных эффектов при соматическом клонировании. Так, теленок, у которого источником ядерной ДНК были клетки эмбриона, погиб на 51-е сут после рождения от тяжелой анемии, вызванной тимической атрофией и лимфоидной
гипоплазией (75).
Для выяснения возможных причин высокой смертности среди
клонированных телят в период внутриутробного развития и после рождения изучили экспрессию трех важных в метаболическом отношении ферментов ? лактатдегидрогеназы, цитратсинтетазы и фосфофруктокиназы,
но отклонений от нормы не выявили (76). В работе других авторов (77) в
большинстве смертных случаев доказано наличие плацентарных аномалий
на протяжении 1-3-го триместра внутриутробного развития у клонированных бычьих зародышей, полученных при переносе ядер соматических клеток в энуклеированные ооциты. Авторы полагают, что причинами этих
аномалий могут быть особенности васкулярного и плацентарного роста,
что повлияло на прикрепление плода и способность плаценты обеспечивать его жизнеспособность. Было также показано (78), что условия культивирования донорских клеток in vitro в дальнейшем существенно влияют
на развитие органов и тканей. В работе использовали 6-суточные овечьи
зиготы, которые извлекали и поддерживали в комбинированных культурах. У 23 % зародышей, полученных при сокультивировании с гранулезными клетками, наблюдали полигидрамниоз (увеличение объема амниотической жидкости), однако подобный эффект не отмечали при культивировании тех же клеток в синтетических жидких средах с различными добавками. У мышей, амфибий и коров при использовании эмбрионов, полученных посредством переноса соматических ядер, для создания последующих поколений животных-клонов потомство оказалось жизнеспособным после 3-5 раундов клонирования. Более высокие фетальные потери и
уменьшение числа беременностей отмечали у особей из 2-го и 3-го поко11
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
лений клонированных животных (79).
Тем не менее, несмотря на отсутствие существенного увеличения
эффективности соматического клонирования и то, что часть популяции
клонированных эмбрионов заведомо несет ряд нарушений, клоны могут
успешно развиваться после трансплантации реципиентам и приводить к
рождению относительно здорового потомства. Следует также учитывать,
что при клонировании перенос ядер из взрослой соматической клетки
может вызывать некоторые отклонения от нормы, не носящие, однако,
серьезного характера. Так, у мышей, полученных посредством переноса
ядер кумулюсных клеток, постнатальная масса оказалась значительно выше,
чем у контрольных животных, а результаты тестирования на поведенческие
характеристики оказались близкими у особей обеих групп (80).
Разработан ряд подходов, которые, возможно, позволят повысить
эффективность соматического клонирования. Один из них заключается в
выборе оптимального метода энуклеации ооцита. К наиболее простым
следует отнести «слепую» энуклеацию, которую применяют при клонировании кроликов, овец, коз, крупного рогатого скота, свиней и лошадей (81).
Определение точного времени выделения первого полярного тельца у ооцитов, культивируемых in vitro (16-18 ч после начала дозревания), и удаление
zona pellucida позволили снизить объем аспирируемой ооплазмы до 3 % от
общего объема ооцита и повысить эффективность энуклеации до 97 %
(82), однако такие эмбрионы требуют индивидуальной системы культивирования. Несомненное преимущество описанного метода в том, что цитопласт не подвергается дополнительным воздействиям, которые могут в
дальнейшем привести к нарушениям эмбрионального развития. Другой
широко известный метод предполагает окрашивание красителем Hoechst и
УФ-облучение. Процент успешных энуклеаций при этом выше, но уже
при 30 с экспозиции повреждается цитоплазматическая мембрана клетки
и нарушается синтез белков (55, 83). Применяют и такие методы энуклеации, как прокол zona pellucida и удаление выступающей части ооцита с
полярным тельцем (81), использование флуорохромов для окраски ДНК
со спектром поглощения, смещенным в более длинноволновую область
(например, SYBR14) (81), энуклеация со вспомогательными химическими
веществами (например, демиколцином) (84) и при помощи центрифугирования (81).
Еще один подход к повышению эффективности процедуры клонирования предполагает более тщательный отбор эмбрионов с наивысшим
потенциалом развития на этапе, предшествующем трансплантации. Например, в настоящее время к наиболее эффективным системам отбора качественных эмбрионов у крупного рогатого скота относится предложенная S. Sugimura c соавт. (85). Она включает использование прижизненной съемки в реальном времени (time-lapse), устройства для индивидуального культивирования в микролунках и анализа потребления кислорода эмбрионами. Отбор эмбрионов по пяти показателям, включая время
I деления, число бластомеров в конце I деления, наличие или отсутствие
фрагментации в конце I деления, число бластомеров G4-G5 (начало фазы
покоя), потребление кислорода на стадии бластоцисты, позволил получить высокий процент беременностей (78,9 %) после трансплантации. У
родившихся телят не наблюдали увеличения массы тела, характерного
для животных, полученных при помощи SCNT, и высокой смертности в
начальный период жизни. Предложенная система отбора, несмотря на
сложность, может стать одним из самых объективных и надежных при
отборе культивируемых in vitro эмбрионов для трансплантации.
12
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
На стадии бластоцисты клонированные эмбрионы млекопитающих
содержат меньшее число клеток, чем развивающиеся in vivo (86). При
этом общее число клеток в бластоцистах при SCNT сравнимо с таковым у
полученных без трансплантации ядер, но отношение числа клеток из внутренней клеточной массы к их общему числу у бластоцист при SCNT значительно выше (86). Число клеток в бластоцисте млекопитающих, культивируемой in vitro, можно увеличить за счет агрегация бластомеров из ранних эмбрионов (87). Так, при SCNT агрегация нескольких мышиных эмбрионов на ранних стадиях развития приводила к 8-кратному увеличению показателей развития после трансплантации (87), на стадии 4 бластомеров ? еще и к увеличению экспрессии мРНК гена Pou5f1 (маркер
недифференцированных клеток) и белка Cdx2, необходимого для формирования плаценты (87, 88). Однако при этом для создания одного клона
требуется большое количество биологического материала.
Качество используемых ооцитов также отражается на эффективности SCNT, поэтому их дозревание in vitro ? важный этап получения эмбрионов. Модификация среды для дозревания, в том числе добавление антиоксидантов и витаминов (например, витамина Е), приводит к увеличению числа формирующихся бластоцист и уменьшению фрагментации
ДНК в клонированных эмбрионах, полученных при использовании ядер
трансгенных доноров (89). Эффективной стратегией улучшения качества
эмбрионов при SCNT может стать использование ооцитов, полученных при
помощи метода «выщипывания» ооцитов (ovum pick-up) (90), дозревших in
vivo (91) или обработанных препаратами, блокирующими мейоз (92).
Перспективным для увеличения эффективности клонирования млекопитающих представляется поиск биомаркеров состояния получаемых
особей. В качестве таких биомаркеров наиболее часто рассматривают активность теломеразы и длину теломеров, эпигенетические модификации,
экспрессию генов и белков (68). Но малые и нерепрезентативные выборки
в большинстве таких исследований, а также то, что для сравнения клонированных и обычных животных используются различные ткани и культуры клеток, приводят к тому, что результаты исследований часто противоречат друг другу и не позволяют установить определенные параметры
оценки (68). Также неоднозначны данные о положительном влиянии обработки эпигенетическими модификаторами на развитие эмбрионов крупного рогатого скота при SCNT (93, 94).
Подводя итог, отметим, что с помощью клонирования посредством
ядерного переноса у сельскохозяйственных животных можно реплицировать большое число особей с преимущественными комбинациями генов,
используя одновременно любые сочетания селекционных методов и трансгенных технологий: направленное встраивание in vitro, клеточный отбор и
перенос ядра. Без клонирования созданные трансгенным способом уникальные сочетания генов легко утрачиваются из-за рекомбинаций. Поэтому очевидно, что наиболее важной сферой применения этого метода должно стать сельское хозяйство. При всех неоспоримых выгодах, которые сулит клонирование при ядерном переносе, чрезвычайно низкая эффективность и большие потери на всех этапах эмбрионального, натального и постнатального развития пока что ограничивают возможности коммерческого
использования этого метода в сельском хозяйстве, что вынуждает исследователей, во-первых, искать более эффективные альтернативные подходы,
во-вторых, сосредоточить внимание на элементах методики, требующих
совершенствования.
Еще одной областью применения соматического клонирования мо13
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
жет быть ДНК-археология (реконструирование вымерших видов или особей
из несколько клеток животных) и сохранение биоразнообразия в связи с
проблемой исчезающих видов. Для этого уже в настоящее время необходимо сформировать и поддерживать банки тканей животных, которым угрожает исчезновение.
Репродуктивное клонирование человека хотя и обсуждается, но
остается (причем не только по этическим соображениям) опасным и соответственно полностью непригодным способом увеличения населения, на
что указывают множественные отклонения от нормы и мертворождения,
сопутствующие репродуктивному клонированию у животных. В то же время клонирование предоставляет на редкость уникальные возможности (получение терапевтических белков, ксенотрансплантация органов от клонированных трансгенных животных с заданными качествами) для борьбы с
заболеваниями человека, а также в случаях искусственного оплодотворения in vitro для преодоления бесплодия, продления возраста материнства
или с целью исключения генетических заболеваний, связанных с митохондриальной ДНК.
Итак, в настоящее время соматическое клонирование прежде всего
рассматривается как возможность быстро и надежно зафиксировать в потомстве уникальные особенности животных, которые имеют хозяйственно
ценное или любое другое значение и/или могут быть утрачены при обычном способе воспроизведения животных либо их исчезновении. Эта технология предоставляет большие возможности для фундаментальных исследований генетических процессов, функциональной активности генома,
клеточной дифференцировки и пр. В то же время молекулярные и клеточные механизмы событий, происходящих при соматическом клонировании,
сложны, специфичны, требуют дальнейшего углубленного изучения, а сама технология все еще имеет низкую эффективность и высокозатратна,
хотя число успешных клонирований и полученных клонов млекопитающих растет. Широкие перспективы, открывающиеся благодаря внедрению
методик клонирования в сельскохозяйственную практику и медицину,
должны быть, тем не менее, всесторонне оценены с морально-этической
точки зрения, поскольку отсутствие такой экспертизы может сделать возможным появление спекулятивных настроений как у сторонников, так и у
противников клонирования.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
14
W a n g Y., Z h a o S., B a i L., F a n J., L i u E. Expression systems and species used for transgenic animal bioreactors. BioMed Res. Int., 2013, ID 580463 (http://dx.doi.org/10.1155/2013/580463).
M a k s i m e n k o O.G., D e y k i n A.V., K h o d a r o v i c h Yu.M., G e o r g i e v P.G.
Use of transgenic animals in biotechnology: prospects and problems. Acta Naturae, 2013,
5(1/16): 33-46.
H a n n a M.G. Cancer vaccines. Are we there yet? Human Vaccines. Immunotherapeutics,
2012, 8(8): 1161-1165.
C o o p e r C.A., G a r a s K l o b a s L.C., M a g a E.A., M u r r a y J.D. Consuming transgenic goats? milk containing the antimicrobial protein lysozyme helps resolve diarrhea in young
pigs. PLoS ONE, 2013, 8(3): e58409.
Z e n g W., T a n g L., B o n d a r e v a A., L u o J., M e g e e S.O., M o d e l s k i M., B l a s h S.,
M e l i c a n D.T., D e s t r e m p e s M.M., O v e r t o n S.A., G a v i n W.G., A y r e s S.,
E c h e l a r d Y., D o b r i n s k i I. Non-viral transfection of goat germline stem cells by nucleofection results in production of transgenic sperm after germ cell transplantation. Mol. Reprod. Dev., 2012, 79(4): 255-261.
M c L a r e n A. Mammalian chimaeras. Cambridge, Cambridge University Press, 1976.
К о н ю х о в Б.В. Межвидовые химеры млекопитающих. Онтогенез, 1985, 16(3): 242-246.
К о н ю х о в Б.В., ? ? ? ? ? ? ? ? ? С.Д., ? ? ? ? ? ? ? ? Б.С. Использование химерных и
трансгенных животных для изучения экспрессии генов в онтогенезе. В сб.: Успехи со-
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
временной генетики. М., 1988: 106-142.
M c G r a t h J., S o l t e r D. Nuclear transplantation in the mouse embryo by microsurgery
and cell fusion. Science, 1983, 220: 1300-1302.
M c G r a t h J., S o l t e r D. Inability of mouse blastomere nuclei transferred to enucleated zygotes to support development in vitro. Science, 1984, 226: 1317-1319.
W i l l a d s e n S.M. Nuclear transplantation in sheep embryos. Nature, 1986, 320: 63-65.
P r a t h e r R.S., B a r n e s F.L., S i m s M.M., R o b l J.M., E y e s t o n e W.H., F i r s t N.L.
Nuclear transplantation in the bovine embryo: assessment of donor nuclei and recipient oocyte.
Biol. Reprod., 1987, 37: 859-866.
M a r x J.L. Cloning sheep and cattle embryos. Science, 1988, 239: 463-464.
F a b e r D.C., F e r r e L.B., M e t z g e r J., R o b l J.M., K a s i n a t h a n P. Agro-economic
impact of cattle cloning. Clon. Stem. Cells, 2004, 6(2): 198-207.
B r o o k s K.R., L u s k J.L. U.S. consumers attitudes toward farm animal cloning. Appetite,
2011, 57(2): 483-492.
M u r p h y C., H e n c h i o n M., M c C a r t h y M., W i l l i a m s G.A. The prospects for acceptance of animal cloning in the European food chain: еarly insights from an Irish sentinel
group. Agr. Bio. Forum, 2011, 14(2): 83-93.
C a m p b e l l K.H., M c W h i r J., R i t c h i e W.A., W i l m u t I. Sheep cloned by nuclear
transfer from a cultured cell line. Nature, 1996, 380(6569): 64-66.
W i l m u t I., S c h n i e k e A.E., M c W h i r J., K i n d A.J., C a m p b e l l K.H. Viable offspring derived from fetal and adult mammalian cells. Nature, 1997, 385(6619): 810-813.
C a m p b e l l K.H.S., R i t c h i e W.A., W i l m u t I. Nuclear?cytoplasmic interactions during
the first cell cycle of nuclear transfer reconstructed bovine embryos: implications for deoxyribonucleic acid replication and development. Biol. Reprod., 1993, 49: 933-942.
H a r l e y C.B. Telomere loss: mitotic clock or genetic time bomb. Mutat. Res., 1991,
256(2-6): 271-282.
W a n g F., Y i n Y., Y e X., L i u K., Z h u H., W a n g L., C h i o u r e a M., O k u k a M.,
J i G., D a n J., Z u o B., L i M., Z h a n g Q., L i u N., C h e n L., Pa n X., G a g o s S.,
K e e f e D. L., L i u L. Molecular insights into the heterogeneity of telomere reprogramming
in induced pluripotent stem cells. Cell Res., 2012, 22: 757-768.
S h i e l s P.G., K i n d A.J., C a m p b e l l K.H., W a d d i n g t o n D., W i l m u t I., C o l m a n A., S c h n i e k e A.E. Analysis of telomer lengths in cloned sheep. Nature, 1999, 399:
316-317.
B e t t s D., B o r d i g n o n V., H i l l J., W i n g e r Q., W e s t h u s i n M., S m i t h L.,
K i n g W. Reprogramming of telomerase activity and rebuilding of telomere length in cloned
cattle. PNAS USA, 2001, 98(3): 1077-1082.
L a n z a R.P., C i b e l l i J.B., B l a c k w e l l C., C r i s t o f a l o V.J., F r a n c i s M.K.,
B a e r l o c h e r G.M., M a k J., S c h e r t z e r M., C h a v e z E.A., S a w y e r N., L a n s d o r p P.M., W e s t M.D. Extension of cell life-span and telomere length in animals cloned
from senescent somatic cells. Science, 2000, 288(5466): 665-669.
M e s q u i t a F.S., M a c h a d o S.A., D r n e v i c h J. Influence of cloning by chromatin
transfer on placental gene expression at day 45 of pregnancy in cattle. Anim. Reprod. Sci.,
2013, 136(4): 231-244.
S m i t h L.C., S u z u k i J. Jr., G o f f A.K., F i l l i o n F., T h e r r i e n J., M u r p h y B.D.,
K o h a n - G h a d r H.R., L e f e b v r e R., B r i s v i l l e A.C., B u c z i n s k i S., F e c t e a u G.,
P e r e c i n F., M e i r e l l e s F.V. Developmental and epigenetic anomalies in cloned cattle.
Reprod. Domest. Anim., 2012, 47(Suppl. 4): 107-114
Y u n Y., Z h a o G.M., W u S.J., L i W., L e i A.M. Replacement of H1 linker histone during bovine somatic cell nuclear transfer. Theriogenology, 2012, 78(6): 1371-1380.
C o u l d r e y C., W e l l s D.N. DNA methylation at a bovine alpha satellite i repeat CpG site
during development following fertilization and somatic cell nuclear transfer. PLoS ONE, 2013,
8(2): e55153.
K i m E.Y., P a r k M.J., P a r k H.Y., No h E.J., N o h E.H., P a r k K.S., L e e J.B.,
J e o n g C.J., R i u K.Z., P a r k S.P. Improved cloning efficiency and developmental potential
in bovine somatic cell nuclear transfer with the oosight imaging system. Cell Reprogram., 2012,
14(4): 305-311.
Z h o u G.B., L i N. Bovine oocytes cryoinjury and how to improve their development following cryopreservation. Anim. Biotechnol., 2013, 24(2): 94-106.
W a n g L.J., X i o n g X.R., Z h a n g H., L i Y.Y., L i Q., W a n g Y.S., X u W.B., H u a S.,
Z h a n g Y. Defined media optimization for in vitro culture of bovine somatic cell nuclear
transfer (SCNT) embryos. Theriogenology, 2012, 78(9): 2110-2119.
C i b e l l i J.B., S t i c e S.L., G o l u e k e P.J., K a n e J.J., J e r r y J., B l a c k w e l l C.,
P o n c e d e L e o n F.A., R o b l J.M. Cloned transgenic calves produced from nonquiescent
fetal fibroblasts. Science, 1998, 280(5367): 1256-1258.
S c h n i e k e A.E., K i n d A.J., R i t c h i e W.A., M y y c o c k K., S c o t t A.R., R i t c h i e M.,
15
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
16
W i l m u t I., C a m p b e l K.H. Human factor IX transgenic sheep produced by nuclear transfer from transfected fetal fibroblasts. Science, 1997, 278(5346): 2130-2133.
N e f f K.L., A r g u e D.P., M a A.C., L e e H.B., C l a r k K.J., E k k e r S.C. Mojo Hand,
a TALEN design tool for genome editing applications. BMC Bioinformatics, 2013, 14(1)
(http://www.biomedcentral.com/1471-2105/14/1).
L i u J., L u o Y., Z h e n g L., L i u Q., Y a n g Z., W a n g Y., S u J., Q u a n F.,
Z h a n g Y. Establishment and characterization of fetal fibroblast cell lines for generating human lysozyme transgenic goats by somatic cell nuclear transfer. Transgenic. Res., 2013 Oct.,
22(5): 893-903.
C a m p b e l l K.H., F i s h e r P., C h e n W.C., C h o i I., K e l l y R.D., L e e J.H., X h u J.
Somatic cell nuclear transfer: past, present and future perspectives. Theriogenology, 2007,
68(Suppl. 1): S214-S231.
H i l l J.R., W i n g e r Q.A., L o n g C.R., L o o n e y C.R., T h o m p s o n J.A., W e s t h u s i n M.E. Development rates of male bovine nuclear transfer embryos derived from adult and fetal cells. Biol. Reprod., 2000, 62(5): 1135-1137.
F i g u e r o a R., L i n d e n m a i e r H., H e r g e n h a h n M., V a n g N e i l s o n K., B o u k a m p P. Telomere erosion varies during in vitro aging of normal human fibroblasts from
young and adult donors. Cancer Res., 2000, 60: 2770-2772.
R e i k W., D e a n W., W a l t e r J. Epigenetic reprogramming in mammalian development.
Science, 2001, 293(5532): 1089-1093.
E v a n s M.J., G u r e r C., L o i k e J.D., W i l m u t I., S c h n i e c e A.E., S c h o n E.A. Mitochondrial DNA genotypes in nuclear transfer-derived cloned sheep. Nat. Genet., 1999,
23(1): 90-93.
S u t o v s k y P., M o r e n o R.D., R a m a l h o - S a n t o s J., D o m i n k o T., S i m e r l y C.,
S c h a t t e n G. Ubiquitinated sperm mitochondria, selective proteolysis, and the regulating of
mitochondrial inheritance in mammalian embryos. Biol. Reprod., 2000, 63(2): 582-590.
Г л а з к о В.И. ДНК технологии животных. Киев, 1997.
D o m i n k o T., M i t a l i p o v a M., H a l e y B., B e y h a n Z., M e m i l i E., M c K u s i c k
B., F i r s t N.L. Bovine oocyte cytoplasm supports development of embryos produced by nuclear transfer of somatic cell nuclei from various mammalian species. Biol. Reprod., 1999,
60(6): 1496-1502.
I m s o o n t h o r n r u k s a S., S r i r a t t a n a K., P h e w s o i W., T u n w a t t a n a W., P a r n p a i R., K e t u d a t - C a i r n s M. Segregation of donor cell mitochondrial DNA in gaurbovine interspecies somatic cell nuclear transfer embryos, fetuses and an offspring. Mitochondrion, 2012, 12(5): 506-513.
K i s h i M., I t a g a k i Y., T a k a k u r a R., I m a m u r a M., S u d o T., Y o s h i n a r i M.,
T a n i m o t o M., Y a s u e H., K a s h i m a N. Nuclear transfer in cattle using colostrumderived mammary gland epithelial cells and ear-derived fibroblast cells. Theriogenology, 2000,
54(5): 675-684.
W a k a y a m a T., P e r r y A.C., Z u c c o t t i M., J o h n s o n K.R., Y a n a g i m a c h i R.
Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature, 1998, 394(6691): 369-374.
D i n n y e s A., D a i Y., B a r b e r M., L i u L., X u J., Z h o u P., Y a n g X. Development
of cloned embryos from adult rabbit fibroblasts: effect of activation treatment and donor cell
preparation. Biol. Reprod., 2001, 64(1): 257-263.
K u b o t a C., Y a m a k u c h i H., T o d o r o k i J., M i z o s h i t a K., T a b a r a N., B a r b e r M., Y a n g X. Six cloned calves produced from adult fibroblast cells after long-term culture. PNAS USA, 2000, 97(3): 990-995.
K a t o Y., T a n i T., T s u n o d a Y. Cloning of calves from various somatic cell types of male
and female adult, newborn and fetal cows. J. Reprod. Fertil., 2000, 120(2): 231-237.
S h i g a K., F u j i t a T., H i r o s e K., S a s a e Y., N a g a i T. Production of calves by transfer of nuclei from cultured somatic cells obtained from Japanese black bulls. Theriogenology,
1999, 52(3): 527-535.
T s a p a l i D.S., S e k e r i - P a t a r y a s K.E., S o u r l i n g a s T.G. Study of the H1 linker histone variant, H1o, during the in vitro aging of human diploid fibroblasts. Ann. N.Y. Acad. Sci.,
2000, 908: 336-340.
C o l a t o C., A l b o r n o z M., M e l l a n o M.L., M e l l a n o P.H., M e l l a n o J.I., M e l t s a s A., M e l l a n o M.A., M e l l a n o J.C., B o r d i g n o n V., B a l d a s s a r r e H. Production of cloned Boer goats and Dorper sheep in Argentina. Reprod. Fert. Devel., 2011, 23(1):
123 abstr.
K u r o m e M., Z a k h a r t c h e n k o V., K e s s l e r B., G u n g o r T., R i c h t e r A., K l y m i u k N., N a g a s h i m a H., W o l f E. Developmental potential of coned transgenic porcine
embryos produced by serial nuclear transfer can be improved by treatment with histone deacetylase inhibitors. Reprod. Fertil. Dev., 2011, 24: 123-124.
F o r s b e r g E.J., S t r e l c h e n k o N.S., A u g e n s t e i n M.L., B e t t h a u s e r J.M.,
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
64.
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77.
C h i l d s L.A., E i l e r t s e n K.J., E n o s J.M., F o r s y t h e T.M., G o l u e k e P.J., K o p p a n g R.W., L a n g e G., L e s m e i s t e r T.L., M a l l o n K.S., M e l l G.D., M i s i c a P.M.,
P a c e M.M., P f i s t e r - G e n s k o w M., V o e l k e r G.R., W a t t S.R., B i s h o p M.D.
Production of cloned cattle from in vitro systems. Biol. Reprod., 2002, 67: 327-333.
K u b o t a C., T i a n X.C., Y a n g X. Serial bull cloning by somatic cell nuclear transfer. Nat.
Biotechnol., 2004, 22: 693-694.
J a n g G., H o n g S.G., O h H.J., K i m M.K., P a r k J.E., K i m H.J., K i m D.Y.,
L e e B.C. A cloned toy poodle produced from somatic cells derived from an aged female dog.
Theriogenology, 2008, 69: 556-563.
Y i n X.J., L e e H.S., Y u X.F., K i m L.H., S h i n H.D., C h o S.J., C h o i E.G., K o n g I.K.
Production of second generation cloned cats by somatic cell nuclear transfer. Theriogenology,
2008, 69: 1001-1006.
S u z u k i T., K o n d o S., W a k a y a m a T., C i z d z i e l P.E., H a y a s h i z a k i Y. Genomewide analysis of abnormal H3K9 acetylation in cloned mice. PLoS One, 2008, 3: e1905.
Z h o u Q., R e n a r d J.P., L e F i e c G., B r o c h a r d V., B e a u j e a n N., C h e r i f i Y.,
F r a i c h a r d A., C o z z i J. Generation of fertile cloned rats by regulating oocyte activation.
Science, 2003, 302: 1179 (Epub 2003 Sep 25).
C h e s n e P., A d e n o t P.G., V i g l i e t t a C., B a r a t t e M., B o u l a n g e r L., R e n a r d J.P.
Cloned rabbits produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nat. Biotechnol., 2002,
20: 366-369.
G a l l i C., L a g u t i n a I., D u c h i R., C o l l e o n i S., L a z z a r i G. Somatic cell muclear
transfer in horses. Reprod. Domest. Anim., 2008, 43(Suppl. 2): 331-337.
H o l d e n C. Genetics. First cloned mule races to finish line. Science, 2003, 300: 1354.
Z h o u H., G u o Z. Heterogeneous nuclear-transferred-embryos reconstructed with camel
(Camelus bactrianus) skin fibroblasts and enucleated ovine oocytes and their development H-M.
Anim. Reprod. Sci., 2006, 95: 324-330.
K e e f e r C.L., K e y s t o n R., L a z a r i s A., B h a t i a B., B e g i n I., B i l o d e a u A.S.,
Z h o u F.J., K a f i d i N., W a n g B., B a l d a s s a r r e H., K a r a t z a s C.N. Production of
cloned goats after nuclear transfer using adult somatic cells. Biol. Reprod., 2002, 66: 199-203.
B e r D.K., L i C., A s h e r G., W e l l s D.N., O b a c k B. Red deer cloned from antler stem
cells and their differentiated progeny. Biol. Reprod., 2007, 77: 384-394.
N a r u s e K., I j i r i K., S h i m a A., E g a m i N. The production of cloned fish in the
medaka (Oryzias latipes). J. Exp. Zool., 1985, 263: 335-341.
E d w a r d s J.L., S c h r i c k F.N., M c C r a c k e n M.D., V a n A m s t e l S.R., H o p k i n s F.M., W e l b o r n M.G., D a v i e s C.J. Cloning adult farm animals: a review of the
possibilities and problems associated with somatic cell muclear transfer. Am. J. Reprod. Immunol., 2003, 50: 113-123.
P a n g S. A review of potential analytical approaches for detecting cloned animals and their
offspring in the food chain. Government Chemist (UK, Project RF1/3.1, report number
LGC/P/2012/130), 2012: 1-34 (http://www.governmentchemists.org.uk).
W a k a y a m a T., Y a n a g i m a c h i R. Cloning the laboratory mouse. Semin. Cell Dev.
Biol., 1999, 10: 253-258.
P a n a r a c e M., A g u e r o J.I., G a r r o t e M., J a u r e g u i G., S e g o v i a A., C a n e L., G u t i e r r e z J., M a r f i l M., R i g a l i F., P u g l i e s e M., Y o u n g S., L a g i o i a J., G a r n i l C., F o r t e P o n t e s J.E., E r e n o J u n i o J.C., M o w e r S., M e d i n a M. How healthy
are clones and their progeny: 5 years of field experience. Theriogenology, 2007, 67: 142-151.
W a t a n a b e S., N a g a i T. Survival of embryos and calves derived from somatic cell nuclear
transfer in cattle: a nationwide survey in Japan. Animal Science Journal, 2011, 82: 360-365.
W e l l s D.N., M i s i c a P.M., D a y T.A., T e r v i t H.R. Production of cloned lambs from
an established embryonic cell line: a comparison between in vivo- and in vitro-matured cytoplasts. Biol. Reprod., 1997, 57(2): 385-393.
H i l l J.R., R o u s s e l A.J., C i b e l l i J.B., E d w a r d s J.F., H o o p e r N.L., M i l l e r M.W., T h o m p s o n J.A., L o o n e y C.R., W e s t h u s i n M.E., R o b l J.M., S t i c e
S.L. Clinical and pathologic features of cloned transgenic calves and fetuses (13 case studies).
Theriogenology, 1999, 51: 1451-1465.
P a c e M.M., A u g e n s t e i n M.L., B e t t h a u s e r J.M., C h i l d s L.A., E i l e r t s e n K.J.,
E n o s J.M., F o r s b e r g E.J., G o l u e k e P.J., G r a b e r D.F., K e m p e r J.C., K o p p a n g R.W., L a n g e G., L e s m e i s t e r T.L., M a l l o n K.S., M e l l G.D., M i s i c a P.M., P f i s t e r - G e n s k o w M., S t r e l c h e n k o N.S., V o e l k e r G.R., W a t t S.R.,
B i s h o p M.D. Ontogeny of cloned cattle to lactation. Biol. Reprod., 2002, 67: 334-339.
R e n a r d J.P., C h a s t a n t S., C h e s n e P., R i c h a r d C., M a r c h a l J., C o r d o n n i e r N., C h a v a t t e P., V i g n o n X. Lymphoid hypoplasia and somatic cloning. Lancet,
1999, 353(9163): 1489-1491.
W i n g e r Q.A., H i l l J.R., S p i n T., W a t s o n A.J., K r a e m e r D.C., W e s t h u s i n M.E.
Genetic reprogramming of lactate dehydrogenase, citrate syntethase, and phosphofructokinase
mRNA in bovine nuclear transfer embryos produced using bovine fibroblast cell nuclei. Mol.
Reprod. Dev., 2000, 56(4): 458-464.
H i l l J.R., W i n g e r Q.A., B u r g h a r d t R.C., W e s t h u s i n M.E. Bovine nuclear transfer
17
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
78.
79.
80.
81.
82.
83.
84.
85.
86.
87.
88.
89.
90.
91.
92.
93.
94.
embryo development using cells derived from a cloned fetus. Anim. Reprod. Sci., 2001, 67(12): 17-26.
S i n c l a i r K.D., M c E v o y T.G., M a x f i e l d E.K., M a l t i n C.A., Y o u n g L.E., W i l m u t I., B r o a d P.J., R o b i n s o n J.J. Aberrant fetal growth and development after in vitro
culture of sheep zygotes. J. Reprod. Fertil., 1999, 116(1): 177-186.
P e u r a T.T., T r o u n s o n A.O. Recycling bovine embryos for nuclear transfer. Reprod. Fertil. Dev., 1998, 10(7-8): 627-632.
T a m a s h i r o K.L., W a k a y a m a T., B l a n c h a r d R.J., B l a n c h a r d D.C., Y a n a g i m a c h i R. Postnatal growth and behavioral development of mice cloned from adult cumulus cells. Biol. Reprod., 2000, 63(1): 328-334.
L i G.-P., W h i t e K.L., B u n c h T.D. Review of enucleation methods and procedures used
in animal cloning: State of the art. Cloning and Stem Cells, 2004, 6(1): 5-13.
P r o k o f i e v M.I., S t e p a n o v O.I., K o m i s s a r o w A.V., A n t i p o v a T.A., P i n y u g i n a M.V., M a l e n k o G.P. Blind enucleation of oocytes is highly efficient in zona-free bovine cloning. Reprod. Fert. Devel., 2006, 19(1): 156-157.
O n i s h i A., I w a m o t o M., A k i t a T., M i k a w a S., T a k e d a K., A w a t a T., H a n a d a H., P e r r y A.C. Pig cloning by microinjection of fetal fibroblast nuclei. Science, 2000,
289: 1188-1190.
T a n i T., S h i m a d a H., K a t o Y., T s u n o d a Y. Demecolcine-assisted enucleation for
bovine cloning. Cloning and Stem Cells, 2006, 8(1): 61-66.
S u g i m u r a S., A k a i T., H a s h i y a d a Y., S o m f a i T., I n a b a Y., H i r a y a m a M.,
Y a m a n o u c h i T., M a t s u d a H., K o b a y a s h i S., A i k a w a Y., O h t a k e M., K o b a y a s h i E., K o n i s h i K., I m a i K. Promising system for selecting healthy in vitro fertilized embryos in cattle. PLoS ONE, 2012, 7: e36627.
K o o D.B., K a n g Y.K., C h o i Y.H., P a r k J.S., K i m H.N., O h K.B., S o n D.S.,
P a r k H., L e e K.K., H a n Y.M. Aberrant allocations of inner cell mass and trophectoderm
cells in bovine nuclear transfer blastocysts. Biol. Reprod., 2002, 67: 487-492.
B o i a n i M., E c k a r d t S., L e u N.A., S c h ь l e r H.R., M c L a u g h l i n K.J. Pluripotency
deficit in clones overcome by clone-clone aggregation: epigenetic complementation? The
EMBO J., 2003, 22: 5304-5312.
B a l b a c h S.T., E s t e v e s T.C., B r i n k T., G e n t i l e L., M c L a u g h l i n K.J., A d j a y e J.A., B o i a n i M. Governing cell lineage formation in cloned mouse embryos. Dev.
Biol., 2010, 343: 71-83.
W o n g s r i k e a o P., N a g a i T., A g u n g B., T a n i g u c h i M., K u n i s h i M., S u t o S.,
O t o i T. Improvement of transgenic cloning efficiencies by culturing recipient oocytes and donor cells with antioxidant vitamins in cattle. Mol. Reprod. Dev., 2007, 74: 694-702.
S u g i m u r a S., K o b a y a s h i S., H a s h i y a d a Y., O h t a k e M., K a n e d a M., Y a m a n o u c h i T., M a t s u d a H., A i k a w a Y., W a t a n a b e S., N a g a i T., K o b a y a s h i E., K o n i s h i K., I m a i K. Follicular growth-stimulated cows provide favorable oocytes
for producing cloned embryos. Cellular Reprogramming, 2012, 14: 29-37.
R i z o s D., W a r d F., D u f f y P., B o l a n d M.P., L o n e r g a n P. Consequences of bovine oocyte maturation, fertilization or early embryo development in vitro versus in vivo: implications for blastocyst yield and blastocyst quality. Mol. Reprod. Dev., 2002, 61: 234-248.
D e B e m T.H., C h i a r a t t i M.R., R o c h e t t i R., B r e s s a n F.F., S a n g a l l i J.R., M i r a n d a M.S., P i r e s P.R., S c h w a r t z K.R., S a m p a i o R.V., F a n t i n a t o - N e t o P.,
P i m e n t e l J.R., P e r e c i n F., S m i t h L.C., M e i r e l l e s F.V., A d o n a P.R., L e a l C.L.
Viable calves produced by somatic cell nuclear transfer using meioticblocked oocytes. Cellular
Reprogramming, 2011, 13: 419-429.
Y a m a n a k a K., K a n e d a M., I n a b a Y., S a i t o K., K u b o t a K., S a k a t a n i M., S u g i m u r a S., I m a i K., W a t a n a b e S., T a k a h a s h i M. DNA methylation analysis on satellite I region in blastocysts obtained from somatic cell cloned cattle. Anim. Sci. J., 2011, 82: 523-530.
S a n g a l l i J.R., D e B e m T.H., P e r e c i n F., C h i a r a t t i M.R., O l i v e i r a L.D., De
A r a щ j o R.R., V a l i m P i m e n t e l J.R., S m i t h L.C., M e i r e l l e s F.V. Treatment of nuclear-donor cells or cloned zygotes with chromatin-modifying agents increases histone acetylation but does not improve full-term development of cloned cattle. Cellular Reprogramming,
2012, 14: 235-247.
ГНУ Центр экспериментальной эмбриологии
и репродуктивных биотехнологий,
Поступила в редакцию
31 января 2014 года
127422 Россия, г. Москва, ул. Костякова, 12, стр. 4,
e-mail: [email protected]
ASPECTS OF SOMATIC CLONING IN MAMMALIAN SPECIES:
ACHIEVEMENTS, OPPORTUNITIES, AND OBSTACLES
(review)
G.Yu. Kosovsky, E.V. Kornienko, V.I. Glazko
18
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
Center for Experimental Embryology and Reproductive Biotechnology, str. 4, 12, ul. Kostyakova, Moscow, 127422 Russia,
e-mail [email protected]
Received January 31, 2014
Abstract
The analysis on a somatic cloning productivity in different animal species is submitted. The
data are summarized on molecular and genetic events involved in cloning and cell reprogramming,
chimerism on mitochondrial DNA under intra- and interspecific cloning. The essential problems
connected with methodical difficulties, low efficiency, and big losses during embryonic, pre- and
postnatal development are in the focus. The somatic cloning is now mainly considered as an opportunity for rapid and durable fixation of the unique valuable traits of an individual, which can be lost
due to recombination under normal reproduction or resulting from the threat of extinction. The
method allows to combine different breeding and transgenic technologies, i.e. the targeted in vitro
insertions, cell selection, and cell nuclear transfer. An agriculture is considered as the main area in
which this approach should be used. But, despite of expected advantages and the increased number
of successful cloning and clones, reported all over the world, a commercial use of the method in
animal husbandry is strictly limited by the extremely low efficacy, high costs, and big losses of the
initial material. At the same time, the specific molecular and cell mechanisms, involved in somatic
cloning, should be further studied. That is why the more effective alternative approaches are forced
to be sought, and the cloning technique must be improved. Nevertheless, despite the still low efficiency (3-5 %) and a lower use compared with forecasts, the cloned animals gradually become an
integral part of agriculture in the U.S. and Europe. Somatic cloning is also prospective for fundamental genetics, particularly in studying genome expression, cell differentiation, etc. The ethic aspects of
cloning in agriculture and medicine must be also discussed and estimated to prevent speculations both
of opponents and supporters of the method.
Keywords: clone, somatic cloning, enucleated oocyte, reprogramming, totipotency, pluripotency, ebryonic stem cells.
Научные собрания
VI СЪЕЗД ВАВИЛОВСКОГО ОБЩЕСТВА ГЕНЕТИКОВ И СЕЛЕКЦИОНЕРОВ И
АССОЦИИРОВАННЫЕ ГЕНЕТИЧЕСКИЕ СИМПОЗИУМЫ
(15-20 июня 2014 года, г. Ростов-на-Дону)
™
™
™
™
™
™
™
™
Эволюционная и популяционная генетика
Молекулярные и клеточные механизмы генетических процессов
Геномика, протеомика, биоинформатика и системная биология
Генетика развития и стволовые клетки
Генетика человека, медицинская генетика и генетические модели для
биомедицинских исследований
Нейрогенетика и генетика поведения
Генетические основы селекции и биотехнологии
Экологическая генетика
Контакты и информация: [email protected]
THE 2nd GENETICS AND GENOMICS CONFERENCE (GC 2014)
(13-15 июня 2014 года, г. Пекин, Китай)
Цель 2-й Конференции по генетике и геномике ? способствовать объединению усилий ученых и специалистов в области генной инженерии.
Тематические направления:
™ Геномика
™ Хромосомные изменения
™ Структурная геномика
™ Эпигенетика и метилирование
™ Повреждения и восстановление ДНК
™ Структура и функции гена
™ Стабильность генома и экспрессия
™ Проблемы старения
™ Клиническая генетика
™ Молекулярная генетика, цитогенетика, эпигенетика
™ Статистическая генетика
Информация: http://www.engii.org/workshop/GC2014June
Контакты: [email protected]
19
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, № 2, с. 20-30
УДК 636.5:57.04:574.24:57.087
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ К ДИАГНОСТИКЕ СТРЕССОВ
В ПТИЦЕВОДСТВЕ
(обзор)
А.В. МИФТАХУТДИНОВ
Обобщены данные литературы о методах диагностики стрессов у кур в лабораторных и
производственных условиях. В настоящее время разработаны многочисленные методы, позволяющие диагностировать состояние адаптационных механизмов и индивидуальной стрессовой чувствительности у кур. В то же время следует отметить, что использование тех из предложенных подходов, которые основаны на определении биохимических маркеров стресса в крови, в производственных условиях представляет собой непростую задачу из-за необходимости применять специальное оборудование, привлекать высококвалифицированный персонал, а также вследствие неоднозначной интерпретации результатов. Весьма информативным и менее сложным приемом при диагностике стрессового состояния у кур может быть изучение количественного соотношения гетерофилов и лимфоцитов в крови. Высокую диагностическую ценность в случае хронических стрессов
имеют показатели общего оперения. В дополнение к ним целесообразно учитывать концентрацию
стрессовых гормонов в крови и время тонической неподвижности кур. Однако и в этих случаях
процедуры, которым подвергается птица, сами по себе служат факторами стресса, тогда как одно
из важнейших условий достоверности результатов при его диагностике ? минимальное воздействие на объект исследования. Для этих целей нами разработан способ, позволяющий диагностировать состояние стресса у кур родительского стада мясного направления продуктивности с помощью определения кортикостерона в пробах помета. Предлагаемый способ может быть использован при оценке целесообразности применения схем антистрессовой терапии, для определения оптимальной плотности комплектования производственных площадей, для анализа степени воздействия на организм кур технологических факторов и ветеринарных обработок.
Ключевые слова: стресс, куры, диагностика стрессов.
Стрессы относятся к актуальным проблемам птицеводства (1). В соответствии со сложившейся концепцией, стрессоры через нервную и эндокринную систему вызывают морфологические и функциональные изменения в органах и тканях, а также усиленный синтез и секрецию гормонов
адаптации, усиливающих резистентность организма к воздействию негативных факторов внешней среды и способствующих восстановлению произошедших в нем обратимых нарушений (2-4).
Стрессы начинаются еще с инкубатора: ранняя выборка или задержка цыплят в инкубаторе ? это сильный стресс, способный существенно снизить будущую продуктивность птицы (5). Различные стрессы могут нарушить процесс созревания тонкого кишечника в первые несколько суток жизни цыпленка (6, 7), выраженное стрессовое воздействие оказывают вакцинация в инкубатории, транспортировка цыплят в корпуса,
посадка при отсутствии выровненной подстилки, оптимальной температуры и вентиляции (5). В дальнейшем добавляются кормовые стрессы,
связанные не только с переходом цыпленка от желткового питания к сухому корму, отличающемуся по составу от желтка, но и с несбалансированностью рациона по питательным и биологически активным веществам. В процессе роста и развития неизбежны технологические стрессы,
связанные с вакцинациями, в летние месяцы особую роль играют тепловые стрессы, наличие микотоксинов в кормах ? один из основных кормовых стрессов (8, 9). В технологии производства пищевого и инкубационного яйца важнейшим стрессом сопровождается выход птицы на пик
яйценоскости (10). Одна из главных проблем, связанных со стрессами, ?
повышенная потребность в питательных и биологически активных веществах, необходимых для борьбы со стрессами, в то время как их поступ20
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ление с кормом уменьшается, поскольку в таком состоянии птица хуже
поедает корм (1, 11, 12).
Методы диагностика стрессов птицы важны для решения как теоретических, так и практических задач. К основным из них относится изучение стрессов у кур в условиях промышленных технологий и в лабораторных физиологических опытах, а также оценка степени влияния внешних факторов на физиологическое состояние птицы. К числу практических задач можно отнести контроль за физиологическим состоянием птицы при разработке новых методов профилактики стрессов, при создании и
выборе оптимальных систем содержания и кормления (13, 14).
В настоящее время единый подход к диагностике стрессов в птицеводстве отсутствует (15). Предлагаемые методы имеют свои преимущества
и недостатки, что требует от исследователя очень осторожного выбора маркеров стресса (16). При использовании любого подхода к изучению стрессов и стрессовой чувствительности организма необходимо в обязательном
порядке учитывать возраст птицы. По данным В.И. Фисинина с соавт.
(13), адаптационно-компенсаторные механизмы у цыплят в процессе роста
и развития претерпевают фазовые изменения. Первая фаза (высокая чувствительность) отмечается у цыплят в раннем возрасте (от 1 до 90 сут), в
возрасте 90-120 сут наступает вторая фаза (относительная резистентность)
и третья фаза (повторное повышение чувствительности) начинается у цыплят со 140-суточного возраста (13).
К общим показателям стресса, не имеющим количественного выражения, можно отнести атрофию тимуса и бурсы у молодой птицы, увеличение массы передней доли гипофиза и надпочечников, истощение холестерина в надпочечниках, повышение концентрации кортикостерона,
инсулина и глюкагона в плазме крови, усиленный расход глюкозы, снижение приростов живой массы и атрофию мышц, выделение в кровь маркеров острых воспалительных процессов, цитокинов, нарушение роста
хрящей и костей, анорексию, повышенную температуру тела. Избыточное
отложение жира в брюшной полости и асцит считают маркерными признаками стресса при интенсивном откорме цыплят-бройлеров (17).
Продуктивность кур не всегда служит объективным критерием наличия стресса, так как компенсаторные механизмы организма позволяют
некоторое время поддерживать гомеостаз, сохраняя определенное состояние здоровья и продуктивности, но по мере истощения резервов адаптационных систем наблюдается снижение реактивности и резистентности и
в результате продуктивность резко падает, развиваются болезни и происходит массовая гибель кур. Высокая смертность может быть важным признаком острых и хронических стрессов в птицеводстве (18).
Убедительно доказана эффективность метода, основанного на изучении гормонального статуса, морфологических показателей крови, базовых биохимических констант организма и показателей резистентности для
определения стрессового состояния кур, и использования описанного подхода для определения воздействия технологических факторов на организм
птиц, а также соответствия технологических параметров физиологическим
потребностям кур (2, 13, 14, 19-21).
Среди способов определения количественных показателей стрессового состояния у кур можно выделить прямые, которые основаны на
оценке содержания стрессовых гормонов в крови. Известны многочисленные исследования, доказывающие эффективность непосредственного измерения количества основных гормонов в системе гипоталамус?гипофиз?надпочечники, а также их метаболитов. При интерпретации резуль21
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
татов подобных анализов необходимо учитывать, что количество гормонов
зависит от природы и силы раздражителя, длительности его воздействия,
возраста и генотипа птицы (2).
По данным В.И. Фисинина и Н.А. Кравченко (14), у взрослых кур
содержание катехоламинов в надпочечниках и крови и кортикостероидов
в крови менее подвержено изменениям при действии раздражителей, чем
у цыплят. Указанный факт объясняется тем, что у взрослой птицы при
адаптации к новым условиям отмечается меньший расход катехоламинов и
кортикостероидов, описанное явление не связано с истощением адренокортикальных структур и может быть следствием изменения чувствительности рецепторов. При этом важное значение имеет исходное состояние
нейроэндокринной системы, которое необходимо учитывать при анализе
регистрируемых данных (14).
Попытки диагностировать стресс посредством определения количества адренокортикотропного гормона (АКТГ) в крови не нашли широкого
практического применения, и этот прием используется только в комплексных лабораторных исследованиях (22).
Определение дофамина в крови ? ценный метод диагностики стрессов и стрессовой чувствительности (23, 24). В мозге птиц, проявляющих
агрессию, обнаружено более высокое содержание дофамина, чем у особей,
не склонных к дивиантному поведению (25).
Анализ содержания адреналина и норадреналина в крови в птицеводстве используется для выявления острых технологических стрессов, вызванных факторами, которые характеризуются внезапностью и вызывают
высокую смертность, а также при диагностике причин каннибализма (26,
27). Концентрация адреналина в сыворотке крови используется в качестве
селекционного признака при создании линий птицы с высокой и низкой
индуцибельностью этого гормона, определяющей разную чувствительность
к стрессам (28).
Изменение содержания катехоламинов и эстрогенов в тканях надпочечников у кур зависит от возраста, периода роста, развития и физиологического состояния и имеет важное прогностическое значение при определении оптимальных технологических параметров для выращивания и
содержания птицы, а также совершенствовании норм питательных и биологически активных веществ, обеспечивающих потребности молодняка и
кур-несушек. В.И. Фисининым и Н.А. Кравченко (14) доказано, что существуют три основные фазы, когда содержание катехоламинов в надпочечниках подвержено изменениям. Первая совпадает с периодом общего роста и развития организма, для нее характерен компенсаторный синтез катехоламинов, при этом содержание адреналина выше, чем норадреналина.
Во вторую фазу количество гормонов в надпочечниках снижается в результате усиления секреции адреналина. Соотношение между адреналином
и норадреналином выравнивается. Вторая фаза характерна для периода
подготовки и начала яйцекладки у птицы. В третью фазу у взрослых кур
основным гормоном в надпочечниках становится норадреналин (14). Указанные физиологические особенности активации адренергической системы организма должны обязательно учитываться при изучении стрессов и
стрессовой чувствительности кур в условиях промышленного содержания.
Серотонин в организме кур выполняет разнообразные физиологические функции и влияет на адаптацию к факторам социальной среды,
сексуальное поведение, эмоции и воспроизводство. Определение в крови
и мозге метаболитов серотонина, в основном 5-гидроксииндолуксусной
кислоты, используется для анализа различных генетических линий по сте22
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
пени агрессии и склонности к дивиантному поведению (29, 30).
Определение в крови глюкокортикоидных гормонов ? общепризнанный метод подтверждения активации стресс-реализующих механизмов
организма. В.И. Фисининым (21) изучен гидрокортизон в качестве маркера стрессового состояния у кур. По данным многочисленных исследователей, кортикостерон относится к наиболее часто анализируемым гормонам
при диагностике стрессового состояния кур, поскольку это основной глюкокортикоидный гормон у птицы (31-34). При определении глюкокортикоидных гормонов у молодняка кур для оценки активации стресс-реализующих механизмов необходимо учитывать, что чем старше особи, подвергшиеся воздействию стресс-фактора, тем менее выражено изменение количества глюкокортикоидов в крови. Эти различия, по-видимому, можно
рассматривать как результат постепенно прогрессирующих физиолого-биохимических изменений гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы, обусловливающих более быстрое возвращение содержания глюкокортикоидных гормонов к норме (2).
К главным проблемам при диагностике стрессов на основе определения концентрации стрессовых гормонов в крови относится активация
стресс-реализующих механизмов при отборе проб крови, что ведет к искажению результатов и не позволяет получать достоверные данные. J. Rushen
(35) и P. Moneva с соавт. (36) указывают на неоднозначность интерпретации получаемых результатов и отсутствие широкой нормативной базы для
сопоставления данных при определении стрессовых гормонов в крови.
Наши исследования нескольких групп признаков, имеющих маркерное значение при стрессах, выполненные с использованием дискриминантного анализа, показали, что концентрация адреналина и кортикостерона у кур в состоянии относительного покоя и после активации стрессреализующих механизмов может быть использована лишь в качестве уточняющего показателя при изучении стрессов и стрессовой чувствительности (37). С целью исключения дополнительного стрессирования кур при
отборе крови и получения наиболее объективных данных рекомендуется
применять катетеризацию крупных кровеносных сосудов ? подкрыльцовой вены, плечевой вены или артерии (36, 38, 39).
Различные модификации метода определения стрессовых гормонов
в крови широко используются в экспериментальных исследованиях, но в
условиях промышленного производства их применение затруднено из-за
трудоемкости определения, сложности интерпретации результатов и активации стресс-реализующих адаптационных механизмов организма вследствие производимых манипуляций и болезненности процедуры отбора крови
для птицы (22, 40).
При изучении стресса и стрессовой чувствительности у кур широко
используется один из косвенных физиологических тестов ? динамика соотношения между гетерофилами и лимфоцитами (Г/Л) в периферической
крови. Установлено, что при развитии состояния стресса этот показатель
увеличивается за счет абортивного выброса незрелых клеток гетерофилов
из костного мозга в кровяное русло и миграции лимфоцитов из последнего в ткани. Изменения величины соотношения Г/Л коррелируют со сдвигом концентрации кортикостерона в крови птицы и пропорциональны
степени действия стресс-факторов различной природы (16, 35, 41, 42). Соотношение Г/Л может характеризовать три уровня физиологического состояния кур: низкий соответствует значению 0,2, средний ? значению 0,5
и высокий ? может быть более 0,8 (41). К недостаткам такого метода следует отнести то, что при воздействии сверхпороговых раздражителей соот23
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ношение Г/Л не всегда изменяется адекватно физиологическому состоянию птицы, поэтому не может приниматься за точный показатель стрессового воздействия (36, 43, 44). Кроме того, подсчет форменных элементов в мазках крови птицы ? процесс весьма трудоемкий и требующий высокой квалификации персонала. J. Post с соавт. (45) указывают на возможность использования и точность автоматических гематологических анализаторов при подсчете соотношения Г/Л.
В качестве уточняющих показателей при диагностике стрессового
состояния кур применяют определение числа эозинофилов и моноцитов
в мазках крови. В исследованиях В.И. Фисинина с соавт. (19), а также
M.H. Maxwell и G.M. Robertson (46) описана эозинопения, сопутствующая
стрессовой реакции у кур, при этом количество эозинофилов в органах и
тканях увеличивается, указывая на то, что эозинофилы в период развития
стресса покидают сосудистое русло. По данным O. Altan с соавт. (47), снижение числа моноцитов и эозинофилов свидетельствует об остром стрессе,
однако этот механизм реализуется не всегда и не может надежно маркировать стресс (46).
Известен прием диагностики стресса по миграционной активности
лейкоцитов периферической крови на основе капиллярного метода в модификации Ю.И. Забудского с соавт. (48). По мнению авторов, этот подход имеет ряд преимуществ по сравнению с определением соотношения
Г/Л. Способ менее трудоемкий, так как не предполагается применять
иммерсионную микроскопию, и более доступный для персонала ветеринарных лабораторий птицефабрик, владеющего навыками постановки серологических реакций. Недостаток описанного подхода в том, что отбор
крови представляет собой дополнительное стрессовое воздействие, влияющее на результаты анализа (48).
В исследованиях В.И. Фисинина с соавт. (19) обоснована диагностическая ценность реакции оседания эритроцитов при определении стрессового состояния у кур. В период развития стрессов этот показатель может
увеличиваться в несколько раз (19).
К последствиям стрессов относится угнетение неспецифической
резистентности и иммунной системы. В работах В.И. Фисинина с соавт.
(19) в качестве маркера стресса использован титр лизоцима, коррелирующий с количеством цитокинов и глюкокортикоидных гормонов. Известно, что цитокины играют важную роль во взаимодействии иммунной и
эндокринной системы при реализации стрессов в организме (49). Ключевым цитокином, стимулирующим стрессовые реакции, считается ИЛ-1?,
секретируемый активированными макрофагами, эндотелиоцитами, кератиноцитами и др. ИЛ-1? действует на нейтрофилы, способствуя хемотаксису, активации метаболизма, выходу из клеток лизоцима и лактоферрина. Главным механизмом ИЛ-1?-зависимой индукции стресса служит активация синтеза и секреции кортикотропин-рилизинг-фактора из нервных окончаний (20). S.-Y. Kang с соавт. (50) обнаружили эффекты стресса, выразившиеся в усилении экспрессии проинфламаторных цитокинов
в печени и селезенке птицы, на основе чего разрабатываются соответствующие диагностикумы.
Состояние страха ? одно из проявлений стресса у кур, при этом
физиологическим индикатором страха, в свою очередь, служит время тонической неподвижности (51). Тоническая неподвижность мало изучена и
проявляется в сниженной реактивности на внешние воздействия при принудительной фиксации. Продолжительность тонической неподвижности
связана с агрессивным поведением, расклевом и каннибализмом кур в ус24
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ловиях промышленного содержания. Она может быть критерием хронических стрессов, индивидуальной стрессовой чувствительности и склонности
к агрессивному поведению (51-54).
К признакам стресса у кур также относится потеря перьевого покрова. В частности, по степени потери пера судят о стрессовом состоянии
птицы в период пика продуктивности. Потеря пера связана с расклевом и
каннибализмом, а также с увеличением количества кортикостерона в крови (3, 37, 55, 56). Наиболее совершенные методы позволяют комплексно
оценивать состояние оперения на основании подсчета перьев на различных участках тела с представлением результатов в баллах (57).
В настоящее время проходит апробацию прием диагностики стрессов, основанной на выявлении белков острой фазы воспаления. Перспективным маркером для этих целей представляется кислый ?1-гликопротеин
(орозомукоид) (58, 59).
Принципиально новый подход к диагностике и профилактике стрессов предлагают В.И. Фисинин и П. Сурай (10). Согласно их данным, устойчивость к стрессам и коррекция повреждений на молекулярном уровне
зависят от функциональной активности витагенов, играющих важнейшую
роль в обеспечении адаптационной способности организма. Влияя на метаболизм, они участвуют в восстановлении нарушенного при стрессе гомеостаза и, как следствие, здоровья и продуктивности птицы. Витагены контролируют экспрессию антиоксидантных ферментов супероксиддисмутазы
и глутатионпероксидазы, белков теплового шока (шаперонов), сиртуинов
(семейство ферментов, которые оказывают защитное действие в условиях
стресса, предупреждая повреждения, вызываемые свободными радикалами),
ферментов второй фазы детоксикации чужеродных веществ, а также факторов роста и белков, вовлеченных в регуляцию процессов энергетического
обмена и поддержания клеточного гомеостаза кальция (10). При слабом
стрессе образование свободных радикалов в клетке находится под контролем антиоксидантной системы и частота повреждений ДНК такова, что
позволяет сиртуинам успешно осуществлять как репарационную, так и регуляторную функцию. С усилением стресса количество образующихся свободных радикалов увеличивается из-за прогрессирующего повреждения
митохондрий, в которых происходят процессы клеточного дыхания, и репарационная функция сиртуинов становится преобладающей. Как следствие, в клетке нарушается метаболический баланс, что негативно влияет на
рост, развитие, продуктивные и репродуктивные качества животных и птицы (4). Диагностическая ценность данных о перекисном окислении липидов при стрессе в настоящее время доказана, в то время как комплексное
исследование продуктов перекисного окисления, шаперонов и сиртуинов
при активации стресс-реализующих механизмов открывает новые, пока
что мало изученные возможности для выявления и профилактики стрессов в птицеводстве.
Для того чтобы полностью исключить внешнее воздействие при
диагностике стрессов и стрессовой чувствительности у птицы, разработаны неинвазивные методы определения гормонов в биологических пробах.
Так, J. Downing (60) указывает на возможность использовать химический
анализ яйца при диагностике стрессов. Как известно, в яйце накапливаются
стероидные гормоны (60, 61), причем, по данным F. Royo с соавт. (62),
приблизительно 80 % кортикостерона находится в желтке и 20 % ? в белке. Однако определение стрессового состояния и стрессовой чувствительности кур по содержанию кортикостерона в яйце пока что не нашло практического применения: однозначная интерпретация результатов такого ис25
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
следования затруднена, кроме того, время, когда метод может применяться, ограничено сроком формирования яйца. Для диагностики стрессов млекопитающих широко используется выявление глюкокортикоидных гормонов в фекалиях (63). В настоящее время разрабатываются способы оценки
стрессового состояния у кур, основанные на определении количества глюкокортикоидов и их метаболитов методами радиоиммунологического анализа, масс-спектрометрии и газожидкостной хроматографии (64). Подобные подходы могут успешно использоваться в лабораторных экспериментах, однако в условиях птицефабрик они технически недоступны и очень
дороги для планового производственного применения.
Нами был разработан метод, позволяющий без непосредственного
воздействия на особей диагностировать стрессовое состояние у кур родительского стада мясного направления продуктивности, используя кортикостерон в качестве специфического маркера стрессовой реакции (65). Способ основан на количественном определении кортикостерона в пробах помета, отобранных через 1-3 ч после воздействия фактора, предположительно вызывающего стресс. Содержание гормона оценивали после экстракции этиловым спиртом, применяя твердофазный конкурентный иммуноферментный анализ, который доступен для лабораторий на большинстве российских птицефабрик. Этот прием высокоспецифичен в отношении кортикостерона (100 %) при незначительной перекрестной реакции с
прогестероном (7,4 %), диоксикортикостероном (3,4 %), 11-дегидрокортикостероном (1,6 %) и другими стероидами (менее 0,3 %). Иммуноферментный анализ кортикостерона характеризуется высокой чувствительностью при широком диапазоне определения (от 0 до 240 нмоль/л). Кортикостерон, как и другие стероиды, устойчив во внешней среде и хорошо
растворим в органических растворителях. Содержание кортикостерона в
помете более 50 нмоль/л (65) указывает на активацию гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой системы и служит индикатором стрессового состояния у кур мясного направления продуктивности. Таким образом, предложенный нами метод специфичен, высокочувствителен и полностью исключает воздействие на исследуемый объект, то есть соответствует одному
из важнейших условий достоверной диагностики стрессов. Он может использоваться при оценке целесообразности применения схем антистрессовой терапии, для определения оптимальной плотности комплектования
птицей производственных площадей, с целью анализа степени воздействия
технологических факторов и ветеринарных обработок на организм кур.
Итак, в настоящее время разработаны многочисленные методы, позволяющие диагностировать состояние адаптационных механизмов и индивидуальной стрессовой чувствительности у кур. В то же время следует
отметить, что использование тех из предложенных подходов, которые основаны на определении биохимических маркеров стресса в крови, в производственных условиях представляет собой непростую задачу из-за необходимости применять специальное оборудование, привлекать высококвалифицированный персонал, а также вследствие неоднозначной интерпретации результатов. Весьма информативным и менее сложным приемом при
диагностике стрессового состояния у кур может быть изучение количественного соотношения гетерофилов и лимфоцитов в крови. Высокую диагностическую ценность в случае хронических стрессов имеют показатели
общего оперения. В дополнение к ним целесообразно учитывать концентрацию стрессовых гормонов в крови и время тонической неподвижности
кур. Однако и в этих случаях процедуры, которым подвергается птица, сами по себе служат факторами стресса, тогда как одно из важнейших усло26
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
вий достоверности результатов при его диагностике ? минимальное воздействие на объект исследования. Нами разработан неинвазивный способ,
позволяющий выявлять состояние стресса у кур родительского стада мясного направления продуктивности по содержанию кортикостерона в пробах помета. Этот метод может использоваться при оценке целесообразности применения схем антистрессовой терапии, для определения оптимальной плотности комплектования птицей производственных площадей, а
также с целью анализа степени воздействия технологических факторов и
ветеринарных обработок на организм кур.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
Ф и с и н и н В.И., П а п а з я н Т., С у р а й П. Инновационные методы борьбы со
стрессами в птицеводстве. Птицеводство, 2009, 8: 10-14.
Ф и с и н и н В.И., К р а в ч е н к о H.A. Реакция надпочечников птицы разного возраста
и генотипа на действие стресс-факторов. Доклады ВАСХНИЛ, 1977, 7: 29-30.
К а в т а р а ш в и л и А.Ш., К о л о к о л ь н и к о в а Т.Н. Физиология и продуктивность
птицы при стрессе (обзор). Сельскохозяйственная биология, 2010, 4: 25-37.
С у р а й П., Ф и с и н и н В.И. Современные методы борьбы со стрессами в птицеводстве: от антиоксидантов к витагенам. Сельскохозяйственная биология, 2012, 4: 3-12.
Ф и с и н и н В.И., С у р а й П. Микотоксины и антиоксиданты: непримиримая борьба
(Т-2 токсин ? метаболизм и токсичность). Птица и птицепродукты, 2012, 3: 38-41.
Ф и с и н и н В.И., С у р а й П. Первые дни жизни цыплят: от защиты от стрессов к эффективной адаптации. Птицеводство, 2012, 2: 11-15.
Ф и с и н и н В.И., С у р а й П. Раннее питание цыплят и развитие мышечной ткани.
Птицеводство, 2012, 3: 9-12.
Ф и с и н и н В.И., С у р а й П. Микотоксины и антиоксиданты: непримиримая борьба (Т-2 токсин ? механизмы токсичности и защита). Птица и птицепродукты, 2012,
4: 36-40.
С у р а й П., Ф и с и н и н В.И. Современные методы борьбы со стрессами в птицеводстве: от антиоксидантов к сиртуинам и витагенам. Мат. XVII Межд. конф. ВНАП «Инновационные разработки и их освоение в промышленном птицеводстве». Сергиев Посад,
2012: 24-34.
Ф и с и н и н В.И., С у р а й П. Эффективная защита от стрессов в птицеводстве: от витаминов к витагенам. Птица и птицепродукты, 2011, 5: 23-27.
Ф и с и н и н В.И., П а п а з я н Т.Т., С у р а й П.Ф. Современные методы борьбы со
стрессами в птицеводстве. Животноводство сегодня, 2009, 3: 62-67.
F i s i n i n V.I., P a p a z y a n T.T., S u r a i P.F. Selenium in poultry nutrition. In: Current
advances in selenium research and applications. Taylor-Pickard, Wageningen Academic Publishers, The Netherlands, 2008: 221-261.
Ф и с и н и н В.И., М у д р ы й И.Н., К р а в ч е н к о Н.А. Возрастные особенности
адаптационно-компенсаторных процессов у цыплят. Доклады ВАСХНИЛ, 1975, 8: 26-29.
Ф и с и н и н В.И., К р а в ч е н к о Н.А. Влияние стресс-факторов на гормональный статус в тканях птицы в зависимости от возраста. Сельскохозяйственная биология, 1979,
XIV(2): 191-194.
D a w k i n s M.S. Behavior as a tool in the assessment of animal welfare. Zoology, 2003, 106:
383-387.
З а б у д с к и й Ю.И. Современные методы диагностики состояния стресса у сельскохозяйственных птиц. Мат. Третьей межд. ирано-российской конф. «Сельское хозяйство и
природные ресурсы». М., 2002: 134-135.
B r o w n K.L. Environmental control in poultry production. Oliver& Boyd, Edinburg, 1967:
101-113.
B l o k h u i s H.J., V a n N i e k e r k T.F., B e s s e i W., E l s o n A., G u e m e n e D.,
K j a e r J.B., L e v r i n o G.A.M., N i c o l C.J., T a u s o n R., W e e k s C.A., D e W e e r d H.A.V. Welfare implications of changes in production systems for laying hens. World?s
Poult. Sci. J., 2007, 63(1): 101-114.
Ф и с и н и н В.И., К р а в ч е н к о Н.А. Оптимальные сроки перемещения молодняка и
профилактики стресса пересадки. Птицеводство, 1977, 7: 29-30.
В о з и а н о в А.Ф., Б у т е н к о А.К., З а к К.П. Цитокины. Биологические и противовоспалительные свойства. Киев, 1998.
Ф и с и н и н В.И. Влияние сукцианата на кур-несушек после воздействия стресса. Вестник сельскохозяйственной науки, 1976, 4: 81-85.
M o r m e d e P., A n d a n s o n S., A u p r e i n B., B e e r d a B., G u e m e n e D., M a l -
27
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
28
m k v i s t J., M a n t e c a X., M a n t e u f f e l G., P r u n e t P., V a n R e e n e n C.G.,
R i c h a r d S., V i e s s i e r J. Exploration of the hypothalamic-adrenal-axis as a tool to evaluate animal welfare. Physiol. Behav., 2007, 92: 317-339.
C r a i g J.V., M u i r W.M. Group selection for adaptation to multiple-hen cages: behavioral
responses. Poultry Sci., 1996, 75: 1145-1155.
G o l d s t e i n D.S. Catecholamines and stress. Endocrine Regulations, 2003, 37: 69-80.
H o l l a d a y S.D., E d e n s F.W. Effect of caponization on central nervous system monoamines in the Japanese quail. Comp. Biochem. Physiol., 1987, 86(3): 465-468.
G o l d s t e i n D.S. Plasma norepinephrine as an indicator of sympathetic neural activity in
clinical cardiology. Am. J. Cardiol., 1981, 48: 1147-1154.
D i l l o n J.E., R a l e i g h M.J., M c g u i r e M.T., B e r g i n - P o l l a c k D., Y u w i l e r A.
Plasma catecholamines and social behavior in male vervet monkeys (Cercopithecus aethiops sabaeus). Physiol. Behav., 1992, 51: 973-977.
B r o w n K.I., N e s t o r K.E. Implications of selection for high and low adrenal response to
stress. Poultry Sci., 1974, 53: 1297-1306.
M o f f i t t T.E., B r a m m e r G.L., C a s p i A., F a w c e t t J.P., R a l e i g h M., Y u w i l e r A., S i l v a P. Whole blood serotonin relates to violence in an epidemiological study. Biological Psychiatry, 1998, 43: 446-457.
L o r r a i n D.S., M a t u s z e w i c h L., H u l l E.M. 8-OH-DPAT influences extracellular
levels of serotonin and dopamine in the medial preoptic area of male rats. Brain Res., 1998,
790: 217-223.
G l i c k B. Antibody and gland studies in cortisone and ACTH-injected birds. J. Immunol.,
1967, 98: 1076-1084.
K o r t e S.M., B e u v i n g G., R u e s i n k W., B l o c k h u i s H.J. Plasma cathecolamine and
corticosterone levels during manual restraint in chicks from a high and low feather pecking line
oflaying hens. Physiol. Behav., 1997, 62: 437-441.
V i r d e n W.S., T h a x t o n J.P., C o r z o A., D o z i e r W.A., K i d d M.T. Environment,
well-being and behavior evaluation of models using corticosterone and adrenocorticotropin to
induce conditions mimicking physiological stress in commercial broilers. Poultry Sci., 2007,
86: 2485-2491.
S h i n i S., K a i s e r P., S h i n i A., B r y d e n W.L. Biological response of chickens (Gallus
gallus domesticus) induced by corticosterone and a bacterial endotoxin. Comp. Biochem.
Physiol., 2008, 149: 324-333.
R u s h e n J. Problems associated with the interpretation of physiological data in the assessment
of animal welfare. Appl. Animal Behav. Sci., 1991, 28: 381-386.
M o n e v a P., P o p o v a - R a l c h e v a S., A b a d j i e v a D., G u d e v D., S r e d k o v a V.
Poultry welfare assessment, is it possible to avoid handling-induced mental stress interference?
Biotechnology in Animal Husbandry, 2009, 25(5-6): 1055-1062.
М и ф т а х у т д и н о в А.В. Оценка информативности физиологических показателей
стресс-чувствительности у кур. Проблемы биологии продуктивных животных, 2012,
1: 46-52.
B u y s e J., D e c u y p e r e E., D a r r a s V.M., V l e u r i c k L.M., K u h n E.R., V e l d h u i s J.D. Food deprivation and feeding of broiler chickens is associated with rapid and
interdependent changes in the somatotriphic and thyrotropic axes. Br. Poult. Sci., 2000,
41: 107-116.
D e J o n g I.C., V a n V o o r s t A.S., E r k e n s J.H.F., E h l h a r d t D.A., B l o k h u i s H.J. Determination of the circadian rhythm in plasma corticosterone and catecholamine
concentrations in growing broiler breeders using intravenous cannulation. Physiol. Behav., 2001,
74: 299-304.
S a v o r y C.J., M a n n J. Is there a role for corticosterone in expression of abnormal behaviour in restricted-fed fowls? Physiol. Behav., 1997, 62: 7-13.
G r o s s W.B., S i e g e l H.S. Evaluation of the heterophil/lymphocyte ratio as a measure of
stress in chickens. Avian Diseases, 1983, 27(4): 972-979.
M a x w e l l M.H., H o c k i n g P.M., R o b e r t s o n G.W. Differential leucocyte responses to
various degrees of food restriction in broilers, turkeys and ducks. Br. Poult. Sci., 1992, 33: 177187.
E d e n s F.W., S i e g e l H.S. Adrenal responses in high and low ACTH response lines of
chickens during acute heat stress. Gen. Comp. Endocrinol., 1975, 25: 64-73.
M a x w e l l M.H. Avian blood leucocyte responses to stress. World's Poult. Sci. J., 1993, 49:
34-43.
P o s t J., R e b e l J.M., H u u r n e A.A. Physiological effect of elevated plasma corticosterone
concentrations in broiler chickens, an alternative means by which to assess the physiological effects of stress. Poultry Sci., 2003, 82: 1313-1318.
M a x w e l l M.H., R o b e r t s o n G.M. The avian heterophil leucocyte: a review. World's
Poult. Sci. J., 1998, 54: 155-178.
A l t a n O., A l t a n A., Q a b u k M., B a y r a k t a r H. Effects of heat stress on some blood
parameters in broilers. Turkish J. Vet. Animal Sci., 2000, 24: 145-148.
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
48. З а б у д с к и й Ю.И., С к у т а р ь И.Г. Миграционная активность лейкоцитов ? маркер
стресса птиц. Ветеринария, 1993, 3: 44-46.
49. F e l t e n S.Y., M a d d e n K.S., B e l l i n g e r D.L., K r u s z e w s k a B., M o y n i h a n J.A., F e l t e n D.L. The role of the sympathetic nervous system in the modulation of
immune responses. Adv. Pharmacol., 1998, 42: 583-587.
50. K a n g S.-Y., K o Y.-H., M o o n Y.-S., S o h n S.-H., J a n g I.-S. Effects of the сombined
stress induced by stocking density and feed restriction on hematological and cytokine parameters as stress indicators in laying hens. Asian-Australasian Association of Animal Societies, 2011,
24(3): 414-420.
51. J o n e s R.B. Fear and adaptability in poultry: insights, implications and imperatives. World's
Poult. Sci. J., 1996, 52: 131-174.
52. B l o k h u i s H.J., B e u v i n g G. Feather pecking and other characteristics in two lines of
laying hen. Proc. the 4th European Symposium on Poultry Welfare /C.J. Savory, B.O. Hughes
(eds.). Universities Federation for Animal Welfare, Potters Bar, UK, 1993: 266.
53. V e s t e r g a a r d K.S., K r u i j t t J.P., H o g a n J.A. Feather pecking and chronic fear in
groups of red jungle fowl: their relations to dustbathing, rearing environment and social stress.
Animal Behav., 1993, 62: 413-419.
54. J o n e s R.B., B l o c k h u i s H.J., B e u v i n g H.J. Open field and tonic immobility responses in domestic chicks of two genetic lines differing in their propensity to feather peck. Br.
Poult. Sci., 1995, 36: 525-530.
55. F o l s c h D.W., B e n e l l i A., G o z z o l i L. Die Auswirkungen der Bodenund Batterihaltung mit Unterschiedlicher Besatzdichte auf die Fortbewegung und das Gefieder von Legehennen. Proc. 6th European Poultry Conference. Hamburg, 1980: 160-168.
56. Щ е р б а т о в В.И., С и д о р е н к о Л.И., Л е в ч е н к о Е.В., П а х о м о в а Т.И.,
К у т о в е н к о Т.А., Д ж о л о в а М.Н. Способ прогноза стресса у яичных кур. Патент
РФ на изобретение № 2151502, A01K67/02. Опубл. 27.06.2000, Бюл. 2-2003.
57. T a u s o n R., K j a e r J., M a r i a G., C e p e r o R., H o l m K. The creation of a common scoring system for the integument and health of laying hens. In: Applied scoring of integument and health in laying hens. Specific Targeted Research Project. Swedish University of
Agriculture Sciences, 2004: 70.
58. G r i g o r P.N., H u g h e s B.O., A p p l e b y M.C. Social inhibition of movement in domestic hens. Animal Behav., 1995, 49: 1381-1388.
59. S a l a m a n o G., M e l l i a E., T a r a n t o l a M., G e n n e r o M.S., D o g l i o n e L.,
S c h i a v o n e A. Acute phase proteins and heterophil: lymphocyte ratio in laying hens in different housing systems. Vet. Record, 2010, 167: 749-751.
60. D o w n i n g J. Non-invasive assessment of stress in commercial housing systems. A report for
the Australian Egg Corporation Limited. Australian Egg Corporation Limited. AECL Publication No US108A, 2012: 69.
61. R e t t e n b a c h e r S., M o s t l E., G r o o t h u i s T.G.G. Gestagens and glucocorticoids in
chicken eggs. Gen. Compar. Endocrinol., 2009, 164: 125-129.
62. R o y o F., M a y o S., C a r l s s o n H.E., H a u J. Egg corticosterone: а noninvasive measure of stress in egg-laying birds. Journal of Avian Medicine and Surgery, 2008, 22: 310-314.
63. Р о г о в и н К.А., Т у п и к и н А.А., Р а н д а л л Дж.А., К о л о с о в а И.Е., М о ш к и н М.П. Многолетняя динамика уровня кортикостерона и его корреляты у самцов
большой песчанки (Rhombomys opimus Licht.) в природе. Неинвазивные методы в исследованиях стресса. Журнал общей биологии, 2006, 1(67): 37-52.
64. M ц s t l E., R e t t e n b a c h e r S., P a l m e R. Measurement of corticosterone metabolites in
birds droppings: an analytical approach. Annual New York Academy Science, 2005, 1046: 17-34.
65. М и ф т а х у т д и н о в А.В. Способ определения стрессового состояния кур мясного
направления продуктивности. Положительное решение на выдачу патента на изобретение по заявке № 2011120009 от 18.05.2011.
ФГБОУ ВПО Уральская государственная
академия ветеринарной медицины,
Поступила в редакцию
3 октября 2012
457100 Россия, Челябинская обл., г. Троицк, ул. Гагарина, 13,
e-mail: [email protected]
EXPERIMENTAL APPROACHES TO STRESS DIAGNOSTICS IN POULTRY
(review)
A.V. Miftakhutdinov
Ural State Academy of Veterinary Medicine, 13, ul. Gagarina, Troitsk, Chelyabinsk Province, 457100 Russia,
e-mail [email protected]
Received October 3, 2012
Abstract
Special data concerning stresses in poultry and their diagnostics in the laboratories and at
29
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
the commercial farms are summarized. To estimate the adaptation mechanisms and individual stress
resistance in chickens, different procedures have been reported till now. But the methods in which
the blood biochemical stress markers must be analyzed are hard to use at commercial farms so far as
special equipment and qualified personnel are required. Besides, the biochemical data from these tests
are not reliable and accurate. Calculation of the blood heterophyls to lymphocytes ratio is considered as
easier and more informative, and the feathering is referred as the highly valuable indicator of chronic
stresses, especially if combined with the stress hormones contents in blood and the time of tonic immobility of chickens. Nevertheless, to evaluate these parameters, a chicken should be subject to the manipulations which are the stressors itself, while only the minimal impact ensures a reliable stress indication. Because of that we improved the method which allows diagnosing stress in parent flocks of the
meat chickens by corticosterone test in excrements. The method can be used to control anti-stress therapy, to optimize the chicken flock size and crowded conditions, and to analyze the impact of applied
technologies and veterinary treatments in poultry.
Keywords: stress, hens, chickens, diagnostics of stresses.
ПРАВИЛА ОФОРМЛЕНИЯ ПРЕДСТАВЛЯЕМЫХ РУКОПИСЕЙ СТАТЕЙ
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
В журнале «Сельскохозяйственная биология» публикуются обзорные, проблемные, оригинальные
экспериментальные и методические работы по генетике и селекции сельскохозяйственных растений и животных, защите их от вредителей и болезней, молекулярной биологии, физиологии, биохимии, биофизике, радиобиологии, иммунитету, представляющие интерес для сельского хозяйства. Не
публикуются статьи серийные и статьи, излагающие отдельные этапы исследований, которые не позволяют прийти к определенным выводам.
Статьи представляются тщательно отредактированными, в 2 экземплярах, напечатанных на одной
стороне листа через два интервала (шрифт 14 Times New Roman) на бумаге стандартного формата, с
приложенным диском с файлом статьи в программе Word for Windows. Рукопись должна быть
подписана авторами и иметь заверенное печатью направление (на публикацию в журнале и в
сети Интернет) от учреждения, в котором выполнена работа, подтверждающее, что материалы
публикуются впервые.
При оформлении статей, содержащих экспериментальные данные, необходимо придерживаться
следующей схемы: обзор литературы, цель исследования, методика, результаты и выводы. Объем
обзорных и проблемных статей, включая список литературы, не должен превышать 18-22 стр., экспериментальных ? 10-12 стр., кратких сообщений ? 5 стр. Статья должна содержать реферат, отражающий структуру и основные положения стати (150-200 слов, с авторским переводом) и ключевые слова (на русском и английском языках).
Иллюстрации и подрисуночные подписи представляются в 2 экземплярах. Рисунки снабжаются всеми необходимыми цифровыми или буквенными обозначениями с их пояснениями в
подписи к рисунку. Максимальное число таблиц ? 3, рисунков ? 3; в кратких сообщениях ?
или 1 таблица, или 1 рисунок.
Формулы следует вписывать разборчиво. Во избежание ошибок в формулах необходимо размечать прописные (заглавные) и строчные буквы, а также верхние и нижние индексы. Сокращаемые слова (названия препаратов, химических соединений, методов, учреждений, латинские названия видов и др.) при первом упоминании приводятся полностью (иностранные ?
также с русским переводом). Единицы физических величин приводятся по Международной
системе СИ (ГОСТ 8.417-81), названия химических соединений, таксономические названия ?
в соответствии с международной номенклатурой (подробно об этом см. на сайте журнала
http://www.agrobiology.ru).
Список литературы должен содержать лишь те источники, на которые имеется ссылка в статье. Составляется список в порядке очередности упоминания этих источников в тексте. Для
цитируемых книг и сборников приводятся: фамилия и инициалы всех авторов, название, место издания (город, для иностранных источников ? город и страна) и год издания; для материалов научных собраний следует указать название, время и место проведения научного мероприятия, название конференции, симпозиума и т.д., при наличии редакторов сборника или
книги ? указать их фамилии и инициалы; при наличии тома, выпуска указываются их номера, приводятся номера цитируемых страниц «от-до»; для журнальных статей указываются фамилия и инициалы всех авторов, название статьи, полное название журнала, год издания, том,
номер (выпуск), страницы «от-до».
Необходимо указать фамилию, имя и отчество всех авторов рукописи полностью, фамилии и
инициалы в транслитерации, принятые авторами в зарубежных публикациях, место работы, адрес
и телефоны (служебный, домашний, мобильный), а также адрес электронной почты (e-mail),
официальное низание учреждения на английском языке.
При несоблюдении этих требований статья к рассмотрению не принимается. При отправке на
доработку датой поступления считается дата получения редакцией окончательного принятого к
публикации варианта статьи.
Аспиранты публикации не оплачивают. Копии отрицательных рецензий направляются авторам, положительных ? предоставляются по запросу.
Экземпляр журнала с опубликованной статьей авторам не высылается. Журнал распространяется только по подписке. Гонорар не выплачивается. Рукописи не возвращаются.
Подробную информацию см. на сайте журнала http://www.agrobiology.ru
30
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, № 2, с. 31-41
УДК 636.085.52+636.085.7
БИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ СИЛОСОВАНИЯ
И СЕНАЖИРОВАНИЯ ТРАВ
(обзор)
Ю.А. ПОБЕДНОВ, В.М. КОСОЛАПОВ
Описаны современные представления о закономерностях течения микробиологических
процессов при силосовании и сенажировании в зависимости от вида консервируемых трав и степени их провяливания с обоснованием рациональных способов консервирования растительных
кормов. Для обеспечения большей сохранности и повышения качества корма при выборе способа
консервирования трав следует учитывать особенности культуры (злаковые или бобовые травы),
содержание сахаров (в расчете на сухое вещество) и его изменение при провяливании растений,
степень подсушивания при провяливании, величину рН и сахаро-буферное отношение в кормовой
массе, численность эпифитной микрофлоры. Кроме того, необходимо строго соблюдать режимы
предварительной обработки массы, ее закладки, а также хранения и выемки кормов. К элементам технологии, обеспечивающей подавление деятельности нежелательных микроорганизмов (в
частности, маслянокислых бактерий, энтеробактерий и дрожжей, размножение которых вызывает соответственно контаминацию корма масляной кислотой и его аэробную порчу) относится
применение препаратов на основе осмотолерантных штаммов молочнокислых бактерий. Подавляющее число сортов многолетних злаковых трав, равно как и их смесей с бобовыми культурами,
выращиваемых в России, имеют оптимальное сахаро-буферное отношение (1,3-4,0) для эффективного силосования с указанными препаратами. Проблема силосования некоторых новых сортов
многолетних злаковых трав с избыточным содержанием сахара (сахаро-буферное отношение ?
4,0) легко решается при их возделывании в смешанных посевах с культурами, не обеспеченными
сахарным минимумом.
Ключевые слова: травы, силос, сенаж, молочнокислые бактерии, энтеробактерии,
дрожжи, сохранность и качество корма.
Силосование и сенажирование ? наиболее известные и применяемые в настоящее время биологические способы консервирования трав. В
основе силосования лежит процесс молочнокислого брожения (1), тогда
как сохранность сенажа базируется на «физиологической сухости» растительного сырья (2, 3). Считается, что при провяливании растений до содержания сухого вещества ? 45 % их водоудерживающая сила, достигая
значения 52 атмосферы и более, уже превышает сосущую силу большинства анаэробных бактерий, тем самым обусловливая невозможность активного развития последних. Общее условие для обоих способов консервирования ? соблюдение тщательной изоляции субстрата от атмосферного воздуха (1-3).
При силосовании по мере подкисления зеленой массы молочной
и частично уксусной кислотами, образующимися при сбраживании сахара молочнокислыми бактериями, жизнедеятельность гнилостных, маслянокислых и других нежелательных бактерий постепенно замедляется, и
как только активная кислотность (рН) силоса достигнет значения 4,24,0, их развитие прекращается (1, 3). Следовательно, одним из основных
условий получения доброкачественного силоса служит наличие в растениях достаточного количества сахаров. Согласно имеющимся данным
(4), оно должно быть выше буферной емкости растений как минимум в
1,7 раза (сахаро-буферное отношение ? 1,7) при силосовании свежескошенных трав и не менее чем в 1,3 раза (сахаро-буферное отношение ? 1,3)
при заготовке силоса из зеленой массы, провяленной до содержания сухого вещества 30-35 %.
При сенажировании сколько-нибудь значительная роль молочнокислого брожения в обеспечении сохранности питательных веществ в на31
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
шей стране не признается. Попытки же некоторых авторов указать на значение этого процесса при сенажировании (5) подвергались критике. Как
полагали, например, Г.А. Богданов и О.Е. Привало (6), на основании того,
что в провяленной массе, заложенной на сенаж, обнаруживается рост молочнокислых бактерий и накопление определенного количества молочной
кислоты, отдельные исследователи пришли к ошибочному заключению,
согласно которому сохранность корма при сенажировании обусловлена не
только физиологической сухостью сырья, но и в какой-то степени молочнокислым брожением.
Переоценка значения физиологической сухости субстрата вскоре
привела к тому, что ее приоритетную роль стали признавать и при силосовании трав, провяленных до содержания сухого вещества 31-40 %. С.Я. Зафрен (3), в частности, отмечал: «При влажности 60-69 % развитие нежелательных анаэробных бактерий предотвращается физиологической сухостью
для них субстрата. Поэтому корм с влажностью 60-69 % в зависимости от
содержания в нем сахара может подкислиться до рН 4,2 или нет, но это не
определяет его сохранности». К такому выводу автор приш?л на основании данных Дж. Виринга (7), который к этому времени установил, что по
мере увеличения содержания сухого вещества в силосуемой массе маслянокислое брожение устраняется при более высоком значении рН, нежели
это отмечается в силосе из свежескошенных трав. В то же время остается
открытым вопрос, служит ли подобный факт доказательством того, что
при силосовании провяленных трав степень подкисления корма утрачивает значение. Анализ работ Дж. Виринга показал, что он утверждал лишь
следующее: по мере увеличения содержания сухого вещества в силосуемой
массе чувствительность маслянокислых бактерий к кислотности корма существенно возрастает, что действительно позволяет подавить их жизнедеятельность при более высоком рН. Однако при каждом конкретном содержании сухого вещества масса должна обязательно, а главное быстро подкислиться до строго определенного значения рН, иначе опасность возникновения в ней маслянокислого брожения не устраняется.
Как показал практический опыт, именно последнее требование
труднее всего выполнить при силосовании зеленой массы, провяленной
до содержания сухого вещества 30-35 %. Причина заключается в том, что
в отличие от ранних представлений (1-3) повышение содержания сухого
вещества в силосуемой массе до 30-35 % и связанное с этим увеличение
осмотического давления в растительных клетках прежде всего угнетает
жизнедеятельность молочнокислых бактерий. Это особенно заметно на
первом, самом решающем этапе силосования провяленных трав (4). Как
правило, подобное приводит к тому, что активная кислотность, необходимая для подавления жизнедеятельности маслянокислых бактерий, создается в корме длительное время, в течение которого указанная группа
микроорганизмов продолжает развитие. В итоге к сроку, когда силос
стабилизируется, в нем уже успевает образоваться некоторое количество
масляной кислоты.
Впрочем, бывают и исключения. Они связаны с наличием таких
неконтролируемых в производственной практике факторов, как количество нитратов в силосуемой массе или обсемененность растений эпифитными молочнокислыми бактериями. Согласно имеющимся данным (4, 8),
при достаточном содержании сахара в провяленных травах маслянокислое
брожение не возникает лишь при условии, если содержание нитратов в их
сухом веществе составляет около 1,0 г/кг или численность эпифитных мо32
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
лочнокислых бактерий в расчете на 1 г массы достигает либо превышает
105 КОЕ. Значение нитратов сводится к тому, что продукты их восстановления (нитриты и окислы азота) обеспечивают подавление жизнедеятельности маслянокислых бактерий в первый период силосования провяленной массы, то есть до создания необходимой кислотности. При этом значение названного фактора во многом определяется содержанием сухого вещества в консервируемой массе. Так, по данным Н.П. Бурякова (9), активное восстановление нитратов (от половины до 97 %) наблюдается лишь
при силосовании трав с содержанием сухого вещества не выше 30 %, в то
время как при силосовании растений с содержанием сухого вещества 40 %
и более восстанавливается их незначительное количество.
При низком содержании нитратов в провяленной массе успешность ее силосования зависит от другого неконтролируемого фактора ?
высокой численности эпифитных молочнокислых бактерий, поскольку численность эпифитных молочнокислых бактерий на растительных покровах
во многом определяет и их качественный состав. Имеющиеся данные показывают (10, 11): если при численности эпифитных молочнокислых бактерий ? 103 кл/г зеленой массы они обычно представлены тремя-четырьмя
малоактивными кокковыми формами, то при плотности ? 105 кл/г ?
лишь одной высокоактивной палочкой Lactobacillus plantarum. По мнению Е.И. Квасникова и И.Ф. Щ?локовой (12), в силосах с повышенным
содержанием сухого вещества у L. plantarum отмечается тенденция опережать в росте другие молочнокислые бактерии, что свидетельствует об ее
лучшей приспособленности к условиям брожения на провяленной массе.
К аналогичному выводу пришли и мы на основании собственных исследований (13). Указанное обстоятельство становится причиной того, что при
высокой численности эпифитных молочнокислых бактерий наблюдается
быстрое (в течение 3 сут) подкисление провяленной массы до рН ? 4,3,
при котором прекращается жизнедеятельность всех нежелательных бактерий (14, 15). И именно это положение приобретает в настоящее время
особое значение при силосовании провяленных трав, так как устранение
маслянокислого брожения ? отнюдь не единственная задача, которую следует решать при заготовке такого корма. Не менее важно предотвратить
размножение и других нежелательных микроорганизмов, которые тоже (и
даже в большей степени, нежели молочнокислые бактерии) приспособлены к условиям брожения на провяленной массе и, по существу, служат
главным фактором увеличения потерь и снижения качества силоса из провяленных трав. К подобным микроорганизмам прежде всего следует отнести энтеробактерии и дрожжи (16).
Необходимо, однако, отметить, что, как и в случае с маслянокислыми бактериями, интенсивность развития энтеробактерий и дрожжей на
провяленной массе неодинакова и зависит от ряда обстоятельств. Так, при
силосовании многолетних бобовых трав, провяленных до содержания сухого вещества 30-35 %, сколько-нибудь заметного развития энтеробактерий и дрожжей не наблюдается (4, 17). Хотя и в этом случае задержка молочнокислого брожения, особенно в первый период силосования, проявляется довольно отчетливо. Причина этого доподлинно не известна. По
мнению некоторых исследователей (18, 19), ею может служить то, что при
провяливании молодых растений с высоким содержанием белка количество влаги, недоступной для бактерий, сильно возрастает. При этом растительные клетки начинают удерживать влагу с силой до 52 атмосфер (характерной для сенажа) уже при содержании сухого вещества в массе около
35 %, делая ее недоступной для энтеробактерий, а активному развитию
33
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
дрожжей мешает относительно невысокое содержание сахара в субстрате.
Возможно, поэтому в варианте с трудносилосующимися бобовыми травами, провяленными до указанного содержания сухого вещества, несмотря
на задержку молочнокислого брожения, большая часть сахара все же достается молочнокислым бактериям, а порча такого сырья в основном связана с маслянокислым брожением, на ликвидацию которого и должны
быть направлены все используемые технологические приемы.
Последнее в равной степени относится и к сенажу. Несмотря на
категоричность некоторых исследователей по обсуждаемому вопросу, результаты, полученные при сенажировании различных растений в производственных условиях, свидетельствуют о возможности накопления масляной кислоты и в этом виде корма. Так, К.Г. Нугматжанов (20) сообщает
о случае, когда содержание масляной кислоты в сенаже из горного разнотравья (49,1-55,1 % сухого вещества) составляло 0,7 %. Накопление подчас
значительного количества масляной кислоты в сенаже из различных растений, провяленных до содержания сухого вещества 45 % и более, отмечают и другие исследователи (21-23). Однако механизм образования масляной кислоты в сенаже несколько отличается от такового при заготовке
силоса. К подобному заключению позволяют прийти, например, опыты
Г.Д. Михеева (24), выполненные при сенажировании люцерны в производственных условиях. Автор установил, что при вскрытии траншеи с сенажом масляная кислота в нем отсутствовала. Начавшееся поступление
воздуха в толщу сенажа инициировало гнилостные процессы, сопровождающиеся увеличением (в 1,5-4,0 раза) образования аммиака и, как следствие, повышением рН полученного корма. В свою очередь, это привело к
развитию маслянокислых бактерий, обусловивших накопление в натуральном корме до 0,17 % масляной кислоты. На основании изложенных
фактов можно заключить, что при благоприятном течении брожения, отмечающемся при сенажировании даже несилосующихся бобовых трав, активная кислотность (рН) корма, как правило, достигает значения, при котором подавляется жизнедеятельность маслянокислых бактерий. Очевидно
и то, что подобное обеспечивается лишь при условии своевременного и
качественного укрытия сенажируемой массы. При несоблюдении этого
требования в корме происходят процессы аэробной деструкции, которая
может протекать на любом этапе консервирования, обусловливая снижение активной кислотности массы и, как следствие, возникновение в ней
маслянокислого брожения.
Таким образом, при сенажировании трав образование масляной
кислоты, как правило, происходит в результате вторичной ферментации,
обусловленной аэробной порчей корма, в то время как при силосовании
провяленных бобовых трав оно может быть результатом как первичной,
так и вторичной ферментации. Следовательно, если для получения свободного от накопления масляной кислоты сенажа достаточно обеспечить
быструю закладку массы в хранилища и их тщательную герметизацию, то
при силосовании бобовых трав, провяленных до содержания сухого вещества 30-35 %, наряду со строгой герметизацией корма, необходимы меры,
направленные на ускорение его подкисления до значения рН, критического для маслянокислых бактерий. Как уже отмечалось, это связано с тем,
что критическое значение рН для маслянокислых бактерий снижается по
мере уменьшения содержания сухого вещества в консервируемой массе, и
для его достижения в условиях слабого молочнокислого брожения требуется все больше времени. Однако наиболее важный практический вывод
состоит в том, что создание пусть незначительной, но все же вполне кон34
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
кретной активной кислотности массы необходимо и при сенажировании.
Зарубежные исследователи (25) давно установили критическое значение
рН для сенажируемой массы, при превышении которого в корме не устраняется опасность маслянокислого брожения. По их мнению, при провяливании растений до содержания сухого вещества 45 % масса должна подкислиться до рН не более 4,85, а при содержании сухого вещества 50 % ?
не более 5,00.
Возвращаясь к прогнозированию успешности силосования трав,
важно отметить, что даже при заготовке силоса из свежескошенных растений их сахаро-буферное отношение (установленный А.А. Зубрилиным
сахарный минимум) ? отнюдь не единственный фактор, обусловливающий результат консервирования. Не меньшее влияние на выход молочной кислоты, а следовательно, и степень подкисления корма оказывает
содержание сахара в натуральной зеленой массе, которое должно быть не
менее 1,5 % (4, 26). Лишь при содержании сахара ? 1,5 % в свежескошенной массе с сахаро-буферным отношением ? 1,7 культуры следует характеризовать как легкосилосующиеся. В противном случае это трудносилосующиеся растения.
Важно отметить, что при минимально необходимом сахаро-буферном отношении (1,8-2,0) и содержании сахара в натуральной свежескошенной массе 1,5 % отмечается самый высокий выход молочной кислоты
из сахара, достигающий 120 % (4, 26). Выход молочной кислоты из сахара
снижается при изменении обоих показателей как в сторону уменьшения,
так и в сторону увеличения. Это особенно заметно при их одновременном
уменьшении, что и служит основной причиной возникновения в корме
маслянокислого брожения.
Однако для практики большее значение имеет то, что в зависимости от конкретной величины сахаро-буферного отношения и количества
сахара в натуральном растительном субстрате их совокупное влияние на
выход молочной кислоты неодинаково. Так, до сахаро-буферного отношения в растениях 1,8-2,0 и содержания сахара 1,5 % оба фактора действуют
в направлении увеличения выхода молочной кислоты (27). Это и позволяет за счет повышения содержания сахара в силосуемой массе при ее предварительном обезвоживании компенсировать недостаточно высокое сахаро-буферное отношение, то есть улучшить сбраживаемость трудносилосующихся культур. При сахаро-буферном отношении в травах выше 2,0 и
количестве сахара в их натуральной массе более 1,5 % оба фактора действуют в противоположном направлении, обусловливая снижение выхода молочной кислоты, так как при силосовании свежескошенных трав в корме
по мере улучшения обеспеченности растений сахаром все сильнее активизируется спиртовое брожение (26).
Повышение содержания сахара в такой массе за счет провяливания
еще более усугубляет положение. Наши опыты показали (4), что при увеличении сахаро-буферного отношения в свежескошенных травах с 1,6 до 4,96,1 выход молочной кислоты из сахара снижается с 119,4 до 70,2-76,4 %,
то есть в 1,6-1,7 раза. В то же время при силосовании аналогичных растений, провяленных до содержания сухого вещества 30 %, выход уменьшался до 50,4-35,0 %, то есть уже в 2,4-3,4 раза (4). В обоих случаях весь содержащийся в травах сахар при силосовании расходовался практически
полностью. Это доказывает, что с ростом обеспеченности провяленных
трав сахаром увеличивается его доля, сбраживаемая при силосовании нежелательной микрофлорой. Значительно большее, чем при силосовании
35
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
свежескошенной массы, снижение выхода молочной кислоты из сахара
при силосовании провяленных трав объясняется тем, что в подобном случае, наряду с дрожжами, значительное развитие получают энтеробактерии.
В этом мы убедились, определив численность указанных микроорганизмов
при силосовании злаковой травосмеси с содержанием сухого вещества 36 %,
сахаро-буферным отношением 1,9 и количеством нитратов в сухом веществе силосуемой массы 4,0 г/кг. Результаты показали (4), что через 5 сут
величина рН такой массы все еще составляла 5,1, а численность энтеробактерий достигала 2,8Ѕ106 КОЕ/г. Отсюда понятно, почему (в отличие от
силоса из бобовых растений) силос из хорошо обеспеченных сахаром злаковых трав, провяленных до содержания сухого вещества 30-35 %, никогда
не подкисляется до значения рН, которое достигается в варианте с аналогичной, но не провяленной массой. Активное развитие энтеробактерий в
первый период силосования такой массы может привести к тому, что содержащегося в ней сахара попросту не хватит для создания в корме необходимой активной кислотности, вследствие чего неминуемо возникнет
вторичная ферментация, сопровождающаяся накоплением значительного
количества масляной кислоты.
На основании этого мы пришли к заключению (28), что процессы,
протекающие при силосовании провяленных трав по сути противоположны происходящим в силосе из свежескошенных растений. Если в последнем случае вероятность получения доброкачественного силоса по мере
улучшения обеспеченности растений сахаром возрастает, то при силосовании трав, провяленных до содержания сухого вещества 30-35 %, процесс
брожения, наоборот, становится все более непредсказуемым. Следовательно, по мере улучшения обеспеченности сахаром провяленных трав возрастает необходимость использования дополнительных приемов, нормализующих процесс брожения. Немаловажно и то, что продукты восстановления нитратов, губительно воздействующие на маслянокислые бактерии, не
только не оказывают никакого отрицательного влияния на энтеробактерии
и дрожжи, но даже стимулируют их развитие. Относительно дрожжей подобные данные уже приводятся в литературе (29). Что же касается энтеробактерий, то об их невосприимчивости к продуктам восстановления нитратов убедительно свидетельствует уже обсуждавшийся нами опыт по силосованию провяленной злаковой травосмеси с содержанием нитратов в
сухом веществе растений 4,0 г/кг. К настоящему времени имеется и теоретическое объяснение этого феномена. Установлено, что в отсутствие кислорода факультативные анаэробы, к которым, в частности, относятся энтеробактерии и дрожжи, могут получать энергию за счет анаэробного дыхания, используя нитраты в качестве акцепторов водорода. В описанном случае механизмы окисления органических субстратов при анаэробном и
аэробном дыхании не различаются (30). А это означает, что дыхательная
аммонификация у факультативных анаэробов позволяет им в анаэробных
условиях осуществлять полное окисление органических соединений до СО2
и Н2О с аккумулированием почти такого же количества энергии, как при
аэробном дыхании.
В то же время у энтеробактерий есть одно важное свойство, которое позволяет регулировать их численность в процессе силосования: они
не выносят высокой кислотности и погибают при быстром подкислении
массы до рН 4,3 и ниже (13, 16). Именно это было использовано при разработке эффективного и малозатратного способа подавления энтеробактерий с помощью препаратов на основе осмотолерантных штаммов молоч36
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
нокислых бактерий. Они обеспечивают такую же интенсивность молочнокислого брожения в провяленных травах, как эпифитные молочнокислые
бактерии ? в свежескошенной массе (14, 15), и, как следствие, скорость
подкисления того и другого корма также становится одинаковой. При оптимальном содержании сахара в силосуемой массе провяленных трав применение указанных препаратов приводит к тому, что в ней не получают
сколько-нибудь значительного развития не только энтеробактерии, но и
дрожжи, поскольку при быстром превращении содержащегося в растениях
сахара в молочную кислоту в анаэробных условиях дрожжи лишаются источника питания.
Отмеченное обстоятельство имеет большое практическое значение,
так как именно от интенсивности развития дрожжей в основном зависит
аэробная стабильность силоса и сенажа при выемке из хранилищ (8, 31). В
свете установленных выше особенностей течения микробиологических процессов очевидно и то, что при силосовании различных провяленных трав
эффективность указанных препаратов окажется неодинаковой и будет существенно отличаться от прогнозируемой на основании все еще господствующих в нашей стране представлений о силосовании с предварительным провяливанием (1-3, 32) и от результатов применения препаратов молочнокислых бактерий при силосовании свежескошенной зеленой массы
(1, 3, 33, 34). Согласно этим взглядам, при силосовании трав в свежескошенном и провяленном виде максимальный эффект от использования
препаратов молочнокислых бактерий должен наблюдаться на сырье с необеспеченным сахарным минимумом. Однако, как отмечалось выше, направленность микробиологических процессов при силосовании трав, провяленных до содержания сухого вещества 30-35 %, противоположна имеющей место в силосе из свежескошенных растений. Следовательно, наибольшую эффективность препаратов молочнокислых бактерий следует ожидать при силосовании хорошо обеспеченной сахаром провяленной массы с
высоким потенциалом нормального заквашивания, который не может реализоваться из-за задержки развития молочнокислых бактерий и сдвига процесса брожения в неблагоприятную сторону. Экспериментальная проверка
подтвердила справедливость этого положения (28, 35). Она показала, что
максимальный эффект от использования препаратов на основе осмотолерантных штаммов молочнокислых бактерий отмечается при силосовании
провяленных трав с содержанием сухого вещества 30-35 % и сахаро-буферным отношением 2,5-3,5, то есть сырья, относящегося по классификации
А.А. Зубрилина (1) к группе легкосилосующихся культур. При изменении
сахаро-буферного отношения в провяленных травах как в сторону уменьшения (ниже 2,5), так и в сторону увеличения (выше 3,5) эффективность
применения указанных препаратов снижается.
В первом случае это связано с более благоприятным течением процесса брожения в провяленной массе с необеспеченным сахарным минимумом (4, 28). По той же причине основной эффект от использования
препаратов молочнокислых бактерий при силосовании трудносилосующихся провяленных трав сводится лишь к устранению опасности возникновения в корме маслянокислого брожения. Во втором случае снижение
эффекта от использования препаратов молочнокислых бактерий обусловлено интенсификацией спиртового брожения. Поскольку входящие в состав препаратов осмотолерантные штаммы молочнокислых бактерий, превосходя по биологической активности эпифитные молочнокислые бактерии, обеспечивают быстрое подкисление корма до рН 4,0 и ниже, жизнедеятельность нежелательных бактерий подавляется и в корме накапливает37
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ся остаток сахара, который полностью утилизируется дрожжами. Вследствие этого по мере увеличения сахаро-буферного отношения в провяленной массе выше 3,5 эффективность препаратов молочнокислых бактерий
начинает постепенно снижаться, практически полностью исчезая при его
значении около 4,5 (4, 26, 35). Имеются доказательства (8, 31), что из-за
активного развития дрожжей силос из провяленных высокосахаристых
трав, приготовленный с внесением гомоферментативных молочнокислых
бактерий, при выемке из хранилищ портится значительно быстрее, нежели
обычный. По той же причине хорошо обеспеченные сахаром злаковые
травы не рекомендуется использовать и на сенаж. Резкое ограничение
жизнедеятельности молочнокислых и нежелательных бактерий высоким
осмотическим давлением в растительных клетках в этом случае обусловливает еще больший остаток сахара в корме, что при доступе воздуха
стимулирует активное развитие дрожжей, то есть процесс аэробной порчи. Как правило, после выемки из хранилищ такой корм очень быстро
разогревается и плесневеет (4).
Таким образом, для приготовления сенажа следует преимущественно использовать многолетние бобовые травы (люцерна, эспарцет, козлятник восточный, клевер луговой и т.п.). Пригодны для этой цели и
трудносилосующиеся злаковые травы. Из-за особенностей физиолого-биохимических процессов при их провяливании в прокосах даже до сенажной влажности (36) в сухом веществе растений отмечается постоянное
увеличение содержания сахара и, как следствие, повышение сахаро-буферного отношения в кормовой массе (но лишь при условии, что в течение одного светового дня ее уберут с поля в хранилище). При провяливании в прокосах хорошо обеспеченных сахаром злаковых трав наблюдается
обратный эффект. Содержание сахара в их сухом веществе начинает снижаться с самого начала провяливания, и в течение суток потери могут достигать 40 %, приводя к заметному ухудшению сбраживаемости (37). Потери
сахара тем выше, чем больше его содержание в исходной зеленой массе.
Поэтому хорошо обеспеченные сахаром многолетние злаковые травы следует быстро (в течение 2-6 ч) провяливать до содержания сухого вещества 30-35 % и закладывать на силос с применением препаратов на основе
осмотолерантных штаммов молочнокислых бактерий.
Подавляющее число сортов многолетних злаковых трав, равно как
и их смесей с бобовыми культурами, выращиваемых в России, имеют оптимальное сахаро-буферное отношение (1,3-4,0) для эффективного силосования с указанными препаратами. Проблема силосования некоторых
новых сортов многолетних злаковых трав с избыточным содержанием сахара (сахаро-буферное отношение ? 4,0) легко решается при их возделывании в смешанных посевах с культурами, не обеспеченными сахарным
минимумом.
Итак, выбор способа консервирования трав определяется прежде
всего их видом. Несилосующиеся травы (люцерна, козлятник восточный,
клевер луговой 2-го и последующих укосов и т.п.) целесообразно использовать в основном на сенаж, провяливая растения до содержания сухого
вещества 45-50 %. При неукоснительном соблюдении технологии это неизменно обеспечивает получение качественного (с минимальными потерями питательных веществ) корма, стабильного в процессе как хранения,
так и выемки из хранилищ. Трудносилосующиеся бобовые и злаковые
травы (клевер луговой 1-го укоса, лядвенец рогатый 2-го и последующих
укосов, ежа сборная 1-го укоса и остальные злаковые травы 2-го и последующего укосов, за исключением некоторых сортов райграсов и создан38
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ных на их основе гибридов) в зависимости от погодных условий можно
использовать как на сенаж, так и на силос, провяливая до содержания сухого вещества 30-35 % и стимулируя молочнокислое брожение в корме
внесением препаратов, созданных на основе осмотолерантных штаммов
молочнокислых бактерий. Легкосилосующиеся травы, к которым относится подавляющее число многолетних злаковых трав 1-го укоса, из-за высокого содержания сахара не подходят в качестве сырья для сенажирования,
так как при этом способе консервирования обеспечивается получение нестабильного при выемке корма. Такие травы после кратковременного провяливания до содержания сухого вещества 30-35 % следует преимущественно использовать на силос, стимулируя в нем молочнокислое брожение внесением препаратов на основе осмотолерантных штаммов молочнокислых бактерий. Тем же способом целесообразно консервировать и
некоторые легкосилосующиеся бобовые травы, например лядвенец рогатый 1-го укоса, а также легкосилосующиеся бобово-злаковые смеси (клеверо-тимофеечная смесь, вико-овсяная смесь и т.п.). Хотя содержание
нитратов и обсемененность растений эпифитными молочнокислыми бактериями служат факторами, обеспечивающими (наряду с сахарами) высокую сохранность и качество корма, их пока что не удается контролировать
в производственных условиях.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
18.
19.
З у б р и л и н А.А. Консервирование зеленых кормов. М., 1938.
М и х и н А.М. Силосование в засушливой зоне. Сталинград, 1937.
З а ф р е н С.Я. Технология приготовления кормов. М., 1977.
П о б е д н о в Ю.А. Основы и способы силосования трав. СПб, 2010.
П е т р о с я н В.А., А б р а м я н А.С. Сравнительная эффективность силосования, химического консервирования и сенажирования зеленых кормов. В сб.: Технология производства, хранения и использования кормов (Научные труды ВАСХНИЛ). М., 1978: 25-27.
Б о г д а н о в Г.А., П р и в а л о О.Е. Сенаж и силос. М., 1983.
В и р и н г а Дж. Некоторые факторы, влияющие на брожение силоса. Новое в улучшении и использовании сенокосов и пастбищ. Мат. 8-го Межд. лугопастбищного конгресса
(11-21 июня 1960 года, г. Рединг, Англия). Пер. с англ. М., 1963: 334-343.
В а й с б а х Ф. Будущее консервирования кормов. Проблемы биологии продуктивных
животных, 2012, 2: 49-70.
Б у р я к о в Н.П. Физиологическое обоснование эффективности использования кормов с повышенным уровнем нитратов в рационах крупного рогатого скота. Докт.
дис. М., 2010.
F e h r m a n n E., M ? l l e r Th. Jaresverlauf des epiphytischen Mikrobenbesatzes auf einen
Graslandstandort. Das Wirtschaftseigene Futter, 1990, 36(1): 66-78.
M ? l l e r Th., F e h r m a n n E., S e y f a r t h W., K n a b e O. Quality of grass silage depending on epiphytic lactic acid bacteria. Landbauforschung Vцlkenrode, 1991, 123: 297-300.
К в а с н и к о в Е.И., Щ ? л о к о в а И.Ф. Новое в микробиологии силосования кормов.
Известия АН СССР, Cер. биологическая, 1968, 4: 543-556.
П о б е д н о в Ю.А. Теоретическое обоснование и разработка способов приготовления
энергонасыщенных высокопротеиновых силосованных кормов на основе регулирования
микробиологических процессов. Докт. дис. М., 2003.
P o b e d n o w Yu., W e i s s b a c h F., P a h l o w G. ?ber den Effekt von Milchsдurebacterien-Prдparaten auf die Sдuerrungsgeschwindigkeit und die Gдrqualitдt von Welksilage. Landbauforschung Vцlkenrode, 1997, 3: 97-102.
П о б е д н о в Ю.А. Влияние содержания сухого вещества, сахара и эпифитных молочнокислых бактерий на эффективность консервирования трав новыми бактериальными
препаратами. Кормопроизводство, 2005, 3: 24-27.
П о б е д н о в Ю.А. Теоретические аспекты силосования провяленных трав. Кормопроизводство, 1998, 8: 21-25.
Ф и л а т о в И.И., К у з н е ц о в а Т.Т., С а ф р о н о в а Л.Г. Микробиологические и
биохимические процессы при силосовании люцерны с разным уровнем сухого вещества.
Сибирский вестник сельскохозяйственной науки, 1978, 5: 44-49.
З у б р и л и н А.А., М и ш у с т и н Е.Н., Х а р ч е н к о В.А. Силос. М., 1950.
Д ж у м а н а з а р о в Б.Н. Процессы, происходящие при хранении сенажа. Бюллетень
39
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ВНИИФБиП сельскохозяйственных животных (Боровск), 1973, 3(29): 50-53.
20. Н у г м а т ж а н о в К.Г. Микробиологические способы повышения качества корма. Алма-Ата, 1984.
21. T h a y s e n J. Ganzpflanzensilage (GPS) zunehmend interessant. Milchpraxis, 1996, 34(2): 80-83.
22. К у н а н б а е в С.К. Научное обоснование сроков уборки, способов консервирования
и использования зернофуражных культур на севере Казахстана. Автореф. канд. дис.
Алматы, 2007.
23. Д у б о р е з о в В.М., В и н о г р а д о в В.Н., Е в с т р а т о в А.И., К и р н о с И.О., С у с л о в а С.В., С о в е т к и н К.С., Д е л я г и н а Е.Н., Н е ф ? д о в Г.Г. Приготовление
объемистых кормов с использованием консервантов различной природы: Рекомендации,
Дубровицы, 2005.
24. М и х е е в Г.Д. Технология приготовления сенажа из люцерны в условиях Туркменской
ССР. В сб.: Технология производства, хранения и использования кормов (Научные труды ВАСХНИЛ). М., 1978: 70-73.
25. В а й с б а х Ф., Ш м и д т Л., Х а й н Е. Метод предотвращения нежелательного процесса брожения при силосовании, основанный на химическом составе зеленых кормов. Сб.
материалов 12-го Межд. конгр. по луговодству (11-20 июня 1974 года, г. Москва). М.,
1977, т. 2: 235-237.
26. П о б е д н о в Ю.А. Силосуемость кормовых трав и пути ее улучшения. Проблемы биологии продуктивных животных, 2008, 3: 94-106.
27. П о б е д н о в Ю.А. Новые подходы к прогнозированию эффективности и оптимизации процессов силосования трав. Проблемы биологии продуктивных животных, 2009,
3: 89-100.
28. П о б е д н о в Ю.А., О с и п я н Б.А. Препараты молочнокислых бактерий при силосовании: теория, проблемы и перспективы применения. Адаптивное кормопроизводство,
2013, 1(13): 21-30.
29. L ? c k E. Chemische Lebensmittelkonservirung. Berlin, Heidelberg, N.Y., Tokyo, 1985.
30. Современная микробиология. Т. 1. Прокариоты /Под ред. Й. Ленглера, Г. Древса, Г. Шлегеля. М., 2005.
31. D a v i e s D.R., F y c h a n R., J o n e s R. Aerobic deterioration of silage: causes and controls.
Proc. Alltech?s 23d Annu. Symp. «Nutritional Biotechnology in the Feed and Food Industries».
Nottingham, 2007: 227-238.
32. К о с о л а п о в В.М., Б о н д а р е в В.А., К л и м е н к о В.П., К р и ч е в с к и й А.Н.
Приготовление силоса и сенажа с применением биологических препаратов Биосиб и
Феркон. М., 2009.
33. Ч у к а н о в Н.К. Микробиология на службе кормопроизводства. Алма-Ата, 1975.
34. Р а м е н с к и й В.А. Научное и практическое обоснование способов повышения качества силосов и эффективность их использования при производстве говядины. Автореф.
докт. дис. Оренбург, 2006.
35. П о б е д н о в Ю.А., П а н к р а т о в В.В. Эффективность и особенности силосования
трав с препаратами молочнокислых бактерий. Проблемы биологии продуктивных животных, 2008, 1: 93-102.
36. П о б е д н о в Ю.А. О новообразовании сахара при провяливании трав. Кормопроизводство, 2012, 8: 37-40.
37. П о б е д н о в Ю.А., М а м а е в А.А., М а м а е в а М.В. К вопросу о физиолого-биохимических процессах при провяливании трав на сенаж и силос. В сб.: Многофункциональное адаптивное кормопроизводство. М., 2011: 280-294.
ГНУ Всероссийский НИИ кормов
им. В.Р. Вильямса Россельхозакадемии,
Поступила в редакцию
7 мая 2013 года
141055 Россия, Московская обл., г. Лобня, Научный городок,
e-mail: [email protected]
BIOLOGICAL BASES OF GRASS SILAGE AND HAYLAGE MAKING
(review)
Yu.A. Pobednov, V.M. Kosolapov
V.R. Vil?yams All-Russian Research Institute of Fodder, Russian Academy of Agricultural Sciences, Nauchnyi Gorodok, Lobnya, Moscow Province, 141055 Russia, e-mail [email protected]
Received May 7, 2013
Abstract
The current concept about regularities of microbiological processes at ensiling and
haymaking depending on the kind of preserved grasses and a degree of wilting is represented in the
review. On this base the rational methods for plant mass conservation have been proved. The
40
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
conservation method should be selected with due regard to the crop peculiarities (gramineous or
leguminous grass), sugars contents (per dry matter) and its changes under the grass wilting, a degree
of plants drying, the pH and sugar-buffer ratio in forage mass, and the composition of epiphytic
microflora to provide an improved fodders storage and increased quality. Besides, it is necessary to
keep strictly the modes of preliminary mass processing and loading as well as silage storage and
removing. The silage additives, based on the osmotically tolerant strains of lactic acid bacteria, is one
of the important elements in the applied technology, providing inhibition of growth of the
undesirable microorganisms, including butyric acid bacteria and the yeasts activity, that can lead to
fodders contamination by the butyric acid. Most perennial grass varieties, as well as their mixtures
with legumes, cultivated in Russia, are characterized by optimal sugar-buffer ratio (1.3-4.0) for the
effective ensiling with above pointed bacterial inoculants. But some new perennial gramineous
grass varieties have excessive sugar contents (sugar-buffer ratio is ? 4.0) and are included in the
group of the hard-to-ensile crops. For solving the ensiling problems with such perennial grasses, it
should be recommended to cultivate them in mixed sowings with crops, characterized by lack of
sugar minimum.
Keywords: grass, silage, haylage, lactic acid bacteria, enterobacteria, yeasts, stability and
quality of forage.
Научные собрания
IX МЕЖДУНАРОДНАЯ КОНФЕРЕНЦИЯ ПО БИОИНФОРМАТИКЕ РЕГУЛЯЦИИ
И СТРУКТУРЫ ГЕНОМОВ И СИСТЕМНОЙ БИОЛОГИИ (BIOINFORMATICS OF
GENOME REGULATION AND STRUCTURE/SYSTEMS BIOLOGY ? BGRS/SB-2014)
(23-28 июня 2014 года, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск, Россия)
BGRS/SB-2014 будет проходить в рамках Мультиконференции «Биоинформатика и
системная биология», интегрирующей биоинформационные и экспериментальные подходы к
исследованию биологических систем и процессов.
Научные
ѓ
ѓ
ѓ
ѓ
ѓ
ѓ
ѓ
ѓ
ѓ
секции и симпозиумы:
Геномика. Протеомика
Генные сети. Реконструкция и моделирование генных сетей
Системная биология взаимодействий патоген?хозяин
Эволюционная биология
Нейробиология, нейрогенетика
Генетика человека
Высокопроизводительные компьютерные вычисления в естественных науках
Интеллектуальный анализ знаний и поиск закономерностей в биологических базах
данных и научных текстах
Системная биология растений
Также пройдет Школа молодых ученых «Системная биология и биоинформатика» (SBB-2014).
Контакты и информация: http://conf.nsc.ru/BGRSSB2014, [email protected]
10TH EUROPEAN CONFERENCE OF PRCISION AGRICULTURE (ECPA)
«EFFICIENT RESOURCES MANAGEMENT UNDER CHANGING GLOBAL CONDITIONS»
(12-16 июля 2015 года, Израиль)
Организатор: ARO (Agricultural Research Organization) Министерства сельского хозяйства и
развития сельскохозяйственного производства Израиля.
Тематика конференции: прецизионное сельское хозяйство как средство эффективного управления ресурсами в условиях глобальных изменений.
ARO ? крупнейший сельскохозяйственный исследовательский центр в Израиле,
объединяющий шесть институтов (по растениеводству, животноводству, защите растений,
почвенным, водным и экологическим исследованиям, переработке и пищевым продуктам), а
также четыре опытных исследовательских станции в разных районах страны. Генбанк Израиля по сельскохозяйственным культурам также расположен в этом центре. На фоне развития
всех направлений исследований особое внимание уделяется проблемам ведения сельского хозяйства в аридных зонах, что позволяет Израилю быть мировым лидером по выходу продукции в подобных условиях.
Среди самых жестких вызовов современности ? климатические изменения, глобальное потепление и ограниченность водных ресурсов. Предлагаемые в этой связи технологии и научные разработки израильских специалистов способны внести существенный вклад в
улучшение ситуации на продовольственном рынке и привлекают к себе пристальное внимание ученых и специалистов во всем мире.
Контакты и инфорация: http://www.ispag.org/Events/9thECPA/
41
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, № 2, с. 42-49
УДК 636.44:[573.6.086.83+577.21]:616-089.843
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ТРАНСГЕННЫХ GAL-KO СВИНЕЙ
В КСЕНОТРАНСПЛАНТАЦИИ: ПРОБЛЕМЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ
Н.А. ЗИНОВЬЕВА1, А.В. МЕЛЕРЗАНОВ2, Е.В. ПЕТЕРСЕН2, Н. КЛИМЮК3,
Н.А. ВОЛКОВА1, А.С. ДУХ2, И.А. ТРУСОВА2, Э. ВОЛЬФ3, Г. БРЕМ4
Ксенотрансплантация (межвидовая трансплантация) имеет огромный потенциал для
решения проблемы нехватки внутренних органов, тканей и клеток для пересадки человеку. В
статье рассматриваются возможности использования генетичес??и модифицированных свиней в
качестве доноров таких органов и тканей. Дано краткое описание процесса сверхострой реакции
отторжения (HAR). Одним из способов предотвращения HAR может стать создание свиней, у
которых отсутствуют ?-1,3-Gal эпитопы ? основные ксеноантигены при пересадке органов от
свиней приматам. Проанализирована результативность работ по таргетингу гена ?-1,3галактозилтрансферазы (GGTA1) в клетках свиней с помощью различных методов: эффективность таргетинга GGTA1 (доля полученных жизнеспособных поросят с нокаутом GGTA1 от числа
пересаженных клонированных эмбрионов) между лабораториями различалась и варьировала от
0,0 до 5,0 %. Кратко описаны технологии, применяемые при получении трансгенных свиней с
«выключенным» геном GGTA1 (GAL-KO свиньи). Дискутируются возможности использования
органов и тканей GAL-KO свиней в ксенотрансплантации. Показаны преимущества применения
кожи GAL-KO свиней как материала для временного покрытия ожоговых ран по сравнению с
кожей обычных свиней и аллогенной трансплантацией. Рассматривается возможность использования GAL-KO свиней в качестве доноров сердечных клапанов. Обсуждаются задачи исследований на перспективу.
Ключевые слова: трансгенные свиньи, GAL-KO, ксенотрансплантация, доноры органов
и тканей, пересадка кожи, сердечные клапаны свиней.
Ключевой проблемой трансплантационной медицины остается нехватка внутренних органов и тканей для пересадки человеку. Одним из
перспективных направлений ее решения в настоящее время считают использование органов и тканей животных ? ксенотрансплантацию.
В качестве наиболее подходящего вида животных ? потенциальных доноров рассматриваются свиньи. Свиньи широко распространены,
их легко выращивать и содержать, их органы сходны с человеческими по
размерам и физиологии, многие люди принимают факт изъятия свиных
донорских органов, поскольку свиней выращивают как источник пищи
для человека (1). Однако до недавнего времени использование свиней в
качестве доноров обсуждалось только теоретически, поскольку пересадка
их органов и тканей приматам сопровождалась отторжением в течение нескольких суток или даже часов после трансплантации (сверхострая реакции отторжения, HAR). Было установлено, что у последних (в том числе у
человека) HAR обусловлена преимущественно наличием в крови естественных антител к карбогидратным эпитопам (?-1,3-Gal), которые синтезируются ?-1,3-галактозилтрансферазой (?-1,3-GalT), кодируемой GGTA1.
GGTA1 функционален у большинства видов животных, включая свиней,
но неактивен у человека и мартышек. После пересадки органов свиней
приматам «натуральные» антитела связываются с эпитопами ?-1,3-Gal на
эндотелии трансплантанта и активируют систему комплемента, приводя к
активации коагуляционного каскада и обусловливая тем самым HAR (2).
Таким образом, проблема заключается в том, чтобы снять HAR, а
следовательно, увеличить период функционирования трансплантантов. Ее
решением может стать создание так называемых GAL-KO трансгенных
свиней (?-1,3-GalT knock-out pigs) с «выключенным» геном GGTA1. Достижение существенного прогресса в этом научном направлении оказалось
возможным благодаря разработке эффективного метода клонирования
42
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
свиней с использованием соматических клеток в качестве доноров ядер
(3). Все GAL-KO свиньи получены методом пересадки ядер генетически
трансформированных соматических клеток свиней с нокаутом (в гемиили гомозиготном состоянии) GGTA1. Как показано в таблице, эффективность таргетинга GGTA1 (доля полученных жизнеспособных поросят с нокаутом GGTA1 от числа пересаженных клонированных эмбрионов) между
лабораториями сильно различается и варьирует от 0,0 до 5,0 %.
Не отмечено
4/10
3/20
3/29
3/21
Не отмечено
Не отмечено
Не отмечено
2/12
4/8
5/11
5/12
2/7
Тип свиней
Супоросности
после пересадки
эмбрионов
Эффективность
таргетинга
Клонировано
эмбрионов
215
9,3
395
1,0
217
0,9
159
5,0
1005
0,5-2,3
1400
0,1
Не отмечено Не отмечено
681
0,7
19738
0,0-0,7
926
0,9
1312
1,0
1953
0,3
1919
0,2
Обычные свиньи
Обычные свиньи
Минипиги
Обычные свиньи
Обычные свиньи
Обычные свиньи
Обычные свиньи
NIBS минипиги
NIBS минипиги
Banna минипиги
Ссылка
литературы
Neo
Neo
Neo
Neo
Neo
Puro
Neo
Neo
Hygro
Neo
Neo
Neo
Neo
Число
гемизиготных
поросят
с нокаутом
4
4
4
9
9
9
9
9
9
9 9
9
6
Позитивная
селекция
Выключаемый
экзон
Эффективность таргетинга гена GGTA1 в клетках свиней с использованием
различных методов (4)
Нет данных
18
6
7
7
Нет данных
1
Нет данных
2
9
13
6
3
(5)
(6)
(7)
(8)
(9)
(7)
(10)
(11)
(12)
(13)
(14)
(14)
(15)
Впервые о создании GAL-KO свиней сообщили две лаборатории в
США: компания «PPL Therapeutics Inc.» получила линию с нокаутом
GGTA1 на основе обычных домашних свиней, использованных в качестве
доноров ядер (9, 16), в то время как группа исследователей из Университета Миссури (University of Missouri) ? на основе минипигов (8, 17). В настоящее время первая линия свиней поддерживается компанией «Revivicor» (штат Виргиния, США), которая создана в 2003 году на базе американского отделения «PPL Therapeutics Inc.» совместно с инвестиционной
группой, руководимой медицинским центром Университета Питсбурга
(University of Pittsburg), вторая ? исследовательским центром трансплантационной биологии Бостона (Transplantation Biology Research Center ?
TBRC, штат Массачусетс, США). Обе линии активно вовлечены в различные доклинические исследования, а также служат донорами клеток для
проведения дополнительных генетических манипуляций.
Принимая во внимание перспективы использования GAL-KO
трансгенных свиней в трансплантационной медицине, в последующем еще
по крайней мере шесть исследовательских групп из разных стран сообщили о создании таких животных. На базе коммерческих пород получены
GAL-KO свиньи в Университете Аделаиды (University of Adelaide) в сотрудничестве с «BresaGen Ltd.» (Австралия) (6, 18) и в Университете Людвига-Максимилиана (Ludwig-Maximilians Universitдt, Мюнхен, Германия)
(19). Группа из исследовательского института по инженерии животных
(Animal Engineering Research Institute, Тсукуба, Япония) получила гомозиготных GAL-KO свиней с помощью метода предварительной in vitro селекции клеток с нокаутом GGTA1 в гомозиготном состоянии (12, 13).
Учеными из института Фридриха-Лефлера (Friedrich-Loeffler Institut, Нойштадт, Германия) предложен новый подход для эффективного получения
биаллельных GAL-KO свиней посредством нокаута GGTA1 с использова43
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
нием цинк-фингерных нуклеаз (20). Группа из института биологических
наук Nippon (Nippon Institute for Biological Science, Хокуто, Япония) сообщила о создании GAL-KO свиней на базе собственной линии минипигов (14). Китайские исследователи с применением метода транскрипции
активатороподобных эффекторных нуклеаз (TALENs) получили инбредных минипигов линии Banna (BMI) с биаллельным нокаутом GGTA1 (15).
Некоторые ограничения в развитии работ по генетической модификации свиней в связи с целями ксенотрансплантации наблюдались в
самом начале XXI века, когда было высказано предположение о том, что
присутствующие в геноме этих животных эндогенные ретровирусы (porcine endogenous retroviruses ? PERV) могут активироваться в геноме других
видов и представлять опасность не только для самого пациента, но и для
остальных людей. Однако проведенные исследования полностью опровергли подобное предположение (21).
Следует отметить, что создание GAL-KO свиней позволяет (в большей степени) решить только проблему предотвращения HAR при пересадке их органов и тканей человеку. Дальнейший прогресс в использовании
таких животных в качестве доноров для ксенотрансплантации связывают с
проведением с ними специальных манипуляций, в частности позволяющих экспрессировать белки-регуляторы комплемента человека ? CD46,
CD55 и CD59 (22). В качестве технологий, обеспечивающих предотвращение острого гуморального отторжения пересаженных органов и тканей,
рассматриваются генетические модификации свиней с целью экспрессии
белков человека: эндотелиальной экто-аденозиновой фосфатазы CD39 (экто-АДФазы), эндотелиального рецептора протеина С (endothelial protein C
receptor ? EPCR), гемоксигеназы 1, тромбомодулина 1 и ингибитора пути
тканевого фактора (tissue factor path inhibitor ? TFPI) (23). На следующем
этапе предполагаются модификации этих животных-доноров, направленные на дополнительную экспрессию генов, которые препятствуют процессу клеточного отторжения (24).
Несмотря на то, что достижение вышеназванных целей требует проведения новых широкомасштабных исследований, успехи в нокауте GGTA1
позволяют уже сегодня говорить о потенциальном значении GAL-KO свиней для решения некоторых задач трансплантационной медицины.
Использование в качестве источника кожи в тер а п и и о ж о г о в ы х р а н. Среди различных повреждений мирного времени на долю ожогов приходится 4-6 %. В России ежегодно ожоги различной степени тяжести получают более 500 тыс. человек. В 2009 году
число ожогов на 1000 человек взрослого населения составило 2,1, на 1000
детей ? 2,5 (25). Идеальным материалом для трансплантации, бесспорно,
служит собственная (аутологичная) кожа пациента, взятая с необожженного участка, однако ее источники даже при применении техник тканевой
экспансии ограничены (26, 27). В этой связи «золотым стандартом» для
временного закрытия ожоговых ран после удаления некротических тканей
считается аллогенная кожа (28). Такая пересадка стимулирует краевую эпителизацию, ограничивает микробную инвазию через поврежденные структуры в организм пострадавшего, обеспечивает прекращение раневой плазмопотери, снижение болевого синдрома и сокращение срока подготовки
ожоговых ран к аутотрансплантации, кроме того, уменьшается потребность
в аутологичной коже. К недостаткам при использовании аллогенной кожи
следует отнести этические вопросы, ее высокую стоимость, риск передачи
заболеваний, а также нехватку доноров.
Кожа свиньи и человека сходна по многим характеристикам (29,
44
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
30). Зафиксированная в глутаровом альдегиде свиная кожа уже давно используется в качестве временного покрытия при ожогах III степени в условиях военных действий (31). Однако она быстро отторгается ? как правило, в течение не более чем 3 сут (32, 33).
Уже первые результаты исследований GAL-KO свиней показали
перспективы их использования в качестве доноров кожи для временного
закрытия ожоговых ран. J. Weiner с соавт. (34) пересадили двум павианам
аутологичную (собственную), аллогенную (от других неродственных павианов) и ксеногенную кожу (от обычных и GAL-KO свиней). Если полное отторжение кожи обычных свиней наблюдалось уже на 4-е сут, а аллогенной ? на 9-е сут, то отторжение кожи GAL-KO свиней у одного павиана произошло на 11-е сут, у другого ? на 14-е сут после пересадки.
Полученные результаты позволили сделать вывод о том, что кожа GALKO свиней в качестве первоначального покрытия обширных ожоговых ран
может служить альтернативой аллогенной коже человека, при том что
биоматериал от свиней дешевле, доступнее и потенциально способен сохранять жизнеспособность более длительное время.
Использование в качестве доноров сердечных клап а н о в. Ежегодно в мире проводится около 300 тыс. операций по замене
сердечных клапанов (35). Оптимальной заменой считается имплантация аллогенного бесклеточного матрикса, обладающего неограниченной продолжительностью использования, исключительной гемодинамикой (не требуется применение антикоагулянтов) и способностью к росту. Такой трансплантант способен к ревитализации in vivo клетками реципиента, которые формируют функциональный эндотелий и интерстиций. Ограничение в источниках донорских сердечных клапанов обусловливает поиск новых подходов к решению проблемы. Использование для этих целей механических
протезов или биопротезов имеет ряд недостатков, связанных с необходимостью применения антикоагуляционной терапии в течение всего последующего периода после пересадки или с возможностью потери функций вследствие кальциноза и стеноза. Применение биопротезов на основе клапанов
животных, в частности свиней и коров, не исключает наличия у пациентов иммунного ответа (36), так как коммерческие биопротезы (даже от основных производителей) после подготовки содержат главный ксеноантиген GGTA1 (37). Проведенные модельные исследования на крысах показали достоверно более низкий уровень кальциноза трансплантированных сердечных клапанов от GAL-KO свиней по сравнению с интактными особями
как в присутствии, так в отсутствие специфических антител к GGTA1, что
позволяет предположить преимущество GAL-KO свиней в качестве нового
источника биоматериала для создания биопротезов сердечных клапанов (38).
Однако самым многообещающим и в то же время сложным направлением остается создание биотехнологии, позволяющей выращивать у
свиней человеческие органы (39-43). Эта технология объединяет возможности использования организма геномодифицированного животного в качестве биореактора и стволовой ниши для формирования в ней человеческих органов из индуцированных стволовых клеток (induced pluripotent
stem cells ? iPS), поскольку с разработкой методов выращивания iPS стало
возможным их получение непосредственно от пациента. В лаборатории
профессора H. Nakauchi такой подход для создания органов был реализован на модели мелких животных (39, 40) и в настоящий момент ведется
работа по формированию человеческих органов в организме крупных животных ? свиней (41). Можно предположить, что описанный прием с использованием полученной от GAL-KO свиней неиммуногенной матрицы
45
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
для заселения аутологичных клеток снимет проблему отторжения пересаживаемых органов, с которой в настоящее время сталкивается трансплантология.
Обсуждая проблемы и перспективы ксенотрансплантации, следует
отметить, что внедрение в практическую медицину технологий, предполагающих использование биоматериала GAL-KO свиней, потребует проведения дополнительных комплексных исследований этих животных для решения ряда ключевых задач. В частности, необходимо обосновать и разработать методологии поддержания гомозиготных линий GAL-KO свиней без
снижения их жизнеспособности, определить критерии оценки и регламенты закладки банков генетического материала от трансгенных особей с
целью быстрого наращивания (при необходимости, например в случае военных действий) ресурсов животных ? потенциальных доноров. Должен
быть выявлен оптимальный возраст свиней для получения от них каждого типа биоматериалов, оптимизированы способы хранения, криоконсервации и подготовки таких биоматериалов без последующей потери их
свойств. К обязательным относятся исследования по иммуносупрессии с
целью увеличения периода функционирования трансплантантов, по разработке требований биобезопасности в отношении ксеногенных материалов,
получаемых от GAL-KO свиней, и др.
Принимая во внимание значение проблемы ксенотрансплантации
и потенциальные преимущества GAL-KO свиней при ее решении, мы запланировали проведение исследований по комплексной экспериментальной оценке линии трансгенных свиней, полученных в институте молекулярного животноводства и биотехнологии Университета Людвига-Максимилиана, в качестве доноров различных типов биоматериалов.
Итак, межвидовая трансплантация имеет огромный потенциал для
решения проблемы нехватки внутренних органов, тканей и клеток для пересадки человеку. В качестве доноров органов и тканей рассматривают генетически модифицированных свиней. Одним из способов предотвращения сверхострой реакции (HAR) отторжения такого пересаженного биоматериала может быть использование линий, у которых отсутствуют ?-1,3Gal эпитопы ? основные ксеноантигены для приматов. Работы по таргетингу гена ?-1,3-галактозилтрансферазы (GGTA1) в клетках свиней с помощью различных методов позволили получить жизнеспособных трансгенных особей с «выключенным» геном GGTA1 (GAL-KO свиньи с нокаутом GGTA1). Кожа GAL-KO свиней в качестве первоначального покрытия обширных ожоговых ран может служить альтернативой аллогенной
коже человека, при том что биоматериал от свиней дешевле, доступнее и
потенциально способен дольше сохранять жизнеспособность. Проведенные модельные исследования на крысах показали достоверно более низкий
уровень кальциноза трансплантированных сердечных клапанов от GALKO свиней по сравнению с интактными особями как в присутствии, так и
в отсутствие специфических антител к GGTA1, что позволяет предположить преимущество GAL-KO свиней в качестве нового источника биоматериала для создания биопротезов сердечных клапанов. Самым многообещающим направлением остается создание биотехнологии, позволяющей
выращивать у свиней человеческие органы. Решение этих проблем, наряду
с совершенствованием медицинских технологий, требует дальнейших дополнительных модификаций животных-доноров. Необходимы исследования их генетики, биохимии, физиологии, иммунологии, репродуктивной
биологии и т.д., разработка биотехнологий и зоотехнических регламен46
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
тов, обеспечивающих эффективное поддержание и использование популяций трансгенных свиней для целей ксенотрансплантации.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
17.
Ш у м а к о в В., Т о н е в и ц к и й А. Ксенотрансплантация: научные и этические проблемы. Журнал «Человек», 1999 год, № 6.
Y a n g Y.G., S y k e s M. Xenotransplantation: Current status and a perspective on the future.
Nat. Rev. Immunol., 2007, 7: 519-531.
P o l e j a e v a I.A., C h e n S.H., V a u g h t T.D., P a g e R.L., M u l l i n s J., B a l l S., D a i Y.,
B o o n e J., W a l k e r S., A y a r e s D.L., C o l m a n A., C a m p b e l l K.H. Cloned pigs
produced by nuclear transfer from adult somatic cells. Nature, 2000, 407: 86-90.
K l y m i u k N., A i g n e r B., B r e m G., W o l f E. Genetic modification of pigs as organ
donors for xenotransplantation. Mol. Reprod. Dev., 2010, 77(3): 209-221.
D e n n i n g C., D i c k i n s o n P., B u r l S., W y l i e D., F l e t c h e r J., C l a r k A.J. Gene
targeting in primary fetal fibroblasts from sheep and pig. Cloning Stem Cells, 2001, 3: 221-231.
H a r r i s o n S., B o q u e s t A., G r u p e n C., F a a s t R., G u i l d o l i n A., G i a n n a k i s C., C r o c k e r L., M c I l f a t r i c k S., A s h m a n R., W e n g l e J., L y o n s I., T o l s t o s h e v P., C o w a n P., R o b i n s A., O ? C o n n e l l P., d ? A p i c e A.J., N o t t l e M.
An efficient method for producing alpha(1,3)-galactosyltransferase gene knockout pigs. Cloning
Stem Cells, 2004, 6: 327-331.
R a m s o o n d a r J., M a c h a t y Z., C o s t a C., W i l l i a m s B.L., F o d o r W.L., B o n d i o l i K.R. Production of alpha 1,3-galactosyltransferase-knockout cloned pigs expressing human alpha 1,2-fucosyltransferase. Biol. Reprod., 2003, 69: 437-445.
L a i L., K o l b e r -S i m o n d s D., P a r k K.W., C h e o n g H.T., G r e e n s t e i n J.L.,
I m G.S., S a m u e l M., B o n k A., R i e k e A., D a y B.N., M u r p h y C.N., C a r t e r D.B., H a w l e y R.J., P r a t h e r R.S. Production of alpha-1,3-galactosyltransferase
knockout pigs by nuclear transfer cloning. Science, 2002, 295(5557): 1089-1092.
D a i Y., V a u g h t T.D., B o o n e J., C h e n S.H., P h e l p s C.J., B a l l S., M o n a h a n J.A., J o b s t P.M., M c C r e a t h K.J., L a m b o r n A.E., C o w e l l -L u c e r o J.L.,
W e l l s K.D., C o l m a n A., P o l e j a e v a I.A., A y a r e s D.L. Targeted disruption of the
alpha1,3-galactosyltransferase gene in cloned pigs. Nature Biotechnology, 2002, 20(3): 251-255.
S h a r m a A., N a z i r u d d i n B., C u i C., M a r t i n M.J., X u H., W a n H., L e i Y.,
H a r r i s o n C., Y i n J., O k a b e J., M a t h e w s C., S t a r k A., A d a m s C.S., H o u t z J., W i s e m a n B.S., B y r n e G.W., L o g a n J.S. Pig cells that lack the gene for alpha 1-3 galactosyltransferase express low levels of the gal antigen. Transplantation, 2003,
75: 430-436.
J i n D.I., L e e S.H., C h o i J.H., L e e J.S., L e e J.E., P a r k K.W., S e o J.S. Targeting
efficiency of ?-1,3-galactosyl transferase gene in pig fetal fibroblast cells. Exp. Mol. Med., 2003,
35: 572-577.
T a k a h a g i Y., F u j i m u r a T., M i y a g a w a S., N a g a s h i m a H., S h i g e h i s a T.,
S h i r a k u r a R., M u r a k a m i H. Production of alpha 1,3-galactosyltransferase gene knockout pigs expressing both human decay-accelerating factor and N-acetylglucosaminyltransferase
III. Mol. Reprod. Dev., 2005, 71: 331-338.
F u j i m u r a T., T a k a h a g i Y., S h i g e h i s a T., N a g a s h i m a H., M i y a g a w a S.,
S h i r a k u r a R., M u r a k a m i H. Production of alpha 1,3-galactosyltransferase gene-deficient pigs by somatic cell nuclear transfer: a novel selection method for gal alpha 1,3-Gal antigen-deficient cells. Mol. Reprod. Dev., 2008, 75(9): 1372-1378.
S h i m a t s u Y., Y a m a d a K., H o r i i W., H i r a k a t a A., S a k a m o t o Y., W a k i S.,
S a n o J., S a i t o h T., S a h a r a H., S h i m i z u A., Y a z a w a H., S a c h s D.H.,
N u n o y a T. Production of cloned NIBS (Nippon Institute for Biological Science) and ?-1,
3-galactosyltransferase knockout MGH miniature pigs by somatic cell nuclear transfer using the
NIBS breed as surrogates. Xenotransplantation, 2013, 20(3): 157-64.
X i n J., Y a n g H., F a n N., Z h a o B., O u y a n g Z., L i u Z., Z h a o Y., L i X.,
S o n g J., Y a n g Y., Z o u Q., Y a n Q., Z e n g Y., L a i L. Highly efficient generation of
GGTA1 biallelic knockout inbred mini-pigs with TALENs. PLoS One, 2013, 8(12): e84250.
P h e l p s C.J., K o i k e C., V a u g h t T.D., B o o n e J., W e l l s K.D., C h e n S.H., B a l l S.,
S p e c h t S.M., P o l e j a e v a I.A., M o n a h a n J.A., J o b s t P.M., S h a r m a S.B.,
L a m b o r n A.E., G a r s t A.S., M o o r e M., D e m e t r i s A.J., R u d e r t W.A., B o t t i n o R., B e r t e r a S., T r u c c o M., S t a r z l T.E., D a i Y., A y a r e s D.L. Production of alpha 1,3-galactosyltransferase-deficient pigs. Science, 2003, 299(5605): 411-414.
K o l b e r - S i m o n d s D., L a i L., W a t t S.R., D e n a r o M., A r n S., A u g e n s t e i n M.L., B e t t h a u s e r J., C a r t e r D.B., G r e e n s t e i n J.L., H a o Y., I m G.S., L i u Z.,
M e l l G.D., M u r p h y C.N., P a r k K.W., R i e k e A., R y a n D.J., S a c h s D.H.,
47
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
48
F o r s b e r g E.J., P r a t h e r R.S., H a w l e y R.J. Production of alpha-1,3-galactosyltransferase null pigs by means of nuclear transfer with fibroblasts bearing loss of heterozygosity mutations. PNAS USA, 2004, 101(19): 7335-7340.
N o t t l e M.B., B e e b e L.F., H a r r i s o n S.J., M c I l f a t r i c k S.M., A s h m a n R.J.,
O ' C o n n e l l P.J., S a l v a r i s E.J., F i s i c a r o N., P o m m e y S., C o w a n P.J.,
d ' A p i c e A.J. Production of homozygous alpha-1,3-galactosyltransferase knockout pigs by
breeding and somatic cell nuclear transfer. Xenotransplantation, 2007, 14(4): 339-344.
B a e h r A. (Re)producing transgenic pigs for xenotransplantation ? selection of founder animals and establishment of breeding herds. Inaugural Dissertation zur Erlangung der tiermedizinischen Doktorwьrde der Tierдrztlichen Fakultдt der Ludwig-Maximilians-Universitдt Mьnchen.
Muenchen, Germany, 2011.
H a u s c h i l d J., P e t e r s e n B., S a n t i a g o Y., Q u e i s s e r A.-L., C a r n w a t h J.W.,
L u c a s - H a h n A., Z h a n g L., M e n g X., G r e g o r y P.D., S c h w i n z e r R., C o s t G.J.,
N i e m a n n H. Efficient generation of a biallelic knockout in pigs using zinc-finger nucleases.
PNAS USA, 2011, 108(29): 12013-12017.
D e n n e r J., T ц n j e s R.R. Infection barriers to successful xenotransplantation focusing on
porcine endogenous retroviruses. Clin. Microbiol. Rev., 2012, 25(2): 318-343.
L u o Y., L i n L., B o l u n d L., J e n s e n T.G., S ш r e n s e n C.B. Genetically modified pigs
for biomedical research. J. Inherit. Metab. Dis., 2012, 35(4): 695-713.
d ? A p i c e A.J., C o w a n P.J. Xenotransplantation: The next generation of engineered animals. Transpl. Immunol., 2009, 21: 111-115.
W e i s s E.H., L i l i e n f e l d B.G., M u l l e r S., M u l l e r E., H e r b a c h N., K e a l e r B.,
W a n k e R., S c h w i n z e r R., S e e b a c h J.D., W o l f E., B r e m G. HLA-E/human
beta2-microglobulin transgenic pigs: Protection against xenogeneic human anti-pig natural killer
cell cytotoxicity. Transplantation, 2009, 87: 35-43.
А н д р е е в а Т.М. Травматизм в Российской Федерации на основе данных статистики.
Социальные аспекты здоровья населения, 2010, 4(16) (http://vestnik.mednet.ru/content/view/234/30/lang,ru/).
V a n d e p u t J., N e l i s s e n M., T a n n e r J.C., B o s w i c k J. A review of skin meshers.
Burns, 1995, 21: 364-370.
L a r i A.R., G a n g R.K. Expansion technique for skin grafts (Meek technique) in the treatment of severely burned patients. Burns, 2001, 27: 61-66.
O r g i l l D.P. Excision and skin grafting of thermal burns. N. Engl. J. Med., 2009, 360: 893-901.
S u l l i v a n T.P., E a g l s t e i n W.H., D a v i s S.C., M e r t z P. The pig as a model for human wound healing. Wound Repair Regen., 2001, 9: 66-76.
H a r u n a r i N., Z h u K.Q., A r m e n d a r i z R.T., D e u b n e r H., M u a n g m a n P.,
C a r r o u g h e r G.G.J., I s i k F.F., G i b r a n N.S., E n g r a v L.H. Histology of the thick
scar on the female, red Duroc pig: final similarities to human hypertrophic scar. Burns, 2006,
32: 669-677.
S c h e c h t e r I. Prolonged retention of glutaraldehyde-treated skin allografts and xenografts:
immunological and histological studies. Ann. Surg., 1975, 182: 699-704.
G a l i l i U., S h o h e t S.B., K o b r i n E., S t u l t s C.L., M a c h e r B.A. Man, apes, and
old world monkeys differ from other mammals in the expression of alpha-galactosyl epitopes on
nucleated cells. J. Biol. Chem., 1988, 263: 17755-17762.
G a l i l i U., W a n g L., L a t e m p l e D.C., R a d i c M.Z. The natural anti-Gal antibody.
Subcell Biochem., 1999, 32: 79-106.
W e i n e r J., Y a m a d a K., I s h i k a w a Y., M o r a n S., E t t e r J., S h i m i z u A.,
S m i t h R.N., S a c h s D.H. Prolonged survival of GalT-KO swine skin on baboons. Xenotransplantation, 2010, 17(2): 147-152.
H i l f i k e r A., R a m m R., G o e c k e T., H a v e r i c h A. Heart valve transplantation: the urgent need for non-immunogenic porcine heart valve matrices. Xenotransplantation, 2013, 20(1): 56.
K o n a k c i K.Z., B o h l e B., B l u m e r R., H o e t z e n e c k e r W., R o t h G., M o s e r B.,
B o l t z - N i t u l e s c u G., G o r l i t z e r M., K l e p e t k o W., W o l n e r E., A n k e r s m i t H.J. Alpha-Gal on bioprostheses: xenograft immune response in cardiac surgery. Eur. J.
Clin. Invest., 2005, 35(1): 17-23.
K a s i m i r M.T., R e i d e r E., S e e b a c h e r G., W o l n e r E., W e i g e l G., S i m o n P.
Presence and elimination of the xenoantigen gal(alpha1,3) gal in tissue-engineered heart valves.
Tissue Eng., 2005, 11(7-8):1274-1280.
L i l a N., M c G r e g o r C.G., C a r p e n t i e r S., R a n c i c J., B y r n e G.W., C a r p e n t i e r A. Gal knockout pig pericardium: new source of material for heart valve bioprostheses. J. Heart Lung Transplant., 2010, 29(5): 538-543.
K o b a y a s h i T., Y a m a g u c h i T., H a m a n a k a S., K a t o -I t o h , M., Y a m a z a k i Y., I b a t a M., S a t o H., L e e Y.S., U s u i J., K n i s e l y A.S., H i r a b a y a s h i M.,
N a k a u c h i H. Generation of rat pancreas in mouse by interspecific blastocyst injection of
pluripotent stem cells. Cell, 2010, 142(5): 787-799.
U s u i J., K o b a y a s h i T., Y a m a g u c h i T., K n i s e l y S., N i s h i n a k a m u r a R.,
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
N a k a u c h i H. Generation of kidney from pluripotent stem cells via blastocyst complementation. Am. J. Pathol., 2012, 180(6): 2417-2426.
41. M a t s u n a r i H., N a g a s h i m a H., W a t a n a b e M., U m e y a m a K., N a k a n o K.,
N a g a y a M., K o b a y a s h i T., Y a m a g u c h i T., S u m a z a k i R., H e r z e n b e r g L.A.,
N a k a u c h i H. Blastocyst complementation generates exogenic pancreas in vivo in apancreatic cloned pigs. PNAS USA, 2013, 110 (12): 4557-4562.
42. N a k a n o K., W a t a n a b e M., M a t s u n a r i H., M a t s u d a T., H o n d a K., M a e h a r a M., K a n a i T., H a y a s h i d a G., K o b a y a s h i M., K u r a m o t o M., A r a i Y.,
U m e y a m a K., F u j i s h i r o S.H., M i z u k a m i Y., N a g a y a M., H a n a z o n o Y.,
N a g a s h i m a H. Generating porcine chimeras using inner cell mass cells and parthenogenetic preimplantation embryos. PloS ONE, 2013, 8(4): e61900.
43. E c k a r d t S., M c L a u g h l i n K.J., W i l l e n b r i n g H. Mouse chimeras as a system to
investigate development, cell and tissue function, disease mechanisms and organ regeneration.
Cell Cycle, 2011, 10(13): 2091-2099.
1ГНУ
Всероссийский НИИ животноводства Россельхозакадемии,
142132 Россия, Московской обл., Подольский р-н, пос. Дубровицы,
e-mail: [email protected], [email protected];
2Московский физико-технический институт,
Поступила в редакцию
15 января 2014 года
Государственный университет,
141700 Россия, Московская обл., г. Долгопрудный, Институтский пер., 9,
e-mail: [email protected], [email protected], [email protected],
[email protected];
3Lehrstuhl fьr Molekulare Tierzucht und
Biotechnologie Genzentrum der LMU,
Feodor-Lynen Str. 25, 81377 Munich, Germany,
e-mail: [email protected], [email protected];
4Institut fьr Tierzucht und Genetik, VMU,
Veterinдrplatz, A-1210, Vienna, Austria,
e-mail: [email protected]
APPLICATION OF GAL-KO TRANSGENIC PIGS
IN XENOTRANSPLANTATION: PROBLEMS AND PROSPECTS
FOR THE FUTURE
N.A. Zinovieva1, A.V. Melerzanov2, E.V. Petersen2, N. Klymiuk3, N.A. Volkova1,
A.S. Dukh2, I.A. Trusova2, E. Wolf3, G. Brem4
1All-Russian Research Institute of Animal Husbandry, Russian Academy of Agricultural Sciences, pos. Dubrovitsy, Podolsk Region, Moscow Province, 142132 Russia, e-mail [email protected], [email protected];
2Moscow Institute of Physics and Technology, State University, 9, Institutskii per., Dolgoprudnyi, Moscow Province,
141700 Russia, e-mail [email protected], [email protected], [email protected], [email protected];
3Institute of Molecular Animal Breeding and Biotechnology LMU, Feodor-Lynen Str. 25, 81377 Munich, Germany,
e-mail [email protected], [email protected];
4 Institute of Animal Breeding and Genetics, VMU, Veterinдrplatz, A-1210, Vienna, Austria,
e-mail [email protected]
Received January 15, 2014
Abstract
Xenotransplantation (сross-species transplantation) has a great potential to serve the needs
for organs, tissues and cells for transplantation. In this review, the applications of genetically modified pigs as the donors of organs and tissues for clinical transplantation are discussed. The hyperacute
rejection (HAR) process is shortly described. One of the ways to overcome HAR is the creation of
pigs lacking alpha-1,3-galactosyltransferase (alpha-1,3-GalT) epitopes ? the major xenoantigene in
pig-to-primate organ xenotransplantation. The analysis of the efficiency of targeting the alpha-1,3galactosyltransferase gene (GGTA1) in porcine cells by using different methods was performed: the
targeting efficiency (the number of piglets carrying the knock-out of GGTA1 born alive from the
number of the cloned embryos transferred) is differed between laboratories and varied of 0.0 to 5.0
per cent. The different techniques used for the development of transgenic pigs lacking GGTA1
(GAL-KO pigs) are shortly described. The possible applications of organs and tissues of GAL-KO
pigs for xenotransplantation are overviewed. The advantages of using of the skin derived from GALKO pigs as a potential alternative for a temporary cover of burns comparing to the alloskin and skin
derived from the normal (GAL-positive) pigs are shown. Uses of GAL-KO pigs as donors of heart
valves are briefly reviewed. The research aims for the future are discussed.
Keywords: transgenic pigs, GAL-KO, xenotransplantation, organs and tissues donors, skin
transplantation, heart valves of pigs.
49
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, № 2, с. 50-58
УДК 636/639:62-52
АВТОМАТИЗИРОВАННЫЕ СИСТЕМЫ УПРАВЛЕНИЯ ЗДОРОВЬЕМ
ЖИВОТНЫХ КАК СТРАТЕГИЧЕСКАЯ ОСНОВА ОПТИМИЗАЦИИ
ВОСПРОИЗВОДСТВА В МОЛОЧНОМ СКОТОВОДСТВЕ
И.М. МИХАЙЛЕНКО
Климатические изменения и аномальные природные явления резко обостряют ситуацию
с продовольствием в современном мире. Проблема обеспечения расширенного производства в молочном животноводстве актуальна для многих стран с развитым сельским хозяйством. Увеличение количества белков и углеводов в рационах коровы нарушает кислотно-щелочной баланс и
становится причиной болезней обмена веществ, среди которых наихудшие последствия вызывает
лактатный ацидоз, обусловливающий потерю репродуктивной функции и преждевременную выбраковку поголовья. Нами предлагается решение этой проблемы на стыке биологических наук и
современной кибернетики. Процессы кормления и ухода рассматриваются как факторы управления состоянием здоровья животных. Такое управление обеспечивает существенное увеличение периода хозяйственного использования лактирующих коров. Для реализации концепции предлагается теория управления, основой которой служат новые математические модели динамики и диагностики состояния здоровья животного. Они позволяют прогнозировать ранние стадии заболеваний и патологий, ведущих к последующей отбраковке. На базе этих моделей разработаны алгоритмы оптимального управления состоянием здоровья и продукционным процессом, где критерием оптимальности служит прибыль. Учитываются суточные, сезонные и возрастные изменения
лактационных характеристик, физиологический статус (нормальная лактация, стельность, сухостойность), генетический потенциал продуктивности особи как базового объекта модели с целью
локальной коррекции стратегии управления «в среднем по группе». Также во внимание принимаются факторы, влияющие на ущербы и убытки, связанные с возникновением всех отбраковочных
потоков. Общий интервал планирования и управления соответствует длительности генетической
программы для породы. Разработанная концепция и теория управления состоянием здоровья животных не имеет мировых аналогов.
Ключевые слова: молочное животноводство, кормовая база, концепция управления, состояние здоровья, пожизненный цикл, лактационный и суточные циклы, алгоритмы управления,
математические модели.
А н а л и з с и т у а ц и и в о т р а с л и. Участившиеся в последние годы аномальные природные явления резко обострили ситуацию с обеспечением продовольствием населения в стране и в мире. Очень показательным оказался 2010 год, когда в Российской Федерации во многих зерносеющих регионах от засухи погибло более 30 % урожая. Это во многом подорвало и без того довольно слабую кормовую базу стратегически важной
отрасли ? молочного животноводства и в еще больше степени затормозило ее развитие. Как следствие, значительно ухудшилось обеспечение качественными и недорогими молочными продуктами отечественного производства, на которые давно сложился устойчивый спрос.
Сами проблемы в развитии молочного животноводства Российской
Федерации, как и в большинстве других стран с высоким уровнем развития сельскохозяйственного производства, были заложены еще в середине
1980-х годов. Они особенно четко проявились Ленинградской области,
где годовая продуктивность коров за период реформ возросла с 4089 кг в
1990 году до 6400 в 2009 году. Однако за тот же период рентабельность
производства молока снизилась с 31-35 до 3-5 %. Сложившаяся ситуация в
преимущественно животноводческом регионе не могла не вызывать серьезного беспокойства, так как столь низкая рентабельность указывала на
то, что в отрасли фактически прекратилось расширенное воспроизводство
(1). Это иллюстрируется постоянным снижением поголовья крупного рогатого скота (КРС) и объема инвестиций в отрасль, что в основном связано с
преобладавшей тогда и сохранившейся до настоящего времени аграрной
50
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
политикой, которая базируется только на показателе продуктивности «любой ценой». Такая политика подразумевалась как «интенсификационная»,
но вызвала значительный рост доли концентрированных кормов (КК) в рационе дойных коров. В частности, при снижении общего расхода кормов
на 1 ц молока с 1,11 ц кормовых единиц (к.е.) в 1990 году до 1,04 ц к.е. в
2003 году доля КК возросла соответственно с 0,34 до 0,43 ц к.е. Повысилось потребление белков и углеводов, что нарушило кислотно-щелочной
баланс в организме животных и стало причиной для возникновения ряда
болезней обмена веществ, среди которых наихудшие последствия вызывает лактатный ацидоз, приводящий к потере репродуктивной функции коровы и ее преждевременной выбраковке. В результате подобной «интенсификации» период хозяйственного использования коров сократился до
2,5-3,0 лактаций, когда ежегодный процент отбраковки составляет 33-37 %,
что стало основной причиной сокращения поголовья, поскольку вся система воспроизводства способна вводить не более 30 % нетелей. Ситуация,
аналогичная сложившейся в Российской Федерации, наблюдается и за рубежом. Многие ученые и специалисты уже смирились с таким положением, считая его неизбежным (2, 3).
В последние десятилетия в ряде областей РФ рост продуктивности
коров из лучших хозяйств, обусловленный генетическим прогрессом, в
целом не сопровождался соответствующим повышением по показателям
продуктивного долголетия и качества получаемой продукции. По оценкам
экспертов, до 70 % прибыли в молочном скотоводстве определяется длительностью хозяйственного использования коров. В Канаде она в целом
по стране составляет 5,0 лактаций, в США ? 4,0, на лучших отечественных племзаводах ? 3,8, во многих товарных хозяйствах ? 2,5 лактации
и менее, тогда как оцененный биологический потенциал составляет 911 лактаций, а экономический оптимум ? 6-7 лактаций. Но если за рубежом отрасль дотационная и ускоренное выбытие коров, ложась на бюджеты стран, все же выгодно для самих производителей молока, племенных
хозяйств и мясоперерабатывающей промышленности, то в Российской Федерации, где все сельское хозяйство мало дотируется и развивается в основном на рыночных принципах, подобное положение приводит по сути
дела к сворачиванию стратегически важной отрасли.
В последние 10-12 лет в Российской Федерации при строительстве
новых и реконструкции старых коровников повсеместно используются естественные системы вентиляции с вытяжными системами, расположенными на коньках кровли сооружений, что обусловлено необходимостью
экономии электрической и тепловой энергии. Такие системы вентиляции
способны обеспечить только 2-3-кратный воздухообмен, чего явно недостаточно для современных технологий содержания скота, где в одном помещении находятся не менее 200 гол. При этом происходит увеличение
количества углекислого газа и аммиака до значений, в несколько раз превышающих ПДК, вследствие чего снижается интенсивность жвачки, ухудшается переваримость пищи, что приводит к нарушению кислотно-щелочного баланса и повышению риска заболевания лактатным ацидозом.
Все отклонения и ошибки в кормлении и содержании животных,
особенно коров с высокой молочной продуктивностью, приводят к нарушению обмена веществ, расстройству функций систем и органов, снижению резистентности и иммунодефициту, многочисленным стрессам и, как
следствие, к высокой заболеваемости и активации механизмов саморегуляции размножения, то есть к бесплодию. Потери от недополучения ремонтного молодняка в молочном животноводстве занимают одно из
51
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
первых мест среди всех экономических потерь. Помимо недополучения
приплода, что следует приравнивать к его гибели, от каждой бесплодной
коровы хозяйство недополучает минимум 25 % удоя за лактацию. К этому
нужно добавить расходы на лечение, на многочисленные безрезультатные
осеменения и потери, связанные с преждевременной выбраковкой ценных
(чаще всего молодых) коров.
Р а з в и т и е к о н ц е п ц и и у п р а в л е н и я в м о л о ч н о м ж ив о т н о в о д с т в е. Для решения столь важной стратегической проблемы нами разработана концепция управления состоянием здоровья лактирующих
коров, где основные факторы управления ? рацион и условия содержания. Для реализации концепции разработана теория управления здоровьем
животных. Основой теории служат новые математические модели динамики и диагностики показателей здоровья и прогнозирования ранних стадий
заболеваний и патологий, ведущих к последующей отбраковке коров. Математические модели дополняются предложенными алгоритмами оптимального управления состоянием здоровья и продукционным процессом,
где критерием оптимальности служит прибыль. Кроме кормления и условий содержания, как факторы управления рассматриваются лечебно-профилактические мероприятия, для проведения которых предполагается использование информации от системы зооветеринарного мониторинга стада.
Разработанная концепция и теория управления состоянием здоровья животных не имеют мировых аналогов.
В соответствии с предложенной концепцией, базовый элемент всего объекта
управления (ОУ) в задаче ?
лактирующая корова. Именно для нее необходимо создать все необходимые условия, обеспечивающие сохранение здоровья, а также способность к отелу и последующим лактациям. Однако
сложившаяся система ведения хозяйства чаще всего
Рис. 1. Лактационные кривые коровы: ?(t) ? суточ- предусматривает содержание
ный удой (1), ?(t) ? общий надой за лактационный в одном помещении сразу
период (2).
многих животных, которые
могут быть объединены в группы. В этом случае мы имеем более сложную структуру ОУ, где в отношении климатических и санитарно-гигиенических условий ОУ служит отдельное животноводческое помещение ?
ферма, а по конечному результату (заданное количество молока) ? определенным образом сформированные группы коров.
Базовый элемент этой группы, то есть корова как объект производства молока, обладает следующими важными свойствами: в течение лактационного периода ее суточная продуктивность изменяется (лактационная
кривая, рис. 1); годовые лактационные кривые имеют тенденцию к подъему и постепенному снижению с возрастом и числом отелов, при этом
общий пожизненный надой в целом постоянно растет с уменьшающейся с
возрастом скоростью (рис. 2).
Обобщение основных технологических характеристик отдельных коров
и их групп позволяет выделить важнейшие особенности задач управления
этим ОУ. Во-первых, животное как элемент общего ОУ ? группы может
52
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
находиться в нескольких существенно различающихся физиологических
состояниях: нормальной лактации, стельности и сухостойности. Каждое из
указанных состояний требует особого подхода к кормлению и содержанию
животных, то есть самостоятельной стратегии управления состоянием животного, влияющей на общий результат. Это приводит к
необходимости разделения
общего стада на группы по
перечисленным состояниям.
Во-вторых, каждое животное обладает естественной
генетической программой
продуктивности по молоку
и приплоду, а общий проРис. 2. График пожизненной лактации коровы: c ? цесс управления его кормобщий надой за n лактаций, ? ; ? ? надои на n-х лением и содержанием доллактациях, ?(t); n = 1, ?N ? индексы и общее число
жен обеспечить максимальлактаций.
ную реализацию такой программы. В-третьих, интенсификация производства молока и мяса приводит к необходимости группового содержания и обслуживания поголовья,
что затрудняет применение индивидуального подхода к кормлению и содержанию животного и в значительной мере снижает степень воспроизводства его естественной
генетической программы. В-четвертых, групповой способ кормления и содержания заставляет в качестве базового ОУ рассматривать среднее животное
в группе и по его состоянию синтезировать
основные стратегии наблюдения и управления. В-пятых, наличие
основных стратегий управления «в среднем по
группе» не исключает
Рис. 3. Граф-схема объекта управления (ОУ, животноводческая ферма): 1 ? телки, 2 ? нетели, 3 ? сухостойные коро- необходимости их ловы, 4 ? новотелы, 5 ? лактирующие коровы, 6 ? отбрако- кальных коррекций по
ванные коровы, 7 ? коровы, выведенные из оборота по кри- индивидуальным сотерию эффективности.
стояниям животных,
причем глубина таких коррекций определяется только технической осуществимостью получения информации о состоянии отдельного животного и
возможностью предоставить особи индивидуальные условия кормления и
ухода. Наличие локального управления позволит повысить степень воспроизводства естественной генетической программы отдельных животных
и тем самым существенно увеличить эффективность производства молока.
Результат всего обобщения ? структура ОУ (рис. 3), соответствующая одному лактационному циклу (циклы должны повторяться столько раз,
53
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
сколько лактаций осуществляется в среднем по конкретной ферме).
После последнего цикла стадо на ферме полностью обновляется.
Невозможность результативного осеменения сразу для всех вводимых и повторно осеменяемых коров, а также неодновременность запуска,
отелов, раздоев и случайность числа отбракованных коров по стадиям
цикла приводят к возникновению случайных потоков животных на каждой стадии. Поэтому случайным будет и число коров в каждом из указанных состояний. Это обстоятельство существенно усложняет процедуры прогнозирования и принятия управленческих решений.
Для полного решения задачи в соответствии с разработанной теорией используются все основные факторы, влияющие как на получение
прибыли, так и на ущербы и убытки, связанные с возникновением всех
отбраковочных потоков. Эти факторы мы разделяем на параметры состояния, которые представляют собой управляемые переменные, и собственно
управляющие переменные, за счет изменения которых возможны модификации параметров состояния, часть из которых относятся к целеобразующим, то есть определяющим критерий оптимальности.
Параметрами состояния служат следующие показатели: по продуктивности ? суточная продуктивность, масса тела; по качеству молока ?
содержание жира, содержание белка; по состоянию здоровья ? температура кожи, температура тела, частота пульса, частота дыхания, рН мочи,
кала, крови и молока, упитанность, число кетоновых тел в моче, число кетоновых тел в молоке, промежуток времени между приемом корма и появлением жвачки, число жевательных движений, затрачиваемое на измельчение одного пищевого кома, продолжительность жвачного периода, число
жвачных периодов в течение суток. Заболевания, ведущие к отбраковке, ?
болезни обмена веществ, пищеварительной системы, вымени, ног, половых
органов, дыхательной системы, маститы, яловость, перикардит, эндометрит,
трудные роды, кетоз печени, прочие незаразные заболевания.
Для удобства понимания смысла решаемой задачи введем вектор
управления U, который разобьем на три отдельных подвектора, определяющих три главных направления в обеспечении благоприятных условий
для животных:
U T = [U1T , U T2 , U3T ] ,
где U1T , UT2 и U3T ? соответственно вектор компонентов рационов, учитывающий расходы всех питательных элементов, добавок и витаминов, вектор условий содержания, включающий параметры воздушной среды и
питьевой воды, и вектор лечебно-профилактических мероприятий.
Цель управления (ЦУ) процессом производства молока в конкретной компании ? за период планирования обеспечить заданную прибыль
от реализации молока, полученного во всех структурных подразделениях.
Исходя из общей стратегии развития компании, ее руководством обосновывается заданная прибыль. Она пропорционально распределяется по всем
фермам и группам животных, которые принимаются в качестве ОУ. В связи с особенностями ОУ, указанными выше, при постановке задачи очень
важно правильно определить период планирования и управления. Так,
планирование только на один год, как принято в настоящее время, полностью противоречит естественной генетической программе животного и
приводит к его преждевременной отбраковке, причем описанный процесс
имеет повсеместный и неотвратимый характер. Поэтому общий интервал
планирования и управления должен соответствовать длительности генетической программы для соответствующей породы. Формально ЦУ с учетом
54
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
приведенных соображений может быть представлена в следующем виде
для стада в среднем:
n?
ЦУ:
?
?? min
? [ M n ? (c n ? n ( U n ) ? r (U n )) + ? n ] ? U???
n =1
? n ( U ) ? ? ?n ,
n
[1]
где n = 1, 2,?, n* ? номера лактаций в генетической программе для используемой породы коров; Мn* ? заданная программа получения прибыли от одной коровы в среднем по стаду; сn ? прогнозы цен на молоко;
Пn(U) ? годовые удои в среднем по стаду по всему жизненному циклу
(функция вектора управления U); ? ? область допустимых значений вектора управлений; r (Un) ? годовые затраты (функция вектора управления
U); ?n ? потери, связанные с отбраковкой; Пn* ? генетическая программа
продуктивности по породе.
В соответствии с разУправление
работанной концепцией и тежизненным циклом
орией достижение цели [1] (с
учетом вышеуказанных осоВ среднем по стаду
Индивидуальное
бенностей) ОУ возможно за
счет решения трех связанных
Управление
между собой задач (рис. 4):
лактационным циклом
обеспечения прохождения всего жизненного цикла от перВ среднем по стаду
Индивидуальное
вой (n = 1) до последней генетически возможной и экоУправление суточным циклом
номически целесообразной лактации (n = n*); получения
В среднем по стаду
Индивидуальное
условного максимума прибыли по каждому лактационРис. 4. Иерархия основных задач управления состоянием
ному периоду всего жизнендойного стада.
ного цикла; индивидуальной
коррекции условного максимума прибыли для коров и стада в среднем в
реальном времени.
Р е а л и з а ц и я к о н ц е п ц и и у п р а в л е н и я. Поскольку основу
предложенной концепции составляют задачи управления состоянием здоровья животных, то успешное их решение во многом связано с проблемой
его контроля, диагностики заболеваний и уменьшения отбраковонного
поголовья. Подобное возможно только при максимальном снижении роли
человеческого фактора в управлении производством молока за счет использования современных технических и измерительных средств, информационных технологий и вычислительной техники. Все указанные компоненты интегрируются в системы физиолого-биохимического контроля
полноценности питания и резервов жизнеспособности для последующей
трансформации такой системы в технологию физиологического мониторинга в молочном скотоводстве. Для этого предлагается применять специальные дистанционные датчики-измерители, закрепляемые на животном.
Указанные датчики позволят измерять основные физиологические параметры и выявлять у животных симптомы заболеваний, непосредственно
связанные с используемыми рационами. Информация от установленных
датчиков обрабатывается с применением математических моделей и алгоритмов диагностики и используется для оперативного управления кормлением и проведением профилактических мероприятий, исключающих
55
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
отбраковку животных.
Важнейший результат при решении задачи управления состоянием
здоровья животных заключается в существенном уменьшении расхода КК
за счет их замещения высококачественными грубыми волокнистыми
кормами собственного приготовления. Это становится возможным благодаря применению современных эффективных систем адаптивно-ландшафтного земледелия, включающих высокорентабельные кормовые севообороты. Первостепенное внимание должно уделяться разработке высокоурожайных и устойчивых к природно-климатическим условиям региона
видовых составов травяных кормосмесей, технологий их возделывания,
новых технических средств реализации технологий и развития собственного семеноводства. Основной подход при решении обозначенной проблемы
заключается в создании принципиально новых приемов управления процессами формирования урожая кормовых культур на базе созданных способов управления, технических средств измерения и оценки состояния, а
также реализации оптимальных технологических воздействий. Основой
для реализации этих приемов служат современные информационные технологии с использованием карт аэроландшафтного и экологического районирования природных кормовых угодий, оценки качества земель и экологического состояния агроландшафтов. Подобные технологии и системы
не имеют мировых аналогов (3-8).
В то же время существенное повышение качества грубых волокнистых кормов невозможно без разработки принципиально новых технологий, методов и технических средств управления процессами их приготовления. Задача таких технологий ? исключить потери питательных веществ
из травостоя с повышенной влажностью, возникающих при использовании тяжелой тракторной техники для трамбования силосной массы. Эти
технологии основываются на применении предложенных нами автоматизированных линий для консервации кормов из исходной массы с любыми
значениями произвольной влажности и содержания углеводов при двухстороннем управлении скоростью ферментации кормовой массы. В качестве основных факторов управления здесь используются специально разработанные химические и биологические препараты и добавки, влияющие
на скорость обезвоживания и ферментативных реакций и содержание в готовом корме питательных веществ. Другим важным приемом существенного повышения качества и надежности хранения готового корма станет автоматическое управление плотностью кормовой массы с целью исключения возникновения очагов грибного поражения. Использование таких автоматизированных линий позволит с высокой надежностью получать волокнистые корма с заданными показателями качества. Указанные технологии и автоматизированные линии не имеют мировых аналогов (9, 10).
Реализация столь сложного комплекса технологий невозможна без
создания автоматизированной системы управления производством молока,
в которой интегрированы в единый комплекс все организационные, технологические, технические и информационные задачи, чем определяется
получение конечного результата с заданной надежностью (рис. 5) (11). Такая система требует разработки инновационного программно-математического обеспечения, посредством которого и будет достигаться объединение всех задач. Кроме получения конечного результата, создание подобной системы позволит автоматизировать работу менеджеров ферм, специалистов-технологов, ветеринарных врачей и другого обслуживающего
56
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
персонала. Центральную задачу автоматизированной системы описывает
блок оптимизации рационов, посредством которого осуществляется планирование и оперативное управление производством.
Блок 1. Анализ и планирование
Анализ результатов
производства текущего
года
План на закупку кормов
Планирование
производства
на следующий год
Задание на производство
кормов
Блок 2. Производство кормов
Мониторинг состояния травостоя и
управление уборкой
Управление процессом силосования и
консервации корма
БД системы
Блок 3. Управление процессом кормления
Идентификация модели продуктивности и оптимизация
рациона
Исполнение оптимального рациона
Блок 4. Управление движением стада
Анализ продуктивности и рентабельности коров
Принятие решений
об отбраковке коров
Рис. 5. Блок-схема автоматизированной системы производства молока.
Таким образом, проблема расширенного производства молока на
современном этапе развития отрасли требует комплексного решения. Оно
включает в себя разработку и апробацию автоматизированной системы
управления производством молока, основное звено которой составляет
подсистема управления здоровьем животных. Для создания такой системы
потребуется принципиально новая измерительно-диагностическая база, с
использованием которой формируется система, обеспечивающая мониторинг состояния здоровья молочного скота. Кроме того, необходимо существенно модернизировать кормовую базу, основу которой должны составлять высокопродуктивные травосмеси и новые технологические линии для
приготовления кормов с заданными питательными свойствами. Все эти
подходы объединяются в серьезный инновационный проект общегосударственного значения. Подобный проект был представлен и одобрен
Министерством образования и науки РФ еще в 2008 году, однако в условиях экономического кризиса его финансирование оказалось невозможным. В настоящее время инновационной политике уделяется больше внимания, что дает надежду на реализацию предлагаемого проекта, способного оказаться мощным импульсом для развития всего продовольственного комплекса страны и сохранить за Россией многие приоритеты, в том
числе в молочном скотоводстве.
57
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ЛИТЕРАТУРА
1.
М и х а й л е н к о И.М., М о л о д к и н В.Ю. Повышение эффективности производства
молока на примере АПК Ленинградской области. Вестник РАСХН, 2005, 2: 80-82.
2. М и х а й л е н к о И.М. Здоровое питание для молочного стада. Торгпред, октябрь 2005,
c. 30.
3. М и х а й л е н к о И.М. Точное сельское хозяйство (precision agriculture). Глава 12 «Системные основы точного животноводства». СПб?Пушкин, 2010: 321-336.
4. М и х а й л е н к о И.М. Способ автоматизированного управления формированием урожая. Патент РФ № 2264703. Опубл. 27.11.2005. Бюл. № 33.
5. М и х а й л е н к о И.М., К у р а ш в и л и А.Е. Управление качеством кормов из многолетних трав. Мат. Межд. конф. «Информационные технологии, информационные измерительные системы и приборы в исследовании сельскохозяйственных процессов». Новосибирск, 2003: 106-115.
6. М и х а й л е н к о И.М. Основные задачи управления производством продукции растениеводства и животноводства. Мат. 3-й науч.-практ. конф. «Машинные технологии производства продукции в системе точного земледелия и животноводства». М., 2005: 246-252.
7. М и х а й л е н к о И.М., К у р а ш в и л и А.Е. Прогнозирование состояния травостоя в
системе управления качеством кормов в молочном животноводстве. Вестник РАСХН,
2008, 2: 10-13.
8. М и х а й л е н к о И.М., Т и м о ш и н В.Н., Д а н и л о в а Т.Н. Математическое моделирование системы «почва?растение?атмосфера» на примере многолетних трав. Доклады
Российской академии сельскохозяйственных наук, 2009, 4: 61-64.
9. М и х а й л е н к о И.М. Управление процессом силосования кормов из многолетних
трав. Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук, 2006, 3: 66-68.
10. М и х а й л е н к о И.М. Устройство для приготовления грубых кормов Патент РФ
№ 2360436. Опубл. 10.07.2009. Бюл. № 14.
11. М и х а й л е н к о И.М., Т и м о ш и н В.Н. Система управления производством молока.
Техника и оборудование для села, 2007, 8(100): 41-43.
ГНУ Агрофизический институт Россельхозакадемии,
195220 Россия, г. Санкт-Петербург, Гражданский пр., 14,
e-mail: [email protected]
Поступила в редакцию
9 сентября 2013 года
COMPUTERIZED ANIMAL HEALTH CONTROL AS THE BASIC
STRATEGY TO OPTIMIZE REPRODUCTION IN DAIRY LIVESTOCK
I.M. Mikhailenko
Agrophysical Research Institute, Russian Academy of Agricultural Sciences, 14, Grazhdanskii prosp., St. Petersburg,
195220 Russia, e-mail [email protected]
Received September 9, 2013
Abstract
Because of climatic anomalies all over the world, the problems in food supply may arise.
The challenge faced by many countries having the developed agriculture is haw to increase the dairy
cattle reproduction and productivity. Animal rations with high protein and hydrocarbon content result in violation of an acid-base balance and the metabolic diseases, of which lactic acidosis is the
worst, as it causes the loss of animal reproductive function and early culling. We suggest a solution
that combines biological knowledge with modern cybernetic facilities. Feeding and the proper housing conditions are considered as the factors to control animal health. It significantly provides more
prolonged economic use of the lactating cows. To implement the concept, we propose a management
theory, based on the new mathematical models for dynamics of the individual physiological
parameters in animals and their indication. The models allow early prediction of the diseases and pathologies which will lead to animal culling. On the basis of these models the algorithms for optimal
control of health and productivity were developed, in which the profit is the optimality criterion.
Changes of lactation parameters due to circadian and seasonal rhythms, because of ageing and in the
reproductive cycle (normal lactation, pregnancy or dry period), and the genetic potential of productivity of a cow as a basic element of the models are monitored to correct locally «an average management strategy». The factors affecting losses and damage from which the culling arises are also regarded. The total period for planning and management is determined in accordance with the genetic
program and bred standards. The developed concept and theory of animal health control have no
analogues in the world.
Keywords: dairy farming, food supply, the concept of management, health, life cycle,
lactation and daily cycles, control algorithms, mathematical models.
58
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, № 2, с. 59-66
Репродуктивная биология
УДК 636.2:636.018:577.175.622:577.171.5
СОДЕРЖАНИЕ ТЕСТОСТЕРОНА И ХОЛЕСТЕРИНА В СЫВОРОТКЕ
КРОВИ У БЫКОВ-ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ТИПА
ПРОДУКТИВНОСТИ, ВОЗРАСТА И СЕЗОНА ГОДА
Х.А. АМЕРХАНОВ1, А.И. АБИЛОВ2, Г.В. ЕСКИН3, Н.А. КОМБАРОВА3,
И.С. ТУРБИНА3, Е.В. ФЕДОРОВА3, М.В. ВАРЕННИКОВ2, И.В. ГУСЕВ2
Известно, что андрогены обеспечивают половую дифференциацию в период внутриутробного развития и ее поддержание у взрослых быков-производителей, определяют функцию яичек, простаты, семенников, качество спермы, участвуют в работе иммунной системы, влияют на
процессы репликации, транскрипции, трансляции, клеточное деление и т.д. В свою очередь, на
синтез андрогенов влияют как эндогенные факторы (например, генотип, синтез предшественника), так и внешние условия, в частности тип кормления или сезон года. Мы сравнили концентрации тестостерона и холестерина в сыворотке крови у быков-производителей современной селекции по сезонам в зависимости от возраста и селекционной направленности. В течение 20122013 годов в условиях ОАО «Головной центр по воспроизводству сельскохозяйственных животных» (ОАО «ГЦВ», Подольский р-н, Московская обл.) на 49 особях быков-производителей
мясных, молочных и комбинированных пород с физиологически нормальным исходным фоном
тестируемого гормона и его предшественника показано, что чем выше концентрация холестерина
в сыворотке крови, тем выше концентрация тестостерона (Р < 0,01). Интенсивность выработки тестостерона у быков-производителей зависит от возраста и породы, а также от сезона года. Так, у быков мясных пород по сравнению с быками молочных пород концентрация сывороточного тестостерона выше (18,12±5,13 ммоль/л против 16,36±5,15 ммоль/л). По нашим данным, на содержание тестостерона в сыворотке крови у быков-производителей голштинской породы не влияет red-фактор.
Ключевые слова: тестостерон, холестерин, быки-производители.
Известно, что андрогены, относящиеся к группе стероидных половых гормонов, крайне важны для реализации физиологических (в особенности репродуктивных) функций у быков-производителей: эти гормоны
обеспечивают половую дифференциацию, определяют функцию яичек, простаты, семенников (1). Биосинтез андрогенов осуществляется в основном
в семенниках в интерстициальных клетках Лейдига. В их митохондриях
холестерин превращается в прегненолон, из которого под действием ферментов образуется тестостерон. Секреция тестостерона контролируется лютеинизирующим гормоном и имеет импульсный характер: выбросы тестостерона из клеток Лейдига происходят каждые 60-90 мин. За 1 сут у человека секретируется около 7 мг тестостерона, он инактивируется в печени и
выводиться в основном с мочой (2). Большая часть андрогенов (97-98 %)
находится в связанном с белками плазмы состоянии и только 2-3 % циркулирует свободно и считается биологически активной.
В комплексировании гормонов основную роль выполняет тестостерон-эстрадиол-связывающий глобулин, обладающий высоким сродством к
тестостерону и эстрадиолу. Этот белок осуществляет транспортную, регулирующую и защитную функции. Некоторое количество андрогенов взаимодействуют с сывороточным альбумином (3). Свободный тестостерон и
тестостерон, связанный с сывороточным альбумином, легко проникают в
клетки мишени. Внутри клеток он может превращаться в дегидротестостерон и эстрадиол. Превращение тестостерона происходит в семенниках с
участием фермента NADPH-зависимой 5?-редуктазы.
Низкий уровень тестостерона в сыворотке крови на фоне повышенного содержания лютеинизирующего гормона (ЛГ) и фолликулостимулируюущего гормона (ФСГ) могут быть причиной первичной и вторич59
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ной тестикулярной недостаточности (гипогонадизм). Р. Свердлофф с соавт. (2) показали, что снижение концентрации тестостерона становится
следствием дефицита глобулинсвязывающего полового гормона, к чему, в
свою очередь, может привести концентратный тип кормления (ожирение).
При снижении содержания тестостерона отмечено уменьшение числа и подвижности сперматозоидов и наоборот. При превышении нормы
по сывороточной концентрации эстрадиола наблюдается уменьшение сперматологических показателей (4). Также установлено, что избыточная или
недостаточная масса тела могут вызвать ухудшение качества спермы (5).
Доказано, что при избыточной массе выделяется больше эстрогенов, вследствие этого (через влияние гипоталамо-гипофизарной системы) в сперме падает число жизнеспособных сперматозоидов, и она становится менее
концентрированной (6).
Есть мнение, что эстрогены и тиреоидные гормоны оказывают стимулирующее влияние на биосинтез тестостерон-эстрадиолсвязывающего
глобулина в печени, а андрогены ? угнетающее (7). Считают, что гиперандрогенизация сопровождается снижением количества тестостерон-эстрадиолсвязывающего глобулина в сыворотке крови и увеличением количества андрогена в тканях, тогда как гиперэстрогенизация и гипертиреоз, наоборот, ведут к усилению активности тестостерон-эстрадиолсвязывающего глобулина и подавлению функции свободного тестостерона.
Следует отметить, что в мужском организме физиологическая роль
андрогенов проявляется на всех этапах фило- и онтогенеза. Так, уже в период внутриутробного развития тестостерон обусловливает дифференциацию половой системы и мозга у плода, необходимую для формирования
соответствующего типа гонадостата и полового поведения, обеспечивая
метаболизм стероидов в печени, и участвует в становлении иммунной защиты организма (8). В половозрелом возрасте у самцов половые гормоны
вовлечены в регуляцию сперматогенеза, сохранение структуры и функции
добавочных половых желез, способствуют поддержанию вторичных половых признаков и т.д.
У всех млекопитающих сперматогенез находится под контролем
пептидных и стероидных гормонов ? ФСГ, ЛГ, тестостерона, эстрадиола
и др. (9). Известно, что для поддержания половой активности требуется в
2 раза меньшее содержание тестостерона в крови, чем для нормального
функционирования механизма обратной связи между семенниками и гипоталамо-гипофизарной системой (3). Физиологическое значение функционального метаболизма тестостерона заключается в усилении или качественной модификации гормонального сигнала. Он также необходим для
индукции сперматогенеза в пубертатный период и его поддержания в зрелом возрасте, стимулирует размножение сперматогониев и мейоз сперматоцитов. Даже незначительное нарушение ритма секреции тестостерона или
малейший его дефицит могут привести к торможению сперматогенеза (2).
Тестостерон активизирует синтез ДНК, клеточное деление, биогенез рибополисом и синтез белков, в том числе андрогензависимых ферментов, а также вовлечен в структурные изменения соответствующих участков хроматина, усиление функциональной активности генома и синтеза
различных видов РНК (3).
F. Neumann и H. Steinbeck (10) показали, что у самок избыток андрогенов (гиперандрогенизация) нарушает центральную регуляцию половой
цикличности и подавляет овуляцию.
Известно также, что в молодом организме умеренные дозы андрогенов способствуют продольному росту трубчатых костей, а большие дозы
60
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
тормозят его вследствие окостенения эпифизарных костей. Андрогенам
принадлежит важная роль в обмене солей Са и Р и обновлении структурных белков костной ткани (3, 10).
Тестостерон подобно глюкокортикоидам проявляет иммунодепрессивные свойства. Тестостерон оказывает разнонаправленное влияние на образование под действием 5-?-редуктазы его 5-?-восстановленных метаболитов в печени и предстательной железе (3).
Отмечена высокая положительная корреляция между концентрацией семени и содержанием тестостерона и отрицательная ? между рН семени и количеством тестостерона (11) в сыворотке у быков симментальской породы в зависимости от сезона года (12). Предполагается, что сезонные колебания тестостерона могут быть связаны с различными внешними и внутренними факторами.
Проводя количественные исследования сывороточного тестостерона у плодов мужского пола и новорожденных бычков, J. Kozumplik (13)
отмечал, что концентрация этого гормона зависит от возраста в период от
2-4 мес до 2 лет (при статистически достоверных различиях). У особей
старше 2 лет статистической достоверности различий не выявлено, хотя
наблюдалась тенденция к увеличению количества тестостерона.
А.И. Абилов с соавт. (14) обнаружили взаимосвязь между содержанием эндогенных гормонов (тироксин, эстрадиол и тестостерон) и наличием спермальных аутоантител в сыворотке крови быков-производителей.
Таким образом, экспериментально доказана роль тестостерона и
его значение для нормального развития и общего метаболизма в организме млекопитающих. Поэтому в связи с задачами современной селекции и
совершенствованием репродуктивных технологий возрастает актуальность
сравнительных исследований особенностей выработки половых гормонов
у высокопродуктивных быков-производителей.
Цель нашей работы заключалась в изучении динамики концентрации эндогенного тестостерона и его предшественника холестерина в сыворотке крови быков-производителей в зависимости от различных факторов (возраст, сезон года, порода).
Методика. Исследования выполняли в 2012-2013 годах на 49 быках-производителях разного возраста (3-7 лет) и селекционной направленности ? мясных (абердин-ангусская, герефордская, лимузинская), молочных (голштинская красно-пестрая и черно-пестрая, айрширская) и комбинированной (бурая швицкая) пород, содержащихся в условиях ОАО «Головной центр по воспроизводству сельскохозяйственных животных» (ОАО
«ГЦВ», Подольский р-н, Московская обл.). Кормление, содержание и эксплуатацию животных осуществляли согласно принятой для этих целей национальной технологии замораживания и использования спермы племенных быков-производителей (15).
Кровь отбирали из яремной вены и помещали в стерильные пробирки объемом 10 мл, после выделения сыворотку до выполнения анализов хранили в морозильной камере при температуре от ?18 до ?20 °С. В
сыворотке крови концентрацию тестостерона определяли иммуноферментным методом с помощью тест-набора Иммуно-ФО-ТС на оборудовании
УНИПЛАН (АФГ-01, ЗАО «Пикон», Россия), холестерина ? на автоматическом биохимическом анализаторе Chem Well 2902 («Awareness Technology, Inc.», США).
Полученные данные обрабатывали статистически с использованием
программы MS Excel.
Результаты. В апреле 2012 года у всех особей, используемых в
61
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
опыте, определили физиологический фон по содержанию анализируемого
гормона и его предшественника в сыворотки крови. Концентрация тестостерона и холестерина составила соответственно 16,35±5,19 ммоль/л (от
8,74 до 29,51 ммоль/л) и 2,23±0,45 ммоль/л (от 1,50 до 3,25 ммоль/л). Из 49
быков только у девяти концентрация тестостерона была выше 20,0 и варьировала в диапазоне 21,12-29,51 ммоль/л. У двух животных отмечали наивысшие показатели по тестостерону (66,9 и 57,73 ммоль/л). Содержание
холестерина у всех изучаемых быков соответствовало физиологической
норме и в среднем равнялось 2,23±0,45 ммоль/л с вариациями от 1,50 до
3,25 ммоль/л (норма ? 1,30-4,42 ммоль/л). То есть в целом быки-производители по изучаемым параметрам находились в физиологически допустимых пределах.
Оценка возрастной динамики сывороточной концентрации тестостерона и холестерина в группе в зависимости от возраста быков-производителей показала (табл. 1), что по холестерину для особей как младшей,
так и старшей возрастной группы показатель сохранялся в границах физиологической нормы. При этом минимальное и максимальное значения
отмечали у животных в возрасте до 30 мес.
1. Концентрация тестостерона и холестерина в сыворотке крови у обследованных быков-производителей мясных, молочных и комбинированной пород в
зависимости от возраста (ОАО «Головной центр по воспроизводству сельскохозяйственных животных», Подольский р-н, Московская обл., 20122013 годы)
Возраст, мес
До 30
30 и старше
Норма
n
26
21
Тестостерон, ммоль/л
M±m
min-max
15,34±5,27
17,94±4,77
8,74-29,51
10,39-28,46
7,0-20,0
Холестерин, ммоль/л
M±m
min-max
2,20±0,49
1,39-3,17
2,24±0,38
1,65-3,02
1,30-4,42
В отношении концентрации тестостерона в сыворотке крови быков-производителей отмечалось увеличение показателя с возрастом. Так,
если в группе молодых животных (24-29 мес) его средняя величина составила 15,34±5,27 ммоль/л, то в группе быков старше 30 мес она возросла
на 17 % (см. табл. 1).
Разброс вариаций был смещен в сторону максимума, а выявленное
наибольшее значение на 30 % превышало верхнюю границу нормы по
обеим группам. У большой части молодых животных (14 гол.) отмечалась
концентрация тестостерона 8,74-14,55 ммоль/л, у восьми животных она
находилась на верхней границе нормы (15,04-18,45 ммоль/л), у четырех
производителей показатель превысил нормативные параметры и составил
22,15-29,51 ммоль/л. В старшей группе быков наблюдалось еще более выраженное смещение показателя по тестостерону к верхней границе нормы:
у шести животных он равнялся 12,09-15,00 ммоль/л, у девяти ? зафиксировали величину 15,01-19,93 ммоль/л, у пяти быков норма оказалась превышена (21,12-28,46 ммоль/л). Таким образом, в исследуемой выборке быков-производителей отмечали увеличение концентрации сывороточного
тестостерона с возрастом, а также тенденцию к превышению нормативных показателей в обеих возрастных группах.
Вызывает также интерес динамика выработки тестостерона у быков-производителей в зависимости от направления продуктивности.
Хотя во всех изучаемых группах уровень тестостерона находился в
пределах физиологической нормы (табл. 2), у быков мясных пород регистрировали бульшую концентрацию гормона (на 11 % выше), чем у быков
молочных пород. У животных комбинированной породы показатель при62
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ходился на нижнюю границу нормы (10,86±2,00 ммоль/л), составляя соответственно 50,64 и 66,85 % от величины, зарегистрированной у молочных
и мясных пород.
2. Концентрация тестостерона в сыворотке крови у обследованных 3-7-летних
быков-производителей в зависимости от направления продуктивности (ОАО
«Головной центр по воспроизводству сельскохозяйственных животных», Подольский р-н, Московская обл., 2012-2013 годы)
Направление продуктивности
n
Тестостерон, ммоль/л (M±m)
Min-max
Молочные породы
35
16,36±5,15
9,34-29,51
Мясные породы
9
18,12±5,13
10,39-25,19
Комбинированная порода
3
10,86±2,00
8,74-12,70
Всего
47
16,47±5,17
8,74-29,51
Норма
7,0-20,0
П р и м е ч а н и е. При статистической обработке не были учтены данные по одному быку молочной породы (66,90 ммоль/л) и одному быку мясной породы (57,73 ммоль/л).
Полученные нами данные также свидетельствовали (табл. 3), что в
сыворотке крови у обследованных быков-производителей содержание холестерина и эндогенного тестостерона взаимосвязано: с повышением первого показателя на 15,7 % второй возрастал на 78,6 % при статистической
достоверности различий (Р < 0,01).
3. Концентрация холестерина в сыворотке крови у обследованных 3-7-летних
быков-производителей мясных, молочных и комбинированной пород в зависимости от продукции эндогенного тестостерона (n = 49, ОАО «Головной центр
по воспроизводству сельскохозяйственных животных», Подольский р-н,
Московская обл., 2012-2013 годы)
Показатель
Среднее, M±m
Вариабельность
Физиологический
уровень тестостерона
В пределах нормы
Выше нормы
В пределах нормы
Выше нормы
n
Тестостерон, ммоль/л Холестерин, ммоль/л
38
11
38
11
14,25±2,81
25,46±2,92*
8,74-19,93
21,12-29,51
7,0-20,0
Норма
* Различия статистически достоверны при Р < 0,01.
2,16±0,39
2,50±0,59
1,50-2,74
1,65-3,25
Количество эндогенного тестостерона и его предшественника холестерина в сыворотке крови у быков-производителей динамично возрастало
в зависимости от сезона года, при этом максимальные значения отмечали
в осенний период при статистической достоверности различий (табл. 4).
4. Концентрация эндогенного тестостерона и холестерина в сыворотке крови у
обследованных 3-7-летних быков-производителей мясных, молочных и комбинированной пород в зависимости от сезона (n = 18, ОАО «Головной центр
по воспроизводству сельскохозяйственных животных», Подольский р-н,
Московская обл., 2012-2013 годы)
Показатель
Весна
Лето
Т е с т о с т е р о н, ммоль/л
Среднее, M±m
16,45±6,70
19,56±5,86
Min-max
8,74-29,51
12,50-32,08
Х о л е с т е р и н, ммоль/л
Среднее, M±m
2,19±0,45
2,23±0,47
Min-max
1,39-2,89
1,32-3,28
* Различия статистически достоверны при P < 0,1.
Осень
27,62±6,56*
15,38-35,66
2,50±0,46
1,52-3,23
Показано, что синтез тестостерона напрямую связан с содержанием витамина D в организме (16). Также общеизвестен тот факт, что у животных разной масти кожа неодинаково воспринимает инсоляцию, от чего, в свою очередь, зависит образование витамина D. Учитывая это, мы
сравнили концентрацию тестостерона в сыворотке крови животных одной
породы в зависимости от наличия у них red-фактора (красно- и чернопестрый скот) (табл. 5). Как оказалось, red-фактор существенно не влияет
63
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
на концентрацию тестостерона: тенденции в изменении количества эндогенного гормона по сезонам года были сходными у быков красно- и черно-пестрой масти.
5. Концентрация эндогенного тестостерона в сыворотке крови (ммоль/л) у обследованных 3-7-летних быков-производителей голштинской породы разной
масти в зависимости от сезона (ОАО «Головной центр по воспроизводству сельскохозяйственных животных», Подольский р-н, Московская обл.,
2012-2013 годы)
Показатель
Среднее, M±m
Масть животных
n
Красно-пестрая
8
Черно-пестрая
9
Min-max
Красно-пестрая
8
Черно-пестрая
9
П р и м е ч а н и е. При статистической обработке не
пестрой масти (66,90 ммоль/л).
Весна
Лето
15,57±5,41
20,45±7,29
18,00±7,55
18,35±4,72
11,40-27,04
12,15-32,08
10,23-29,51
15,01-26,98
были учтены данные по одному
Осень
26,87±7,40
28,05±6,49
15,38-35,66
16,24-35,58
быку красно-
Ускорение селекции в молочном и мясном скотоводстве повлекло
за собой общие изменения метаболизма в организме животных. В результате в случае высокопродуктивных быков-производителей существовавшие
ранее нормативы по содержанию половых гормонов утрачивают актуальность, хотя эти данные очень важны как для селекционных исследований,
так и для зоотехнической практики. В этой связи мы оценили оптимальные
концентрации тестостерона в сыворотки крови у быков на примере обследованных производителей голштинской породы (n = 18). Показатели разместили на графике в порядке нарастания в зависимости от сезона года (рис.).
Исключив крайние значения, получили, что у основной части обследованных
быков концентрация сывороточного тестостерона была сходной, при этом отмечалась незначительная тенденция к увеличению этого
показателя в осенний периИндивидуальные показатели концентрации тестостерона в од. Видимо, отмеченный эфсыворотке крови у быков-производителей голштинской по- фект связан с частичным сороды в возрасте 3-7 лет в разные сезоны года: 1 ? сен- хранением генетически зактябрь, 2 ? июль, 3 ? апрель (по нарастанию в группе;
ОАО «Головной центр по воспроизводству сельскохо- репленной сезонной зависизяйст??енных животных», Подольский р-н, Московская мости жизненного цикла у
обл., 2012 год).
современных пород крупного рогатого скота.
Таким образом, нами установлено, что у быков-производителей
повышение концентрации холестерина в сыворотке крови способствует
росту количества тестостерона (Р < 0,01) и зависит от сезона года, возраста и породы. Концентрация тестостерона у быков мясных пород в среднем
на 11 % выше, чем у производителей молочных пород (18,12 ммоль/л
против 16,36 ммоль/л). Независимо от возраста и сезона года у 78 % быков-производителей современной селекции концентрация тестостерона
составляет 15-30 ммоль/л, у 11 % животных этот показатель варьирует от
7 до 15 ммоль/л, и у такого же процента особей его значение равняется
35 ммоль/л и выше. По сезонам показатель нарастает: в весенний период
его величина составила 16,45 ммоль/л, в летний ? 19,56 ммоль/л, осенью ?
64
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
до 27,62 ммоль/л. Для минимальных и максимальных сезонных показателей характерна одинаковая динамика. В умеренно-континентальном климате Центральной России red-фактор не оказывал существенного влияния
на содержание тестостерона в сыворотке крови у обследованных животных. Результаты сравнения особенностей выработки половых гормонов у
высокопродуктивных быков-производителей современной селекции, полученные нами в этой работе, могут быть использованы при решении задач
селекции и совершенствовании репродуктивных технологий.
Авторы благодарят сотрудников лаборатории биохимии Всероссийского НИИ
животноводства за помощь в проведении анализов.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
М и л о в а н о в В.К. Биология воспроизведения и искусственного осеменения животных. М., 1962.
С в е р д л о ф ф Р., Б х а с и н Ш. Нарушения половой функции у мужчин. В сб.: Эндокринология /Под ред. Н. Лавина. М., 1999: 369-409.
Р е з н и к о в А.Г., В а р г а С.В. Антиандрогены. М., 1988.
Г у т о р о в а Н.В., О с а д ч у к Л.В., К л е ш о в М.А., К у з н е ц о в а Н.Н., О с а д ч у к A.В. Качество спермы и уровень репродуктивности гормонов у мужчин. Проблемы
репродукции, 2010, 6: 89-93.
Q i n D.D., Y u a n W., Z h o u W.J., C u i Y.Q., W u J.Q., G a o E.S. Do reproductive
hormones explain the association between body mass index and semen quality? Asian J. Androl., 2007, 9: 827-834.
F e j e s I., K o l o s z a r S., Z a v a c z k i Z., D a r u J., S z o l l o s i J., P a l A. Effeсt of
body weight on testosterone estradiol ratio in oligozoospermie patients. Anthology Archive,
2006, 52: 97-102.
W a g n e r R.K. Extracellular and intracellular steroid binding proteins: properties, discrimination, assay and clinical application. Acta Endocrinology, 1978, Suppl. 218: 73.
Р е з н и к о в А.Г. Половые гормоны и дифференциация мозга. Киев, 1982.
K u m a n o v P., N a n d i p a t i K., T o m o v a A., A g a r w a l A. Inhibin B is a better marker
of spermatogenesis than other hormones in the evaluation of male factor infertility. Fertil.
Steril., 2006, 2: 332-338.
N e u m a n n F., B a h n e r F., B r o t h e r t o n J., G r a f K.-J., H a s a n S.H., H o r n H.J.,
H u g h e s A., O e r t e l G.W., S t e i n b e c k H., V o s s H.E., W a g n e r R.K. Androgens II
and antiandrogens. Handbook of experimental pharmacology (Berlin-N.Y.), 1974, 35(2): 235-484.
C h a c u r M.G.M., M i z u s a k i K.T., G a b r i e l F i l h o L.R.A., O b a E., R a m o s A.A.
Seasonal effects on semen and testosterone in Zebu and Taurine bulls. Acta Scientiae Veterinariae, 2013, 41: pub. 1110.
J a v e d M.T., A b r a r K., M u m t a z A. Influence of season on seminal plasma testosterone
and oestrogen in healthy and abnormal bulls and their relationship with other semen parameters. Veterinary Archive, 2000, 70(3): 141-149.
K o z u m p l i k J. The level of plasma testosterone during the prenatal and postnatal period of
development in bulls. Acta Vet. (Brno), 1981, 50: 27-32.
А б и л о в А.И., А м е р х а н о в Х.А., Е с к и н Г.В., Ф е д о р о в а Е.В., Ж а в о р о н к о в а Н.В., К о м б а р о в а Н.А., В а р е н н и к о в М.В. Эндогенные гормоны у быковпроизводителей в новой генерации и их связь с титром аутоиммунности. Зоотехния,
2013, 9: 25-28.
Национальная технология замораживания и использования спермы племенных быковпроизводителей /Под ред. Н.М. Решетниковой. М., 2008.
A n d e r s s o n A.M., C a r l s e n E., P e t e r s e n J.H., Sk a k k e b a e k N.S. Variation in
levels of serum inhibin B, testosterone, estradiol, luteinizing hormone, follicle-stimulating hormone, and sex hormone-binding globulin in monthly samples from healthy men during a 17month period: possible effects of seasons. J. Clin. Endocrinol. Metab., 2003, 88: 932-937.
1Министерство
сельского хозяйства РФ,
107139 Россия, г. Москва, Орликов пер., 1/11;
2ГНУ Всероссийский НИИ животноводства
Поступила в редакцию
25 июля 2013 года
Россельхозакадемии,
142132 Россия, Московская обл., Подольский р-н,
пос. Дубровицы,
e-mail: [email protected];
3ОАО «Головной центр по воспроизводству
65
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
сельскохозяйственных животных»,
142143 Россия, Московская обл., Подольский р-н,
пос. Быково, ул. Центральная, 3,
e-mail: [email protected], [email protected], [email protected],
[email protected]
CONCENTRATION OF TESTOSTERONE AND CHOLESTEROL IN
BLOOD SERUM OF SERVICING BULLS DEPENDING ON THEIR
TYPE OF PRODUCTIVITY, AGE AND THE SEASON
Kh.A. Amerkhanov1, A.I. Abilov2, G.V. Eskin3, N.A. Kombarova3, I.S. Turbina3,
E.V. Fedorova3, M.V. Varennikov2, I.V. Gusev2
1Ministry
of Agriculture of the Russian Federation, 1/11, Orlikov per., Moscow, 107139 Russia;
Research Institute of Animal Husbandry, Russian Academy of Agricultural Sciences, pos. Dubrovitsy, Podolsk Region, Moscow Province, 142132 Russia, e-mail [email protected];
3Head Center for Farm Animal Reproduction, Plc., 3, ul. Central?naya, pos. Bykovo, Podolsk Region, Moscow Province, 142143 Russia, e-mail [email protected], [email protected], [email protected], [email protected]
Received July 25, 2013
2All-Russian
Abstract
The androgenic hormones are known to control sexualization during prenatal period and to
keep up the sex-influenced traits in adult servicing bulls. In particular, the hormones determine functions of testes, prostate, android glands, semen quality, affect the DNA replication, transcription,
translation, cell division, they are also involved in immune activity, etc. In turn, production of the
androgens is influenced by both internal factors (i.e. genotype, precursors), and external conditions, such as feeding and the season of the year. In our examination conducted in 2012 to 2013,
the servicing bulls (n = 49) up to 30 month old and the older which are used in breeding for milk
and meet productivity were tested at different seasons (spring, summer and autumn) to compared the
testosterone and cholesterol concentrations in blood serum. In all tested animals an initial content of
the hormone and its precursor in blood serum was within the physiological limits. It was shown that
the higher cholesterol content, the higher testosterone concentration was tested (Р < 0.01). Testosterone production depended on the age and breed of bulls, and also on the season. In meat bulls the
concentration of blood serum testosterone was higher if compared to that in milk bulls, 18.12±5.13
and 16.36±5.15 mmol/l, respectively. According to the data obtained the endogenous testosterone
content is not influenced by red-factor in Holsteins.
Keywords: testosterone, cholesterol, servicing bulls.
Вниманию читателей!
Подписку на журнал «Сельскохозяйственная биология»
на 2014 год можно оформить через почтовое отделение
Информация о нашем издании помещена в Объединенном
каталоге «Российские и зарубежные газеты и журналы»
Индекс ? 70804
С 1989 года журнал выходит тематическими выпусками:
? биология растений (№№ 1, 3 и 5),
? биология животных (№№ 2, 4 и 6).
Профиль журнала остается прежним.
На журнал можно также подписаться через редакцию. Для этого
необходимо перевести деньги на расчетный счет редакции
" Институты и организации перечисляют деньги на счет редакции.
" Индивидуальные подписчики почтовым переводом перечисляют деньги на счет
редакции. Квитанцию с указанием точного адреса (индекс обязателен), на который
нужно выслать журнал, необходимо переслать в редакцию.
" Стоимость подписки на I полугодие ? 539 руб. за один номер с учетом НДС 10 %.
Срок подписки не ограничен
Банковские реквизиты редакции:
Получатель ? ИНН 7708051012 Редакция журнала «Сельскохозяйственная биология»,
Марьинорощинское ОСБ 7981, г. Москва, р/с 40703810638050100603
Банк получателя ? Сбербанк России ОАО, г. Москва, БИК 044525225, к/с 30101810400000000225
Адрес редакции: 127434 г. Москва, Дмитровское ш., д. 11, офис 343
Адрес в Интернетe: www.agrobiology.ru
66
E-mail: [email protected]
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, № 2, с. 67-71
УДК 636.2:619:618.2:[577.121+591.51
МЕТАБОЛИЧЕСКИЙ ПРОФИЛЬ БЕРЕМЕННЫХ КОРОВ
С РАЗНЫМ ТИПОМ ЭТОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
Е.В. СМИРНОВА, А.Г. НЕЖДАНОВ, М.И. РЕЦКИЙ, Э.В. БРАТЧЕНКО,
Н.Е. ПАПИН, А.В. СТЕПАНОВ, В.И. ШУШЛЕБИН, Г.Г. ЧУСОВА
Известно, что высокопродуктивные животные крайне чувствительны к изменениям условий содержания и эксплуатации, что влечет за собой глубокие нарушения в функциях эндокринной, иммунной, репродуктивной и других систем организма. Интеграция адаптационных реакций у животных, которую осуществляет центральная нервная система, зависит от особенностей
высшей нервной деятельности. У глубокостельных коров черно-пестрой голштино-фризской породы в возрасте 4-6 лет со среднегодовой молочной продуктивностью за предшествующую лактацию 7-8 тыс. кг (n = 82) и разным типом поведения изучали комплекс биохимических и гормональных показателей крови, характеризующих метаболический статус и стрессоустойчивость. В
сыворотке и цельной крови определяли концентрацию белков, мочевины, креатинина, общих липидов, холестерина, триглицеридов, глюкозы, молочной и пировиноградной кислот, Ca, P, Mg,
Zn, Mn, Cu, Fe, витаминов А, Е, связанного с белком йода, малонового диальдегида, общих иммуноглобулинов, активность аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы, ?-глутамилтрансферазы, щелочной фосфатазы, глутатионпероксидазы, каталазы, бактерицидную активность,
содержание половых (прогестерон, эстрадиол-17?, тестостерон), кортикостероидных (кортизол)
и тиреоидных (тироксин, три-йодтиронин) гормонов. Также анализировали характер течения родов и послеродового периода. Показано, что по активности функционирования физиологических
систем организма идентичными оказываются инфрапассивные и ультраактивные животные (крайние типы), а также активные и пассивные животные (средние типы). Коровы со средними типами поведения более устойчивы к родовым и послеродовым патологиям. Следовательно, крупногрупповое содержание животных, периодическое перемещение их из одной технологической группы в другую без учета типологических особенностей нервной системы и поведенческих реакций
приводит к снижению репродуктивного (и продуктивного) потенциала.
Ключевые слова: коровы, поведение, гормонально-метаболический статус, акушерская
патология.
Согласно общепризнанному мнению, продуктивные и воспроизводительные качества молочного скота определяются состоянием метаболического гомеостаза на разных этапах репродуктивного цикла и лактации
(1-4). Особенно важно это положение для высокопродуктивных коров, у
которых вектор обмена веществ направлен в первую очередь на реализацию генетического потенциала молочной продуктивности. К физиологическим особенностям таких животных относится их высокая чувствительность к дисбалансу биологически активных веществ и энергии и изменяющимся технологическим условиям содержания и эксплуатации, что
влечет за собой глубокие нарушения в функциях эндокринной, иммунной,
репродуктивной и других систем организма (5). Интеграция их адаптационных реакций на внутренние и внешние раздражители осуществляется
центральной нервной системой, а характер функционирования указанных
систем обусловлен типом высшей нервной деятельности (6).
Внешними проявлениями типологических особенностей нервной
системы служат поведенческие реакции, которые в достаточной степени
отражают силу, подвижность и уравновешенность нервных процессов (6),
так как в основе формирования поведенческого акта любой степени сложности лежат интегративные свойства центральных нейронов (7, 8).
Наша цель заключалась в оценке особенностей биохимического
статуса глубокостельных коров в зависимости от типа поведенческих реакций и показателей воспроизводительной способности после родов.
Методика. Объектом исследований служили 82 коровы черно-пестрой голштино-фризской породы в возрасте 4-6 лет со среднегодовой мо67
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
лочной продуктивностью за предшествующую лактацию 7-8 тыс. кг. Исследования проводились в 2012 году на базе ЗАО «Славянское» (Верховский р-н, Орловская обл.) в условиях беспривязного содержания животных. Рацион соответствовал зоотехническим нормам кормления.
Поведенческие реакции коров определяли за 45-60 сут до предполагаемого отела на основании наблюдений в течение 3 сут (каждое наблюдение занимало по 3 ч) до начала, во время и после кормления по методике В.И. Великжанина (9).
В четырех группах, на которые животных разделили по результатам определения этологической активности каждой коровы, за 30-45 сут
до предполагаемого отела от 32 коров (по 8 из каждой группы) получали
венозную кровь для оценки биохимического и гормонального статусов.
В пробах сыворотки и цельной крови оценивали содержание белков, мочевины, креатинина, общих липидов, холестерина, триглицеридов,
глюкозы, молочной и пировиноградной кислот, минералов (Ca, P, Mg, Zn,
Mn, Cu, Fe), витаминов А, Е, связанного с белком йода (СБЙ), малонового диальдегида (МДА), общих иммуноглобулинов, активность ферментов:
аспартатаминотрансферазы (АсАТ), аланинаминотрансферазы (АлАТ),
?-глутамилтрансферазы (ГГТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), глутатионпероксидазы (ГПО), каталазы, бактерицидную активность сыворотки крови
(БАСК) с помощью унифицированных методов (10). Определение содержания половых (прогестерон, эстрадиол-17?, тестостерон), кортикостероидных (кортизол) и тиреоидных (тироксин, трийодтиронин) гормонов осуществляли методом ИФА с применением диагностических систем фирм
«Диагностические системы» и «Хема-Медика» (Россия).
Характер течения родов и послеродового периода учитывали, пользуясь стандартными приемами клинического исследования.
Полученные данные подвергали математической и статистической
обработке в программе Statistica v. 5.0.
Результаты. После расчета среднего индекса этологической активности у каждой коровы животных условно разделили на четыре группы ?
ультраактивные (индекс 0,877±0,008), активные (0,777±0,009), пассивные
(0,675±0,010) и инфрапассивные (0,525±0,023). В процентном соотношении они составили соответственно 24,8; 31,4; 19,8 и 24,0 %.
Было установлено, что для животных с активным типом поведения
характерна достаточно высокая физиологическая функция плаценты, щитовидной и надпочечных желез. У этих особей содержание прогестерона в
крови превышало таковое у животных инфрапассивного типа на 29,4 %,
трийодтиронина ? на 27,2 % и кортизола ? на 13,9 % (табл. 1).
1. Гормональный статус глубокостельных коров черно-пестрой голштинофризской породы с разным типом этологической активности (Х+х, ЗАО
«Славянское», Верховский р-н, Орловская обл., 2012 год)
Гормон
Прогестерон, нмоль/л
Эстрадиол-17?, нмоль/л
Тестостерон, нмоль/л
Кортизол, нмоль/л
Тироксин, пмоль/л
Трийодтиронин, пмоль/л
инфрапассивные
7,65±1,15
0,69±0,05
2,42±0,23
74,8±4,97
17,1±0,59
3,34±0,29
Группа животных
пассивные
активные
9,18±0,85
0,62±0,04
2,81±0,14
69,7±5,98
17,4±0,70
3,48±0,29
9,90±1,09
0,67±0,07
2,56±0,15
85,2±4,68
16,7±0,83
4,25±0,36
ультраактивные
9,67±0,82
0,65±0,07
2,47±0,15
82,6±4,30
16,8±1,06
3,52±0,33
Животные с ультраактивным типом поведения характеризовались
высокой концентрацией в крови гормонов плаценты и надпочечных желез, а пассивного типа ? только прогестерона.
При изучении биохимического статуса было выявлено, что у коров
68
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
активное уравновешенное поведение в сравнении с инфрапассивным сопряжено с повышением содержания глобулинов, иммуноглобулинов, мочевины, витаминов А и Е, связанного с белком йода, ростом активности
АсАТ, ЩФ, БАСК и снижением концентрации глюкозы, пировиноградной кислоты, фосфора, цинка, МДА, уменьшением активности ГГТ, ГПО,
каталазы (табл. 2).
Количество глобулинов в сыворотке крови у активных коров по
сравнению с инфрапассивными было выше на 5,0 %, общих иммуноглобулинов ? на 30,8 %, мочевины ? на 15,8 %, что свидетельствовало о более
интенсивном синтезе функциональных белков и высокой неспецифической резистентности. На последнее указывало также превышение бактерицидной активности сыворотки крови на 13,1 %.
2. Биохимический статус глубокостельных коров черно-пестрой голштинофризской породы с разным типом этологической активности (Х+х, ЗАО
«Славянское», Верховский р-н, Орловская обл., 2012 год)
Показатель
инфрапассивные
Общий белок, г/л
76,40±1,28
Альбумины, %
45,85±1,41
Общие глобулины, %
54,20±1,19
Общие иммуноглобулины, г/л
24,65±1,42
Мочевина, ммоль/л
4,43±0,20
Креатинин, мкмоль/л
84,40±4,77
Общие липиды, г/л
2,40±0,13
Холестерин, ммоль/л
3,04±0,12
Триглицериды, ммоль/л
0,17±0,03
Глюкоза, ммоль/л
2,63±0,13
Лактат, ммоль/л
1,72±0,02
Пируват, мкмоль/л
107,70±11,10
Лактат/пируват
16,0
Витамин А, мкмоль/л
1,22±0,34
Витамин Е, мкмоль/л
11,90±1,40
Кальций, ммоль/л
2,54±0,03
Фосфор, ммоль/л
2,05±0,08
Цинк, мкг%
296,40±27,60
Железо, мг%
20,90±0,18
СБЙ, мкг%
9,13±0,44
АсАТ, Е/л
62,00±4,89
АлАТ, Е/л
20,20±1,52
АсАТ/АлАТ
3,07
ГГТ, Е/л
20,50±2,63
ЩФ, Е/л
90,80±11,16
ГПО, мкмоль/(л?мин)
15,73±0,19
Каталаза, мкмоль/(л?мин)
36,66±1,12
МДА, мкмоль/л
1,86±0,09
БАСК, %
56,84±5,16
П р и м е ч а н и е. СБЙ ? связанный с белком йод,
наминотрансфераза, ГГТ ? ?-глутамилтрансфераза,
роксидаза, МДА ? малоновый диальдегид, БАСК ?
Группа животных
пассивные
активные
ультраактивные
75,32±2,92
77,57±1,49
75,54±2,17
43,16±2,18
44,06±1,46
46,99±2,11
56,80±1,53
56,90±1,36
53,00±1,83
31,79±3,43
32,24±2,21
26,89±1,50
5,02±0,34
5,13±0,30
4,46±0,14
93,40±6,60
84,30±6,24
75,80±4,64
2,24±0,21
2,53±0,10
2,43±0,16
2,82±0,28
3,29±0,20
3,00±0,16
0,13±0,03
0,12±0,02
0,18±0,03
2,39±0,06
2,25±0,08
2,53±0,12
1,67±0,04
1,69±0,03
1,74±0,05
78,30±11,60
71,30±12,30
110,00±10,90
21,3
23,7
15,8
1,55±0,33
1,70±0,31
1,37±0,15
16,10±1,79
16,00±1,27
13,20±1,97
2,58±0,04
2,60±0,04
2,51±0,03
1,90±0,05
1,93±0,04
2,04±0,04
273,00±13,70 260,70±19,90
297,30±36,20
20,99±0,22
20,80±0,25
20,91±0,15
9,41±0,36
10,63±0,44
9,91±0,74
75,60±11,97
73,00±6,10
59,60±5,72
21,70±2,01
21,90±0,90
22,30±0,88
3,49
3,34
2,67
17,00±1,93
15,20±0,40
22,80±2,66
110,60±10,49 112,60±7,42
99,80±7,31
14,66±0,73
14,48±0,84
15,22±0,50
34,75±1,33
35,45±1,02
36,62±0,98
1,63±0,12
1,63±0,10
1,95±0,13
66,08±4,07
64,28±3,29
58,52±4,49
АсАТ ? аспартатаминотрансфераза, АлАТ ? аланиЩФ ? щелочная фосфатаза, ГПО ? глутатионпебактерицидная активность сыворотки крови.
Пониженное содержание в крови глюкозы (на 16,9 %), пировиноградной кислоты (на 51,1%), цинка (на 13,7 %), фосфора (на 6,2 %), превышение индекса соотношения лактат/пируват (на 48,1 %) свидетельствовали об активных окислительно-восстановительных процессах в основном
за счет повышения интенсивности анаэробного гликолиза.
Более высокие показатели активности АсАТ (на 17,7 %) и ЩФ (на
24,1 %) отражали основные метаболические пути интеграции белкового и
углеводного обменов (АсАТ) и высокую интенсивность метаболических
процессов в костной ткани у матери и плода (ЩФ).
Превышение содержания в крови связанного с белком йода (на
16,4 %), как и показатели гормонального фона, отражали активное функционирование щитовидной железы.
У коров с активным типом поведения концентрация МДА в крови
69
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
оказалась на 14,1 % ниже, чем у инфрапассивных животных, активность
ГПО ? на 8,6 %, каталазы ? на 3,4 % ниже, а содержание витаминов Е и
А ? выше соответственно на 34,5 % и 39,3 %, что свидетельствует о стабильности процессов свободнорадикального окисления.
Для животных с пассивным (инертным) типом поведения был характерен метаболический статус, близкий к наблюдаемому у особей с активным типом. Небольшие различия отмечались только по содержанию
креатинина (выше на 10,8 %), глюкозы (выше на 6,2 %), пировиноградной
кислоты (выше на 9,8 %), витамина А (ниже на 9,6 %). В то же время метаболические и иммунологические показатели у коров с ультраактивным
(неуравновешенным) поведением соответствовали таковым у инфрапассивных животных.
Выраженных различий в содержании магния, меди и марганца в
крови у коров из разных групп не установили.
Таким образом, характер функционирования физиологических систем был одинаковым у животных двух крайних (инфрапассивные и ультраактивные) и двух средних (активные и пассивные) типов.
При анализе течения родов и послеродового периода, вызывающих перенапряжение нервной системы, нарушения физиологических процессов чаще всего регистрировали у животных с инфрапассивным и неуравновешенным ультраактивным типом поведения. Так, в группе инфрапассивных и ультраактивных коров задержание последа наблюдали в
среднем у 23,7 % животных, тогда как среди активных и пассивных ? у
17,9 %, послеродовой эндометрит ? соответственно у 44,3 и 25,2 % особей. По степени устойчивости к родовым и послеродовым заболеваниям
коровы распределялись в следующей последовательности: активные > пассивные > ультраактивные > инфрапассивные.
Итак, по особенностям функционирования физиологических систем
организма идентичными оказываются инфрапассивные и ультраактивные
животные (крайние типы), а также активные и пассивные животные (средние типы). Коровы со средними типами поведения более устойчивы к проявлению акушерской патологии. Гормонально-метаболические показатели
крови у беременных коров отражают не только условия их кормления, содержания и эксплуатации, но и состояние адаптивных реакций со стороны
нервной системы, выражающихся в типологических особенностях поведения. Поэтому крупногрупповое содержание животных, периодическое перемещение их из одной технологической группы в другую без учета типологических особенностей нервной системы и поведенческих реакций приводит к снижению репродуктивного (и продуктивного) потенциала.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
70
Л е й б о в а В.Б., Ш а п и е в И.Ш., Л е б е д е в а И.Ю. Метаболическое состояние в
конце периода раздоя у высокопродуктивных молочных коров с разной воспроизводительной способностью. Сельскохозяйственная биология, 2011, 6: 103-109.
Н е ж д а н о в А.Г. Болезни органов размножения у крупного рогатого скота в свете современных достижений репродуктивной эндокринологии и патобиохимии. В сб. науч.
тр.: Современные проблемы диагностики, лечения и профилактики инфекционных болезней животных и птиц. Екатеринбург, 2008: 350-363.
С а м о х и н В.Т. Профилактика нарушений обмена микроэлементов у животных. Воронеж, 2003.
С а ф о н о в В.А. О метаболическом профиле высокопродуктивных коров при беременности и бесплодии. Сельскохозяйственная биология, 2008, 4: 64-67.
Ш а б у н и н С.В., Н е ж д а н о в А.Г., А л е х и н Ю.Н. Проблемы профилактики бесплодия
у высокопродуктивного молочного скота. Ветеринария, 2011, 2: 3-8.
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
6.
И п п о л и т о в а Т.В. Типы высшей нервной деятельности, их связь с реактивностью и
продуктивностью сельскохозяйственных животных. М., 1998.
7. А н о х и н П.К. Системные механизмы высшей нервной деятельности. М., 1979.
8. Функциональные системы организма /Под ред. К.В. Судакова. М., 1987.
9. В е л и к ж а н и н В.И. Методические рекомендации по использованию этологических признаков в селекции молочного скота. СПб, 2000.
10. Р е ц к и й М.И., Ш а х о в А.Г., Ш у ш л е б и н В.И. и др. Методические рекомендации по
диагностике, терапии и профилактике нарушений обмена веществ у продуктивных животных.
Воронеж, 2005.
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский
ветеринарный институт патологии,
фармакологии и терапии Россельхозакадемии,
Поступила в редакцию
1 апреля 2013 года
394087 Россия, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114-б,
е-mail: [email protected], [email protected]
THE METABOLIC PROFILE OF LATE PREGNANT COWS
OF VARIOUS ETHOLOGICAL ACTIVITY TYPES
E.V. Smirnova, A.G. Nezhdanov, M.I. Retsky, E.V. Bratchenko, N.E. Papin,
A.V. Stepanov, V.I. Shushlebin, G.G. Chusova
All-Russian Research Veterinary Institute of Pathology, Pharmacology and Therapy, Russian Academy of Agricultural Sciences, 114-b, ul. Lomonosova, Voronezh, 394087 Russia, е-mail [email protected], [email protected]
Received April 1, 2013
Abstract
It is known that highly productive animals are extremely sensitive to housing and service
conditions changes that lead to serious disorders of endocrine, immune, reproductive and other functions. Integration of the adaptive responses, realized by central nervous system, depends on the
higher nervous activity peculiarities. The complex of biochemical and hormonal blood indexes, characterizing metabolic status and stress resistance, were studied in the late pregnant Black and White
Holstein-Friesian cows at age of 4-6 years with an average annual dairy efficiency of prior lactation
of 7000-8000 kg (n = 82) and different types of behavior. The concentrations of proteins, urea,
creatinine, total lipids, cholesterin, triglyceride, glucose, lactic and pyruvic acids, Ca, P, Mg, Zn,
Mn, Cu, Fe, vitamins A, E, connected with iodine, malonic dialdehyde and total immunoglobulins,
activity of aspartate aminotransferase, alanine aminotransferase, ?-glutamil transferase, alkaline phosphatase, glutathione peroxidase, catalase, bactericidal activity, content of sex (progesterone, estradiol-17?, testosterone), corticosteroid (cortisol) and thyroid (thyroxin, triiodthyronin) hormones were
determined in the whole blood and blood serum. The character of labor process was also analyzed.
It is shown that infra-passive and ultra-active animals (extreme types) and passive animals (mean
types) are identical according to the activity of physiological systems functioning. Cows with mean
behavior types are more resistant to natal and postnatal pathologies. Consequently, large-group housing of animals, their periodical translocation from one technological group into another without taking
into account typological peculiarities of their nervous systems and behavioral responses lead to decrease of their reproductive (and productive) potential.
Keywords: cow, behavior, hormonal-metabolic status, obstetrical pathology.
Новые книги
Л ы с о в В.Ф. Практикум по физиологии и
этологии животных. М.: изд-во «КолосС»,
2010, 304 с.
Второе издание «Практикума по
физиологии и этологии животных» отражает
современный уровень развития физиологии
как науки с учетом требований производственного процесса, а также последних достижений в области биохимии, биофизики и
биотехнологии. В практикуме (соответствует
программе по физиологии и этологии животных, утвержденной Министерством образования и науки РФ) изложены на современном методическом уровне в систематизи-
рованном виде формы и методики выполнения лабораторных и практических работ по
физиологии и этологии животных в соответствии с закономерностями деятельности систем организма, а также принципы работы,
возможности и правила использования приборов. Описаны методы исследования, методические приемы для оценки физиологических функций, поведения и адаптации животных. Предназначен для студентов высших
учебных заведений по направлениям подготовки и специальностям «Ветеринария» и
«Зоотехния», других биологических специальностей, слушателей ФПК ? преподавателей высших учебных заведений.
71
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, № 2, с. 72-77
УДК 636.52/.58:577.121:577.152.2
ОЦЕНКА РОЛИ АМИНОТРАНСФЕРАЗ В ФОРМИРОВАНИИ
ПРОДУКТИВНОСТИ У КУР-НЕСУШЕК
Т.И. СЕРЕДА, М.А. ДЕРХО
Известно, что с участием ферментных систем реализуется наследственная информация
в онтогенезе, поддерживается гомеостаз, обеспечивается регуляция роста и развития, формирование продуктивных качеств. Однако исследования ферментов в тканях и органах сельскохозяйственной птицы немногочисленны. Наиболее перспективными для оценки физиологического состояния особи и яичной продуктивности представляются системы аланинаминотрансферазы
(АлАТ) и аспартатаминотрансферазы (АсАТ). В доступной нам литературе мы не нашли сведений
об особенностях влияния возраста, срока продуктивного использования и яичной продуктивности
на соотношение активности АсАТ и АлАТ в крови и тканях разных органов у кур. В этой связи
мы изучили динамику активности аминотрансфераз в крови и клетках печени, сердца и почек у
кур-несушек кросса Ломан белый из промышленного стада (ОАО «Челябинская птицефабрика»,
2011 год) в течение периода яйцекладки. Установлено, что изменения показателей активности
аминотрансфераз и их соотношения в тканях и органах даже в пределах физиологической нормы
представляют собой следствие метаболических сдвигов в обменных процессах. При этом каталитическая активность АлАТ, АсАТ и ее соотношение в сыворотке крови несушек, во-первых,
взаимосвязаны с внутриклеточным содержанием ферментов в печени, сердце и почках, вовторых, отражают интенсивность и направленность превращений аминокислот в клетках организма, в-третьих, характеризуют скорость выхода ферментов из клеток в кровь и, в-четвертых,
сопряжены с величиной яичной продуктивности. Содержание АсАТ и АлАТ в гепатоцитах и скорость выхода аминотрансфераз из клеток в кровь при физиологической регенерации в наибольшей степени влияют на содержание ферментов в крови кур и, как следствие, на метаболические
превращения аминокислот в организме птицы, что сказывается на ее яичной продуктивности.
Ключевые слова: аминотрансферазы, кровь, органы, куры, продуктивность.
Ферментные системы играют важную роль в регуляции и интеграции процессов жизнедеятельности у животных и птиц. С участием ферментных систем реализуется наследственная информация в онтогенезе,
поддерживается гомеостаз, обеспечивается регуляция роста и развития,
формирования продуктивных качеств. Поэтому показатели функциональной активности ферментных систем используют для оценки хозяйственно
полезных признаков и прогнозирования продуктивности животных, характеристики состояния обмена веществ, механизмов адаптации к действию
эндогенных и экзогенных факторов (1-8). Однако эти сведения в основном получены для различных пород крупного и мелкого рогатого скота,
свиней. Работ же, в которых исследовались бы ферментные системы тканей и органов у сельскохозяйственной птицы, очень мало. Исключение
составляют данные об использовании ферментов крови в оценке пищевых
качеств яиц (6), скорости роста и сохранности цыплят (1, 4, 5).
Из ферментов крови наиболее перспективными для оценки физиологического состояния и яичной продуктивности птицы представляются
аспартатаминотрансфераза (КФ.2.6.1.1; L-аспартат:2-оксоглутарат аминотрансфераза, АсАТ) и аланинамнотрансфераза (КФ.2.6.1.2; L-аланин:2-оксоглутарат аминотрансфераза, АлАТ), катализирующие реакции переаминирования (взаимное превращение амино- и ?-кетокислот посредством
переноса аминогруппы) (9, 10). Активность названных ферментов у птицы
определяется не только влиянием факторов внешней и внутренней среды
клетки (рН, концентрация субстратов, наличие активаторов и ингибиторов, изменение проницаемости мембран, скорость биосинтеза и деградации ферментного белка и др.), но и степенью влияния биологических и
технологических факторов (возраст, кросс птиц, тип кормления, репродук72
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
тивные периоды и др.). Однако в доступной нам литературе мы не нашли
сведений об особенностях влияния возраста, срока репродуктивного периода и яичной продуктивности на соотношение АсАТ и АлАТ в крови и
тканях разных органов у кур.
В связи с этим целью нашей работы стало изучение активности
ферментов переаминирования в крови и органах у кур в зависимости от
яйценоскости и периода продуктивного использования.
Методика. Объектом исследований в научно-производственном опыте (ОАО «Челябинская птицефабрика», Челябинская обл., 2011 год) были
куры-несушки из промышленного стада (кросс Ломанн белый), в течение
периода яйцекладки, которых содержали в основных производственных
корпусах, оборудованных клеточными батареями. Условия кормления (полнорационные кормосмеси, изготавливаемые в кормоцехе предприятия) и
содержания (поддержание микроклимата в помещениях) соответствовали
рекомендациям по работе с указанным кроссом. Из аминокислот в составе
кормосмеси нормировали содержание следующих аминокислот (в расчете
на 100 г комбикорма): лизин ? 0,88, метионин + цистин ? 0,65 и треонин ? 0,63 г (для 26-недельных несушек); лизин ? 0,70 г, метионин + цистин ? 0,63 г и треонин ? 0,60 г (для 52-недельных); лизин ? 0,70 г, метионин + цистин ? 0,55 г и треонин ? 0,53 г (для 80-недельных несушек).
На базе промышленного стада по принципу приближенных аналогов
сформировали опытную группу. Из нее на 26-ю, 52-ю и 80-ю нед яйцекладки отбирали по 6 особей, от которых после декапитации брали биологический материал для определения биохимических показателей.
После декапитации кровь собирали в пробирки, подвергали центрифугированию при 3000 об/мин в течение 15 мин и получали сыворотку, в которой определяли общий белок, мочевину, активность АсАТ и
АлАТ с помощью наборов реактивов «Клини-тест» («ЭкоСервис», Россия).
Извлеченные органы (печень, сердце, почки) помещали в охлажденную
льдом фарфоровую чашку, отмывали от крови физиологическим раствором и тщательно измельчали. К 1 г ткани медленно при перемешивании
добавляли охлажденную среду выделения (0,005 н. Tрис-HCl, 0,1 н. KСl,
pH 7,4): для сердца и почек ? в соотношении 1:50, для печени ? 1:100.
Полученную суспензию центрифугировали при 4500 об/мин 10 мин при
3-4 °С. В супернатанте определяли активность АсАТ и АлАТ при помощи
стандартных наборов реактивов «Клини-тест» (в ряде случаев показатели
выражали в расчете на 1 г ткани).
Для оценки взаимосвязи между активностью аминотрансфераз в
крови и клетках органов определяли соотношение между показателями по
формуле: КФР = (Фкрови/Форгана)?100, где КФР ? коэффициент физиологической регенерации, усл. ед.; Фкрови ? активность ферментов в сыворотке
крови, мкмоль?ч?1?мл?1; Форгана ? активность ферментов в расчете на 1 г
ткани органа, мкмоль?ч?1?мл?1?г?1; 100 ? нормализующий коэффициент.
Продуктивность кур рассчитывали как процент в целом по промышленному стаду за 1 нед, соответствующую исследованию образцов крови и органов (26-я, 52-я и 80-я нед).
Экспериментальный цифровой материал был подвергнут статистической обработке с использованием программы Microsoft Excеl. Достоверность различий между группами оценивали с учетом t-критерия Стьюдента
в соответствии с общепринятой методикой (11).
Результаты. Мы установили, что яичная продуктивность несушек
в период использования постепенно снижалась ? с 97 % (26-я нед) до 82
% (80-я нед). Это сопровождалось постепенным увеличением концентра73
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ции мочевины в сыворотке крови кур на фоне недостоверного колебания
концентрации общего белка. В то же время величина соотношения общий
белок/мочевина постоянно уменьшалась ? с 13,47±0,62 усл. ед. на 26-ю
нед репродуктивного периода до 9,85±0,64 усл. ед. на 80-ю нед. Следовательно, в течение продуктивного использования в белковом обмене у кур
постепенно начинают превалировать катаболические процессы, что снижает степень усвоения азота свободных аминокислот и, соответственно,
отражается на активности и соотношении ферментов переаминирования и
показателях яйценоскости (табл. 1).
1. Биохимические показатели крови у кур-несушек кросса Ломанн белый в период продуктивного использования (X±Sx, n = 6, ОАО «Челябинская птицефабрика», Челябинская обл., 2011 год)
Показатель
26-я нед
52-я нед
80-я нед
Общий белок, г/л
37,20±4,63
42,00±4,38
39,60±4,57
Мочевина, ммоль/л
2,76±0,18
3,35±0,31
4,03±0,11*
Общий белок/мочевина, усл. ед.
13,47±0,62
12,53±0,71
9,85±0,64*
0,09±0,02
0,06±0,01
0,04±0,01*
АлАТ, мкмоль?ч?1?мл?1
1,06±0,04
0,92±0,04
0,76±0,08*
АсАТ, мкмоль?ч?1?мл?1
Коэффициент де Ритиса
11,78±0,23
15,16±0,44
19,75±0,28*
Продуктивность по стаду, %
97,0
95,0
82,0
П р и м е ч а н и е. АлАТ ? аланинаминотрансфераза, АсАТ ? аспартатаминотрансфераза.
* р < 0,05 по отношению к 26-й нед.
Так, в течение репродуктивного периода активность аминотрансфераз в сыворотке крови постепенно снижалась. Однако во все исследованные сроки у АсАТ она была выше, чем у АлАТ в десятки раз, о чем
свидетельствовали значения коэффициента де Ритиса (табл. 1). Можно
предположить, что, во-первых, реакции переаминирования с участием аланина, катализируемые АлАТ, в обмене аминокислот у кур играют менее
важную роль, чем протекающие с участием АсАТ. На наш взгляд, это не
случайно. Фермент АсАТ занимает центральное место в метаболизме, обеспечивая субстратами цикл трикарбоновых кислот, и, соответственно, участвует в регуляции образования энергии в процессах окислительного фосфорилирования (9, 10, 12). Иными словами, АсАТ служит маркером интенсивности катаболического вектора в обмене веществ. Во-вторых, преобладание активности АсАТ над АлАТ максимально проявлялось в конце
периода яйцекладки, что подтверждает ранее сделанный нами вывод о
том, что к 80-й нед репродуктивного периода в аминокислотном обмене у
несушек преобладает катаболический тип, с чем, вероятно, связано снижение яичной продуктивности.
При оценке сопряженности между активностью аминотрансфераз в
органах (печень, почки, сердце) и в крови мы установили следующие особенности (табл. 2). Во-первых, в образцах ткани печени и почек преобладала активность АлАТ, сердца ? АсАТ. Во-вторых, максимальное количество
аминотрансфераз обнаружили в печени, поскольку этот орган у несушек,
как и других сельскохозяйственных животных, занимает центральное место в обмене веществ, особенно в продуктивный период. В печени синтезируются белковые компоненты, которые поступают в кровь, а затем используются при формировании химической структуры яйца. В-третьих,
активность АлАТ в клетках печени и почек изменялась волнообразно с
максимумом на 52-ю нед яйцекладки, сердца ? возрастала от начала к
концу репродуктивного периода. Активность АсАТ независимо от органа в
течение периода яйцекладки постоянно (хотя и недостоверно) снижалась,
что влияло на значения коэффициента де Ритиса. При этом максимальные показатели соответствовали 26-й и 52-й нед репродуктивного перио74
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
да, когда яйценоскость кур была наивысшей (табл. 2).
2. Активность аминотрансфераз (мкмоль?ч ? 1 ?мл ? 1 ?г ? 1 ) в органах у курнесушек кросса Ломанн белый в период продуктивного использования
(X±Sx, n = 6, ОАО «Челябинская птицефабрика», Челябинская обл.,
2011 год)
Орган
Показатель
26-я нед
52-я нед
80-я нед
Печень
АлАТ
23,40±0,38
26,10±0,20
19,00±0,29*
АсАТ
8,80±0,17
8,20±0,34
7,52±0,33*
Коэффициент де Ритиса
0,38±0,04
0,31±0,04*
0,40±0,03
Сердце
АлАТ
0,82±0,02
0,86±0,09*
1,18±0,05*
АсАТ
2,20±0,28
2,02±0,15
1,92±0,12
Коэффициент де Ритиса
2,68±0,17
2,35±0,19
1,62±0,17*
Почки
АлАТ
3,80±0,35
4,28±0,16*
3,80±0,35
АсАТ
3,20±0,23
3,00±0,20
2,71±0,29
Коэффициент де Ритиса
0,84±0,05
0,70±0,03
0,71±0,03
П р и м е ч а н и е. АлАТ ? аланинаминотрансфераза, АсАТ ? аспартатаминотрансфераза (активность определяли в супернатанте тканевой суспензии и выражали в расчете на 1 г образца ткани).
* р < 0,05 по отношению к 26-й нед.
Следовательно, снижение активности аминотрансфераз в сыворотке крови несушек в течение репродуктивного периода происходило из-за
изменения их содержания в клетках исследованных органов, что сказалось
на интенсивности внутриклеточного обмена аминокислот и белков, а также на яичной продуктивности. При этом в клетках печени к концу периода яйцекладки формировался катаболический тип обмена белков, тогда
как в клетках сердца и почек ? анаболический. Об этом свидетельствовала динамика значений коэффициентов де Ритиса. Можно заключить, что
состояние обменных процессов в гепатоцитах в наибольшей степени определяет направленность биохимических превращений аминокислот в ор??анизме и, в конечном счете, влияет на яичную продуктивность.
Для того чтобы проверить подобный вывод, мы попытались оценить характер взаимосвязи между активностью аминотрансфераз в клетках
печени, сердца, почек и в сыворотке крови у кур-несушек в течение периода продуктивного использования. При этом мы исходили из того, что
АсАТ и АлАТ появляются в крови в результате физиологической регенерации клеток в органах и тканях (9, 13-16), активность которой оценивали с
помощью КФР, отражающего соотношение между активностью аминотрансфераз в крови и клетках органов и характеризующего скорость выхода ферментов в кровь в процессе регенерации (табл. 3).
3. Динамика значений коэффициента физиологической регенерации у курнесушек кросса Ломанн белый в период продуктивного использования
(X±S x , n = 6, ОАО «Челябинская птицефабрика», Челябинская обл.,
2011 год)
Орган
Фермент
26-я
52-я
80-я
Печень
АлАТ
0,38±0,03
0,22±0,03*
0,21±0,03*
АсАТ
12,04±0,30
10,21±0,41
10,11±0,36
Сердце
АлАТ
10,97±0,38
6,97±0,23*
3,38±0,26*
АсАТ
48,18±0,32
45,54±1,25
39,58±0,53
Почки
АлАТ
2,36±0,17
1,40±0,15*
1,05±0,04*
АсАТ
33,12±0,28
30,67±0,26
28,04±0,61
П р и м е ч а н и е. Коэффициент физиологической регенерации рассчитывали на основании соотношения
активности ферментов в крови и в тканях исследуемых органов. АлАТ ? аланинаминотрансфераза,
АсАТ ? аспартатаминотрансфераза.
* р < 0,05 по отношению к 26-й нед.
Анализ значений КФР позволил выявить следующие закономерности. Наибольшие значения КФР для печени, сердца и почек отмечали в
начале яйцекладки (26-я нед), наименьшие ? в конце (80-я нед). Значит,
в начале репродуктивного периода на фоне наивысшей яйценоскости мак75
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
симальная активность аминотрансфераз в сыворотке крови поддерживалась за счет большей скорости физиологической регенерации клеток. В
конце периода продуктивного использования снижение ферментативной
активности в сыворотке крови сопровождалось уменьшением скорости физиологической регенерации клеток. Следовательно, продуктивность несушек в период интенсивной яйцекладки (26-я и 52-я нед) обеспечивается
высокой активностью белкового обмена (в первую очередь, в клетках печени), имеющего преимущественно анаболический профиль. Это возможно благодаря большому количеству митохондрий в клетках органов (4, 5),
содержащих аминотрансферазы, что и определяет активность последних в
супернатантах суспензий, полученных из тканей печени, сердца и почек. В
этих условиях клетки органов и находящиеся в них каталитические белки
имеют более короткий период полужизни.
К концу репродуктивного периода скорость физиологической регенерации клеток в органах уменьшается, что сопровождается изменением
не только клеточной активности и соотношения аминотрансфераз, но и
скорости их высвобождения в кровь. Возможно, одной из причин служит
удлинение времени жизни каталитических белков за счет более длительной деполимеризации белковых молекул (10).
Минимальное соотношение между активностью ферментов в клетках органов и в крови было характерно для печени. Следовательно, печень
служит основным источником пополнения пула аминотрансфераз в крови
у кур-несушек. Каталитическая активность и соотношение ферментов в гепатоцитах определяет интенсивность превращений аминокислот не только в
органе, но и в организме птицы в целом, что сказывается на ее яичной
продуктивности.
Таким образом, результаты наших исследований показали, что у
кур-несушек изменение активности и соотношения аминотрансфераз в тканях и органах даже в пределах физиологической нормы происходит вследствие метаболических сдвигов в обменных процессах. При этом каталитическая активность аланинаминотрансферазы (АлАТ), аспартатаминорансферазы (АсАТ) и их соотношение в сыворотке крови, во-первых, взаимосвязаны с внутриклеточным содержанием ферментов в печени, сердце и
почках; во-вторых, отражают интенсивность и направленность превращений аминокислот в клетках; в-третьих, характеризуют скорость выхода
ферментов из клеток органов в кровь; в-четвертых, сопряжены с яичной
продуктивностью. Содержание в гепатоцитах АсАТ и АлАТ и скорость их
выхода из клеток в кровь при физиологической регенерации в наибольшей степени влияют на активность этих ферментов в крови кур, а также
на интенсивность и направленность превращений аминокислот в организме птицы, что сказывается на яичной продуктивности.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
76
К о л е с н и к Е.А., Д е р х о М.А. Корреляция прироста живой массы и сохранности
бройлеров кросса ISA-15 с уровнем биохимических показателей крови. Аграрный вестник Урала, 2011, 3(82): 27-29.
К о ч и ш И.И., П е т р а ш М.Г., С м и р н о в С.Б. Белковый и углеводный обмен веществ у несушек. Птицеводство, 2010, 4: 34-35.
К у д р и н А.Г. Ферменты крови и прогнозирование продуктивности молочного скота.
Мичуринск, 2006.
М о с я г и н В.В. Влияние возраста и физиологического состояния на активность ферментных систем клеток, тканей и органов животных. Автореф. докт. дис. М., 2011.
М о с я г и н В.В., Ф у р м а н Ю.В., М а к с и м о в В.И. Биохимия активного транспорта, метаболизма белка и энергии в организме птиц. Курск, 2009.
Н а д и н с к а я М.Ю. Печеночная энцефалопатия: патогенный подход к лечению. Гаст-
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
роэнтерология, 2006, 1: 12-16.
Н г у е н Т х и Ф ы о к Н у а н. Белки и активность аспартатаминотрансферазы, щелочной и кислой фосфатаз в сыворотке крови кур разных линий кросса Беларусь 9 в онтогенезе. Канд. дис. М., 1984: 112-119.
У ш а Б.В., Б е л я к о в И.М., П у ш к а р ? в Р.П. Клиническая диагностика внутренних
незаразных болезней животных. М., 2004.
Б е р е з о в Т.Т., К о р о в к и н Б.Ф. Биологическая химия. М., 2008.
Н а г р а д о в а Н.К., М у р о н е ц В.И. Мультидоменная организация ферментов. В сб.:
Итоги науки и техники. Сер. Биол. химия. Т. 38. М., 1991.
Р е б р о в а О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. Применение пакета прикладных программ STATISTICA. М., 2002.
Х и г г и н с К. Расшифровка клинических лабораторных анализов /Под ред. В.Л. Эммануэля. М., 2006.
Л а з а р е в а Л.В. Активность аминотрансфераз в различных тканях свиней. Фундаментальные исследования, 2007, 9: 72-74.
Л а з а р е в а Л.В. Митохондриальные ферменты разных органов у свиней. Успехи современного естествознания, 2003, 5: 40-42.
С а п р у н о в Д.А., К в о ч к о А.Н., К р и в о р у ч к о А.Ю. Активность ферментов в сыворотке крови индеек в постнатальном онтогенезе. Аграрный вестник Урала, 2010, 2(68): 65-66.
A s m a r i a n S., R a j a i a n H., M o r t a z a v i P., N a z i f i S., A n s a r i L a r i M.,
M e h d i n e j a d B., H o s s e i n i R., A s h r a f i A. Salinomycin toxicity in chickens: biochemical changes and treatment with hypertonic dextrose. Australian Journal of Basic and Applied Sciences, 2010, 4(11): 5683-5688.
ФГБОУ ВПО Уральская государственная
академия ветеринарной медицины,
Поступила в редакцию
12 марта 2013 года
457105 Россия, Челябинская обл., г. Троицк, ул. Гагарина, 13,
e-mail: [email protected]
THE ROLE OF AMINOTRASFERASE ACTIVITY IN HEN PRODUCTIVITY
Т.I. Sereda, M.A. Derkho
Ural State Academy of Veterinary Medicine, 13, ul. Gagarina, Troitsk, Chelyabinsk Province, 457105 Russia, e-mail [email protected]
Received March 12, 2013
Abstract
Enzymes are known to play the significant role in gene expression during ontogenesis, in
maintenance of homeostasis and regulation of growth and development, and in productive traits. To
estimate the physiological conditions and egg productivity in hens, the alanine and aspartate aminotrasferases (AlAT and AsAT) activity is considered as the most adequate. Nevertheless, the investigations of fermentative status in tissues and organs of hens are limited, and particularly, the information on specific effects of the age, the stage of the oviposition period, and the egg productivity to
AlAT and AsAT activity in hen blood and tissues was not found in the accessible literature. We studied the dynamics of AlAT and AsAT activity in blood, liver, heart and kidneys during egg laying (26,
52 and 80 weeks) in Lohmann White hens from commercial farm. It was shown the changes of activities and the ratio of AlAT and AsAT, even if the physiological variability is not exceeded, occur
due to metabolic changes. There is the relationship between the catalytic activity of AlAT, AsAT,
AlAT/AsAT ratio in blood serum and in liver, heart and kidneys cells. The functional parameters of
AlAT and AsAT reflect both the intensiveness and specificity of amino acids metabolism in cells, and
the rate of enzymes output from cells to blood, and also correlate with egg productivity. Thus, the
amount of AlAT and AsAT in hepatocytes and the rate of aminotransferases output to blood during
the physiological regeneration the mostly affect the AlAT and AsAT concentrations, ratio and activity
in blood, which, in turn, determine the character of biochemical changes of amino acids in hens
and, as a result, affect the egg production.
Keywords: aminotransferase, blood, organs, chickens, hens, productivity.
Новые книги
Б е с с а р а б о в Б.Ф. и др. Этиопатогенез,
диагностика и профилактика нарушений обмена веществ у сельскохозяйственной птицы. М.:
из-во «Зоомедлит», 2011, 296 с.
Рассмотрены основные этапы и методология диагностики состояния обмена ве-
ществ у сельскохозяйственной птицы, что позволяет выявлять возможные отклонения в
развитии птицы, контролировать технологию
содержание, кормление, применение новых
препаратов. Приведены меры профилактики
нарушений обмена веществ.
77
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, № 2, с. 78-83
Физиология сельскохозяйственных животных
УДК 636.4+636.32/.38]:591.1:539.1.047
ПОДХОД К ОЦЕНКЕ РАДИОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ СВИНЕЙ НА
ОСНОВАНИИ ЖИВОЙ МАССЫ С ПРИМЕНЕНИЕМ ПОПРАВОЧНОГО
КОЭФФИЦИЕНТА
В.Я. САРУХАНОВ, Г.В. КОНЮХОВ, И.М. КОЛГАНОВ
Для уменьшения негативного воздействия облучения на животных на территориях, загрязненных радионуклидами, необходим комплекс мероприятий, ключевым звеном которых служит нормирование действия радиационных факторов, что, в свою очередь, невозможно без оценки радиочувствительности организма. Интегральным показателем радиочувствительности служит
величина LD50, которая зависит от вида, возраста и физиологического состояния особи. В литературе число работ, посвященных радиочувствительности крупных сельскохозяйственных животных, в том числе свиней, ограничено. В то же время на животных многих видов показано, что
радиочувствительность снижается при увеличении живой массы. Это дает основания предположить, что, например, у взрослых овец и свиней радиочувствительность в определенной степени
зависит от живой массы, а параметры, характеризующие количественную зависимость гибели
овец можно использовать для определения радиочувствительности свиней с поправкой на видовые особенности животных и их живую массу. Мы проанализировали полученные в наших опытах данные о гибели свиней после двустороннего внешнего экспериментального ?-облучения, описали математически выявленную количественную зависимость для животных с разной живой
массой и сравнили результаты с зарегистрированными нами ранее на овцах. На этой основе
предложен поправочный коэффициент К, который количественно отражает изменение мощности
излучения при воздействии физически одинаковой дозы на животное другого вида. Свиньи и овцы обладают аналогичным типом кроветворения, что позволяет использовать закономерности, полученные на овцах, для изучения радиочувствительности у свиней. Значение множителя 0,426 показывает, что при одинаковой живой массе свиньи менее чувствительны к внешнему ?-облучению, чем
овцы. Оценка адекватности использованного математического подхода показала, что он позволяет
достаточно точно описать гибель облученных свиней с живой массой от 30 до 114 кг. Полученные
закономерности могут быть использованы для прогнозирования радиочувствительности у других видов сельскохозяйственных животных на основании их живой массы.
Ключевые слова: радиочувствительность, внешнее ?-облучение, свиньи, живая масса,
гибель, LD50, количественная зависимость.
Ведение сельского хозяйства на территориях, загрязненных радионуклидами, создает дополнительные нагрузки на организм продуктивных
животных, что может привести к снижению качества и количества продукции животноводства. Для уменьшения негативного воздействия облучения на животных необходима разработка комплекса мероприятий, ключевым звеном которых служит нормирование действия радиационных факторов на организм, что, в свою очередь, невозможно без изучения радиочувствительности. Для количественного изучения радиочувствительности
организма пользуются кривыми доза?эффект, при построении которых на
оси абсцисс откладывают дозы излучения, на оси ординат ? процент гибели в течение определенного срока наблюдения. Для всех млекопитающих такая кривая имеет S-образную форму. На этой кривой выделяют несколько точек: MLD ? минимальная летальная доза (LD1 или LD5), или
летальная доза, при которой практически не наблюдается гибели животных; LD50 ? доза облучения, при которой погибают 50 % животных, и
MALD ? минимальная абсолютно летальная доза, приводящая к гибели
практически всех подопытных животных. Интегральным показателем радиочувствительности служит величина LD50, которая зависит от вида, возраста и физиологического состояния животного (1, 2).
Работа по определению параметров гибели особей разного возраста
78
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
может быть выполнена в три этапа. На первом этапе необходимо определить эти параметры для животных одного возраста при разной мощности
дозы облучения, проанализировав как минимум четыре S-образные кривые. Аналогичные исследования должны быть выполнены не менее чем на
четырех возрастных группах. Затем необходимо определить зависимость параметров гибели от возраста животных. Заключительный этап состоит в
верификации полученной зависимости. Если каждую экспериментальную
группу сформировать из пяти особей, а кривые гибели построить с использованием пяти групп, то для выполнения этой работы необходимы данные,
полученные хотя бы на 600 животных.
В литературе число работ, посвященных радиочувствительности
крупных сельскохозяйственных животных, ограничено, поскольку эксперименты на них связаны с большими материальными затратами. Так,
данные о гибели взрослых свиней, облученных с мощностями доз 0,6; 6 и
30 Гр/ч, представлены в работе D.G. Brown с соавт. (3). Единичные эксперименты были выполнены на облученных свиньях с живой массой 30; 80
и 107 кг с мощностями доз 1,0; 0,5; 18 и 6 Гр/ч (4-6). Однако этих сведений недостаточно для определения параметров кривой гибели свиней,
облученных с разными мощностями доз. В то же время имеются сведения, что при облучении взрослых овец и свиней с мощностью дозы 6,0 и
6,6 Гр/ч (живая масса 45 и 114 кг) LD50 составляет соответственно 2,37
(2,15-2,57) и 4,30 (4,10-4,60) Гр (3, 7). То есть радиочувствительность животных снижается при увеличении живой массы. Это позволяет предположить, что радиочувствительность взрослых овец и свиней в определенной степени зависит от живой массы, а параметры количественной зависимости, полученные на овцах, можно использовать для определения радиочувствительности у свиней с поправкой на видовые особенности животных и их живую массу.
Известно, что живая масса увеличивается в период роста животных, и молодые животные более чувствительны к внешнему облучению,
чем взрослые особи. Это связано с преобладанием в организме у первых
молодых делящихся клеток и высокой активностью основного обмена (1,
2, 8). Пониженная чувствительность к внешнему ?-облучению у взрослых
особей по сравнению с молодыми обусловлена наличием запасов энергии
при переходе на эндогенное питание и низкой активностью основного
обмена, которая уменьшается при увеличении живой массы (8, 9). Живая
масса у животных одного возраста может различаться весьма значительно,
что способно повлиять на их радиочувствительность. Так, LD50/30 при облучении помесных свиней и свиней породы дюрок в возрасте 8 мес (при
живой массе 80 и 114 кг) составляет соответственно 6,30 Гр (5,14-7,10 Гр)
и 6,82 Гр (6,26-7,49 Гр) (3, 5).
Таким образом, радиочувствительность животных зависит от возраста, активности основного обмена и связанной с ними живой массы,
которую можно считать интегральным показателем, определяющим радиочувствительность. Это подтверждается результатами экспериментальных исследований. Так, при рентгеновском облучении в дозе 3 Гр погибают все поросята (живая масса 20 кг), тогда как при аналогичной дозе
радиационного воздействия (60Co) не наблюдается гибели животных с живой массой 107 кг (7, 10). Известно, что интенсивность метаболизма в организме животного связана с их живой массой. Следовательно, зависимость активности метаболизма от массы животного m является степеннуй,
или аллометрической (11).
В литературе отсутствуют данные о радиочувствительности особи в
79
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
зависимости от живой массы. Между тем решение этого вопроса позволит
разработать подходы к нормированию действия внешнего облучения на
сельскохозяйственных животных.
Ранее в нашей работе были обобщены экспериментальные данные
и определены параметры количественной зависимости гибели овец с живой массой 40-45 кг от мощности и дозы внешнего облучения, закономерности которой легли в основу определения радиочувствительности у свиней с разной живой массой (12):
[
]
L50 / 60 = 100/ 1 + exp{4,594? (P) ?0,031 ? 1,330? (P) 0,118 ? D} .
[1]
Цель настоящего исследования состояла в разработке методического
подхода к оценке радиочувствительности свиней, имеющих разную живую
массу, с использованием данных по животным другого вида.
Методика. Для решения поставленной задачи были проанализированы экспериментальные данные, полученные на 48 подсвинках крупной
белой породы с живой массой 40 кг, 32 помесных свиньях с живой массой
80 кг; 56 и 73 свиньях породы дюрок с живой массой 100 и 114 кг, подвергнутых двухстороннему ?-облучению с мощностью дозы соответственно
0,4; 18,0; 6,0 и 0,6 Гр/ч. Неравномерность облучения не превышала 10-15 %
(3, 5, 7). Для оценки адекватности выявленной зависимости использовали
экспериментальные данные, которые были зафиксированы на 48 подсвинках крупной белой породы с живой массой 30 кг; 56 подсвинках породы
ландрас с живой массой 60 кг, облученных с мощностью дозы 1 и 9 Гр/ч,
а также 80 свиньях породы дюрок (живая масса 114 кг), облученных с
мощностью доз соответственно 6 и 30 Гр/ч (3-5). Все экспериментальные
животные содержались в условиях вивария на сбалансированном рационе.
Гибель животных оценивали по формуле логистической кривой,
полученной при облучении взрослых овец (12). Расчет LD50 осуществляли
с помощью программы Probit Analysis 2008. Поправочные коэффициенты
подбирали, применяя программу MathCAD 2001.
Оценка адекватности полученной формулы осуществлялась по независимым данным LD50, полученным в диапазоне мощности доз от 1,0
до 30,0 Гр/ч.
Для характеристики точности прогноза гибели свиней использовали коэффициент несовпадения Тейла (13).
Результаты. Для свиней с живой массой 40; 60;
100 и 114 кг были подобраны
поправочные коэффициенты на
мощность дозы (K) и установлена функциональная зависимость этих коэффициентов от
живой массы (m) относительно значений изучаемых параметров для овец.
На рисунке представлены кривые, отражающие гибель (в течение 30 сут) свиней
Гибель свиней крупной белой породы с живой массой 40
крупной белой породы с жи(1) и 140 кг (2) при внешнем экспериментальном ?вой массой 40 и 140 кг (соотоблучении с мощностью дозы 0,4 Гр/ч (виварий).
ветственно 64 и 36 гол.), облученных с мощностью дозы 0,4 Гр/ч: при увеличении живой массы кривая смещалась вправо и становилась более пологой. Аналогичную зако80
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
номерность отмечали у взрослых овец при увеличении мощности дозы ?облучения (12).
Представленные закономерности были использованы при построении графика, описывающего количественную зависимость частоты гибели облученных свиней от их живой массы на основе следующих положений. При заданной мощности дозы (P) гибель животных описывается логистической (или S-образной) кривой. С уменьшением мощности дозы (P)
кривая доза?эффект становится более пологой и смещается вправо относительно оси ординат. С увеличением живой массы (m) кривая доза?эффект также становится более пологой и смещается вправо относительно
оси ординат. Кроме того, свиньи и овцы обладают аналогичным типом
кроветворения. Следовательно, гибель свиней может быть описана кривой
гибели овец с использованием поправочного коэффициента (K) на радиочувствительность животных. Зависимость коэффициента K от массы животного (m) подчиняется аллометрическим закономерностям и является
степеннуй величиной.
Для определения радиочувствительности свиней по сравнению с
овцами и ее зависимости от живой массы свиней был введен поправочный
коэффициент, который количественно отражает эффект изменения мощности дозы излучения:
ЭИМД = K·P,
[2]
где ЭИМД ? эффект изменения мощности дозы; P ? мощность дозы при
облучении свиней; К ? поправочный коэффициент на мощность дозы излучения. Для животных с живой массой 40, 80, 107 и 114 кг величину коэффициентов К подобрали таким образом, чтобы полученные значения
гибели в зависимости от дозы, рассчитанные по формуле [1] с учетом формулы [2], описывали исходные данные с наименьшим суммарным отклонением от экспериментальных данных (табл. 1). Методом наименьших
квадратов была определена степеннбя зависимость коэффициента К от массы свиней (формула [3]). Также для этих групп животных по экспериментальным данным рассчитали значения LD50 (табл. 1).
1. Значения поправочного коэффициента (К) для определения радиочувствительности свиней в зависимости от живой массы (mсв) и возраста по сравнению с овцами для разной мощности дозы (Р) при экспериментальном ?облучении
Живая масса mсв, кг
Возраст, мес
P, Гр/ч
3
8
8
8
0,4
18,0
6,0
0,6
40
80
107
114
LD50/30
4,10
2,80
4,05
6,82
(3,36-4,74)
(2,20-3,10)
(3,59-4,43)
(6,26-7,49)
К
R2
0,675
0,112
0,063
0,035
0,98
K = 8150? (m?? ) .
[3]
Для удаления размерности коэффициента К в основание степени
было внесено значение массы «средней» овцы (45 кг), использованных для
расчета формулы [1] в работе, представленной нами ранее (12):
?2,59
? 2 , 59
? 2 , 59
? m ?
? m ?
? ?? ?? ??
= 0 , 426 ? ?? ?? ??
.
[4]
? m ?? ?
? m ?? ?
Таким образом, зависимость параметра К от живой массы может
быть представлена следующей функцией [5]:
K = 8150 ? (m ??
)? 2 , 59
?2 , 59
где mсв
?m ?
,
K = 0, 426 ? ?? ?? ??
[5]
? m?? ?
? живая масса свиней, кг; mов ? живая масса овец (45 кг); К ?
81
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
коэффициент, отражающий радиочувствительность животных. Величина
множителя не зависит от массы животных и описывает радиочувствительность свиней в сопоставлении с овцами. Его значение, равное 0,426, указывает на бульшую устойчивость к внешнему ?-облучению у свиней по
сравнению с овцами, что подтверждается данными литературы (3). При
увеличении живой массы свиней значения коэффициента К резко уменьшаются, что свидетельствует о снижении радиочувствительности животных.
Таким образом, окончательная формула, описывающая гибель свиней с учетом их массы и полученная на основании формул [1]-[5], выглядит следующим образом:
-0,306
0,0803
L = 100 / 1 + exp{3,475 ? m ??
? P ?0, 031 ? 3,85 ? m ??
? P 0,118 ? D} .
[6]
[
]
Тогда LD50 можно определить по следующей формуле:
0,0803
-0,306
LD 50 = 3 , 475 ? m ??
? P ? 0 , 031 / 3 ,85 ? m ??
? P 0 ,118 .
[
][
]
[7]
2. Рассчитанные и экспериментальные значения LD50/30 для свиней в зависимости от живой массы и мощности дозы ?-облучения
Живая масса, кг Возраст, мес
30
60
114
114
2
4
8
8
P, Гр/час
1
9
6
30
по формуле
Расчет LD50/30, Гр
по экспериментальным данным
3,7
3,2
4,3
3,4
3,8
3,1
4,3
3,5
(3,6-4,0)
(1,9-3,9)
(4,1-4,6)
(3,2-3,8)
П р и м е ч а н и е. Формулу, использованную для расчета, см. в тексте статьи.
Для оценки адекватности полученной формулы были взяты независимые экспериментальные данные, по которым были рассчитаны значения LD50 (табл. 2). Из данных, представленных в таблице 2, видно, что
значения LD50, рассчитанные по результатам эксперимента и по формуле
[7], в целом хорошо согласовывались между собой. Расчет коэффициента
несовпадения Тейла (S = 0,0093) показал, что предложенная формула достаточно адекватно описывает гибель облученных свиней. Это позволяет использовать полученную зависимость в качестве рабочего инструмента при
построении кривой гибели для свиней с живой массой от 30 до 114 кг, облученных в диапазоне мощности доз от 0,6 до 30 Гр/ч.
Итак, живая масса отражает породные особенности, возраст и физиологическое состояние животных, что делает возможным ее использование для оценки радиочувствительности. С возрастом и соответствующим
увеличением живой массы кривая гибели свиней смещается вправо относительно оси ординат и становится более пологой. Аналогичная закономерность наблюдается при росте мощности дозы ?-излучения. Свиньи и овцы
обладают аналогичным типом кроветворения, что позволяет использовать
закономерности, полученные на овцах, для изучения радиочувствительности у свиней. Значение множителя 0,426 в формуле [4] показывает, что при
одинаковой живой массе свиньи менее чувствительны к внешнему ?облучению, чем овцы. Кроме того, при облучении крупных животных, вероятно, играет роль снижение поглощенной дозы ?-облучения в расчете на
объем костного мозга. Следовательно, исход лучевого поражения животных
определяется такими показателями организма, как возраст особей, их физиологическое состояние, состояние основного обмена веществ и живая
масса, которая, в свою очередь, отражает все вышеперечисленные параметры. В дальнейшем требуется уточнение пространственного распределения
дозы ?-излучения с учетом базовой локализации гемопоэза. Методический
подход, разработанный на свиньях, вероятно, может быть использован для
определения радиочувствительности у крупного рогатого скота.
82
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
А н н е н к о в Б.Н. Радиационные катастрофы и контрмеры в сельском хозяйстве. М., 2008.
Я р м о н е н к о С.П. Радиобиология человека и животных. М., 1984.
B r o w n D.G., G r a m l y W.A., C r o s s F.H. Effect of cobalt-60 gamma radiation dose rate
on 30-day mortality in swine. Am. J. Vet. Res., 1972, 33(5): 957-962.
Ч е п и к о в Н.С., А н н е н к о в Б.Н., К р у г л и к о в Б.П. и др. Влияние внешнего ?облучения на состояние здоровья и продуктивность свиней. В сб.: Проблемы животноводства в зоне наземного ядерного взрыва. Обнинск, 1980: 144-160.
J o n e s T.D., M o r r i s M.D., W e l l s S.M., Y o u n g R.W. Animal uniform exposures to radiations: calculated LD50 and a compilation of experimental data. Oak Ridge, Tennessee, 1986.
N a c t h w e y D.S., A i n s w o r t h E.J., L e o n g G.F Recovery from radiation injury in
swine as evaluated by the split-dose technique. Rad. Res., 1967, 31: 353-367.
P a g e N.P., A i n s w o r t h E.J., L e o n g G.F. The relationship of exposure rate and exposure time to radiation injury in sheep. Rad. Res., 1968, 33(1): 94-106.
Е п и м а х о в В.Г. Биоэнергетический подход к оценке радиочувствительности овец. Автореф. канд. дис. Обнинск, 1990.
М о д я н о в А.В. Кормление овец. М., 1978.
P r o c h a z k a Z., H a m p l J., S e d l a M., K o d a k L. Optimization of irradiation of LD50
in pigs. Strahlentherapie, 1975, 150(5): 526-531.
M a k a r i e v a A.M., G o r s h k o v V.G., L i B.-L. Revising the distributive networks models of
West, Brown and Enquist (1997) and Banavar, Maritan and Rinaldo (1999): Metabolic inequity
of living tissues provides clues for the observed allometric scaling rules. J. Theor. Biol., 2005,
237: 291-301.
С а р у х а н о в В.Я., И с а м о в Н.Н., Е п и м а х о в В.Г., К о л г а н о в И.М. Количественная зависимость гибели овец от дозы и мощности дозы внешнего ?-излучения. Радиационная биология, радиоэкология, 2010, 50(5): 548-551.
Т е й л Г. Экономические прогнозы и принятие решений. М., 1971.
ГНУ Всероссийский НИИ сельскохозяйственной
радиологии и экологии Россельхозакадемии,
Поступила в редакцию
13 августа 2013 года
249020 Россия, Калужская обл., г. Обнинск, Киевское ш., 109 км,
e-mail: [email protected], [email protected]
ESTIMATION OF RADIOSENSITIVITY IN PIGS USING BODY WEIGHT
AND AN ADJUSTING COEFFICIENT
V.Ya. Sarukhanov, G.V. Konyukhov, I.M. Kolganov
All-Russian Research Institute of Agricultural Radiology and Ecology, Russian Academy of Agricultural Sciences, 109 km,
Kievskoe sh., Obninsk, Kaluga Province, 249020 Russia, e-mail [email protected], [email protected]
Received August 13, 2013
Abstract
To reduce the negative effects of radiation on animals inhabiting radioactively contaminated areas, it requires a set of activities, a key element of which is the regulation of radiation factors
that is impossible without assessing the radiosensitivity of the organism. An integral indicator of radiosensitivity is the value of lethal dose LD50, which depends on the species, age and physiological
state of the animal unit. The number of papers devoted to the radiosensitivity of gross agricultural
animals, including swine, is limited. At the same time it is shown on many animal species that radiosensitivity is reduced with the growth of live weight. This allows to assume that, for example, adult
sheep and swine have the radiosensitivity to some extent depending on live weight, and the parameters describing the quantitative dependence of sheep death can be used to determine swine radiosensitivity corrected to the species features and live weight. During our investigation we analyzed the received experimental data on swine death after bilateral external experimental ?-irradiation, described
mathematically identified quantitative dependence for animals with various live weight and compared
the results with the previously registered for the sheep. On this basis the compensation factor K was
developed, it quantitatively reflects the radiation power change when physically identical dose affects
an animal of another species. Swine and sheep have the similar hematosis, that allows to use patterns, obtained on sheep, to study swine radiosensitivity. Multiplier value of 0.426 shows that at the
same live weight, swine are less sensitive to external ?-irradiation than sheep. The adequacy estimation of the used mathematic approach showed that it allows sufficiently accurate description of irradiated swine death with the live weight from 30 to 114 kg. The resulting patterns can be used to predict the radiosensitivity of other species of farm animals on the basis of their live weight.
Keywords: radiosensitivity, external ?-irradiation, swine, live weight, death, LD50, quantitative relationship.
83
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, № 2, с. 84-88
УДК 636.38:636.084.2:591.134.5(574)
ЖИВАЯ МАССА У ОВЕЦ КАЗАХСКОЙ МЯСОШЕРСТНОЙ ПОРОДЫ
ПРИ СЕЗОННОМ СОДЕРЖАНИИ НА ПАСТБИЩАХ РАЗНОГО ТИПА
А.Т. МУСАХАНОВ
В процессе роста и развития животное приобретает не только породные и видовые признаки, но и присущие только ему особенности конституции, экстерьера, продуктивности, то есть
все племенные качества. Поэтому подобные сведения важны как для практики разведения животных, так и для селекции. По изменению живой массы с возрастом и по сезонам года можно
судить об интенсивности роста, условиях кормления, характере обмена веществ, скороспелости и
состоянии организма в целом. Кроме того, этот показатель характеризует приспособленность животных к разведению в конкретных экологических условиях. Мы сравнили сезонную динамику
живой массы у аксенгерских овцематок казахской мясошерстной породы в разных пастбищных
зонах Заилийского Алатау (Республика Казахстан) в зависимости от конституционального типа.
Показано, что живая масса у всех овец на пастбищах как в предгорных, так и в полупустынных
зонах значительно изменялась при максимуме в летне-осенний период и минимуме (с разницей
20-25 %) в зимне-весенний период. В полупустынной зоне овцы более чувствительны к ухудшению пастбищно-кормовых условий, нежели в предгорной зоне. С точки зрения практики содержания овец подобные колебания отражают в том числе и тот факт, что повышению продуктивности зимне-весенних пастбищ и созданию необходимых страховых запасов грубых и концентрированных кормов на местах зимовок овец уделяется недостаточно внимания.
Ключевые слова: живая масса, конституция, крепкий, нежный и грубый тип, предгорные и полупустынные пастбища.
Селекция на продуктивность у сельскохозяйственных животных невозможна без изучения закономерностей их роста и развития. Индивидуальное развитие представляет собой совокупность изменений, происходящих после оплодотворения яйцеклетки и образования зиготы на протяжении всей жизни особи в соответствии с унаследованным ею генотипом и
нормой реакции. В процессе роста и развития животное приобретает не
только породные и видовые признаки, но и присущие только ему особенности конституции, экстерьера, продуктивности, то есть все племенные качества. В основе всякого развития лежат количественные и качественные
модификации. А.Н. Шотаев (1), Н.С. Марзанов с соавт. (2, 3), И.Г. Козлов (4) отмечают, что добиться качественных изменений можно лишь на
основе количественного изучения признаков.
Как указывают А.И. Ерохин с соавт. (5), В.И. Косилов с соавт.
(6), Б.Б. Траисов (7), А.М. Давлетова с соавт. (8), рост и развитие животных протекают неравномерно в разные возрастные периоды, подчинены
определенным биологическим закономерностям и считаются одними из
главных племенных показателей у мясошерстных пород овец мясного направления продуктивности. В мясошерстном овцеводстве живая масса используется как важнейший критерий и главный селекционный признак
при совершенствовании породы, определяющий как мясную, так и шерстную продуктивность.
К важным характеристикам роста и развития относится изменение
живой массы с возрастом и по сезонам года. По этому показателю мы можем судить об интенсивности роста, условиях кормления, характере обмена
веществ, скороспелости и состоянии организма в целом.
В Казахстане после реформирования структуры основных сельскохозяйственных производителей (совхозов, колхозов) постепенно стали организовываться фермерские и крестьянские хозяйства, специализирующиеся на разведении сельскохозяйственных животных, в частности овец.
В зависимости от размера, технологических и финансовых ресурсов хозяй84
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ства изменились условия и системы содержания овец. В связи с практикой приобретения или получения в долгосрочную аренду пастбищных участков, прилегающих к бывшим зимовьям чабанов, появилась необходимость обосновать рациональное размещение овцеводческих фермерских хозяйств согласно особенностям по рельефу местности и растительности.
Цель работы ? оценить сезонную динамику живой массы у овец с
неодинаковой конституцией при содержании на различных пастбищах.
Методика. Наблюдения проводили на овцах аксенгерского типа казахской мясошерстной породы (племенное хозяйство «Мырзабек», Казахстан, 2007-2009 годы). Были сформированы две группы овцематок: I группу (150 гол., из них по 50 гол. крепкой, нежной и грубой конституции)
содержали в предгорной зоне, II группу (также 150 гол., из них по 50 гол.
крепкой, нежной и грубой конституции) ? в полупустынно-пастбищной
зоне. Всех животных периодически взвешивали.
Ботанический состав пастбищ оценивали при маршрутных обследованиях.
Полученные данные обрабатывали методом вариационной статистики (9).
Результаты. По природно-климатическим условиям (10) основную
территорию племенного хозяйства «Мырзабек» относят к очень засушливой зоне с резко-континентальным климатом полупустынных степей (орошаемое земледелие) с интенсивно развитым животноводством, которая переходит в горную пастбищную зону Заилийского Алатау, на юго-востоке ?
в предгорно-земледельческую зону, на западе ? в пустынно-пастбищную
зону песков Мойынкум и на севере ? в пустынно-пастбищную зону Сары-Ишик-Отрау. Согласно данным Н.К. Жумадиллаева с соавт. (11) и
нашим собственным многолетним наблюдениям, естественные кормовые угодья в этой зоне по признакам хозяйственного использования
могут быть разделены в соответствии с характером растительности и
типам пастбищ на следующие пояса: предгорные пастбища с преобладанием эфемерово-злаково-полынной растительности, которые располагаются в подгорной равнине, частично заходя на низкие предгорья
Заилийского Алатау; полупустынные пастбища на светло- и темнокаштановых почвах равнин.
Изучение ботанического состава изучаемых пастбищ показало, что
травостой на первом (предгорная зона) состоит из ковыльно-полынной,
ковыльно-разнотравной растительности с урожайностью 4-8 ц/га и типчаково-полынной, типчаково-ковыльной ? с урожайностью 3-5 ц/га. Ранее
подобные участки использовались преимущественно весной и осенью, в
настоящее время отары и табуны содержатся на них и зимой, и летом.
Второй участок (полупустынно-пастбищная зона) характеризовался
ковыльно-типчаковой, тырса-типчаковой, смешанно-ковыльно-типчаковой
растительностью, в той или иной степени опыленной. На солонцовых и
солонцеватых почвах встречались белополынные пастбища. Белая полынь,
или полынь Лерха, ? невысокий (20-40 см) ксерофильный полукустарник,
поедается овцами в течение всего года, особенно хорошо осенью. Ее урожайность достигает 4 ц/га, отклоняясь на 35-40 % от средней в зависимости от метеорологических условий года.
В соответствии с пастбищно-кормовыми условиями изменялась и
живая масса овец, что подтверждали данные наших исследований (табл. 1).
При анализе представленных результатов видно, что общей закономерностью для исследуемого показателя у овец была более выраженная зависимость живой массы от сезона года (при значительных колебаниях), чем от
85
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
конституции животных. Максимальную живую массу регистрировали в
конце летне-осеннего нагула. Некоторое снижение показателя, наблюдаемое в сентябре, связано с перегоном с летних пастбищ на зимовку.
1. Изменчивость живой массы (кг) у мясошерстных овцематок аксенгерского типа с разной конституцией при содержании в предгорной и полупустынной зонах (Заилийский Алатау, Казахстан, 2007-2009 годы)
Месяц
Предгорное пастбище
Полупустынное пастбище
конституция животных
крепкая
нежная
грубая
крепкая
нежная
грубая
Октябрь
61,8
58,4
Декабрь
60,0
56,5
Март
50,1?
52,8?
Апрель
53,6
52,0
Июнь
57,8
55,3
Август
60,5
57,2
Сентябрь
61,3
58,2
?
??
и Соответственно Р > 0,999 и Р > 0,99.
63,2
61,8
53,2?
56,5
58,2
60,9
62,3
60,6
59,0
51,8??
52,5
57,4
59,5
60,0
57,6
55,8
48,7??
50,5
53,6
56,8
57,2
62,1
60,0
51,9??
53,0
57,9
60,0
61,6
Наименьшую массу подопытные овцы имели в период окота ? в
марте (см. табл. 1) (для предгорной зоны Р > 0,999, для полупустынной ?
Р > 0,99). В предгорной зоне живая масса от случки до окота снизилась у
овец с крепкой конституцией на 9,0 кг, или 17,0 %, с нежным типом ? на
8,3 кг, или 15,9 %, и с грубым типом ? на 10,0 кг, или 18,8 %. В условиях
полупустынной зоны эти показатели составили соответственно 8,8 кг, или
16,9 %, 8,9 кг, или 18,3 %, и 10,2 кг, или 19,7 %. Резкое снижение живой
массы во второй половине суягности связано с уменьшением запасов и питательности кормов на пастбищах к концу зимовки при одновременном
увеличении потребности овец в питательных веществах на развитие плода.
Масса тела аксенгерских мясошерстных овец в период суягности
имеет исключительно важное значение как косвенный показатель обеспеченности плода питательными веществами. В этот период происходит формирование кожи и шерсти, состояние которых подвержено большой изменчивости в зависимости от условий питания овцематок.
2. Относительные показатели живой массы (%) у мясошерстных овцематок аксенгерского типа с разной конституцией при содержании в предгорной и полупустынной зонах (Заилийский Алатау, Казахстан, 2007-2009 год)
Месяц
Октябрь
Декабрь
Март
Апрель
Июнь
Август
Сентябрь
Предгорное пастбище
Полупустынное пастбище
конституция животных
крепкая
нежная
грубая
крепкая
нежная
грубая
100
100
100
100
100
100
100
94,5
94,2
94,9
97,0
95,7
94,5
94,9
102,3
103,0
100,7
105,4
100,6
100,7
101,6
100
100
100
100
100
100
100
95,0
94,6
94,0
96,2
93,4
95,5
95,3
102,5
101,7
100,2
101,0
100,9
100,8
102,7
У овец с крепкой конституцией как в предгорных, так и полупустынных зонах масса тела была менее подвержена сезонным колебаниям,
чем у животных с нежным и грубым конституциональными типами. Если
массу тела овец с крепкой конституцией из предгорной зоны принять за
100 %, то у особей с нежной конституцией по сезонам года анализируемый показатель колебался в пределах 94,2-97,0 %, у животных с грубой ?
от 100,6 до 105,4 % относительно живой массы у овец с крепкой конституцией (табл. 2). Аналогичную закономерность наблюдали у аксенгерских мясошерстных овец при содержании на полупустынных пастбищах:
величина живой массы у особей с грубой конституцией составила 100,2102,7 %, с нежной ? 93,4-96,2 % от показателя у животных с крепкой
86
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
конституцией.
Если массу тела овец из предгорной зоны для каждого типа конституции во все периоды взвешивания принять за 100 %, то можно констатировать, что овцы крепкой и нежной конституции как в предгорных,
так и в полупустынных зонах в октябре и декабре имели практически
одинаковую массу тела, тогда как в марте и апреле овцематки в условиях
предгорной зоны (независимо от типа конституции) значительнее превосходили по массе животных из полупустынной зоны (табл. 3).
3. Живая масса в зависимости от конституции у мясошерстных овцематок аксенгерского типа из полупустынной зоны относительно массы особей из
предгорной зоны (%, Заилийский Алатау, Казахстан, 2007-2009 год)
Крепкая конституция
Месяц
Октябрь
Декабрь
Март
Апрель
Июнь
Август
Сентябрь
Нежная конституция
Грубая конституция
пастбище
предгорное полупустынное предгорное полупустынное предгорное полупустынное
100
100
100
100
100
100
100
98,1
98,3
98,1
97,9
99,3
98,3
97,9
100
100
100
100
100
100
100
98,6
98,8
97,2
97,1
96,9
99,3
98,3
100
100
100
100
100
100
100
98,3
97,1
97,6 93,8
99,5
98,5
98,9
При благоприятных пастбищно-кормовых условиях (период летнеосеннего нагула) между подопытными овцами с аналогичным типом конституции как в предгорной, так и полупустынной зоне различий по живой
массе практически не наблюдали. Так, живая масса овец с крепкой конституцией в условиях полупустынной зоны в сентябре?октябре составила
97,9-98,1 % от массы овец с крепкой конституцией из предгорной зоны,
по овцам с нежной конституцией этот показатель равнялся 98,3-98,6 %, с
грубой ? 98,9 и 98,3 %.
Показатели живой массы в зимний период и при окоте свидетельствовали, что аксенгерские мясошерстные овцы в условиях полупустынной зоны более чувствительны к ухудшению пастбищно-кормовых условий, нежели овцы в условиях предгорной зоны. Так, в марте (при окоте)
этот показатель у овец с крепкой и грубой конституцией в условиях полупустынной зоны был на 3-5 % ниже в сравнении с таковым у овец тех же
конституциональных типов в условиях предгорной зоны, а у овец с нежной конституцией он оказался меньше на 8,5 % (см. табл. 1).
Таким образом, живая масса у аксенгерских мясошерстных овцематок разных конституциональных типов при содержании как в предгорной, так и в полупустынной зоне значительно варьирует по сезонам года
при максимуме в летне-осенний период и минимуме (с разницей 20-25 %)
в зимне-весенний период. Отметим, что подобные различия стали следствием недостаточного внимания, уделяемого повышению продуктивности
зимне-весенних пастбищ и созданию необходимых страховых запасов грубых и концентрированных кормов на местах зимовок овец.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
Ш о т а е в А.Н. Морфогенетические основы преобразовательного скрещивания в полтонкорунном овцеводстве. Алматы, 2004.
М а р з а н о в Н.С., Д е в р и ш о в Д.А., М а р з а н о в а С.Н., К о м к о в а Е.А., О з е р о в М.Ю., К а н т а н е н Ю. Генетическое маркирование, сохранение биоразнообразия
и проблемы разведения животных. Сельскохозяйственная биология, 2011, 2: 3-15.
М а р з а н о в Н.С., А м е р х а н о в Х.А., Ф о к е е в В.С., Н а с и б о в М.Г., О з е р о в М.Ю., К а н т а н е н Ю., М а р з а н о в а Л.К., А ж м у л а е в Р.Р., Б у р а б а е в А.А., К о м к о в а Е.А., П е т р о в С.Н. Генетические особенности овец отечествен-
87
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ных и зарубежных пород. Сельскохозяйственная биология, 2012, 2: 14-27.
К о з л о в И.Г. Влияние разных форм подбора на продуктивность полукровных забайкало-ставропольских помесей. Овцы, козы, шерстяное дело, 2013, 4: 19-20.
5. Е р о х и н А.И., Е р о х и н С.А. Овцеводство. М., 2004.
6. К о с и л о в В.И., Ш к и л е в П.Н., Н и к о н о в а Е.А. Рациональное использование
генетического потенциала отечественных пород овец для увеличения производства продукции овцеводства. Оренбург, 2009.
7. Т р а и с о в Б.Б. Акжаикские мясошерстные овцы. Овцы, козы, шерстяное дело, 2013, 3: 4-6.
8. Д а в л е т о в а А.М., Е с е н г а л и е в К. Конституционально-продуктивные типы овец
едильбаевской породы. Овцы, козы, шерстяное дело, 2013, 3: 12-14.
9. П л о х и н с к и й Н.А. Руководство по биометрии для зоотехников. М., 1969.
10. Т о р е х а н о в А.А. Использование различных типов пастбищ в условиях вертикальной
зональности Юго-Восточного Казахстана. Мат. Межд. науч.-практ. конф. «Проблемы
разработки и внедрения научных изысканий в области сельского хозяйства в свете стратегии вхождения Республики Казахстан в число 50 наиболее конкурентоспособных стран
мира». Алматы, 2008: 169-174.
11. Ж у м а д и л л а е в Н.К., А б д р а и м о в С.А. Современное состояние и проблемы пастбищ Казахстана. Мат. Межд. науч.-практ. конф. «Современные аспекты развития животноводства в пустынных и полупустынных зонах Казахстана». Шымкент, 2012, 280-285.
4.
Казахский НИИ животноводства и
кормопроизводства (филиал НИИ овцеводства),
Поступила в редакцию
3 октября 2013 года
040622 Республика Казахстан, Алматинская обл., с. Мынбаев,
e-mail: [email protected]
SEASONAL PARAMETERS OF THE KAZAKH MEAT-WOOL SHEEP
BODY WEIGHT UNDER DIFFERENT PASTURING
A.T. Musakhanov
Kazakh Research Institute of Livestock and Fodder Production (Branch of Research Institute of Sheep), s. Mynbaev,
Almata Region, 040622 Kazakhstan Republic, e-mail [email protected]
Received October 3, 2013
Abstract
In the course of animal growth and development, there are expressed both bred and special
traits, and also the individual peculiarities of constitution, exterior and productivity which characterize the animal pedigree. Thus, studying growth and development contributes both to rearing and
breeding technologies. The seasonal changes of body weight could be used to characterize the animal
growth rate, feeding, metabolism, early maturation and health. Besides, basing on the body weight, it
is possible to estimate the animal adaptation to environment. We compared the seasonal changes of
body weight in Kazakh meat-wool sheep Aksenger females of different constitutional types pastured
at different climatic zones of Zailiy Alatau (Kazakhstan Republic). The body weight was shown to
vary considerably both under pasturing in semi-desert zone and at foothills, and to depend more on
season if compared to constitutional type. It was the highest in summer and autumn, and 20-25 %
lower in winter and spring. In semi-desert zone, the sheep were more influenced when fodder became
worse and limited. As to practical point of view, that resulted from no measures on restoring the pasture
productivity during winter and spring and also from limited reserves of coarse and concentrated fodder
at the pastures where sheep are kept in winter.
Keywords: body weight, constitution, strong, gentle and rough type, foothills and semidesert grassland.
Новые книги
Д о н ч е н к о А.С., О с т а ш к о Т.Н., С а м о л о в о в а Т.Н. и др. История ветеринарной медицины: древний мир ? начало XX века.
М.: изд-во «КолосС», 2012, 488 с.
В учебном издании обобщен исторический опыт зарождения и развития ветеринарной медицины с древнейших времен до
начала XX века. На примере разных цивилизаций показана непрерывность развития традиционных систем врачевания людей и животных, тесная связь медицинских и ветеринарных знаний. Специальный раздел книги
88
посвящен истории развития ветеринарии в
Российской империи: рассмотрены процесс
становления самостоятельной ветеринарной
службы в России, формы организации ветеринарной деятельности, система организации
ветеринарных кадров, меры борьбы с наиболее опасными болезнями сельскохозяйственных животных. Показаны достижения естественно-биологических наук, ставших основой ветеринарной медицины. Книга включает биографии известных ученых и педагогов
в области ветеринарии и медицины.
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, № 2, с. 89-93
УДК 638.1:581.1:57.04
ТЕМПЕРАТУРНАЯ ЗАВИСИМОСТЬ ИЗМЕНЕНИЯ МАССЫ ТЕЛА
И СОДЕРЖАНИЯ В НЕМ ВОДЫ У ПЧЕЛ (Apis mellifera L.) ПРИ
АНЕСТЕЗИИ ДИОКСИДОМ УГЛЕРОДА
Е.К. ЕСЬКОВ, М.Д. ЕСЬКОВА, С.Е. СПАСИК
У медоносной пчелы, как и одиночно живущих насекомых, интенсивность дыхания находится в прямой зависимости от температуры, понижаясь с ее приближением к верхней границе
витального диапазона, находящейся на уровне 40-45 оС. Специфическая особенность медоносной
пчелы выражается в высокой толерантности к гипоксии. Действию особенно высоких концентраций СО2, достигающих 6-8 %, пчелы подвергаются в период зимовки, когда интенсивное охлаждение стимулирует их агрегирование в небольшой зоне гнездового пространства. В изучении
адаптаций пчел к широкому изменению внешней температуры остается невыясненным их отношение к гипо- и гипертермии в условиях гипоксии. Поскольку высокие концентрации СО2 анестезируют пчел, мы изучили в динамике физиологические эффекты диоксида, в частности температурную (0 °С, 25 °С и 35 °С) зависимость потерь воды в состоянии, исключающем активное использование систем, которые обеспечивают регуляцию метаболизма и дыхания. Экспериментальными объектами были рабочие особи медоносной пчелы (Apis mellifera L.) весеннелетних генераций из одних и тех же семей. Установлено влияние анестезии на уменьшение
массы тела пчел, что связано преимущественно с потерями воды. Понижение температуры от
ее внутриульевых значений до состояния холодового оцепления замедляет изменение массы головных, грудных и брюшных отделов тела и содержания воды в них. Из-за того, что в состоянии холодового оцепенения и анестезии дыхательная функция приостанавливается, транспорт
воды происходит преимущественно через покровы тела.
Ключевые слова: медоносная пчела, масса, отделы тела, вода, анестезия, диоксид углерода, температура.
У наземных насекомых потери воды через кутикулу зависят от
температуры. При ее значениях, вызывающих плавление восков эпикутикулы, скорость испарения воды резко возрастает. Эти температурные
показатели у личинки мухи Сalliphora равняются 37-38 °С, у куколки жука
Tenebrio ? около 48 °С (1), тогда как у нимфы Rhodnius ? 58 °С (2), что
обусловлено видовой специфичностью восков, обладающих разной
температурой плавления (1-3).
С влиянием температуры на интенсивность дыхания связаны потери воды из тела насекомых. Поэтому в условиях пониженной влажности
при высокой температуре для ограничения потерь воды насекомые закрывают дыхальца, что приводит к снижению интенсивности дыхания (4, 5).
У медоносной пчелы, как и одиночно живущих насекомых, интенсивность дыхания находится в прямой зависимости от температуры, понижаясь с ее приближением к верхней границе витального диапазона (6).
Потери воды у пчел под влиянием гипертермии подвержены возрастной
изменчивости (7). В регуляции водного обмена пчелы важная роль принадлежит метаболической воде, аккумулируемой в ректумах в то время весенне-летнего периода жизни, когда пчелы из-за неблагоприятной погоды
не могут вылетать из улья (6).
Специфическая особенность медоносной пчелы выражается в высокой толерантности к гипоксии. Развитие этой адаптации у пчел сопряжено с приспособлением к жизни в укрытиях. Действию особенно высоких концентраций СО2 особи подвергаются в период зимовки, когда интенсивное охлаждение стимулирует их агрегирование в небольшой зоне
гнездового пространства (8). Гипоксия влияет на интенсивность метаболизма (9) и сокращение продолжительности жизни пчел (10).
89
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
В изучении адаптаций пчел к широкому изменению внешней температуры остается невыясненным их отношение гипо- и гипертермии в
условиях гипоксии.
Поскольку высокие концентрации СО2 анестезируют пчел, в настоящей работе было предпринято изучение температурной зависимости
потерь воды в состоянии, исключающем активное использование систем,
которые обеспечивают регуляцию метаболизма и дыхания.
Методика. Исследование выполнено на разновозрастных пчелах
весенне-летних генераций. Для каждого опыта насекомых одновременно
отбирали из ульев в энтомологические садки по 150-200 особей из одних
тех же семей. Для наркотизации пчел помещали в эксикатор с впускающим и выпускающим штуцерами. Через впускающий штуцер воздух в
эксикаторе замещали химически чистым диоксидом углерода. Он за несколько секунд анестезировал пчел, после чего оба штуцера перекрывали
и эксикаторы на определенное время помещали в суховоздушный термостат или холодильную камеру. Чтобы исключить затраты времени на нагревание или охлаждение эксикатора, его перед началом каждого опыта
выдерживали в течение 2-3 ч при заданной температуре в термостате или
в холодильной камере.
Влияние разной продолжительности воздействия диоксидом углерода на массу головных, грудных и брюшных отделов тела пчел определяли посредством их расчленения и последующего взвешивания с точностью
до 0,05 мг на аналитических электронных (AR 2140, Россия) или торсионных (ВТ-500, Россия) весах. Содержание воды в теле пчел определяли высушиванием при 102 °С до постоянной массы.
Статистический анализ цифровых данных выполняли с использованием Microsoft Excel для Office XP и профессионального пакета для обработки и анализа многомерной статистической информации (11).
Результаты. Пчелы, использованные в каждом опыте, были отобраны из одних тех же семей в одно и то же время, что позволяло нивелировать возможные существенные различия между особями по физиологическому состоянию в течение весенне-летнего периода.
Особи, анестезированные диоксидом углерода, как и охлажденные
до состояния холодового оцепенения, находились в неподвижном состоянии. Для активизации анестезированных пчел был необходим кислород
воздуха, для находящихся в состоянии холодового оцепенения ? нагрев
до температуры, превосходящей порог холодового оцепенения. Продолжительность жизни анестезированных пчел летних генераций при 25 °С
ограничивалась 7 ч, при 35 °С ? 5 ч. В состоянии холодового оцепенения
при 0 оС пчелы сохраняли жизнеспособность до 3 сут.
1. Изменение массы (мг) разных отделов тела у пчел Apis mellifera L. под
влиянием анестезии диоксидом углерода
Состояние
Голова
M±m (lim)
Cv, %
А
14,8±0,20 (13-17)
8,8
Б
13,1±0,20 (10-16)
11,7
В
12,8±0,20 (10-16)
8,3
П р и м е ч а н и е. А ? исходное состояние,
чение 3 ч при 35 °С.
Грудь
M±m (lim)
Cv, %
Брюшко
M±m (lim)
Cv, %
40,3±0,40 (36-45)
7,3
72,1±1,90 (48-98)
19,2
37,9±0,40 (32-41)
8,1
67,7±2,10 (56-92)
16,8
37,3±0,50 (33-44)
11,8
66,6±2,60 (39-88)
19,5
Б ? анестезия в течение 3 ч при 25 °С, В ? анестезия в те-
А н е с т е з и я п р и 25 и 35 °С. Изменение массы тела анестезированных пчел зависело от температуры (табл. 1). У особей при 25 °С за
3 ч масса головных отделов уменьшалась в среднем на 11,5 %, грудных ?
на 6,0 % и брюшных ? на 6,1 % (Р ? 0,99). За такое же время у анестези90
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
рованных пчел, находившихся при 35 °С, масса указанных отделов уменьшалась соответственно на 13,5; 7,4 и 7,6 % (Р > 0,99).
Различия по уменьшению массы тела между анестезированными
пчелами, находившимися при 25 и 35 °С, в значительной мере согласовывались с таковыми по потерями воды. При 25 °С содержание воды за 3
ч в головных отделах у пчел уменьшалось на 4,0 %, в грудных ? на 2,4 %
и в брюшных ? на 7,9 %. Повышение температуры на 10 °С способствовало увеличению потерь воды (табл. 2). При 35 °С в головных отделах
содержание воды уменьшалось на 4,7 %, в грудных ? на 2,8 % и в
брюшных ? на 8,7 % (Р ? 0,95).
2. Изменение содержания воды (%) в разных отделах тела у пчел Apis mellifera
L. под влиянием анестезии диоксидом углерода
Состояние
Голова
M±m (lim)
Грудь
M±m (lim)
Cv, %
А
70,3±0,50 (66-79)
5,3
Б
66,3±0,60 (62-75)
6,5
В
65,6±0,70 (61-73)
7,3
П р и м е ч а н и е. А ? исходное состояние, Б
ние 3 ч при 35 °С.
Cv, %
67,1±0,40 (63-73)
4,9
64,7±0,40 (62-71)
4,1
64,3±0,40 (61-70)
4,2
? анестезия в течение 3 ч при
Брюшко
M±m (lim)
Cv, %
76,6±0,70 (69-88)
6,8
68,7±1,40 (66-85)
13,9
67,9±1,20 (65-82)
11,2
25 °С, В ? анестезия в тече-
А н е с т е з и я п р и 0 °С. Охлаждение до состояния холодового
оцепенения при 0 °С и анестезия диоксидом углерода обладали сходным,
но не одинаковым влиянием на динамику массы и содержание воды в
теле пчел. В состоянии холодового оцепенения за 3 ч масса головных отделов уменьшалась на 1,5 %, грудных ? на 1,8 % и брюшных ? на 1,3 %,
за 7 ч эти изменения возросли и значения потерь составили соответственно 3,8; 2,6 и 2,0 %, за 24 ч ? 6,4; 16,7 и 6,4 %, а за 48 ч ?16,4; 9,5 и
15,5 % (Р > 0,99) (табл. 3).
3. Изменение массы разных отделов тела и содержания воды в них у пчел Apis
mellifera L. в естественной воздушной среде под влиянием холодового оцепенения при 0 °С
Отдел тела
Голова
Грудь
Брюшко
Голова
Грудь
Брюшко
Голова
Грудь
Брюшко
Голова
Грудь
Брюшко
Голова
Грудь
Брюшко
Время, ч
0
3
7
24
48
Масса, мг
M±m (lim)
13,2±0,22
38,8±0,54
68,6±0,59
13,0±0,21
38,1±0,49
67,7±0,58
12,7±0,22
37,8±0,54
67,2±0,89
12,4±0,17
36,2±0,47
64,2±1,85
10,9±0,16
35,1±0,57
59,3±1,47
(10-15)
(33-45)
(34-90)
(10-14)
(33-44)
(33-88)
(10-15)
(33-45)
(54-90)
(10-13)
(31-39)
(50-70)
(9-13)
(30-40)
(40-66)
Cv, %
11,8
9,6
19,5
8,9
9,1
19,7
11,8
9,7
15,5
8,0
6,6
18,7
8,9
9,5
15,7
Содержание воды, %
M±m (lim)
Cv, %
73,7±0,59
67,7±0,49
85,1±0,59
72,8±0,57
66,7±0,52
83,3±0,57
70,3±0,59
64,5±0,49
82,4±0,67
70,0±0,93
63,4±0,37
80,1±0,75
65,5±0,70
62,1±0,32
78,8±0,66
(63,1-74,5)
(62,5-78,1)
(74,9-90,8)
(62,9-72,2)
(62,1-77,3)
(73,1-88,5)
(63,3-84,6)
(61,1-78,3)
(75,6-92,9)
(63,6-75,0)
(62,5-71,0)
(70,0-85,9)
(55,5-72,7)
(60,0-67,5)
(70,0-85,9)
5,6
5,1
5,5
5,8
6,3
7,3
5,6
5,0
5,5
6,9
2,8
4,7
6,3
2,9
4,8
Анестезия диоксидом углерода оцепеневших пчел снижала влияние
охлаждения на динамику массы отделов тела. У анестезированных пчел
при 0 °С за 3 ч масса головных отделов уменьшалась на 0,8 %, грудных ?
на 1,0 % и брюшных ? на 0,3 %, за 7 ч эти показатели составляли соответственно 2,3; 2,1 и 0,7 %, за 24 ч ? 5,3; 4,1 и 2,4 %, а за 48 ч ? 15,2; 8,2
и 11,5 % (табл. 4).
Динамика содержания воды подобно массе тела различалась у анестезированных и неанестезированных пчел (см. табл. 4). У оцепеневших
пчел, находившихся при свободном доступе воздуха, за 3 ч потери воды в
91
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
головном отделе составляли 0,9 %, в грудном ? 1,0 %, в брюшном ? 1,8 %.
За 24 ч потери воды достигли в среднем 3,7; 4,3 и 4,0 %, а за 48 ч ? 8,2;
5,6 и 6,3 %.
Под влиянием анестезии небольшое уменьшение потерь воды прослеживалось у пчел, находившихся в состоянии оцепенения в течение 24 и
48 ч. У первых из них содержание воды в головных отделах уменьшалось
на 3,6 %, в грудных ? на 3,9 %, в брюшных ? на 3,8 %, а у вторых ? соответственно на 7,8; 5,1 и 5,9 % (см. табл. 4).
4. Изменение массы разных отделов тела и содержания воды в них у пчел Apis
mellifera L. под влиянием анестезии диоксидом углерода при 0 °С
Отдел тела
Голова
Грудь
Брюшко
Голова
Грудь
Брюшко
Голова
Грудь
Брюшко
Голова
Грудь
Брюшко
Голова
Грудь
Брюшко
Время, ч
0
3
7
24
48
Масса, мг
M±m (lim)
13,2±0,22
38,8±0,54
68,6±0,59
13,1±0,22
38,4±0,43
68,4±0,59
12,9±0,31
38,0±0,86
68,1±2,01
12,5±0,21
37,2±0,53
66,8±2,08
11,2±0,17
35,6±0,52
60,7±1,61
(10-15)
(33-45)
(34-90)
(10-15)
(32-44)
(34-88)
(9-15)
(31-50)
(55-96)
(9-14)
(31,41)
(52-80)
(9-13)
(28-42)
(40-73)
Cv, %
11,8
9,6
19,5
9,9
9,2
16,4
13,0
12,0
15,2
9,4
7,6
16,6
10,2
9,0
16,0
Содержание воды, %
M±m (lim)
Cv, %
73,7±0,59
67,7±0,49
85,1±0,67
72,6±0,52
66,7±0,44
83,5±0,77
70,5±0,63
64,6±0,91
82,7±1,18
70,1±0,89
63,8±0,44
81,3±1,21
65,9±0,74
62,6±0,40
79,2±0,60
(63,3-75,6)
(62,5-78,3)
(75,6-92,9)
(60,1-82,2)
(62,3-77,1)
(74,5-87,6)
(63,3-75,0)
(51,4-74,4)
(66,6-88,5)
(63,6-79,2)
(58,0-65,8)
(53,7-78,8)
(55,5-72,7)
(60,6-69,4)
(73,3-87,8)
5,6
5,1
5,5
5,3
5,4
5,9
4,8
7,7
8,1
7,0
3,9
9,3
6,8
3,8
4,4
Таким образом, анестезия стимулирует резкое уменьшение массы
тела пчел, что, очевидно, связано преимущественно с потерями воды. Повышение температуры в диапазоне, обеспечивающем высокий уровень активности пчел, интенсифицирует уменьшение массы тела и потери воды.
В отличие от этого в состоянии холодового оцепенения анестезия замедляет динамику уменьшения массы и содержания воды в разных отделах
тела пчел. Поскольку в состоянии холодового оцепенения и анестезии дыхательная функция приостанавливается, транспорт воды происходит преимущественно через покровы тела.
ЛИТЕРАТУРА
1.
B e a m e n t J.W.L. The waterproofing mechanism of arthropods. J. Exp. Biol., 1959, 36:
391-422.
2. W i g g l e s w o r t h V.B. Transpiration through the epicuticle of insect. J. Exp. Biol., 1945, 21:
97-114.
3. O l o f f s P.C., S c u d d e r G.G. The transition phenomenon in relation to the penetration of
water through the cuticle of an insect, Cenocorixa expleta (Hungerford). Canad. J. Zool., 1966,
44: 621-630.
4. Т ы щ е н к о В.П. Основы физиологии насекомых. Ч. 1. Физиология метаболических систем. Л., 1976.
5. M i l l e r P.L. Factors altering spiracle control in adult dragonflies: water balance. J. Exp. Biol.
1964, 41: 331-343.
6. Е с ь к о в Е.К. Экология медоносной пчелы. Рязань, 1995.
7. Е с ь к о в Е.К., Б а б к и н а Н.Г. Возрастная и сезонная изменчивость индивидуальной
устойчивости медоносной пчелы к экстремальным температурам. Энтомологическое
обозрение, 1990, 69(1): 481-485.
8. Е с ь к о в Е.К. Индивидуальные и социальные адаптации медоносной пчелы к зимовке.
Успехи современной биологии, 2003, 123(4): 383-390.
9. Е с ь к о в Е.К., Е с ь к о в а М.Д. Физиологические эффекты гипоксии развивающихся
и взрослых пчел Apis mellifera L. Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2011,
6: 469-474.
10. Е с ь к о в Е.К., Е с ь к о в а М.Д., С п а с и к С.Е. Изменение массы тела и продолжительности жизни пчел Apis mellifera L. под влиянием наркотизации диоксидом угле-
92
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
рода. Журнал эволюционной биохимии и физиологии, 2013, 49(6): 459-461.
11. П р о т а с о в К.В. Статистический анализ экспериментальных данных. М., 2005.
ФГБОУ ВПО Российский государственный
аграрный заочный университет,
Поступила в редакцию
19 ноября 2013 года
143900 Россия, Московская обл., г. Балашиха,
ул. Ю. Фучика, 1,
e-mail: [email protected]
INFLUENCE OF TEMERATURE ON BODY WEIGHT AND WATER
CONTENT IN HONEY BEES (Apis mellifera L.) UNDER AN ANESTHESIA
WITH CARBON DIOXIDE
E.K. Eskov, M.D. Eskova, S.E. Spasik
Russian State Agrarian Extramural University, 1, ul. Yu. Fuchika, Balashikha, Moscow Province, 143900 Russia, email [email protected]
Received November 19, 2013
Abstract
In bees Apis mellifera L., similar to other insects, the respiration depends directly on temperature, being suppressed as the temperature approaches the upper limit of viability. High hypoxia
tolerance is known to be a characteristic feature of honey bees. In winter, bees are influenced by the
high СО2 level when the law temperatures stimulate their aggregation in a limited zone of the nest
space. In adaptation of bees to a wide range of outer temperature, the effect of hypo- and hyperthermia under hypoxia are still not studied. Because the high СО2 concentrations act as anesthetics,
we examined in dynamics a physiological effect of temperature (0 °С, 25 °С, and 35 °С), particularly body weight and water losses, when the systems regulating metabolism and respiration activity
in insects are out of active use. The worker bees of spring and summer generations from the same
families were investigated. СО2 was shown to influence the body weight losses, due to the water
losses mainly. If the temperature changes from the parameter registered inside a hive to that causing
a cold numb, the weigh of and the water content in bees? head, thorax and abdomen decreased
slowly. Because of repressed respiration under cold numb and anesthesia, the transpiration occurs
through an integument.
Keywords: honey bee, weight, parts of a body, water, anesthesia, carbon dioxide, temperature.
Редакция журнала «Сельскохозяйственная биология»
выполняет рассылку электронных оттисков опубликованных статей
Для получения электронного оттиска Вам необходимо:
™
отослать точное описание заказа (авторы и название статьи, год, номер журнала, страницы)
по адресу [email protected], указав Ваши фамилию, имя, отчество (полностью), город, где проживаете, контактные e-mail и телефон;
™
получить из редакции по своему e-mail подтверждение заказа (с присвоенным ему номером);
™
оплатить услугу, указав в платежном документе в графе «Назначение платежа» присвоенный заказу номер и Ваши фамилию, имя, отчество.
Оттиски высылаются на Ваш контактный e-mail после зачисления оплаты на счет редакции.
Банковские реквизиты редакции:
Получатель:
Банк получателя:
ИНН 7708051012 Редакция журнала «Сельскохозяйственная
Сбербанк России ОАО г. Москва,
биология», Марьинорощинское ОСБ 7981,
БИК 044525225,
г. Москва, р/с 40703810638050100603
к/с 30101810400000000225
В назначении платежа укажите номер заказа, Ваши фамилию, имя, отчество.
Стоимость услуги:
™
один оттиск ? 120 руб.,
™
не более шести оттисков (абонемент) ? 360 руб.,
™
не более двенадцати оттисков (абонемент) ? 700 руб.
Цены приведены с учетом НДС 10 %. Абонементное обслуживание предполагает предоставление указанного числа оттисков за период не более каждого текущего года по предоплате.
E-mail для заказа электронных оттисков ? [email protected]
© Электронные оттиски являются интеллектуальной собственностью редакции журнала «Сельскохозяйственная
биология». Внесение в них каких бы то ни было изменений и дополнений не допускается. Перепечатка, тиражирование, размещение в средствах информации, в том числе электронных и сети Интернет, а также
коммерческое распространение возможны только с разрешения редакции.
93
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, № 2, с. 94-104
Ветеринарная микробиология, ветеринария
УДК 636:619: [579.62+591.8
ХАРАКТЕРИСТИКА ТОКСИГЕННОСТИ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ,
ВЫДЕЛЕННЫХ ПРИ ЖЕЛУДОЧНО-КИШЕЧНЫХ БОЛЕЗНЯХ
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ
Е.М. ЛЕНЧЕНКО, Е.А. МАНСУРОВА, А.В. МОТОРЫГИН
Как известно, у бактерий семейства Enterobacteriaceae , которые занимают существенное место в этиологии неонатальных заболеваний сельскохозяйственных животных, в большинстве случаев отсутствует корреляция между серологической группой и токсигенностью. В связи с
этим при диагностике целесообразно либо выявлять бактериальные адгезины, либо непосредственно подтверждать присутствие токсинов на различных лабораторных моделях, что, как правило, достаточно сложно и занимает много времени. Мы оценили токсигенность и вирулентность у
патогенных и условно-патогенных энтеробактерий, выделенных при желудочно-кишечных болезнях молодняка сельскохозяйственных животных (1-5-суточные телята голштинской и чернопестрой пород), и у референтных штаммов с использованием различных тестов на лабораторных
животных (беспородные белые мыши, морские свинки линии Self, кролики породы Chinchilla и
перепела Coturnix comuni). Доминирующая часть эпизоотических энтеробактерий, выделенных
нами от телят (64 из 86 изолятов), идентифицировалась как Escherichia coli. Из изолятов E. coli
34 не серотипировались по О-антигену. При этом 35,0 % таких изолятов оказались патогенными и 65,0 % ? непатогенными в тесте на белых мышах при внутрибрюшинном заражении бактериальной суспензией. В то же время токсигенность была выявлена у 53,9 % изученных изолятов и референтных штаммов энтеробактерий родов Salmonella (2 изолята), Klebsiella (2 изолята), Kluyvera (1 изолят), Yersinia (3 изолята), Escherichia (13 изолятов). Умеренно токсигенными
и слаботоксигенными свойствами характеризовались соответственно 15,4 и 38,5 % изолятов, нетоксигенными ? 46,1 %. Гистохимическими методами выявлены структурные изменения в тканях и органах лабораторных животных при экспериментальном моделировании токсемии, вызываемой энтеробактериями. При экспериментальной токсемии, обусловленной токсинами E.
coli и Y. pseudotuberculosis, динамика патологических процессов характеризовалась развитием
гидропической дистрофии эпителиоцитов ворсинок в тонком отделе кишечника, а также общей
реакции сосудов микроциркуляторного русла в слизистой оболочки желудка, тонкого и толстого
отделов кишечника животных.
Ключевые слова: энтеробактерии, желудочно-кишечные заболевания, сельскохозяйственные животные, лабораторные модели, токсемия.
В структуре неонатальной патологии сельскохозяйственных животных, в том числе птицы, существенное место занимают инфекционные
болезни, в этиологии которых значительную долю составляют патогенные
бактерии семейства Enterobacteriaceae : Salmonella, Escherichia, Citrobacter,
Enterobacter, Klebsiella, Proteus, Morganella, Providencia, Yersinia. Реализация
взаимоотношений патогенных энтеробактерий с организмом восприимчивого животного обеспечивается спектром специфических факторов патогенности, в том числе благодаря способности продуцировать токсины,
принимающие участие в развитии патологического процесса (1-4). Учитывая, что в большинстве случаев корреляция между серологической группой и токсигенностью у энтеробактерий отсутствует, целесообразным
представляется выявление либо адгезинов, либо непосредственно токсинов с применением различных лабораторных моделей, как правило, характеризующихся сложностью воспроизведения и чрезвычайной продолжительностью исполнения (5).
Целью работы была оценка токсигенности энтеробактерий, доминирующих при желудочно-кишечных болезнях молодняка сельскохозяйственных животных, с использованием различных лабораторных тестов, а
также регистрации гематологических и гистохимических изменений, наблюдаемых при инфицировании лабораторных животных.
94
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
Методика. Исследовали изоляты энтеробактерий, выделенные из
патологического материала, смывов из носовой полости и из фекалий телят голштинской и черно-пестрой пород в возрасте от 1 до 5 сут (n = 70)
из хозяйств Кораблинского района Рязанской области. Видовую принадлежность изолятов идентифицировали с использованием дифференциально-диагностических питательных сред: ВСА, Эндо («HiMedia Laboratories Pvt. Ltd.», Индия), Rambach agar, XLT-4 agar, Cromocult Coliform
agar («Merck KGaA», Германия). Биохимические свойства микроорганизмов изучали с использованием сред Гисса и множественной тест-системы
«Пластина биохимическая, дифференцирующая энтеробактерии» («ПБДЭ»,
НПО «Диагностические системы», г. Нижний Новгород, Россия) и API
(«BioMйrieux S.A.S.», Франция). Для серотипирования E. coli по О-антигену применяли диагностические сыворотки (ФГУП «Армавирская биофабрика», Россия) в соответствии с рекомендациями («Наставления по
применению агглютинирующих О-коли сывороток». М., 1998). В качестве референтных использовали паспортизированные штаммы Escherichia
coli О2 № 388, E. coli О78:К80 № 320, E. coli О138:К81 № 723, Klebsiella
pneumonia № 356, Salmonella typhimurium № 5715, Yersinia pseudotuberculosis
I № 290, Y. enterocolitica (S- и R-формы) № 383 (получены из коллекции
«Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и
кормов» ? ВГНКИ, г. Москва).
Патогенные и токсигенные свойства энтеробактерий изучали общепринятыми методами на лабораторных животных ? беспородных белых
мышах (живая масса 14-16 г), морских свинках (линия Self, живая масса
200-300 г), кроликах (порода Chinchilla, живая масса 2,5 кг) и перепелах
Coturnix comuni (6, 7).
При оценке патогенности изолятов заражали беспородных белых
мышей внутрибрюшинно взвесью микроорганизмов (по 0,5 см3; плотность бактериальной суспензии ? 1 млрд кл/см3) (n = 60). Для наблюдения за местными изменениями в слизистых оболочках с применением кератоконъюнктивальной пробы морским свинкам (n = 6) в конъюнктивальную полость вводили взвесь изучаемых микроорганизмов (1Ѕ1091Ѕ1010 клеток) (8). При исследовании токсигенных свойств штаммы предварительно выращивали в жидкой среде Хоттингера в течение 24 ч при
37 °С (Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica ? при 28 °С), культуры (Sформы) осветляли центрифугированием (6000 об/мин в течение 30 мин) и
супернатант использовали в плантарном тесте и тесте расширения кишечника. В плантарном тесте осветленную культуральную жидкость вводили
беспородным белым мышам (n = 3) в область плантарной поверхности
лапы (в контроле стерильный бульон Хоттингера инъецировали в другую
лапу в том же количестве). В тесте расширения кишечника белым беспородным мышам-сосункам 2-3-суточного возраста per rectum вводили надосадочную жидкость в объеме 0,2 мл и рассчитывали коэффициент расширения тонкого кишечника (отношение массы тонкого кишечника с содержимым к остальной массе тела).
С целью исследования клинико-гематологических показателей морским свинкам (n = 6) и кроликам (n = 6) внутрибрюшинно в дозе 5Ѕ109
клеток вводили 18-часовую бактериальную культуру; в аналогичных контрольных группах животным инъецировали стерильный раствор NaCl
(0,9 %). При изучении клинико-гематологических изменений у 10-суточных перепелов Coturnix comuni (n = 12) птицу интраназально заражали 18часовой культурой Е. coli 1111 (О149:К91:К88) в дозе 5Ѕ109 бактериальных
клеток. Клинико-гематологические показатели изучали на морских свин95
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ках при внутрибрюшинном заражении референтным штаммом Y. pseudotuberculosis I и изолятом Е. coli О115.
Для оценки динамики гибели белых мышей использовали внутрибрюшинное заражение культурой микроорганизмов (500 млн кл/см3) и
интрагастральное введение 0,5 см3 токсина, полученного после осветления жидкой культуры. Из животных по принципу аналогов сформировали
6 групп (по 10 гол. в каждой): особям из I и II группы вводили соответственно культуру микроорганизмов и токсин E. coli О8 (выделен из фекалий
3-суточного теленка с клиническими признаками диареи; из III и IV ?
соответственно культуру микроорганизмов и токсин K. pneumoniae (референтный штамм № 356); из V групп ? внутрибрюшинно ассоциацию
(по 250 млн кл/см3) культур микроорганизмов E. coli O8 и K. pneumoniae; из VI группы (контроль) ? внутрибрюшинно и интрагастрально
стерильный раствор NaCl (0,9 %). Рассчитывали летальность (отношение
числа погибших от болезни к числу заболевших) и смертность (отношение числа погибших от болезни к общей численности контролируемой
популяции).
Патологоанатомические исследования проводили общепринятыми методами, при гистохимических исследованиях патологический материал от животных и птицы фиксировали 10,0 % формалином и заключали
в парафин, срезы окрашивали гематоксилином и эозином, по Ван Гизону,
по Крантцу и по Лейшману.
В экспериментах использовали анализаторы крови фирмы «Mindray» (Китай); микроскоп модели H604 Trinocular («Unico, Inc.», США) с
цифровой фотокамерой Canon Power Shot A 640 (США), цифровую окулярную видеокамеру МА 88 («Hight Technology Inc.», США).
Полученные данные обрабатывали методом вариационной статистики в соответствии с методическим руководством с применением программы Statgraphics Plus v. 5.0 (9).
Результаты. Использование питательных сред Rambach agar, XLT4 agar, Cromocult Coliform agar при проведении бактериологических исследований позволило идентифицировать и дифференцировать колонии
таксономически сходных видов энтеробактерий. Результаты идентификации с применением сред Гисса согласовывались с результатами тестсистем, но последние позволяли сократить сроки и снизить затратность
процедуры. Из патологического материала, смывов из носовой полости и
фекалий телят, а также смывов, полученных в репродукторных помещениях животноводческих объектов, выделили 86 культур микроорганизмов,
принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae, из которых 64 культуры
идентифицировались как E. coli, 10 ? как Proteus mirabilis, 9 ? Klebsiella
pneumoniae, 3 ? Salmonella typhimurium, то есть среди них доминировали
эшерихии.
При серологической идентификации с использованием О-коли сывороток из 139 эпизоотических штаммов E. coli к группе О8 отнесли 20
штаммов, к О141 ? 27, О138 ? 18, О9 ? 11, О139 ? 9 и к О157 ? 3. К
нетипируемым причислили 34 изолята E. coli. По данным литературы, серотипирование E. coli по О-антигену затруднено из-за узкого спектра и невысокой чувствительности существующих наборов О-коли сывороток, в частности по О-серогруппе не удалось типировать 49,0 % изолятов E. coli,
выделенных от птицы, и 22,0 % изолятов E. coli от пушных зверей (10, 11).
При идентификации микроорганизмов, не типируемых по О-антигену, в соответствии с общепринятыми методами определяли патогенные
свойства при внутрибрюшинном заражении белых мышей. Из исследо96
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ванных нами штаммов энтеробактерий 35,0 % оказались патогенными и
65,0 % ? непатогенными. Известно, что парентеральное введение иерсиний мышевидным грызунам из-за естественной восприимчивости последних не дает объективных сведений о наличии факторов патогенности
у указанных микроорганизмов и их способности вызвать инфекционный
процесс (8). Поэтому для изучения патогенных свойств референтных
штаммов Y. enterocolitica О9 № 383 и Y. pseudotuberculosis № 290 мы апробировали кератоконъюнктивальную пробу. Для сравнения в качестве
тест-штамма использовали изолят E. coli О8, выделенный из фекалий
2-суточного теленка с клиническими признаками диареи. На морских
свинках в течение 1 нед при ежедневном осмотре после введения в
конъюнктивальную полость взвеси микроорганизмов (штамм E. coli О8,
референтные штаммы Y. enterocolitica О9 № 383 и Y. pseudotuberculosis №
290), регистрируя выраженность признаков конъюнктивита (сужение
глазной щели, гиперемия конъюнктивы, отек век, наличие и характер
отделяемого) и состояния роговицы, установили следующие различия.
Штамм E. coli О8 вызывал прогрессирующий конъюнктивит и кератит,
характеризующийся склеиванием изъязвленных век, обильным гнойным
или гнойно-творожистым экссудатом, сильное помутнение роговицы. В
случае референтного штамма Y. enterocolitica О9 (S-форма) № 383 отмечался выраженный и прогрессирующий к 5-7-м сут конъюнктивит при незначительном непрогрессирующем помутнении роговицы, в то время как в
варианте с референтными штаммами Y. enterocolitica (R-форма) № 383 и
Y. pseudotuberculosis № 290 наблюдали незначительно выраженный конъюнктивит через 2-3 сут после заражения, отсутствие или слабую выраженность кератита через 2-3 сут без прогрессирования или даже с исчезновением помутнения роговицы через 5-7 сут. В целом было установлено, что кератоконъюнктивальная проба может считаться чувствительным и легко воспроизводимым в практических условиях тестом для оценки патогенности иерсиний.
В плантарном тесте на продукцию токсина средняя разность массы лапок у мышей в опыте и контроле через 24 ч колебалась от 6,66±4,41
до 48,33+3,54 мг. У 42,8 % изолятов энтеробактерий получили критерий достоверности td > 9,9, что соответствовало достоверности различий
Р ? 0,01; у 52,4 % изолятов ? td > 4,3, что соответствовало достоверности
различий Р ? 0,05. Из 21 изученной культуры референтных и эпизоотических штаммов энтеробактерий, в том числе эшерихий, не типируемых набором О-коли сывороток, 42,9 % были умеренно токсигенными, 28,5 % ?
слаботоксигенными и 33,3 % ? нетоксигенными (табл. 1).
1. Результаты оценки токсигенности эпизоотических и референтных штаммов
энтеробактерий в плантарном тесте на белых лабораторных мышах
Вид микроорганизма, № штамма
(источник выделения)
Salmonella typhimurium № 5715 (референтный штамм)
S. typhimurium (смывы, полученные в репродукторных помещениях)
Klebsiella pneumoniae № 356 (референтный штамм)
Токсигенность
масса лапки, мг средняя разность
опыт контроль массы, мг (M±m)
205
215
205
185
185
200
190
195
190
160
165
165
165
160
175
155
150
145
td
45,00±2,64
12,4
23,33±6,43
8,3
38,33±4,32
7,2
97
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
Продолжение таблицы 1
180
155
180
155
28,33±5,04
5,9
185
150
Kluyvera ascorbata (патологический материал от теленка)
210
160
205
160
46,66±4,35
7,4
210
165
Yersinia pseudotuberculosis № 290 (референтный штамм)
180
175
185
170
6,66+4,41
6,3
185
180
Y. enterocolitica О9 S-форма № 383 (референтный штамм)
210
165
48,33±3,54
4,3
210
165
215
160
Y. enterocolitica О9 R-форма № 383 (референтный штамм)
180
150
185
155
30,00±3,26
8,4
180
150
Escherichia coli O78 № 320 (референтный штамм)
190
155
205
165
36,66±6,10
15,0
195
160
E. coli О115 № 580 (референтный штамм)
210
155
200
140
55,00±5,40
12,5
205
155
E. coli О35 (фекалии теленка)
185
155
170
150
21,66±4,72
6,0
180
165
E. coli О115 (фекалии теленка)
155
150
3,33±2,26
10,7
160
155
155
155
E. coli О8 (фекалии теленка)
185
145
190
145
40,00±3,52
9,4
185
150
E. coli О115 (фекалии теленка)
205
190
195
185
11,66±2,35
14,3
200
190
E. coli О26 (фекалии теленка)
195
180
195
180
13,33±6,34
4,5
200
190
E. coli О35 (фекалии теленка)
195
180
210
185
18,33±4,15
12,1
195
180
E. coli О8 (фекалии теленка)
190
190
1,66±1,27
5,9
190
185
185
185
E. coli О35 (фекалии теленка)
205
165
205
160
40,00±3,41
13,2
195
160
E. coli О8 (фекалии теленка)
225
185
220
180
41,66±6,14
11,9
235
190
E. coli О115 (фекалии теленка)
180
175
175
170
3,33±2,26
11,3
180
180
E. coli О115 (фекалии теленка)
175
160
175
160
13,33±5,14
8,7
180
170
П р и м е ч а н и е. При средней разности массы лапок 15,00-34,00 мг штамм характеризуется как слаботоксигенный; 35,00-64,00 мг ? как умеренно токсигенный, 65 мг и более ? как высокотоксигенный.
K. pneumoniae (смыв со слизистой оболочки носовой полости теленка)
Гистохимические изменения в тканях плантарной поверхности лап
при введении токсина Y. pseudotuberculosis характеризовались деструкцией
ороговевшего слоя эпидермиса кожи и общей сосудистой реакцией, отеком и гиперемией соединительной ткани дермы. В сосочковом слое дермы между волокнами рыхлой волокнистой соединительной ткани располагались гомогенные массы экссудата бледно-красного цвета. Гемоциркуляторные изменения проявлялись в виде полнокровия артериол, венул,
капилляров, в просвете сосудов микроциркуляторного русла отмечалась
агрегация эритроцитов и нити фибрина, что свидетельствовало о процессе
тромбообразования, вдоль эндотелия сосудов наблюдалась так называемая
98
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
пограничная локализация лейкоцитов. В сосочковом слое дермы между
волокнами рыхлой волокнистой соединительной ткани находились гомогенные массы экссудата бледно-красного цвета, наблюдалась инфильтрация лейкоцитами (рис. 1, а, б).
Рис. 1. Морфология тканей у лабораторных мышей после введения бактериальной взвеси референтного штамма Yersinia pseudotuberculosis внутрикожно (плантарный тест) и его токсина per
rectum (осветленная культуральная жидкость, тест расширения кишечника): а ? деструкция
ороговевшего слоя эпидермиса плантарной поверхности лап, б ? инфильтрация лейкоцитами
сосочкового слоя дермы плантарной поверхности лап; в ? гидропическая дистрофия энтероцитов кишечника. Окрашивание гематоксилином и эозином, увеличение Ѕ250.
В тесте расширения кишечника с использованием надосадочной
жидкости Y. pseudotuberculosis средние значения коэффициента для тонкого кишечника находились в пределах от 0,070±0,009 до 0,116±0,005. Из
общего числа изученных штаммов 27,7 % характеризовались как токсигенные, 18,1 % ? как слаботоксигенные и 54,5 % ? как нетоксигенные.
Гистохимические изменения при введении токсина энтеробактерий проявлялись в гидропической дистрофии энтероцитов за счет накопления
жидкости в цитоплазме клеток, деструктивно-некротических изменениях,
во всех оболочках тонкого и толстого отдела кишечника наблюдались сосудистые нарушения и инфильтративные явления (см. рис. 1, в).
В целом результаты теста расширения кишечника и плантарного
теста имели высокую степень корреляции (r = 0,96). Вместе с тем недостатком теста расширения кишечника на мышах-сосунках следует
считать бульшую чувствительность и гибель животных при транспортировке и содержании, возможность выбраковки при травме кишечника
при введении материала. Оценка токсигенности энтеробактерий в плантарном тесте онкометрическим методом с использованием плетизмометра позволяет наблюдать развитие экспериментально вызванной реакции у животных за счет изменения объема вытесняемой жидкости из
водной камеры до и через определенный промежуток времени после
введения токсина (12).
Оценка динамики гибели белых мышей при внутрибрюшинном
заражении и интрагастральном введении токсина изолята E. coli О8 и референтного штамма K. pneumoniae № 356 показала, что летальность и
смертность составили 100 % независимо от способа поступления исследуемого материала в организм. При внутрибрюшинном заражении изолятом E. coli О8, выделенным из фекалий 3-суточного теленка с клиническими признаками диареи (I группа), гибель 6 мышей наступила через
24 ч, 4 ? через 48 ч, тогда как при интрагастральном введении токсина
E. coli О8 (II группа) гибель 8 особей регистрировали через 12 ч, 2 ? через 24 ч. При внутрибрюшинном заражении культурой микроорганизмов
референтным штаммом K. pneumoniae № 356 (III группа) гибель 2 мышей
зафиксировали через 24 ч, 8 ? через 48 ч, тогда как при интрагастраль99
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ном введении токсина K. pneumoniae № 356 (IV группа) смерть 4 мышей
наступила через 12 ч, 6 ? через 24 ч. При внутрибрюшинном заражении
ассоциацией эшерихий и клебсиелл (V группа) 3 особи погибли через 6 ч,
7 ? через 12 ч. В целом при введении токсина животные погибали быстрее, чем при заражении культурой микроорганизмов (рис. 2).
Рис. 2. Динамика гибели лабораторных мышей при внутрибрюшинном заражении культурой энтеробактерий или интрагастральном
введении их токсинов: 1 и 2 ? I и II группы,
соответственно культура и токсин изолята Escherichia coli О8 (выделен из фекалий 3-суточного теленка с клиническими признаками диареи); 3 и 4 ? III и IV группы, соответственно культура и токсин Klebsiella pneumoniae (референтный штамм № 356); 5 ? V
группа, введение внутрибрюшинно ассоциации E. coli O8 и K. pneumoniae; 6 ? VI группа
(контроль), введение внутрибрюшинно и интрагастрально стерильного раствора NaCl (0,9 %).
При интрагастральном введении токсина E. coli О8 и K. pneumoniae
клинические признаки болезни развивались в первые 6-8 ч в форме общего тремора, судорог, диареи. Патологоанатомические изменения у мышей, погибших через 12 ч после введения токсина, проявлялись полнокровием печени, почек и селезенки. У всех подопытных животных наблюдали увеличение селезенки и мезентериальных лимфатических узлов в
2-3 раза по сравнению с контролем. У части животных отмечались единичные мелкоточечные кровоизлияния в легких и кровянистое содержание в желчном пузыре. У животных, погибших через 24 ч после поступления токсина, наблюдались явления энтеросорбции, характеризующиеся
резким и неравномерным вздутием петель кишечника, скоплением жидкости в просвете желудка и кишечника. При гистохимическом исследовании патологический процесс при введении токсина характеризовался сочетанием общей сосудистой реакции с дистрофическими и некротическими изменениями во всех внутренних органах. Гемоциркуляторные
изменения проявлялись полнокровием сосудов микроциркуляторного
русла, отмечались признаки серозного отека и лейкоцитарная инфильтрация эпителия и собственной пластинки слизистой оболочки всех отделов
кишечника, в тонком кишечнике зафиксировали проявления гидропической дистрофии энтероцитов (см. рис. 1, в). Наиболее выраженные изменения обнаруживались в печени, селезенке и лимфатических узлах. В печени регистрировали признаки токсической дистрофии (зернистость и
неравномерное окрашивание цитоплазмы гепатоцитов). У части гепатоцитов наблюдалась гипертрофия ядра. В паренхиме имелись многочисленные некротические очажки овальной формы, инфильтрированные полиморфноядерными лейкоцитами. Отмечалось расширение и полнокровие
центральной вены, внутридольковые синусоидные капилляры были заполнены студенистой массой бледно-красного цвета. В селезенке и лимфатических узлах лимфоидные фолликулы были мелкого размера без признаков антигенной реакции.
Учитывая данные литературы о восприимчивости лабораторных
животных к энтеробактериям (13), клинико-гематологические показатели
при внутрибрюшинном заражении референтным штаммом Y. pseudotuberculosis исследовали на морских свинках, изолятом Е. coli О115 ? на
кроликах. Клинические признаки болезни у морских свинок отмечали на
2-е сут после заражения в виде потери аппетита и отказа от корма, конъ100
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
юнктивита, повышения температуры тела до 40 °С, прогрессирующей диареи, через 5 сут у животных наблюдались судороги и паралич конечностей. У кроликов клинические признаки болезни регистрировали через
5 сут после заражения Е. coli О115 (отсутствие аппетита, жажда, цианоз
слизистых оболочек, прогрессирующая диарея). Гематологические и биохимические показатели крови и сыворотки крови у животных при заражении Y. pseudotuberculosis и E. coli О115 характеризовались снижением
содержания гемоглобина, альбумина и глюкозы, повышением гематокрита, числа лейкоцитов, количества билирубина, аланинаминотрансферазы
(АлАТ), аспартатаминотрансферазы (АсАТ) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ),
креатинина, ?-амилазы (табл. 2).
2. Изменение гематологических и биохимических показателей при заражении
морских свинок референтным штаммом Yersinia pseudotuberculosis и кроликов
изолятом Escherichia coli O115 (M±m)
Показатель
Группа лабораторных животных (n = 6)
морские свинки
кролики
опыт
контроль
опыт
контроль
Гемоглобин, г/л
76,0±1,5
Гематокрит, %
56,8±0,5
Лейкоциты, тыс/мкл
28,2±1,6
Эозинофилы, %
2,4±0,3
Базофилы, %
3,3±0,3
Нейтрофилы, %
5,6±0,3
Лимфоциты, %
86,4±0,8
Моноциты, %
2,0±0,5
Билирубин общий, мкмоль/л
1,3±0,2
АсАТ, ед/л
518,0±0,2
АлАТ, ед/л
135,0±0,3
ЛДГ, ед/л
685,0±0,7
Мочевина, моль/л
10,3±1,3
Креатинин, мкмоль/л
54,7±1,3
Общий белок, г/л
25,0±1,8
Альбумин, г/л
38,9±0,6
Щелочная фосфатаза, ед/л
98,0±0,5
1179,0±0,4
?-Амилаза, ед/л
Глюкоза, моль/л
5,0±0,9
П р и м е ч а н и е. АсАТ ? аспартатаминотрансфераза,
дегилргеназа.
Р ? 0,001.
115,0±0,7
98,0±1,2
38,7±1,3
54,7±0,6
11,5±3,2
15,7±0,1
2,5±0,2
1,8±0,6
1,4±0,6
2,6±0,7
3,2±0,5
8,4±0,4
68,8±0,7
38,6±0,6
4,6±0,4
6,1±0,3
0,6±1,5
16,2±1,6
347,0±0,5
156,0±1,2
76,0±1,5
113,0±0,1
456,0+1,4
201,0±1,1
9,1±0,7
9,2±1,1
46,5±1,3
57,8±1,0
47,0±1,4
45,0±1,9
25,7±1,3
53,8±1,0
125,0±1,2
10,5±1,3
786,0±1,1
1235,0±0,3
7,0±1,9
4,0±1,9
АлАТ ? аланинаминотрансфераза,
145,0±0,2
32,6±1,3
9,3±0,3
3,1±0,6
3,6±0,5
6,3±0,4
36,1±0,8
5,2±0,6
1,2±2,6
111,0±1,9
75,0±0,5
130,0±1,7
8,1±1,5
47,5±2,3
53,0±0,3
27,6±1,7
15,0±1,9
325,0±0,5
7,0±1,5
ЛДГ ? лактат-
После интраназального заражения 10-суточных перепелов Coturnix
comuni (n = 12) референтным штаммом Е. coli 1111 (О149:К91:К88) клинические признаки болезни наблюдали через 3 сут в виде прогрессирующей депрессии, жажды, отсутствия аппетита, цианоза слизистых оболочек, в последующие 4-5 сут развивались признаки диареи. Патологоанатомические изменения, обусловленные подострой септикотоксемией, характеризовались геморрагическим энтеритом, серозно-фибринозным перигепатитом, атрофией фабрициевой бурсы, серозно-фибринозным аэросаккулитом, серозно-фибринозным перитонитом.
При гистохимическом исследовании в слизистой оболочке желудка и тонкого отдела кишечника у птиц отмечали разрастание рыхлой волокнистой соединительной ткани, окрашивающейся по Ван-Гизону в красный цвет. В собственной пластинке ворсинок кишечника были видны
скопления бактериальных клеток, окрашенных по Крантцу и Лейшману.
На всем протяжении кишечника наблюдалась резкая гиперемия, выраженный отек подслизистой основы, множественные кровоизлияния, инфильтрация мононуклеарами и псевдоэозинофилами, диффузная лимфоидная пролиферация. В печени выявляли расширение и полнокровие сосудов портальных трактов и центральных вен долек, в расширенных синусоидных капиллярах имелись скопления гиалиноподобной массы и не101
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
многочисленные зерна гемосидерина. В фабрициевой бурсе отмечали набухание многорядного призматического эпителия складок слизистой оболочки; в некоторых клетках встречались мелкие вакуоли; в собственном
слое слизистой оболочки регистрировали признаки отека. Корковое вещество лимфатических фолликулов было истончено, имелись просветленные участки; в мозговом веществе наблюдали очаги деструкции и лизиса
лимфоцитов с явлениями кариопикноза и кариорексиса. При большом
увеличении микроскопа в корковом веществе лимфатических фолликулов
обнаруживались близкорасположенные лимфоциты, мозговое вещество характеризовалось более светлой окраской. Селезенка была вишневого цвета, кровенаполненная, отмечали отек и частичное разволокнение капсулы. В отдельных участках наблюдались опустошения пульпы (как результат нарушения структурных связей элементов), выявлялись гигантские макрофаги. Венозные синусы красной пульпы были расширенными.
В белой пульпе вокруг центральной артерии не отмечали формирования
плотного кольца из лимфоцитов, слои оболочек артерий были разволокненными, в центрах размножения происходила пролиферация лимфоцитов.
У подопытных перепелов по сравнению с контрольными повышалось число лейкоцитов (соответственно 33,9±2,6 и 28,3±3,6 тыс. кл/мкл), лимфоцитов (18,8±0,7 и 15,7±0,8 %), моноцитов (2,8±0,4 и 2,0±0,5 %) и эозинофилов (соответственно 3,08±0,63 и 1,80±0,64 %).
При прогрессирующей диарее на 3-5-е сут после заражения цыплят наблюдались нарушения водно-электролитного баланса. Так, показатели по Na+ (ммоль/л) составили в опыте 128,11±0,32, в контроле ?
154,21±0,33; по К+ (ммоль/л) ? соответственно 33,81±0,23 и 3,97±0,13;
по Cl? (ммоль/л) ? 102,66±0,31 и 101,16±0,42. В первую очередь при потерях ионов натрия развивались компенсаторные изменения кислотнощелочного состояния, при тяжелой дегидратации ? гиперкалиемия. Такие нарушения относятся к тяжелым патоморфологическим синдромам,
особенно при средней и тяжелой степени дегидратации, и будучи нераспознанными и неустраненными, во многом определяют выраженность
клинических признаков, течение и исход заболевания. Ранее мы сообщали, что при доминировании токсигенных энтеробактерий в микробиоценозах кишечника поросят гематологические показатели характеризовались
повышением показателя гематокрита, фагоцитарной активности и общей
окислительно-восстановительной способности лейкоцитов крови (14). Наши результаты изучения изменений, происходящих при патологических
процессах, в целом согласуются с данными других исследователей: например, установлено, что токсины энтеробактерий, адсорбируясь на эпителиальных клетках ворсинок тонкого кишечника, стимулируют аденилатциклазу, поэтому увеличивается концентрация аденозинмонофосфата, усиливающего гиперсекрецию воды и хлоридов в просвет кишечника
и угнетающего резорбцию натрия. Как следствие, просвет кишки переполняется жидкостью, активируется перистальтика кишечника и развивается диарея (15, 16).
Таким образом, при идентификации энтеробактерий, не типируемых по О-антигену, общепринятая схема бактериологического исследования завершается биологической пробой. Восприимчивость лабораторных
моделей зависит от вирулентности возбудителя, дозы, метода введения,
чувствительности к термолабильным и термостабильным токсинам. Так,
при внутрибрюшинном введении белым беспородным мышам бактериальной взвеси результаты воспроизведения болезни на лабораторных и
102
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
естественно восприимчивых животных не коррелируют (16). Установлено,
что энтеротоксигенные (ЕТЕС) штаммы E. coli продуцируют два типа энтеротоксинов ? термолабильный (ТЛЭ) и термостабильный (ТСЭ), различающиеся по структуре, молекулярной массе, иммуногенности, механизмам действия. В настоящее время для оценки ТЛЭ применяют тест
отека лап у белых мышей, кожную пробу на кроликах, реакции агрегации
тромбоцитов, в случае ТСЭ ? инокуляцию 15-суточных куриных эмбрионов и анальную пробу на 15-суточных мышатах-сосунах (5, 16). Однако
вследствие того, что оценка токсического эффекта на лабораторных моделях
сопряжена с определенными трудностями, перспективными для этих целей признаны тест-системы, основанные на методе обратной пассивной
латексной агглютинации, методы иммунодиффузии, позволяющие быстро
определить наличие термостабильного и термолабильного токсинов.
Итак, в наших опытах при оценке токсигенных свойств изолятов
Escherichia coli с применением лабораторных моделей наличие энтеротоксина выявлено у 53,9 % изолятов, при этом умеренно токсигенными и
слаботоксигенными свойствами характеризовались соответственно 15,4 и
38,5 % изолятов, нетоксигенными ? 46,1 %. При экспериментальной токсемии, обусловленной токсинами E. coli и Yersinia pseudotuberculosis, динамика патологических процессов характеризовалась развитием гидропической дистрофии эпителиоцитов ворсинок тонкого отдела кишечника и
развитием общей реакции сосудов микроциркуляторного русла слизистой
оболочки желудка, тонкого и толстого отделов кишечника животных.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
С в е т о ч Э.А. Факторы патогенности возбудителей эшерихиозов сельскохозяйственных
животных. Автореф. докт. дис. М., 1992.
П и р о ж к о в М.К. Биологические препараты для специфической профилактики и терапии эшерихиоза животных. Автореф. докт. дис. М., 2002.
П о з д е е в О.К. Энтеробактерии: руководство для врачей /Под. ред. Р.В Федорова. М., 2007.
B a i n e s D., M a s s o n L., M c A l l i s t e r T.A. Rapid, sensitive method for testing the
activity of Escherichia coli 0157: H7 secreted cytotoxins against epithelial cells from the jejunum and descending colon of cattle. Canad. J. Аnim. Sci., 2008, 88(1): 51-55.
С к о р о д у м о в Д.И., С у б б о т и н В.В., С и д о р о в М.А., К о с т е н к о Т.С. Микробиологическая диагностика бактериальных болезней животных. М., 2005.
Методические указания по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных. М., 2000.
Методические рекомендации по бактериологической диагностике смешанной кишечной
инфекции молодняка животных, вызываемой патогенными энтеробактериями. М., 1999.
Инструкция: эпидемиология, лабораторная диагностика иерсиниозов, организация и
проведение профилактических и противоэпидемических мероприятий. М., 1990.
Ш м о й л о в а Р.А., М и н а ш к и н В.Г., С а д о в н и к о в а Н.А., Ш у в а л о в а Е.Б.
Теория статистики. М., 2006.
К а п у с т и н А.В. Этиологическая структура эшерихиоза кур. Канд. дис. М., 2001.
Т о л п ы г и н М.А. Этиологическая структура эшериихоза пушных зверей и кроликов.
Канд. дис. М., 2006.
З и я м у х а м е д о в а М.М., Н а з а р о в а З.А., Ф а й з у л л а е в а Н.С. Получение
жидкого экстракта ханделии волосолистной. Химико-фармацевтический журнал, 2006,
40(10): 45-47.
П о л о ц к и й Ю.Е., Ц е н е в а Г.Я., Е ф р е м о в В.Е., К л е г а н о в В.К. Моделирование псевдотуберкулезной инфекции. Тр. Института имени Пастера «Болезни с природной очаговостью», 1983, 60: 91-103.
В о л к о в а Е.А., Л е н ч е н к о Е.М. Перспективы совершенствования лабораторной
диагностики желудочно-кишечных болезней поросят, вызываемых энтеробактериями
(Мат. Межд. науч.-практ. конф. «Современные средства и методы диагностики, профилактики и лечения инфекционных, протозойных и микотических болезней сельскохозяйственных и промысловых животных, рыб и пчел»). Тр. ВИЭВ (М.), 2009, 75: 127-132.
З а р о з а В.Г. Эшерихиоз телят. М., 1991: 103-106.
103
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
16. Т и м ч е н к о Н.Ф., Н е д а ш к о в с к а я Е.П., Д о л м а т о в а Л.С., С о м о в а - И с а ч к о в а Л.М. Токсины Yersinia pseudotuberculosis. Владивосток, 2004.
ФГБОУ ВПО Московский государственный
университет пищевых производств,
Поступила в редакцию
3 февраля 2013 года
109316 Россия, г. Москва, ул. Талалихина, 33,
e-mail: [email protected]
CHARACTERIZATION OF TOXIGENIC Enterobacteriaceae
FROM FARM ANIMALS WITH GASTROINTESTINAL DISEASES
E.M. Lenchenko, E.A. Mansurova, A.V. Motorygin
Moscow State University of Food Industry, 33, ul. Talalikhina, Moscow, 109316 Russia, e-mail [email protected]
Received February 3, 2013
Abstract
In most Enterobacteriaceae family bacteria, being the main etiological agents of the diseases in young farm animals, there is no strict correlation between a serological group and toxic activity. Thus, when diagnosing the diseases, a direct identification of the bacterial adhesins or the
toxin detection with the laboratory animals are conducted, and of these two procedures the animal
test is usually long and difficult. We evaluated toxins and virulence in the pathogenic and opportunistic bacteria isolated from 1-5 days Holstein and Black Mottled calves with the diarrhea syndrome,
and in the reference strains using different tests with the laboratory animals (white mice, the Self
line guinea pigs, Chinchilla rabbits, and quail Coturnix comuni). Most of the samples (64 of 86
isolates) were identified as Escherichia coli. In 34 E. coli isolates the O-antigen was not detected.
In the test on white mice, infected intraperitoneally with a bacterial suspension, 35.0 % and 65.0 %
of the bacteria were identified as pathogenic and nonpathogenic, respectively. Nevertheless, the toxins were detected in 53.9 % of the studied isolates and reference strains of Salmonella (2 strains),
Klebsiella (2 strains), Kluyvera (a strain), Yersinia (3 straines), Escherichia (13 strains) genera. Moderate and low toxic properties were identified in 15.4 % and 38.5 % of these isolates, respectively,
and in 46.1 % no toxigenic activity was found. By the histochemical methods, the histomorphological changes in tissues and organs of the laboratory animals were revealed under the experimental
toxicoinfection caused by Enterobacteriaceae. At experimental toxemia, induced by E. coli and Y.
pseudotuberculosis strains, a hydropic dystrophy of the villus epithelium cells developed in the
small intestine, and a generalized microvascular reaction occurred in the gastric mucosa and in
the mucosa of small and large intestines.
Keywords: enterobacteriaceae, gastroenteric diseases, agricultural animals, laboratory
models, toxication.
Новые книги
З ы к и н Л.Ф., Х а п ц е в З.Ю., С п и р я х и н а Т.В. Современные методы в ветеринарной микробиологии. М.: изд-во «КолосС»,
2011, 109 с.
В учебном пособии для вузов описаны современные микробиологические методы применительно к задачам ветеринарных бактериологических, вирусологических
и серологических лабораторий. Основное
внимание уделено ИФА, РИА, ПЦР и др.
Подробно изложена техника постановки
этих реакций, подчеркнуты их преимущества перед традиционными методами, приведены примеры их практического использования. Большой раздел отведен современным селективным средам, тест-системам
для изучения биохимических свойств микроорганизмов, а также методам определения
их чувствительности к антибиотикам. Для
студентов вузов по специальности «Ветеринария», практикующих ветеринарных врачей.
104
Л ы с о в В.Ф., К о с т и н а Т.Е., М а к с и м о в В.И. Этология животных. М.: изд-во
«КолосС», 2010, 296 с.
Учебник освещает систематизированную совокупность современных знаний
по этологии животных. Весь материал разделен на четыре части. Первая часть посвящена изложению общей этологии, вторая ?
частной этологии сельскохозяйственных
животных, третья ? частной этологии домашних животных, четвертая ? методике
выполнения лабораторных и практических
работ по этологии. Материал второй и
третьей частей разделен на основные рубрики по видам животных: этология крупного
рогатого скота, овец, лошадей, свиней, кроликов, птиц, собак, кошек, как взрослых
особей, так и их детенышей. Для студентов
высших учебных заведений по специальностям «Зоотехния» и «Ветеринария», других
биологических специальностей, слушателей
факультетов повышения квалификации.
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, № 2, с. 105-111
УДК 619:636.2-053.31:591.434:579.26
ФОРМИРОВАНИЕ КИШЕЧНОГО МИКРОБИОЦЕНОЗА У ТЕЛЯТ
С СИНДРОМОМ ГИПОТРОФИИ В МОЛОЧНЫЙ ПЕРИОД
А.Г. ШАХОВ, Л.Ю. САШНИНА, Д.В. ФЕДОСОВ, Т.Е. ЕРИНА, Ю.Н. АЛЕХИН
У новорожденных основной причиной развития патологии служит несоответствие между
адаптационной способностью особи и условиями внешней среды. В большей степени это проявляется у животных с врожденным морфофункциональным недоразвитием, поэтому их следует относить в группу риска и организовывать работу с ними с учетом метаболических и иммунологических свойств. У телят с синдромом гипотрофии и наиболее высокой степенью риска проявления
патологии практически не изучены особенности формирования нормального кишечного микробиоза, защитные свойства которого многообразны. В условиях молочно-товарной фермы (Воронежская обл., 2012-2013 годы) мы провели бактериологические исследования фекалий телят, полученных от первотелок голштино-фризской породы немецкой селекции, маточно-вагинальных выделений коров в первые минуты после выведения плода, молозива (молока) на 1-е, 3-и и 7-е сут,
смывов со стен и кормушек, а также воздуха. Установлено, что к основным источникам, формирующим микробоценоз кишечника у новорожденных, относится микрофлора родовых путей коров-матерей, молозива (молока) и окружающей среды. У телят с синдромом гипотрофии в отличие от животных-нормотрофиков на фоне относительно низкого содержания бифидобактерий и
лактобацилл выявлены золотистый стафилококк, доминирование бактерий родов Proteus, Citrobacter, Enterobacter и Enterococcus, что свидетельствует о нарушении формирования нормобиоза.
Ключевые слова: телята, гипотрофия, кишечный микробиоз, индигенная микрофлора.
Болезни новорожденных значительно снижают эффективность животноводства и прежде всего генетически обусловленный потенциал продуктивности. Доминирующий алгоритм развития патологии определяется
несоответствием между адаптационной способностью новорожденного и условиями внешней среды. В большей степени это проявляется у животных
с врожденным морфофункциональным недоразвитием, поэтому их следует
относить в группу риска и организовывать работу с ними с учетом метаболических и иммунологических особенностей (1-4).
Следует отметить, что многие вопросы становления функций органов и систем у животных из группы риска недостаточно изучены. Особенно это касается телят с синдромом гипотрофии (клинически выраженной формы морфофункционального недоразвития) и наиболее высокой
степенью риска проявления патологии. У последних практически не изучены особенности формирования нормального кишечного микробиоза, защитные свойства которого многообразны. Нормальная микрофлора кишечника участвует в формировании колонизационной резистентности организма, пищеварении, оказывает иммуномодулирующий эффект, обладает биосинтетическими, ферментативными, детоксикационными и другими
функциями (5-8).
Известно, что формирование нормального микробиоценоза кишечника у новорожденного начинается с момента прохождения плодом родовых путей матери и ключевую роль при этом играет состояние индигенной
влагалищной экосистемы (1), а в дальнейшем ? своевременно выкармливаемое молозиво, которое обеспечивает организм необходимыми питательными веществами и служит важным иммунозаместительным средством, источником и селективным стимулятором основных представителей нормобиоза (9, 10). Становление последнего во многом зависит также от санитарного состояния среды обитания новорожденных.
Цель нашей работы ? изучить формирование кишечного микробиоценоза у телят с синдромом гипотрофии в молочный период.
105
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
Методика. Исследования проводили в 2012-2013 годах в условиях
молочно-товарной фермы ОАО «Юбилейное» (Воронежская обл.) на телятах, полученных от первотелок голштино-фризской породы немецкой селекции. Для опыта из молодняка отобрали две группы животных: в I группу
вошли телята-гипотрофики (n = 8), во II (группа сравнения) ? животныенормотрофики (n = 8) и соответственно их коровы-матери.
Для бактериологических исследований отбирали фекалии от телят
на 1-е, 3-и и 7-е сут, маточно-вагинальные выделения от коров в первые
минуты после выведения плода, молозиво (молоко) на 1-е, 3-и и 7-е сут,
смывы со стен и кормушек, воздух помещений перед размещением в них
телят. Изучение культурально-морфологических и биохимических свойств
выделенных микроорганизмов проводили общепринятыми методами (11,
12). При определении индекса видовой насыщенности биоценоза (число
видов, входящих в его состав) выявляли участие каждого в образовании
структуры популяции по формуле c = (p/P) Ѕ 100 %, где c ? показатель
постоянства; p ? число наблюдений с выявлением изучаемого вида; P ?
общее число наблюдений. При с > 50 % вид учитывали как постоянный,
при значении 25-50 % ? как добавочный, при величине < 25 % ? как
случайный (13).
Для статистической обработки использовали программу Statistica?99
Edition.
Результаты. На основании обследования новорожденных телят в
первые часы жизни и в 1-суточном возрасте было установлено наличие
гипотрофии у 9,0 % от общего числа полученного молодняка (n = 100).
Заключение о гипотрофии делали на основании клинических и лабораторных тестов (гипопротеинемия, выраженное торможение физиологических рефлексов, склонность к гипотермии, умеренная тахикардия, уменьшение дыхательных объемов, длительное сохранение дисбаланса фаз дыхания и учащенное поверхностное дыхание, не сопровождающееся нарушением его ритма).
1. Показатели распространенности видов микроорганизмов (КОЕ/г и частота, %) в маточно-вагинальных выделениях у коров голштино-фризской породы ? матерей телят-гипотрофиков (I группа) и телят-нормотрофиков (II группа) (Х±х, молочно-товарная ферма ОАО «Юбилейное», Воронежская обл.,
2012-2013 годы)
Вид микроорганизма
Lactobacillus spp.
Bifidobacterium spp.
Corynebacterium spp.
Staphylococcus epidermidis
Staphylococcus saprophyticus
Staphylococcus aureus
Enterococcus faecalis
Streptococcus spp. (гемолитический)
Streptococcus группы С
Escherichia coli
Klebsiella spp.
Proteus spp.
Enterobacter spp.
Группа коров-матерей
I
II
5,0±1,33 (Ѕ107) (100 %)
3,8±0,99 (Ѕ105) (100 %)
3,2±0,12 (Ѕ103) (75 %)
3,3±0,29 (Ѕ105) (75 %)
9,4±0,01 (Ѕ105) (25 %)
5,0±0,01 (Ѕ103) (25 %)
6,2±0,01 (Ѕ106) (50 %)
1,9±0,16 (Ѕ106) (50 %)
2,0±0,01 (Ѕ105) (25 %)
8,9±0,35 (Ѕ105) (75 %)
1,8±0,01 (Ѕ103) (25 %)
25 %
4,7±0,24 (Ѕ105) (50 %)
5,2±1,91 (Ѕ107) (100 %)
5,3±1,18 (Ѕ105) (100 %)
2,0±0,19 (Ѕ105) (75 %)
4,7±0,26 (Ѕ105) (75 %)
4,1±0,01 (Ѕ105) (50 %)
Не выделили
1,7±0,48 (Ѕ106) (50 %)
Не выделили
1,7±0,01 (Ѕ104) (25 %)
2,3±0,18 (Ѕ105) (50 %)
Не выделили
Не выделили
Не выделили
При исследовании микробного пейзажа родовых путей коров после
отела установлено (табл. 1), что у животных из обеих групп в микробных
популяциях постоянно присутствовали лактобациллы и бифидобактерии, а
у животных, от которых получили телят-гипотрофиков, ? также коринебактерии, эпидермальный, золотистый и сапрофитный стафилококк и эшерихии, энтерококки, гемолитические стрептококки, стрептококки группы
106
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
С, энтеробактеры, клебсиеллы и протей. В целом коэффициент видовой
насыщенности, характеризующий микробиоценоз родовых путей у животных, от которых получили телят с синдромом гипотрофии, был выше
(7,00), чем в группе сравнения (5,24). У коров-матерей телят-гипотрофиков численность одного из основных представителей индигенной микрофлоры ? бифидобактерий оказалась в 1,4 раза ниже, чем в группе сравнения, тогда как эшерихий, энтерококков и стрептококков группы С ?
выше соответственно в 3,9; 3,7 и 11,8 раза. Кроме того, следует отметить
достаточно высокую долю золотистого стафилококка и условно-патогенных микроорганизмов (клебсиелл, энтеробактерий, гемолитического стрептококка и протея) в образцах.
Таким образом, в структуре микробной популяции родовых путей
коров после отела были установлены качественные и количественные различия. У животных, от которых получили телят-гипотрофиков, выявлялись добавочные виды: золотистый стафилококк, гемолитический стрептококк, клебсиеллы, энтеробактеры и протей при доминировании эшерихий, энтерококков и стрептококков группы С на фоне относительно низкого содержания бифидобактерий, что свидетельствует о дисбиотическом
состоянии родовых путей.
2. Динамика численности микроорганизмов (КОЕ/г) в молозиве (молоке) у коров голштино-фризской породы ? матерей телят-гипотрофиков (I группа) и
телят-нормотрофиков (II группа) (Х±х, молочно-товарная ферма ОАО
«Юбилейное», Воронежская обл., 2012-2013 годы)
Вид микроорганизма
1-е
Срок исследований после отела, сут
3-и
3,6±0,37Ѕ103 (100 %)
4,5±0,98Ѕ103 (100 %)
5,3±0,61Ѕ103 (100 %)
Bifidobacterium spp.
5,9±0,92Ѕ103 (100 %)
5,2±0,01Ѕ105 (25 %)
Streptococcus lactis
4,4±0,01Ѕ105 (100 %)
2,3±0,50Ѕ103 (50 %)
Staphylococcus saprophyticus
1,9±0,75Ѕ103 (50 %)
1,8±0,01Ѕ103 (25 %)
Staphylococcus epidermidis
6,4±0,01Ѕ103 (25 %)
8,2±0,02Ѕ103 (100 %)
Staphylococcus hyicus
7,9±0,01Ѕ103 (25 %)
Не выделили
Staphylococcus intermedius
Не выделили
Не выделили
Streptococcus dysgalactiae
1,9±0,01Ѕ103 (25 %)
1,5±0,95Ѕ104 (50 %)
Streptococcus agalactiae
Не выделяли
1,1±0,01Ѕ103 (50 %)
Staphylococcus aureus
Не выделили
Не выделили
Streptococcus bovis группы D
Не выделили
4,3±0,38Ѕ104 (50 %)
Escherichia coli
3,6±0,67Ѕ103 (25 %)
П р и м е ч а н и е. Над чертой ? данные для I группы,
Lactobacillus spp.
7-е
3,1±0,16Ѕ103 (100 %)
2,5±0,13Ѕ103 (100 %)
4,3±0,87Ѕ103 (100 %)
3,8±0,15Ѕ103 (100 %)
5,6±0,53Ѕ103 (100 %)
5,1±0,32Ѕ102 (100 %)
4,4±0,29Ѕ103 (100 %)
5,5±0,51Ѕ103 (100 %)
Не выделили
Не выделили
7,2±0,01Ѕ103 (100 %)
Не выделили
1,2±0,01Ѕ104 (25 %)
3,5±0,50Ѕ102 (50 %)
1,7±0,48Ѕ104 (50 %)
4,5±0,22Ѕ103 (75 %)
1,6±0,11Ѕ102 (50 %)
1,7±0,10Ѕ103 (50 %)
Не выделили
Не выделили
Не выделили
Не выделили
Не выделили
Не выделили
Не выделили
Не выделили
Не выделили
7,0±0,01Ѕ102 (25 %)
Не выделили
Не выделили
1,1±0,77Ѕ103 (25 %)
6,2±0,01Ѕ104 (25 %)
4
3,4±0,15Ѕ10 (50 %)
1,7±0,01Ѕ105 (75 %)
Не выделили
Не выделили
6,1±0,01Ѕ103 (50 %)
6,8±0,02Ѕ103 (50 %)
Не выделили
Не выделили
Не выделили
Не выделили
Не выделили
6,1±0,01Ѕ102 (25 %)
5,6±0,26Ѕ103 (50 %)
7,5±0,01Ѕ102 (75 %)
2,1±0,27Ѕ103 (25 %)
2,1±0,01Ѕ102 (25 %)
под чертой ? для II группы.
Изучение микрофлоры молозива через 1 сут после отела показало
(табл. 2), что у коров из I группы численность лактобацилл в образцах в
1,3 раза меньше, чем в группе сравнения. Из него выделяли патогенные микроорганизмы Streptococcus agalactiae и золотистый стафилококк, в 2 раза
чаще и в большем количестве (в 11,9 раза) ? эшерихии, Staphylococcus hyicus ? в 4 раза чаще, реже ? Streptococcus lactis, а при одинаковой частоте
изоляции сапрофитных микроорганизмов Staphylococcus epidermidis и Staphylococcus saprophyticus их содержание было ниже соответственно в 3,6 и
1,2 раза. На 3-и сут в молозиве коров из I группы число бифидобактерий
и лактобацилл не изменялось и при этом было в 1,4 раза ниже, чем в
107
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
группе сравнения, но численность золотистого стафилококка увеличилась
в 6,0 раза и продолжал выделяться Streptococcus agalactiae, хотя и в несколько меньшем (в 1,5 раза) количестве. Частота изоляции эшерихий по
сравнению с фоновым показателем значительно снизилась (в 76,7 раза),
но их численность была в 2,7 раза выше, чем в группе сравнения. Продолжал выделяться Staphylococcus epidermidis, хотя его численность в популяциях уменьшилась в 11,3 раза. При снижении частоты обнаружения Staphylococcus saprophyticus его численность увеличилась в 5,2 раза. На 7-е сут в
молоке коров из I группы частота выделения бифидобактерий уменьшилась в 11, лактобацилл ? в 24 раза и их численность в популяциях была
соответственно в 10,8 и 1,5 раза ниже аналогичного показателя в группе
сравнения. Одновременно возросло число агалактийного стрептококка (в
5 раз) и эпидермального стафилококка (в 10 раз), частота выделения эшерихий (при уменьшении численности в 7,5 раза), Staphylococcus saprophyticus (при уменьшении численности в 3,4 раза).
В целом коэффициент видовой насыщенности микрофлоры молозива (молока) у коров, от которых получили телят-гипотрофиков, во все
сроки исследований был выше (5,5; 4,3 и 5,0), чем в группе сравнения
(4,5; 4,0 и 3,8), имелись и качественные различия. Так, в молозиве (молоке) таких животных независимо от срока исследования обнаруживались
патогенные микроорганизмы ? золотистый стафилококк, агалактийный
стрептококк, доминировали эшерихии и эпидермальный стафилококк на
фоне относительно низкой численности основных представителей индигенной микрофлоры ? лактобацилл, бифидобактерий и молочнокислого
стрептококка. Молозиво (молоко), содержащее золотистый стафилококк,
агалактийный стрептококк, а также высокий титр эшерихии, представляет
собой фактор передачи возбудителей соответствующих инфекций.
Перед размещением новорожденных телят в помещении, предназначенном для их выращивания, микробное число воздуха составило
7,9Ѕ102, что считается допустимым санитарно-бактериологическим показателем (500-1000 м.к./м3). В воздухе были обнаружены бактерии родов
Streptococcus spp. (титр 2,5Ѕ102), Enterococcus spp. (1,9Ѕ102), Micrococcus
spp. (2,3Ѕ102), а также Staphylococcus haemolyticus (1,1Ѕ102). В смывах с
поверхностей стен клеток в 10 % случаев выявлялись Staphylococcus aureus, Escherichia coli штаммы О2, О26, О119, Citrobacter spp., Proteus vulgaris,
в смывах с кормушек ? Salmonella spp., Staphylococcus hyicus, Proteus
vulgaris, что свидетельствует о неэффективности дезинфекции.
При сравнении структуры микробных популяций в толстом отделе кишечника у телят-гипотрофиков и телят-нормотрофиков (табл. 3) установили, что в 1-е сут у особей из I группы титр бифидобактерий и сапрофитных стафилококков оказался ниже (соответственно в 25,4 и 16,2 раза),
численность Enterococcus faecalis и Enterococcus faecium ? выше (в 5,0 и 4,2
раза), титр лактозоположительных эшерихий ? ниже в 1,5 раза, лактозоотрицательных ? выше в 1,6 раза с их соотношением 5,3:1 (в группе сравнения ? 12,5:1). От телят-гипотрофиков выделяли бактерии рода Proteus,
цитробактеры и энтеробактеры. Последние два вида микроорганизмов
также изолировали от нормотрофиков, но их титр оказался меньше соответственно в 1,4 и 1,9 раза.
На 3-и сут у телят-гипотрофиков число бифидобактерий было ниже в 9,9, лактобацилл ? в 72,3 раза, сапрофитных стафилококков ? в
71,8 раза, соотношение лактозоположительных и лактозоотрицательных
эшерихий ? меньше в 5,6 раз на фоне увеличения численности Enterococcus faecium и Enterococcus faecalis соответственно в 17,7 и 5,0 раза. Частота
108
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
выделения бактерий родов Citrobacter и Enterobacter возросла, при этом их
титр был соответс??венно в 13,5 и 53,6 раза выше, чем в группе сравнения.
От телят обеих групп изолировали бактерии рода Proteus.
3. Динамика численности микроорганизмов (КОЕ/г) в фекалиях у телят-гипотрофиков (I группа) и телят-нормотрофиков (II группа) голштино-фризской породы (Х±х, молочно-товарная ферма ОАО «Юбилейное», Воронежская обл., 2012-2013 годы)
Вид микроорганизма
1-е
Возраст, сут
3-и
7-е
(Ѕ105) (100 %) 1,1±0,53 (Ѕ105) (100 %) 5,0±0,14 (Ѕ106) (100 %)
(Ѕ105) (100 %) 8,5±0,77 (Ѕ106) (100 %) 5,0±0,17 (Ѕ107) (100 %)
(Ѕ105) (100 %) 4,7±0,99 (Ѕ107) (100 %) 3,7±0,01 (Ѕ108) (100 %)
Bifidobacterium spp.
(Ѕ107) (100 %) 4,6±0,58 (Ѕ108) (100 %) 3,1±0,12 (Ѕ109) (100 %)
(Ѕ104) (100 %) 2,3±0,44 (Ѕ105) (100 %) 6,5±0,40 (Ѕ107) (100 %)
?
Escheriсhia coli (Л )
(Ѕ104) (100 %) 1,1±0,10 (Ѕ104) (100 %) 2,3±0,48 (Ѕ106) (100 %)
(Ѕ105) (100 %) 3,1±0,18 (Ѕ106) (100 %) 3,9±0,96 (Ѕ108) (100 %)
+
E. coli (Л )
(Ѕ105) (100 %) 8,1±0,32 (Ѕ106) (100 %) 4,5±0,16 (Ѕ107) (100 %)
5,3:1
13,6:1
7,1:1
?
+
E. coli (Л ):E. coli (Л )
12,5:1
73,6:1
19,6:1
2
4
3,9±0,57 (Ѕ10 ) (100 %) 1,7±0,31 (Ѕ105) (100 %)
6,8±0,65 (Ѕ10 ) (50 %)
Citrobacter
4,8±0,45 (Ѕ102) (50 %)
2,9±0,83 (Ѕ103) (75 %)
3,0±0,22 (Ѕ103) (75 %)
3,5±0,11 (Ѕ102) (50 %)
1,5±0,14 (Ѕ105) (100 %) 2,5±0,28 (Ѕ105) (100 %)
Enterobacter
1,8±0,03 (Ѕ102) (25 %)
2,8±0,17 (Ѕ102) (75 %)
3,1±0,24 (Ѕ103) (75 %)
1,7±0,66 (Ѕ104) (100 %) 3,9±0,46 (Ѕ105) (100 %) 4,5±0,31 (Ѕ105) (100 %)
Enterococcus faecium
3,4±0,97 (Ѕ103) (100 %) 2,2±0,14 (Ѕ104) (100 %) 2,1±0,15 (Ѕ105) (100 %)
3,2±0,17 (Ѕ104) (100 %) 2,4±1,03 (Ѕ105) (100 %) 1,9±1,10 (Ѕ107) (100 %)
Enterococcus faecalis
7,6±0,45 (Ѕ103) (100 %) 4,8±0,16 (Ѕ104) (100 %) 5,1±0,19 (Ѕ104) (100 %)
Не выделили
Не выделили
8,1±0,64 (Ѕ102) (75 %)
Staphylococcus aureus
Не выделили
Не выделили
Не выделили
25 %
25 %
50 %
Proteus
Не выделили
25 %
Не выделили
2
2
Staphylococcus (saprophyicus,
2,9±0,23 (Ѕ10 ) (100 %) 3,9±0,27 (Ѕ10 ) (100 %) 4,5±0,38 (Ѕ103) (100 %)
еpidermidis)
4,7±0,56 (Ѕ103) (100 %) 2,8±0,15 (Ѕ104) (100 %) 2,0±0,93 (Ѕ105) (100 %)
П р и м е ч а н и е. Над чертой ? данные для I группы, под чертой ? для II группы; Л? и Л+ ? соответственно лактозоотрицательные и лактозоположительные штаммы.
Lactobacillus spp.
3,5±0,34
3,1±0,72
2,4±0,19
6,1±0,13
4,5±0,65
2,8±0,23
2,4±0,59
3,5±0,73
На 7-е сут у телят-гипотрофиков количество бифидобактерий и
лактобацилл оказалось ниже, чем в группе сравнения, соответственно в
8,4 и 9,9 раза, но возросла численность Enterococcus faecalis в 38,2 раза, бактерий родов Citrobacter и Enterobacter ? соответственно в 56,7 и 41,0 раза,
лактозоположительных и лактозоотрицательных эшерихий ? в 8,7 и 28,3
раза при их соотношении 7,1:1 (в группе сравнения ? 19,6:1). Помимо
этого, у гипотрофиков обнаружили золотистый стафилококк и бактерии
рода Proteus, в то время как от животных-нормотрофиков их не выделили.
В целом коэффициент видовой насыщенности, характеризующий
микробиоценоз кишечника, у телят с синдромом гипотрофии составил
10,3; у нормотрофиков ? 9,3.
Таким образом, микробиоценоз кишечника у новорожденных телят
формировался в основном при участии микрофлоры родовых путей коровматерей, молозива (молока) и окружающей среды. У животных с разным
морфофункциональным развитием при относительно одинаковой видовой
насыщенности микробиоценоза выявлены некоторые качественные различия. В частности, у телят-гипотрофиков (в отличие от нормотрофиков) установлено более значимое положение Staphylococcus aureus, бактерий родов
Proteus, Citrobacter, Enterobacter, Enterococcus, лактозонегативных эшерихий
на фоне относительно низкой численности главных представителей индигенной микрофлоры ? бифидобактерий и лактобацилл. Этот факт свидетельствует о нарушении формирования нормобиоза и наличии у обследованного молодняка дисбактериоза, клинически проявившегося у большинства животных диарейным синдромом, длительность которого составила 5,5±0,3 сут (в группе сравнения ? только у 25,0 % при длительности
109
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
2,4±0,5 сут).
Итак, нарушения антенатального развития телят и формирования
нормальной микрофлоры кишечника в период новорожденности, обусловленные дисбиозом родовых путей коров-матерей, контаминацией молозива (молока) и среды обитания потенциально патогенными микроорганизмами, повышают риск возникновения желудочно-кишечных болезней. Для
его снижения необходим комплекс мероприятий, обеспечивающих преобладание основных представителей индигенной микрофлоры ? бифидобактерий и лактобацилл в кишечном микробиоценозе у молодняка.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
Д о н н и к И.М., С м и р н о в П.Н. Экология и здоровье животных. Екатеринбург, 2001.
А л е х и н Ю.Н., З о л о т а р е в А.И. Актуальные вопросы получения жизнеспособного
приплода крупного рогатого скота и пути повышения его сохранности. Мат. межд. науч.-практ. конф. «Современные проблемы ветеринарного акушерства и биотехнологии
воспроизведения животных», Воронеж, 2012: 48-56.
Ш а х о в А.Г., А н у ф р и е в А.И., С у л е й м а н о в С.М., К о с т ы н а М.А., А л е х и н Ю.Н., А н т и п о в В.А., Т е р е х о в В.И. Желудочно-кишечные болезни телят. В
сб.: Комплексная экологически безопасная система ветеринарной защиты здоровья животных: методические рекомендации. М., 2000: 109-133.
А л е х и н Ю.Н. Методы диагностики перинатальной патологии у крупного рогатого
скота: методическое пособие. Воронеж, 2013.
Я н к о в с к и й Д.С. Микробная экология человека: современные возможности ее поддержания и восстановления. Киев, Украина, 2005.
К р а м а р е в С.А., В ы г о в с к а я О.В., Я н к о в с к и й Д.С., Д ы м е н т Г.С. Защитные функции микрофлоры кишечника. Здоровье ребенка, 2008, 2(11): 3-8.
А р д а т с к а я М.Д. Дисбактериоз кишечника: понятие, диагностика, принципы лечебной коррекции. Consilium medicum, 2008, 10(8): 86-92.
Ф и с и н и н В.И., С у р а й П. Кишечный иммунитет у птиц: факты и размышления
(обзор). Сельскохозяйственная биология, 2013, 4: 3-25.
М е л ь н и к о в В.Г., А б р а м о в В.М., Х л е б н и к о в В.С., Ч и к и л е в а И.О., В а с и л е н к о Р.Н., К о с а р е в И.В., С а к к у л и н В.К., О в и н о в а Г.Р., З а х а р о в а И.Н., К и с е л е в с к и й М.В., З а п о р о ж е ц Т.С., К у з н е ц о в а Т.А. Восстановление микробного баланса матери как оптимальный путь профилактики врожденного
дисбиоза у детей. Тихоокеанский медицинский журнал, 2012, 1: 20-22.
Я н к о в с к и й Д.С. Состав и функции микробиоценозов различных биотопов человека.
Здоровье женщины, 2003, 16(4): 145-158.
С и д о р о в М.А., С к о р о д у м о в Д.И., Ф е д о т о в В.Б. Определитель зоопатогенных
микроорганизмов. М., 1995.
Г о р к о в е н к о Н.Е., М а к а р о в Ю.А., К у з ь м е н к о А.М. Количественная оценка
кишечного микробиоценоза телят. Труды ВИЭВ, 2009, 75: 176-177.
З а х а р о в а Е.А., А з и з о в И.С. Микроэкологическая характеристика кишечного микробиоценоза часто болеющих детей. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии, 2012, 2: 63-68.
ГНУ Всероссийский научно-исследовательский
ветеринарный институт патологии, фармакологии
и терапии Россельхозакадемии,
Поступила в редакцию
11 декабря 2012 года
394087 Россия, г. Воронеж, ул. Ломоносова, 114-б,
е-mail: [email protected]
INTESTINAL MICROBIOSIS IN HYPOTROPHIC MILK-FED CALVES
A.G. Shakhov, L.Yu. Sashina, D.V. Fedosov, T.E. Erina, Yu.N. Alekhin
All-Russian Research Veterinary Institute of Pathology, Pharmacology and Therapy, Russian Academy of Agricultural
Sciences, 114-b, ul. Lomonosova, Voronezh, 394087 Russia, е-mail [email protected]
Received December 11, 2012
Abstract
A lot of pathologies in the newborn calves occur due to lack of their adaptability to the environment. This is more evident in the animals with an inborn morphofunctional hypogenesis, there-
110
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
fore they should be identified as a risk group and cared in accordance with their metabolic and immune specificity. The risk of pathology is the highest in hypotrophic calves, but in fact the natural
formation of their intestinal microbiosis, which is known to have the multiple defensive functions,
has been little studied. In our investigations, conducted at a commercial dairy farm in the Voronezh
region in 2012-2013, the microbiological analysis was carried out to test the bacterial patterns in the
feces from calves of the first-calf German Holstein-Frisian cows, in the mother-cow?s utero-vaginal
excretions during first few minutes after the removal of fetus, in the colostrum and milk 1, 3, and 7
days after the delivery, and also in the washings from walls and feeders, and in air samples. The intestinal microbiosis of the newborn calves was found to be mainly determined by the microbial patterns of the mother-cow genital tract, by the microflora of colostrum and milk, and also by the environment. In hypothrophic calves, when compared to their good developed peers, the number of bifidobacteria and lactobacilli was relatively low, Staphylococcus auerus was identified, and Proteus,
Citrobacter, Enterobacter and Enterococcus bacteria predominated, indicating the imbalance and disturbances in the intestinal microbiosis.
Keywords: calves, hypotrophy, intestinal microbiosis, autochtonous microflora.
Адрес сайта журнала в Интернете ? www.agrobiology.ru
Статьи, события, информация ? 7500 просмотров за месяц
73 % ? посетители из России, около 7 % ? из США и Канады, 20 % ?
из других стран
111
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, № 2, с. 112-117
УДК: 619:636.934.55:616.62-002:616.62-008.222:591.8
ЦИСТИТ КАК ВЕРОЯТНЫЙ ЭТИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКТОР
СИНДРОМА НЕДЕРЖАНИЯ МОЧИ У СОБОЛЕЙ
В.Е. СОБОЛЕВ1, С.И. ЖДАНОВ2
В статье рассматриваются гистологические изменения мочевого пузыря с патологоанатомическими признаками цистита у молодняка соболя черного в возрасте 7 мес при синдроме
недержания мочи. Недержание мочи у соболей («wet belly», «мокрое брюшко», «подмокание») ?
заболевание пушных зверей, проявляющееся непроизвольным мочеиспусканием. Ранее в наших исследованиях показано, что недержание мочи у соболей («подмокание») ? основной симптом заболевания, наряду с которым у больных животных наблюдается анемия, потеря мышечной массы,
анорексия, воспалительные процессы в желудочно-кишечном тракте. В рамках настоящей работы
при патолого-анатомическом исследовании внутренних органов у молодняка соболя черного (76
гол.) с клиническими признаками недержания мочи в 28 % случаев у самцов и в 41 % случаев у
самок выявлен цистит в катаральной или геморрагической форме. По сравнению с клинически
здоровыми животными у больных соболей методами количественной морфометрии обнаружены
статистически значимые отличия в морфологии мочевого пузыря. Наиболее существенные из
них ? уменьшение толщины слизистой и мышечной оболочки мочевого пузыря, что, вероятно,
связано с такими нарушениями его функции, как атония и дилатация. С помощью гистохимических методов в собственной пластинке мочевого пузыря у больных животных выявлены признаки
накопления гликозаминогликанов, свидетельствующие об активации локальных защитных механизмов вследствие развития воспалительного процесса. Полученные в настоящем исследовании
результаты подтверждают гипотезу о наличии у значительной части (до 40 %) животных с синдромом недержания мочи воспалительного процесса в мочевом пузыре.
Ключевые слова: соболь, цистит, недержание мочи, «подмокание», морфометрия.
В отечественной и зарубежной ветеринарной литературе обозначение рассматриваемого в настоящей статье заболевания пушных зверей существенно различается. В Российской Федерации наиболее часто используется термин «подмокание», подразумевающий нарушение мочеотделения
у самцов норок и соболей и непроизвольное мочеиспускание (1). Он не
вполне корректен, поскольку не отражает область развития патологического процесса и, как следствие, более информативен для специалистов
звероводческой отрасли. В иностранной литературе предлагается дефиниция «wet belly», или мокрое брюшко, ? заболевание, проявляющееся недержанием мочи у пушных зверей и сопровождающееся повреждением
кожи и меха в области живота (2). Второе определение точнее указывает
на область развития патологического процесса, однако и оно отражает
только основной симптом заболевания (повреждение непроизвольно выделяющейся мочой меха и кожи в области живота), не описывая главный
элемент патогенеза ? недержание мочи.
В этой связи мы предлагаем использование более точного на наш
взгляд термина ? «синдром недержания мочи» (СНМ). Как показали наши наблюдения за больными животными, повреждение мочой кожи и меха зверей в области живота вследствие недержания мочи ? основное, но
не единственное проявление патологии (3). Авторы осознают, что термин
СНМ, по сути обозначающий совокупность симптомов при подмокании у
соболей, не оптимален и, вероятно, будет пересмотрен в случае определения главного этиологического фактора заболевания, который в настоящее
время не известен.
Синдром недержания мочи (подмокание) наблюдается преимущественно у молодняка пушных зверей, в том числе у норок и соболей.
Большинство публикаций, в которых обсуждаются возможные этиологи112
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ческие и патогенетические факторы заболевания wet belly у норок, относится к 1960-1970 годам. Так, в качестве вероятных этиологических факторов зарубежными исследователями рассматривались компоненты рационов, климатические условия, наследственность, технологии выращивания,
а также микроорганизмы.
Наибольшее число работ посвящено изучению влияния условий
кормления на заболеваемость животных. В частности, установлена повышенная частота патологии у норок, в рационе которых доля кальция увеличена до 1,03 % и кальциево-фосфорное отношение составляет 2:1 (4).
При повышении содержания жира в рационе норок с 4,6 до 8,6 % более
чем в 5 раз возрастает частота патологии у животных (5). В руководствах
по кормлению и выращиванию норок, изданных за рубежом (5, 6), отмечается роль неблагоприятных климатических условий, повышенной температуры окружающей среды и параметров микроклимата на рост числа
случаев wet belly у норок.
Зарубежными учеными (7, 8) проводились патолого-анатомические
исследования органов мочевыделительной системы и кожи у больных норок, однако подобную информацию об изучении заболевания у соболей в
доступной научной литературе нам обнаружить не удалось.
Следует отметить, что сведения о воспалительном процессе в мочевом пузыре у пушных зверей с синдромом недержания мочи также практически отсутствуют в современной научной литературе. В работе R.E. Bostrom с соавт. (7), посвященной изучению гистологических изменений в
органах мочевыделительной системы у норок, обнаружена жировая дистрофия почек, уменьшение размеров почечных клубочков, а также признаки сквамозной метаплазии переходного эпителия простатической части
уретры. Признаки воспалительного процесса в уретре и мочевом пузыре у
больных зверей выявлены не были.
В этой связи представляет интерес изучение клинической роли
цистита как потенциального этиологического фактора и его возможное
влияние на развитие синдрома недержания мочи у пушных зверей.
Цель нашей работы ? изучить гистологические изменения в тканях
мочевого пузыря у соболей с синдромом недержания мочи при клинических и патолого-анатомических признаках цистита и с помощью методов
количественной морфометрии оценить характер повреждений этих тканей.
Методика. Наблюдения выполняли в период с 2009 по 2011 год в
звероводческом хозяйстве «Заря» (Ленинградская обл.) на молодняке соболя черного (возраст ? 7 мес). Было проведено патолого-анатомическое
вскрытие 76 особей (64 самца и 12 самок) с диагнозом СНМ. Для сравнительного анализа гистологических изменений в мочевом пузыре выборку
животных, подвергнутых аутопсии (n = 76), разделили на три группы: I ?
контрольная (проявления патологии отсутствовали), II и III ? особи с
различными клиническими признаками заболевания и патологическими
изменениями в мочевом пузыре.
Мочевые пузыри животных фиксировали в жидкости Карнуа (9).
Гистологические срезы мочевого пузыря толщиной 5-7 мкм готовили на
роторном микротоме Slee Cut 5062 («Mainz©», Германия). Срезы окрашивали гематоксилином и эозином, альциановым синим, а также по методу
Хейла для выявления мукополисахаридов (9). Препараты изучали с помощью микроскопа Zeiss Axio Observer A1 («Сarl Zeiss Group», Германия),
микрофотографии получали с использованием устройства захвата изображения Penguin 150 CL («Pixera©», Япония). Морфометрические измерения
в срезах мочевого пузыря проводили в программе Видеотест-размер v. 5.0.
113
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
Обработку данных выполняли в программе GraphPad Prizm v. 5.0
для Windows XP в соответствии с рекомендациями по медико-биологической статистике (2). Нормальность распределения выборки проверяли с
помощью теста Шапиро-Уилка. Полученные данные оценивали методами
описательной статистики с определением средних значений и стандартного
отклонения в формате М±s. Статистическую значимость различий показателей сравниваемых групп определяли методом однофакторного дисперсионного анализа (2). Для сравнения парных выборок, не отвечающих критериям нормальности, использовали
U-критерий Манна-Уитни. Различия сравниваемых показателей считали статистически значимыми при
р < 0,05.
Результаты. При патологоанатомическом вскрытии 76 молодых
соболей с диагнозом СНМ у 28,1 %
самцов и 41,6 % самок диагностировали цистит в форме катарального
или геморрагического воспалительного процесса (секционный материал, полученный от особей соответственно из II и III группы). Патологических изменений в других органах мочевыделительной системы
не выявили.
При секционном осмотре материала установили, что в отличие
от здоровых животных (контрольная
группа) у соболей из II и III группы
Рис. 1. Геморрагический цистит у 7-месячного
в мочевых пузырях содержалось сусамца соболя черного с синдромом недержания
мочи: 1 ? мочевой пузырь, 2 ? геморрагиче- щественно большее количество осский участок (звероводческое хозяйство «За- таточной мочи. У животных с геря», Ленинградская обл., 2011 год).
моррагическим циститом (III группа) наблюдали признаки устойчивой дилатации мочевого пузыря (рис. 1;
представлен мочевой пузырь с участком геморрагического воспаления
в виде локально-очагового кровоизлияния).
При изучении гистологических срезов мочевого пузыря у больных соболей из III группы выявили
геморрагические участки с дегенеративными изменениями структуры соединительной ткани подслизистой
основы и мышечных волокон в мышечной оболочке органа (рис. 2).
Рис. 2. Гистологический срез мочевого пузыря
При окрашивании срезов по
7-месячного самца соболя черного с синдромом
недержания мочи и проявлением геморрагиче- Хейлу и альциановым синим отмеского цистита: 1 ? эпителий; 2 ? геморраги- чали интенсивное связывание краческие участки. Окрашивание по методу Хей- сителя с собственной пластинкой
ла, увеличение Ѕ246 (звероводческое хозяйстслизистой оболочки (см. рис. 2).
во «Заря», Ленинградская обл., 2011 год).
Этот факт, вероятно, указывает на
накопление гликозаминогликанов, которые, как известно, защищают сли114
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
зистую оболочку мочевого пузыря от воздействия повреждающих факторов (10). Для количественной оценки содержания мукополисахаридов в
слизистой оболочке мочевого пузыря необходимы дальнейшие биохимические исследования крови и мочи у животных с СНМ.
Методами количественной морфометрии у здоровых и больных
животных были выявлены статистически значимые различия по ряду линейных и объемных характеристик тканей и клеток в срезах мочевого пузыря (табл.).
Результаты оценки морфометрических показателей мочевого пузыря у 7-месячных соболей черных с синдромом недержания мочи и различными проявлениями цистита (животные, M±s; звероводческое хозяйство «Заря», Ленинградская обл., 2011 год)
Показатель
I (контроль)
Группа животных
II
III
Гистометрические показатели
Толщина слизистой оболочки, мкм
130,7±33,4
47,9±6,2**
48,7±7,2**
Толщина собственной пластинки, мкм
71,0±6,9
123,3±24,6**
55,0±5,9*
Толщина подслизистой основы, мкм
141,9±19,1
84,3±9,1*
53,8±7,2**
834,9±101,2*
340,3±50,2**
Толщина мышечной оболочки, мкм
1276,0±340,3
Цитометрические показатели
2
Площадь эпителиоцита, мкм
252,1±110,6
601,9±165,0**
677,9±173,1**
719,8±468,7
909,1±520,0
2297±1076**
Объем ядра эпителиоцита, мкм3
Объем эпителиоцита, мкм3
2098±1514
9763±3734**
11526±4661**
ЯЦО
0,61±0,15
0,87±0,07**
0,72±0,09
П р и м е ч а н и е. У животных из II и III группы при вскрытии отмечали признаки соответственно катарального и геморрагического цистита; к I группе относили здоровых особей. ЯЦО ? ядерно-цитоплазматическое отношение.
* р < 0,05; ** р < 0,01 по сравнению с показателями в I группе.
Представленные данные позволяют выявить некоторые закономерности в сравниваемых показателях (см. табл.). Так, у животных из II и III
группы слизистая оболочка и подслизистая основа, представленная элементами рыхлой соединительной ткани, была значительно тоньше, чем в
контрольной группе. Истончение слизистой объясняется усилением эксфолиации эпителиальных клеток под влиянием воспалительного процесса в мочевом пузыре. У животных из II группы наблюдалось утолщение и
отек собственной пластинки слизистой оболочки, характерные для катарального воспалительного процесса. Уменьшение толщины мышечной оболочки мочевого пузыря у соболей из II и III групп отражало его функциональную неполноценность, в частности атонию и последующую дилатацию.
Рис. 3. Срез стенки мочевого пузыря у соболя черного с синдромом недержания мочи и катаральным циститом (слева) и у здорового животного (справа): 1 ? слизистая оболочка, 2 ?
собственная пластинка, 3 ? подслизистая основа, 4 ? мышечная оболочка. Окрашивание
альциановым синим, увеличение Ѕ103 (7-месячные особи; звероводческое хозяйство «Заря»,
Ленинградская обл., 2011 год).
При развитии катарального воспалительного процесса в мочевом
115
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
пузыре происходило растяжение мышечных волокон продольного слоя
мышечной оболочки (рис. 3, А), что наглядно проявлялось, если сравнить
с мочевым пузырем здоровых животных (см. рис. 3, Б). Значительный
объем остаточной мочи в мочевом пузыре у особей из II и III группы служит вероятным резервуаром для развития инфекции и повреждения слизистой оболочки.
Цитометрические и кариометрические показатели эпителиоцитов
мочевого пузыря соболей из II и III группы, как видно из представленных
в таблице данных, отличались от контрольных при высоком уровне значимости. Клетки эпителия у больных животных имели большую площадь
и объем. Ядерно-цитоплазматическое отношение (ЯЦО) было существенно выше в эпителиальных клетках мочевого пузыря у соболей из II группы. Подобное увеличение ЯЦО может свидетельствовать о перестройке
внутриклеточной архитектоники эпителиальных клеток под влиянием
факторов воспалительного процесса. Следует отметить, что у зверей из
III группы показатель ЯЦО для переходного эпителия мочевого пузыря
незначительно отличался от такового в группе сравнения. Это различие,
по-видимому, обусловлено областью воздействия повреждающих факторов. Если у животных из II группы развитие катарального воспалительного процесса было связано с повреждением слизистой оболочки, то у соболей из III группы очаговый геморрагический цистит развивался в подслизистой основе и мышечном слое мочевого пузыря ? структурах, которые,
как известно, хорошо снабжены системой кровеносных сосудов. Нарушение проницаемости сосудистой стенки стало в описанном случае одним из
звеньев патогенеза геморрагического цистита.
Результаты проведенных исследований в целом подтверждают гипотезу о наличии воспалительного процесса в мочевом пузыре у животных, который может обусловливать развитие синдрома недержания мочи у
молодняка соболя. В то же время необходимо дальнейшее изучение этиологии и патогенеза заболевания в связи с тем, что в наших экспериментах
воспалительный процесс в мочевом пузыре выявлен в 28 % случаев у самцов и в 41 % ? у самок. Подобная статистика не исключает влияния других возможных этиологических факторов.
Таким образом, нами впервые получена информация о гистологических изменениях мочевого пузыря у соболей с синдромом недержания мочи, сопровождающимся патолого-анатомическими признаками цистита. С
помощью гистохимического исследования обнаружены признаки накопления гликозаминогликанов в собственной пластинке мочевого пузыря у
больных животных, что свидетельствует об активации слизистой оболочкой
ее защитных свойств под влиянием факторов воспалительного процесса.
Выявлены статистически значимые различия в морфологии мочевого пузыря у соболей при недержании мочи, в частности уменьшение толщины слизистой и мышечной оболочки мочевого пузыря у больных животных, что,
по-видимому, обусловлено развитием функциональных нарушений, таких
как атония и дилатация мочевого пузыря, наблюдаемых у некоторых особей
при секционном осмотре мочевого пузыря. Уменьшение толщины слизистой оболочки у больных животных, вероятно, указывает на усиление десквамации переходного эпителия под влиянием воспалительного процесса.
ЛИТЕРАТУРА
1.
116
Д а н и л е в с к и й В.М., З а б а л у е в Г.И. Словарь ветеринарных терапевтических терминов. М., 1989.
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
2.
3.
Г л а н ц С. Медико-биологическая статистика /Пер. с англ. Ю.А. Данилова. М., 1999.
С о б о л е в В.Е., Ж д а н о в С.И. Патологоанатомическая картина при синдроме недержания мочи у соболей. Ветеринарная патология, 2012, 2: 95-98.
4. A u l e r i c h R., S h e l t s G., S c h a i b i e P.J. Influence of the dietary calcium level on the
incidence of urinary incontinence and «wet belly» in mink. Michigan Quarterly bulletin, 1963,
45(3): 444-449.
5. A u l e r i c h R., S c h a i b i e P.J. The use of spent chickens for mink feeding. Michigan Quarterly bulletin, 1965, 47(3): 451-458.
6. Experiments in mink nutrition: progress report 1963. Agricult. Exp. St. Oregon St. University, 1964.
7. B o s t r o m R.E., A u l e r i c h R.J., S c h a i b i e P.J. Histological observation on the urinary
system of male mink affected with «wet belly». Michigan Quaterly Bulletin, 1967, 50(1): 100-105.
8. B o s t r o m R.E., A u l e r i c h R.J., S c h a i b i e P.J. Histological features of inguinal skin of
«wet belly» and normal mink (Mustella vision). Am. J. Vet. Res., 1967, 28(126): 1549-1554.
9. Л у п п а Х. Основы гистохимии. М., 1980.
10. B h a v a n a n d a n V.P. Glycosaminoglycans and glycoproteins of animal bladder. J. Connect.
Tissue, 2001, 33(3): 245-252.
1ФГУП
НИИ гигиены, профпатологии и экологии
человека Федерального медико-биологического
агентства России,
Поступила в редакцию
14 мая 2012 года
188663 Россия, Ленинградская обл., Всеволожский р-н,
ж/д станция Капитолово, пос. Кузьмоловский, корп. 93,
e-mail: [email protected];
2ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургская государственная
академия ветеринарной медицины,
196084 Россия, г. Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5,
e-mail: [email protected]
CYSTITIS: AN ETIOLOGICAL FACTOR FOR SYNDROME OF URINARY
INCONTINENCE IN FUR BEARING ANIMALS
V.E. Sobolev1, S.I. Zhdanov2
1Research
Institute of Hygiene, Occupational Pathology and Human Ecology, 93, pos. Kuz'molovskii, st. Kapitolovo,
Vsevolozhskii Region, Leningrad Province, 188663 Russia, e-mail [email protected];
State Veterinary Academy, 5, ul. Chernigovskaya, St.-Petersburg, 196084 Russia,
e-mail [email protected]
Received May 14, 2012
2Saint-Petersburg
Abstract
«Wet belly» disease of fur animals, the sables particularly, has little been studied, and the
data have been mostly limited to publications in 1960-1970. In our examinations carried out earlier
on the sables with urinary incontinence, the incidence of anemia, anorexia, the inflammation in gastrointestinal tract, and the weight loss were also found, indicating the urinary incontinence not to be
the only symptom of the disease. This article gives new information for histological changes in the
urinary bladder of 7-month black sables, injured by «wet belly» (a «syndrome of urinary incontinence»). The catharal and haemorrhagical cystitis were indicated as possible etiological factors of the
disease. Post-mortem examination of 76 sables with «wet belly», or «syndrome of urinary incontinence», showed that 28 % of the males, and 41 % of the females have various types of inflammation
in the urinary bladder. Using morphometric analysis, a loss of the urinary bladder mucosa and muscle layer was demonstrated in the urinary bladder of sick animals if compared to healthy sables. Authors suggest that the phenomenon is probably related to high epithelium exfoliation and bladder
dysfunction, such as atony and dilatation in the muscle layer of urinary bladder. In the young sables,
injured by haemorrhagic cystitis with the symptoms of «wet belly» disease, an increase of glycosaminoglycans in the urinary bladder tissue was detected by hystochemical methods, indicating activation
of local defense mechanisms due to the inflammation. These facts support a hypothesis, whereby a
various form of cystitis may account for the development of «wet belly» disease in young sables.
Keywords: sable, cystitis, urinary incontinence, «wet belly», morphometry.
Научные собрания
FORUM FOR INNOVATIONS IN AGRICULTURE GFIA 2014
(3-5 февраля 2014 года, Абу Даби, ОАЭ)
Форум призван объединить усилия ведущих ученых, практических специалистов и инвесторов для решений в связи с глобальными вызовами, с которыми сталкивается человечество.
Контакты и информация: http://www.innivationsinagriculture.com
117
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, № 2, с. 118-122
Кормопроизводство: биологические основы и технологии
УДК 636.085:633.34:631.524.84:[631.461.5+631.466.12
ПОВЫШЕНИЕ ПРОДУКТИВНОСТИ И КАЧЕСТВА СЕМЯН СОИ
ЗА СЧЕТ ИНТЕНСИФИКАЦИИ АЗОТФИКСАЦИИ
Н.В. ПАРАХИН1, А.А. ОСИН1, М.В. ДОНСКАЯ2, А.А. ОСИН2
Применение биопрепаратов, повышающих симбиотическую азотфиксацию, урожайность
и качество бобовых культур, ? один из современных приемов, который позволяет разрабатывать
энергосберегающие, экологически безопасные технологии кормопроизводства, учитывающие природные особенности региона и обеспечивающие устойчивое развитие отрасли. В полевых опытах
в условиях Среднерусской лесостепи оценивали урожайность и качество семян у сои ультраскороспелого сорта Магева на фоне разных доз азотно-фосфорно-калийных удобрений при совместной инокуляции растений клубеньковыми бактериями (Bradiorhizobium japonicum) и эндомикоризным грибом (Glomus intraradices). Определяли численность и массу клубеньков, их нитрогеназную
активность и количество фиксированного азота воздуха. Биопрепараты на основе азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, применяемые совместно без удобрений и на фоне
расчетных норм фосфорно-калийных удобрений, в значительной степени способствовали повышению симбиотической активности у растений сои, усилению биологической фиксации азота воздуха, росту урожайности и улучшению качества семян. Так, фосфорно-калийные удобрения повысили нодуляцию растений, а количество биологически фиксированного азота возросло в 3,0 раза
по сравнению с контролем. При инокуляции с применением ризоторфина и гломуса без внесения
удобрений и на фоне фосфорно-калийных удобрений отмечали максимальную нодуляцию. При естественном плодородии почвы с одновременным использованием обоих биопрепаратов урожайность сои повысилась на 7,3 ц/га, содержание белка ? на 2,3 %. Применение под культуру расчетных норм фосфорно-калийных удобрений обеспечило увеличение урожайности на 48,0 %.
Ключевые слова: соя, продуктивность, инокуляция, клубеньковые бактерии, эндомикоризные грибы.
Одной из наиболее актуальных задач остается разработка энергосберегающих, экологически безопасных технологий, учитывающих природные условия региона и обеспечивающих устойчивое развитие сельского
хозяйства. В кормопроизводстве к числу таких приемов относится применение биопрепаратов, повышающих симбиотическую азотфиксацию, урожайность и качество бобовых культур. Предпосевная обработка семян микробиологическими препаратами повышает их биологическую активность,
активизирует физиологические процессы во время вегетации растений,
усиливает адаптивные возможности в неблагоприятных условиях, улучшает качество выращиваемой продукции (1-11).
Бобово-ризобиальный и эндомикоризный симбиозы относятся к
наиболее важным для сельского хозяйства интегрированным растительномикробным системам. Эндомикоризные грибы в симбиозе с бобовыми
растениями образуют арбускулярную микоризу, которая оптимизирует водный статус растения, снабжает необходимыми элементами минерального
питания и повышает устойчивость к фитопатогенам (12).
Так, инокуляция сои ризобиумом и грибами арбускулярной микоризы улучшает поглощение P, Ca, Mg, а также увеличивает общее потребление азота растениями (1, 13-15). При совместной инокуляции растений
азотфиксирующими и фосфатмобилизующими микроорганизмами усиливается образование корневых клубеньков, увеличивается их сухая масса, нитрогеназная активность; при этом повышается урожайность растений и содержание белка в семенах. Показано, что инокуляция азотфиксирующими и
фосфатмобилизирующими организмами по эффекту соответствует внесению минеральных форм азота и фосфора в дозе N30P30. При этом удвоение
количества минеральных удобрений не приводит к достоверной прибавке
118
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
урожая (1, 2). Аналогичные результаты отмечены на горохе посевном (3).
В задачу нашей работы входила оценка влияния биопрепаратов (ризоторфина, грибов арбускулярной микоризы) и разных доз минеральных
удобрений на формирование симбиотической системы, биологическую
азотфиксацию, урожайность и качество семян.
Методика. Объектом исследований служили растения сои ультраскороспелого сорта Магева, районированного в Центрально-Черноземной
зоне. Эксперименты проводили в условиях севооборота (опытные участки
Всероссийского НИИ зернобобовых культу, Орловский р-н, 2004-2006 годы). Почва опытного участка ? темно-серая лесная, по гранулометрическому составу среднесуглинистая, по глубине пахотного слоя и обеспеченности питательными веществами среднеокультуренная. Содержание гумуса
и общего азота составляет соответственно 4,4-5,5 и 0,14-0,16 %, легкогидролизуемого азота ? 6,5-7,8, обменного калия (К2О) ? 8-12, подвижного фосфора (Р2О5) ? 9,2-11,3 мг/100 г почвы; гидролитическая кислотность ? 4,2-4,6; сумма поглощенных оснований ? 21,2-26,5 мг-экв/100 г
почвы; степень насыщенности основаниями ? 76-94 %; рН солевой вытяжки ? 5,5-6,3. Учетная площадь делянок составляла 15 м2, повторность
4-кратная, размещение рендомизированное. Агротехника сои в опыте ?
общепринятая для зоны. Норма высева ? 0,6 млн всхожих семян на 1 га.
Для инокуляции растений использовали ризоторфин ? биопрепарат клубеньковых бактерий Bradiorhizobium japonicum (штамм 646а) и препарат на
основе эндомикоризного гриба Glomus intraradices (штамм 8), представляющий собой смесь субстрата с микоризованными корнями суданской
травы (Sorghum sudanense) (оба препарата получены из Всероссийского
НИИ сельскохозяйственной микробиологии, г. Санкт-Петербург?Пушкин). Ризоторфином (200 г/га) обрабатывали семена перед посевом, препарат эндомикоризного гриба (300 кг/га) вносили в почву непосредственно при посеве.
Симбиотическую активность и продуктивность растений сои анализировали в следующих вариантах опыта: I ? абсолютный контроль (без
применения минеральных удобрений и биопрепаратов клубеньковых бактерий и гломуса); II ? без применения минеральных удобрений, но с совместной инокуляцией азотфиксирующими и фосфатмобилизирующими
микроорганизмами; III ? с внесением РК без инокуляции; IV ? с внесением РК на фоне совместной инокуляцией азотфиксирующими и фосфатмобилизирующими микроорганизмами; V ? на фоне N0,5РК без инокуляции. Минеральные удобрения рассчитывали на планируемую урожайность 30 ц/га и вносили под предпосевную культивацию. Азотфиксирующую способность растений оценивали по показателю нодуляции, числу и
массе клубеньков, их нитрогеназной активности и количеству фиксированного азота воздуха по общепринятым методикам (16). В лабораторных
условиях определяли также содержание жира и белка в семенах на ИКанализаторе N12-42 (Россия). Урожайность учитывали при уборке сплошным методом (комбайн Sampo-500, «Sampo Rosenlew Ltd.», Финляндия),
пересчитывая на 100 % чистоту и 14 % влажность семян.
Математическую обработку данных проводили с использованием
компьютерных программ Statistica v. 6.0 («StatSoft, Inc.», США) и Microsoft
Оffice Exсel 2010.
Результаты. У растений сои активность формируемой симбиотической системы зависела от условий минерального питания и применения
биопрепаратов (табл.).
119
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
Характеристика азотфиксирующей активности, продуктивности и качества
семян у растений сои ультраскороспелого сорта Магева в зависимости от условий минерального питания и применения биопрепаратов азотфиксирующих
и фосфатмобилизующих микроорганизмов (опытный участок Всероссийского НИИ зернобобовых культур, Орловский р-н, 2004-2006 годы)
Показатель
контроль
I
II
Вариант опыта
РК
III
IV
V
Азотфиксирующая активность
Нодуляция, %
33,5
94,5
68,6
98,6
12,7
Число клубеньков, млн шт/га
2,2
7,0
6,1
10,7
1,5
Масса клубеньков, кг/га
50,9
251,9
251,3
332,7
22,6
100,1
314,5
259,8
390,2
20,5
Нитрогеназная активность, мкг N2/(раст.?ч)
Количество фиксированного N2 воздуха, кг/га
33
115
98
161
8
Продуктивность и качество семян
Урожайность, ц/га
11,9
19,2
17,6
24,1
22,7
Содержание белка, %
39,3
41,5
40,5
42,8
41,6
Содержание жира, %
17,9
17,4
17,6
17,1
17,1
П р и м е ч а н и е. I ? абсолютный контроль (без применения минеральных удобрений и биопрепаратов
клубеньковых бактерий и гломуса); II ? без применения минеральных удобрений, но с совместной инокуляцией азотфиксирующими и фосфатмобилизующими микроорганизмами; III ? с внесением РК без
инокуляции; IV ? с внесением РК на фоне совместной инокуляции азотфиксирующими и фосфатмобилизующими микроорганизмами; V ? на фоне N0,5РК без инокуляции.
Фосфорно-калийные удобрения повысили нодуляцию растений с
33,5 до 68,6 %, при этом число клубеньков и их масса возросли соответственно в 2,8 и 4,9 раза по отношению к абсолютному контролю. Нитрогеназная активность составила 259,8 мкг N2/(раст.?ч), а количество биологически фиксированного азота повысилось в 3,0 раза. Инокуляция с применением ризоторфина и гломуса в вариантах без использования удобрений
и на фоне внесения фосфорно-калийных удобрений приводила к дальнейшему повышению всех симбиотических показателей. Число клубеньков и
их масса были соответственно в 3,2-4,9 и 4,9-6,5 раз выше контроля, а количество симбиотически фиксированного азота составило соответственно
115 и 161 кг/га. В этих вариантах зафиксировали максимальную нодуляцию
растений. Применение половинной нормы азота на фоне фосфорно-калийных удобрений существенно снижало все симбиотические показатели, особенно активность нитрогеназы и долю биологического азота в урожае.
Наибольшее влияние на урожайность и качество семян сои оказала
совместная обработка растений азотфиксирующими и фосфатмобилизующими биопрепаратами (см. табл.). При естественном плодородии почвы с
одновременным использованием обоих биопрепаратов урожайность сои
повысилась на 7,3 ц/га, содержание белка ? на 2,3 %. Применение под
эту культуру расчетных норм фосфорно-калийных удобрений обеспечило
увеличение урожайности на 48,0 %. Содержание белка в семенах составило 40,5 % против 39,3 % в I варианте (абсолютный контроль). При совместной обработке семян сои ризобиумом и гломусом и внесении фосфорно-калийных удобрений улучшались условия симбиотрофного питания.
Доля азота, фиксируемого из атмосферы, увеличивалась, что положительно отражалось на продуктивности растений и качестве ??емян. Урожайность и содержание белка в семенах в этом варианте были наибольшими:
при сборе зерна 24,1 ц/га его белковость повысилась на 3,5 %.
Половинная норма азота (V вариант) предусматривала участие как
симбиотического, так и минерального азота в формировании урожая. Однако внесенные азотные удобрения существенно угнетали симбиоз, поэтому
урожайность семян и их качество были ниже, чем в варианте с применением совместной инокуляции ризобиями и гломусом на фоне РК (IV вариант). В то же время использование полного минерального удобрения увели120
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
чивало урожайность на 5,1 ц/га и белковость семян на 1,1 % по отношению
к абсолютному контролю. Содержание жира находилось в обратной корреляционной зависимости от внесения компонентов, обеспечивающих питание растений (рис.). Наибольшую масличность семян отмечали в I варианте опыта (абсолютный контроль) ? 17,9 %. Биопрепараты и минеральные удобрения снизили этот показатель на 0,5-0,8 %, однако за счет роста
урожайности сбор жира с 1 га посевов повысился. Фосфорно-калийные
удобрения увеличили выход жира на 97 кг/га, белка ? на 245 кг/га. Сбор
белка возрос на 70 %, жира ? на 57 % (см. рис.).
Сбор белка (а, кг/га) и жира (б, кг/га) у
сои (ультраскороспелый сорт Магева) в
зависимости от условий минерального
питания и применения биопрепаратов
азотфиксирующих и форсфатмобилизующих
микрооргнизмов: I ? абсолютный контроль (без применения минеральных
удобрений и инокуляции биопрепаратами клубеньковых бактерий и гломуса);
II ? без применения минеральных удобрений, но с совместной инокуляцией
азотфиксирующими и фосфатмобилизующими микроорганизмами; III ? с внесением РК без инокуляции; IV ? с внесением РК на
фоне совместной инокуляции азотфиксирующими и фосфатмобилизующими микроорганизмами; V ? на фоне N0,5РК без инокуляции (опытный участок Всероссийского НИИ
зернобобовых культур, Орловский р-н, 2004-2006 годы).
Совместная инокуляция микробиологическими биопрепаратами в
сочетании с внесением фосфорно-калийных удобрений обеспечили получение максимального количества белка и жира с 1 га: в IV варианте опыта
белковая продуктивность составила 1031 кг/га, сбор масла ? 412 кг/га.
Половинная норма азота на фоне фосфора и калия повышала выход белка
и жира в зерне сои (V вариант), но эти показатели уступали отмеченным
при инокуляции ризобиями и гломусом с одновременным применением
фосфорно-калийных удобрений (IV вариант).
Таким образом, совместное использование биопрепаратов на основе
азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов без внесения
удобрений и на фоне расчетных норм фосфорно-калийных удобрений в
значительной степени способствует повышению симбиотической активности растений сои, увеличивает биологическую фиксацию азота воздуха и
тем самым обеспечивает рост урожайности и улучшение качества семян.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
6.
K a w a i Y., Y a m a m o t o Y. Increase in the formation and nitrogen fixation of soybean nodules by vesicurar-arbuscular mycorrhiza. Plant Cell Physiol., 1986, 27(3): 399-405.
Л а б у т о в а Н.М., П о л я к о в А.И., Л я х В.А., Г о р д о н В.Л. Влияние инокуляции
растений клубеньковыми бактериями и эндомикоризным грибом на урожай различных
сортов сои и содержание белка и масла в семенах. Доклады РАСХН, 2004, 2: 10-12.
Б о р и с о в А.Ю., Н а у м к и н а Т.С., Ш т а р к О.Ю., Д а н и л о в а Т.Н., Ц ы г а н о в В.Е. Эффективность использования совместной инокуляции гороха посевного грибами
арбускулярной микоризы и клубеньковыми бактериями. Доклады РАСХН, 2004, 2: 12-14.
В о р о н и ч е в Б.А., К о л о м е й ч е н к о В.В. Кормовые бобы ? надежный резерв увеличения производства растительного белка. Кормопроизводство, 2003, 5: 14-18.
Д е б е л ы й Г.А., К а л и н и н а Л.В., Д у п л я к А.И. Зернобобовые культуры в Нечерноземье. М., 1985.
Е л ь ч а н и н о в а Н.Н., В а с и н А.В., Н е ч а е в а Е.Х., А л е к с а н д р о в Ю.А., З а с ы п к и н М.Е. Продуктивность и экономическая эффективность возделывания зернобобовых культур при использовании ризоторфина и микроудобрений. Известия Самарской государственной сельскохозяйственной академии (Самара), 2009, 4: 11-14.
121
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
7.
8.
З а в а л и н А . А . Биопрепараты, удобрения и урожай. М., 2005.
Б о р и с о в А.Ю., Ш т а р к О.Ю., Ж у к о в В.А., Н е м а н к и н Т.А., Н а у м к и н а Т.С.,
П и н а е в А.Г., А х т е м о в а Г.А., В о р о ш и л о в а В.А., О в ч и н н и к о в а Е.С.,
Р ы ч а г о в а Т.С., Ц ы г а н о в В.Е., Ж е р н а к о в А.И., К у з н е ц о в а Е.В., Г р и ш и н а О.А., С у л и м а А.С., Ф е д о р и н а Я.В., Ч е б о т а р ь В.К., Б и с с е л и н г Т.,
Л е м а н с о Ф., Д ж и а н и н а з з и - П и р с о н В., Р а т э П., С а н х у а н Х., С т о у г а а р д Й., Б е р г Г., М а к ф и К., Э л л и с Н., Т и х о н о в и ч И.А. Взаимодействие
бобовых с полезными почвенными микроорганизмами: от генов растений к сортам.
Сельскохозяйственная биология, 2011, 3: 41-47.
Ч е б о т а р ь В.К., З а в а л и н А.А., К и п р у ш к и н а Е.И. Эффективность применения биопрепарата экстрасол. М., 2007.
G i a n i n a z z i - P e a r s o n V . , D u m a s - G a u d o t E . The contribution of model legumes to arbuscular mycorrhiza research. Grain Legumes, 2009, 53: 21-22.
W i p f D. Mechanisms of beneficial legume-microbe interactions. Proc. First Legume Society
Conference 2013: A Legume Odyssey. Novi Sad, Serbia, 2013: 227.
Т и х о н о в и ч И.А. Создание высокоэффективных микробно-растительных систем. Сельскохозяйственная биология, 2000, 1: 28-33.
О с и н А.А. Влияние бобово-ризобиального и арбускулярно-микоризного симбиозов на
урожайность и белковую продуктивность сои и фасоли в условиях центральной лесостепи России. Автореф. канд. дис. Орел, 2009.
П а р а х и н Н.В., О с и н а В.С., О с и н А.А., О с и н А.А. Влияние двойной инокуляции на симбиоз, азотфиксацию, продуктивность и качество сои. Вестник ОрелГАУ
(Орел), 2008, 3: 2-4.
О с и н а В.С., О с и н А.А., О с и н А.А. Симбиотическая активность и продуктивность
сои при двойной инокуляции семян. Мат. Межд. науч.-практ. конф. «Фитосанитарное
обеспечение устойчивого развития агросистем». Орел, 2008: 39-42.
П о с ы п а н о в Г.С. Методы изучения биологической фиксации азота воздуха. М., 1991.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
16.
1ФГБОУ
ВПО Орловский государственный
аграрный университет,
Поступила в редакцию
11 мая 2013 год
302019 Россия, г. Орел, ул. Генерала Родина, 69,
e-mail: [email protected];
2ГНУ Всероссийский НИИ зернобобовых
и крупяных культур Россельхозакадемии,
302502 Россия, Орловская обл., Орловский р-н,
пос. Стрелецкий, ул. Молодежная, 10/1,
e-mail: [email protected]
ELEVATION OF SOYBEAN PRODUCTIVITY AND GRAIN QUALITY
DUE TO INTENSIFICATION OF NITROGEN FIXATION
N.V. Parakhin1, Al.A. Osin1, M.V. Donskaya2, A.Al. Osin2
1Orel
State Agrarian University, 69, ul. Generala Rodina, Orel, 302019 Russsia, e-mail [email protected];
Research Institute of Legumes and Groats Crops, Russian Academy of Agricultural Sciences, 10/1, ul. Molodezhnaya, pos. Streletskii, Orel Province, 302502 Russia, e-mail [email protected]
Received May 11, 2013
2All-Russian
Abstract
Usage of the biopreparations beneficial to symbiotic nitrogen fixation are regarded as an effective and environmentally friendly technology, allowing elevation of the fodder crop yield and
quality, and ensuring sustainable and low-energy consuming development of fodder production under
the local climatic conditions. During the field trials in the Middle-Russian forest-steppe zone, the
yield and grain quality parameters were examined in Mageva, an ultra-early ripening soybean variety,
inoculated with Bradiorhizobium japonicum and Glomus intraradices under different levels of mineral
N, P, and K. The number and the weight of nodules, the nitrogenase activity, and the N2-fixation
were estimated. A combination of nitrogen fixing and phosphate mobilizing microorganisms, being
used with or without P and K fertilizers, was found to elevate the symbiotic activity in soybean plants
(the nodulation at 94.5-98.6 %), to increase the nitrogen fixation (up to 115-161 kg/ha) and crop
yield, and also to improve the fodder quality. When P and K fertilizers were applied separately from
biopreparations, the nodulation made 68.6 % and was higher enough to cause 3-fold nitrogen fixation. When no fertilizer was used, the inoculation with Bradiorhizobium japonicum and Glomus intraradices resulted in the increase of soybean yield by 7.3 centner/ha, and the protein content was
2.3 % higher. If the calculated doses of P and K fertilizers were applied together with the biopreparatins, the soybean yield increased by 48.0 %.
Keywords: soya, productivity, inoculation, nodule bacteria, endomycorrhizal fungi.
122
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, № 2, с. 123-126
УДК 636.087.7:577.16:635.032/.034
ОБОРУДОВАНИЕ И ТЕХНОЛОГИЯ ПРОИЗВОДСТВА ВИТАМИННОГО
ЗЕЛЕНОГО КОРМА
А.К. ВИЛИЧКО, Ю.П. БАРЫШНЕВ, В.Л. СУДАКОВ
В зимний период вводимые в корма добавки не обеспечивают полноценной замены комплекса витаминов, получаемых животными в летнее время при выпасе, так как главную роль в
специфическом действии свежей зелени играют хлорофилл, каротин, витамины и другие компоненты, находящиеся в нативном состоянии и разрушающиеся при любой консервации. Нами разработано оборудование и предложена технология получения витаминного зеленого корма (ВЗК).
Для производства ВЗК используются семена зерновых культур ? овса, ячменя, пшеницы или их
смеси. Метод экономичен, сборка установки по модульному принципу позволяет организовать
при минимальных затратах энергии в требуемых объемах (как для небольшого личного хозяйства, так и в промышленных масштабах) непрерывное производство витаминного зеленого корма
независимо от времени года и климатических условий. Инвентарная площадь модуля ? 5,0 м2,
общая полезная площадь установки ? 15 м2. Зеленый витаминный корм по содержанию витаминов превосходит все известные естественные корма и даже промышленные концентраты. Эффективность установки: загрузка сухим зерном одного стеллажа ? 15-20 кг, выход ВЗК с одного
стеллажа ? около 100 кг, выход ВЗК с одного модуля ? 350-400 кг. Проведена проверка эффективности использования витаминного зеленого корма в качестве добавок в рацион животных.
Ключевые слова: витаминный зеленый корм, модульная установка, стеллаж, семена
зерновых культур, время облучения, химический состав, витамины.
В зимний период в потребляемых животными кормах уменьшается
количество витаминов и других необходимых для полноценного питания
веществ, что ведет к снижению продуктивности и прироста живой массы,
повышению заболеваемости и т.д. Вводимые в корма витаминные добавки
не обеспечивают полноценной замены комплекса витаминов, получаемых
животными в летнее время при содержании на выпасах, так как главную
роль в специфическом действии свежей зелени играют хлорофилл, каротин, витамины и другие компоненты в нативном состоянии. Как известно,
эти вещества разрушаются при любой консервации, поэтому специфическое действие зимней подкормки свежей зеленью практически незаменимо.
Добавка витаминного зеленого корма (ВЗК) в рацион улучшает переваримость грубых кормов, обеспечивает организм витаминами группы В, каротином, хлорофиллом и т.д., качественно улучшая условия зимнего содержания. Добавка микроэлементов в ВЗК при кормлении животных и птицы
значительно повышает качество корма и его диетические свойства. Использование такого питательного корма увеличивает прирост живой массы
у молодняка, яйценоскость кур и т.д. (1).
С целью организации эффективного производства свежего витаминного зеленого корма (ВЗК) нами разработана установка и предложена
технология непрерывного производства ВЗК. Сборка установки по модульному принципу позволяет получать зеленый корм в необходимых объемах ? как для небольшого личного хозяйства, так и в промышленных
масштабах.
Описание методики. Единичный модуль установки для производства ВЗК в непрерывном режиме состоит из четырех 5-ярусных стеллажей с
общей высотой стеллажа 1,8 м. На каждом ярусе размещаются по 2 кюветы размером 60Ѕ60 см. По периметру блока установлены 8 люминесцентных ламп мощностью 40 Вт. При увеличении числа блоков число ламп
сокращается (лампы, расположенные по периметру модуля, одновременно
используются для двух соседних модулей). Единичный модуль комплекту123
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
ется шкафом, в котором происходит первоначальное проращивание семян
без освещения (темновой шкаф), системой автоматического полива (при
небольших объемах производства может использоваться ручной полив),
пультом автоматического управления режимом полива и освещения, общего для нескольких модулей, баком для замачивания зерна, изготовленного из некорродирующего материала. Инвентарная площадь модуля ? 5,0
м2, общая полезная площадь установки ? 15 м2. Модули могут быть смонтированы в помещении, в котором возможно круглосуточное поддержание
температуры не ниже 16 °С, оборудованного системами водо- и электроснабжения (2, 3). Канализация нужна только для слива бытовых отходов.
Полезная площадь помещения определяет потенциальную производительность комплекса по выращиванию ВЗК.
Для производства ВЗК использовали семена зерновых культур:
овса, ячменя, пшеницы или смеси этих культур. Семена должны быть
чистые, без примеси сорняков и мусора, всхожесть ? не ниже 80 %, расход зерна ? 1,5-1,7 кг на одну кювету. Зерно в необходимом количестве
на 12-16 ч замачивали в растворе КNO3 + MgSO4 + KH2PO4 (концентрация каждой соли 0,25 г/л) + Сa(NO3)2 (0,5 г/л). Оптимальное количество
раствора для замачивания ? 3-кратный объем относительно массы семян.
После замачивания семена раскладывали по кюветам, на дно которых наносили слой кормового мела для дезинфекции и как источник кальция.
Семена в кювете разравнивали, закрывали пленкой и помещали в темновой шкаф на 3 сут без полива и освещения. На 4-е сут кюветы выставляли
на стеллажи и включали лампы ЛБ-40 (Россия) (фотопериод 12 ч/12 ч).
Для увеличения выхода продукции с единицы полезной площади использовали прием прерывания темнового промежутка суточного цикла выращивания светом красных люминесцентных ламп (на ярус ? 1 лампа ЛФР150, Россия), режим освещения с применением красного света: 11 ч, ЛБ40/4 ч, темновая фаза (без освещения)/1 ч красный свет/8 ч, темновая
фаза. Дополнительный выход ВЗК при этом составлял 0,50-0,70 кг/м2
(4). Полив производили 1 раз в сутки, начиная с установки кювет на
стеллажи. Корм собирали на 7-8-е сут в зависимости от культуры, скорости прорастания семян, температуры воздуха (5).
Каротин и хлорофилл обусловливают питательную ценность ВЗК, а
обогащение ВЗК микроэлементами (Co, Cu, I, Zn) делает производство
зеленого корма более эффективным как по количеству, так и по качеству
получаемой продукции. Для этого проростки на 7-е сут выращивания опрыскивали раствором микроэлементов (соли CоCl2, KI, MnSO4, ZnSO4,
CuSO4 в концентрации 0,005 %). При этом дополнительный выход ВЗК
составил 0,20-0,25 кг/м2. Числом работающих модулей определялся конечный выход зеленой продукции. Можно наладить конвейерный выпуск
и получать нужный объем продукции ежесуточно либо в режиме, который
определяется требованиями рациона. Эффективность работы: загрузка сухим зерном одного стеллажа ? 15-20 кг, выход ВЗК ? около 100 кг, выход ВЗК с одного модуля ? 350-400 кг.
Мы провели сравнительный химический анализ содержания витаминов и микроэлементов в семенах овса, закладываемых в установку, и в
произведенном ВЗК (с использованием стандартных методик по ГОСТ
7047-55) (табл.).
Оборудование и технология выращивания ВЗК прошли производственные испытания в ЗАО «Ручьи» (Ленинградская обл.) и в НПО «Ярославское» (Ярославский НИИ животноводства и кормопроизводства). В
124
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
совхозе «Ручьи» проверили эффективность скармливания ВЗК в виде доХимический состав сухих семян ов- бавки к рациону свиноматок. Отход
са, используемых для получения ви- молодняка при кормлении свиноматок
таминного зеленого корма (ВЗК) по уменьшился на 11 % по сравнению с
предложенной технологии, и в 7- показателем в контрольной группе. При
выращивании поросят-отъемышей в
суточных проростках
НПО «Ярославское» в опытной группе
Образец
Показатель
0,5 кг влажной концентратной смеси
сухие семена ВЗК
Сухое вещество, г/кг
870,0
186,0
замещали 0,5 кг ВЗК. Среднесуточный
Макроэлементы, г/кг:
прирост живой массы за 123 сут в конкальций
0,56
0,83
трольной группе составил 328 г, в опытфосфор
0,08
1,22
магний
20,50
22,80
ной группе ? 366 г.
Микроэлементы, мг/кг:
Таким образом, разработано обокобальт
0,12
0,35
йод
81,00
0,35
рудование и предложена технология
Витамины, мг/кг:
выращивания витаминного зеленого
каротин
0,0
5,8
корма. Проведена проверка эффективС
0,0
330,0
Е
24,8
32,0
ности использования витаминного зеВ1
3,8
6,5
леного корма в качестве добавки в раВ2
1,2
2,4
12,0
15,0
В3
цион поросят и свиноматок. ПредлоВ6
14,6
35,0
женный метод экономичен и позволяет
РР
14,0
150,0
при минимальных энергетических затратах организовать в требуемых объемах производство витаминного зеленого корма независимо от времени года и климатических условий (в том
числе в условиях Центральной России и Крайнего Севера). При этом с
высоким выходом можно получать продукт, который по содержанию витаминов превосходит все известные естественные корма и даже концентраты,
произведенные промышленным способом.
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
4.
5.
Х о х р и н С.Н. Корма и кормление животных. СПб, 2002.
Е р м а к о в Е.И. Системы интенсивного культивирования растений в регулируемых условиях. В сб. науч. тр.: Системы интенсивного культивирования растений. Л., 1987: 3-21.
Т а т ь я н к о А.К., П о т а п о в а С.М. Метод проведения экологического испытания
сортов зерновых культур в регулируемых условиях. В сб.: Агрофизические методы и
приборы. СПб, 1998: 123-125.
Е р м а к о в Е.И., С у д а к о в В.Л. Кратковременные фоторегуляторные световые воздействия в темновой период суточного цикла как способ повышения продуктивности
длиннодневных растений. В сб.: Регулируемая агроэкосистема в растениеводстве и экофизиологии. СПб, 2007: 172-178.
Т а т ь я н к о А.К., П о т а п о в а С.М. Исследование реакции злаков на факторы воздействия в контролируемых условиях. В сб.: Физиологические основы управления ростом и продуктивностью растений в регулируемых условиях. Л., 1988: 46-60.
ГНУ Агрофизический НИИ Россельхозакадемии,
195220 Россия, г. Санкт-Петербург, Гражданский просп., 14,
e-mail: [email protected], [email protected]
Поступила в редакцию
25 апреля 2012 года
EQUIPMENT AND TECHNOLOGY FOR PRODUCTION OF VITAMIN
GREEN FODDER
A.K. Vilichko, Yu.P. Baryshnev, V.L. Sudakov
Agrophysical Research Institute, Russian Academy of Agricultural Sciences, 14, Grazhdanskii prosp., St. Petersburg,
195220 Russia, e-mail [email protected], [email protected]
Received April 25, 2012
Abstract
The vitamin additives to winter rations are known not to be enough to substitute the vita-
125
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
mins of green fodder due to special effects of chlorophyll, carotene, vitamins and other intact bioactive components in fresh summer greencrops, destroyed under any conservation. We developed the
equipment and technology for cultivation of vitamin green fodder. To produce the vitamin green
fodder, the cereal seeds (oats, barley, wheat or their mixture) are used. The procedure is efficient and
allows getting a required amount of vitamin green fodder (for individual or commercial use) regardless of the time of year and weather conditions, and at the lowest expenses for energy. The total effective square of the unit makes about 15 m2, with a module square about 5,0 m2. On chemical
composition, the vitamin green fodder exceeds any natural and concentrated fodder. The output of
vitamin green fodder makes 100 kg per shelves, or 350-400 kg per a module with 15-20 kg of seeds
being used. A verification of the efficiency of the vitamin green fodder as an additive was carried out
at industrial farms on pigs and piglets, and its high effect was shown.
Keywords: vitamin green fodder, modular installation, rack, seeds of grain crops, exposure
time, the chemical composition, vitamins.
Новые книги
К о з л о в С.А., П а р ф е н о в В.А. Коневодство. М.: изд-во «КолосС», 2012, 352 с.
Учебник подготовлен в соответствии с примерной программой дисциплины
«Коневодство», рекомендованной Министерством образования Российской Федерации, и
предназначен для студентов зооинженерных
и аграрных факультетов сельскохозяйственных вузов и университетов. В учебнике приводятся современные материалы по всем разделам программы, позволяющие в полном
объеме освоить дисциплину «Коневодство»
для эффективного использования этих знаний в практической работе.
С е м е н о в Б.С., В и д е н и н В.Н., В о щ е в о з А.Т и др. Оперативная хирургия у
животных. М.: изд-во «КолосС», 2012, 423 с.
Рассмотрены способы фиксации животных, учение о хирургической операции и
понятие хирургической инфекции, средства
и методы общей и местной анестезии. Упомянуты новейшие шовные материалы и приспособления для соединения тканей. Подробно описаны техника проведения операций у
животных разных видов и анатомо-топографические особенности оперируемых областей. Учебное пособие иллюстрировано большим числом наглядных рисунков. Для студентов вузов и ветеринарных специалистов.
Б а л а к и р е в Н.А., П е р е л ь д и к Д.Н.
Кормление плотоядных пушных зверей. М.:
изд-во «КолосС», 2010, 192 с.
Изложены вопросы кормления наиболее широко разводимых на фермах плотоядных пушных зверей: норок, соболей, хорьков, лисиц, песцов. Приведены нормы и потребность зверей в энергии, питательных веществах, аминокислотах, витаминах, наиболее важных минеральных элементах во все
производственно-биологические периоды; питательность и требуемые параметры доброкачественности кормов, используемых в настоящее время для пушных зверей; типовые
рационы и расчет затрат кормов для пушных
зверей на год. Один из разделов учебного пособия посвящен компьютерной программе оптимизации кормления пушных зверей, пока-
126
зан получаемый от ее использования экономический эффект ? уменьшение до 30 %
затрат на кормление. Для студентов высших
учебных заведений по специальности «Зоотехния».
Д а н и л е в с к а я Н.В., С у б б о т и н В.В.
Дисбактериозы у мелких домашних животных
(серия «Мастер-класс»). М.: изд-во «КолосС»,
2010, 63 с.
Изложены сведения о теоретических и практических аспектах, связанных с
клиническим проявлением, профилактикой
и лечением дисбактериозов у мелких домашних животных. Приведены результаты многолетних научных исследований и практической работы по восстановлению нормальной микрофлоры и функции пищеварения, что является одним из необходимых
условий здоровья домашних питомцев и
обеспечивает их активное долголетие. Для
ветеринарных врачей, может быть полезна
студентам ветеринарных факультетов очной
и заочной форм обучения.
К а л ю ж н ы й И.И., Б а р и н о в Н.Д., Щ е р б а к о в Г.Г. и др. Клиническая гастроэнтерология животных. М.: изд-во «КолосС»,
2010, 568 с.
Рассмотрены анатомо-физиологические особенности органов, участвующих в
пищеварении, и методы их исследовании.
Описана этиология, клиническое проявление, диагностика, лечение и профилактика
болезней пищеварительной системы у животных разных видов и птиц. Изложены методы инструментальной диагностики: эндоскопия, гастрофиброскопия, колонофиброскопия, лапароскопия, рентгенологическое
и ультразвуковое исследования. Отдельная
глава посвящена методам профилактики заболеваний органов пищеварения путем контроля обмена веществ и составления рациона кормления с учетом физиологического
состояния животных, уровня продуктивности и характера использования. Для студентов вузов по специальности «Ветеринария». Книга может быть полезна практикующим врачам.
?рушение проницаемости сосудистой стенки стало в описанном случае одним из
звеньев патогенеза геморрагического цистита.
Результаты проведенных исследований в целом подтверждают гипотезу о наличии воспалительного процесса в мочевом пузыре у животных, который может обусловливать развитие синдрома недержания мочи у
молодняка соболя. В то же время необходимо дальнейшее изучение этиологии и патогенеза заболевания в связи с тем, что в наших экспериментах
воспалительный процесс в мочевом пузыре выявлен в 28 % случаев у самцов и в 41 % ? у самок. Подобная статистика не исключает влияния других возможных этиологических факторов.
Таким образом, нами впервые получена информация о гистологических изменениях мочевого пузыря у соболей с синдромом недержания мочи, сопровождающимся патолого-анатомическими признаками цистита. С
помощью гистохимического исследования обнаружены признаки накопления гликозаминогликанов в собственной пластинке мочевого пузыря у
больных животных, что свидетельствует об активации слизистой оболочкой
ее защитных свойств под влиянием факторов воспалительного процесса.
Выявлены статистически значимые различия в морфологии мочевого пузыря у соболей при недержании мочи, в частности уменьшение толщины слизистой и мышечной оболочки мочевого пузыря у больных животных, что,
по-видимому, обусловлено развитием функциональных нарушений, таких
как атония и дилатация мочевого пузыря, наблюдаемых у некоторых особей
при секционном осмотре мочевого пузыря. Уменьшение толщины слизистой оболочки у больных животных, вероятно, указывает на усиление десквамации переходного эпителия под влиянием воспалительного процесса.
ЛИТЕРАТУРА
1.
116
Д а н и л е в с к и й В.М., З а б а л у е в Г.И. Словарь ветеринарных терапевтических терминов. М., 1989.
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
2.
3.
Г л а н ц С. Медико-биологическая статистика /Пер. с англ. Ю.А. Данилова. М., 1999.
С о б о л е в В.Е., Ж д а н о в С.И. Патологоанатомическая картина при синдроме недержания мочи у соболей. Ветеринарная патология, 2012, 2: 95-98.
4. A u l e r i c h R., S h e l t s G., S c h a i b i e P.J. Influence of the dietary calcium level on the
incidence of urinary incontinence and «wet belly» in mink. Michigan Quarterly bulletin, 1963,
45(3): 444-449.
5. A u l e r i c h R., S c h a i b i e P.J. The use of spent chickens for mink feeding. Michigan Quarterly bulletin, 1965, 47(3): 451-458.
6. Experiments in mink nutrition: progress report 1963. Agricult. Exp. St. Oregon St. University, 1964.
7. B o s t r o m R.E., A u l e r i c h R.J., S c h a i b i e P.J. Histological observation on the urinary
system of male mink affected with «wet belly». Michigan Quaterly Bulletin, 1967, 50(1): 100-105.
8. B o s t r o m R.E., A u l e r i c h R.J., S c h a i b i e P.J. Histological features of inguinal skin of
«wet belly» and normal mink (Mustella vision). Am. J. Vet. Res., 1967, 28(126): 1549-1554.
9. Л у п п а Х. Основы гистохимии. М., 1980.
10. B h a v a n a n d a n V.P. Glycosaminoglycans and glycoproteins of animal bladder. J. Connect.
Tissue, 2001, 33(3): 245-252.
1ФГУП
НИИ гигиены, профпатологии и экологии
человека Федерального медико-биологического
агентства России,
Поступила в редакцию
14 мая 2012 года
188663 Россия, Ленинградская обл., Всеволожский р-н,
ж/д станция Капитолово, пос. Кузьмоловский, корп. 93,
e-mail: [email protected];
2ФГБОУ ВПО Санкт-Петербургская государственная
академия ветеринарной медицины,
196084 Россия, г. Санкт-Петербург, ул. Черниговская, 5,
e-mail: [email protected]
CYSTITIS: AN ETIOLOGICAL FACTOR FOR SYNDROME OF URINARY
INCONTINENCE IN FUR BEARING ANIMALS
V.E. Sobolev1, S.I. Zhdanov2
1Research
Institute of Hygiene, Occupational Pathology and Human Ecology, 93, pos. Kuz'molovskii, st. Kapitolovo,
Vsevolozhskii Region, Leningrad Province, 188663 Russia, e-mail [email protected];
State Veterinary Academy, 5, ul. Chernigovskaya, St.-Petersburg, 196084 Russia,
e-mail [email protected]
Received May 14, 2012
2Saint-Petersburg
Abstract
«Wet belly» disease of fur animals, the sables particularly, has little been studied, and the
data have been mostly limited to publications in 1960-1970. In our examinations carried out earlier
on the sables with urinary incontinence, the incidence of anemia, anorexia, the inflammation in gastrointestinal tract, and the weight loss were also found, indicating the urinary incontinence not to be
the only symptom of the disease. This article gives new information for histological changes in the
urinary bladder of 7-month black sables, injured by «wet belly» (a «syndrome of urinary incontinence»). The catharal and haemorrhagical cystitis were indicated as possible etiological factors of the
disease. Post-mortem examination of 76 sables with «wet belly», or «syndrome of urinary incontinence», showed that 28 % of the males, and 41 % of the females have various types of inflammation
in the urinary bladder. Using morphometric analysis, a loss of the urinary bladder mucosa and muscle layer was demonstrated in the urinary bladder of sick animals if compared to healthy sables. Authors suggest that the phenomenon is probably related to high epithelium exfoliation and bladder
dysfunction, such as atony and dilatation in the muscle layer of urinary bladder. In the young sables,
injured by haemorrhagic cystitis with the symptoms of «wet belly» disease, an increase of glycosaminoglycans in the urinary bladder tissue was detected by hystochemical methods, indicating activation
of local defense mechanisms due to the inflammation. These facts support a hypothesis, whereby a
various form of cystitis may account for the development of «wet belly» disease in young sables.
Keywords: sable, cystitis, urinary incontinence, «wet belly», morphometry.
Научные собрания
FORUM FOR INNOVATIONS IN AGRICULTURE GFIA 2014
(3-5 февраля 2014 года, Абу Даби, ОАЭ)
Форум призван объединить усилия ведущих ученых, практических специалистов и инвесторов для решений в связи с глобальными вызовами, с которыми сталкивается человечество.
Контакты и информация: http://www.innivationsinagriculture.com
117
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, № 2, с. 118-122
Кормопроизводство: биологические основы и технологии
УДК 636.085:633.34:631.524.84:[631.461.5+631.466.12
ПОВЫШЕНИЕ ПРОДУКТИВНОСТИ И КАЧЕСТВА СЕМЯН СОИ
ЗА СЧЕТ ИНТЕНСИФИКАЦИИ АЗОТФИКСАЦИИ
Н.В. ПАРАХИН1, А.А. ОСИН1, М.В. ДОНСКАЯ2, А.А. ОСИН2
Применение биопрепаратов, повышающих симбиотическую азотфиксацию, урожайность
и качество бобовых культур, ? один из современных приемов, который позволяет разрабатывать
энергосберегающие, экологически безопасные технологии кормопроизводства, учитывающие природные особенности региона и обеспечивающие устойчивое развитие отрасли. В полевых опытах
в условиях Среднерусской лесостепи оценивали урожайность и качество семян у сои ультраскороспелого сорта Магева на фоне разных доз азотно-фосфорно-калийных удобрений при совместной инокуляции растений клубеньковыми бактериями (Bradiorhizobium japonicum) и эндомикоризным грибом (Glomus intraradices). Определяли численность и массу клубеньков, их нитрогеназную
активность и количество фиксированного азота воздуха. Биопрепараты на основе азотфиксирующих и фосфатмобилизующих микроорганизмов, применяемые совместно без удобрений и на фоне
расчетных норм фосфорно-калийных удобрений, в значительной степени способствовали повышению симбиотической активности у растений сои, усилению биологической фиксации азота воздуха, росту урожайности и улучшению качества семян. Так, фосфорно-калийные удобрения повысили нодуляцию растений, а количество биологически фиксированного азота возросло в 3,0 раза
по сравнению с контролем. При инокуляции с применением ризоторфина и гломуса без внесения
удобрений и на фоне фосфорно-калийных удобрений отмечали максимальную нодуляцию. При естественном плодородии почвы с одновременным использованием обоих биопрепаратов урожайность сои повысилась на 7,3 ц/га, содержание белка ? на 2,3 %. Применение под культуру расчетных норм фосфорно-калийных удобрений обеспечило увеличение урожайности на 48,0 %.
Ключевые слова: соя, продуктивность, инокуляция, клубеньковые бактерии, эндомикоризные грибы.
Одной из наиболее актуальных задач остается разработка энергосберегающих, экологически безопасных технологий, учитывающих природные условия региона и обеспечивающих устойчивое развитие сельского
хозяйства. В кормопроизводстве к числу таких приемов относится применение биопрепаратов, повышающих симбиотическую азотфиксацию, урожайность и качество бобовых культур. Предпосевная обработка семян микробиологическими препаратами повышает их биологическую активность,
активизирует физиологические процессы во время вегетации растений,
усиливает адаптивные возможности в неблагоприятных условиях, улучшает качество выращиваемой продукции (1-11).
Бобово-ризобиальный и эндомикоризный симбиозы относятся к
наиболее важным для сельского хозяйства интегрированным растительномикробным системам. Эндомикоризные грибы в симбиозе с бобовыми
растениями образуют арбускулярную микоризу, которая оптимизирует водный статус растения, снабжает необходимыми элементами минерального
питания и повышает устойчивость к фитопатогенам (12).
Так, инокуляция сои ризобиумом и грибами арбускулярной микоризы улучшает поглощение P, Ca, Mg, а также увеличивает общее потребление азота растениями (1, 13-15). При совместной инокуляции растений
азотфиксирующими и фосфатмобилизующими микроорганизмами усиливается образование корневых клубеньков, увеличивается их сухая масса, нитрогеназная активность; при этом повышается урожайность растений и содержание белка в семенах. Показано, что инокуляция азотфиксирующими и
фосфатмобилизирующими организмами по эффекту соответствует внесению минеральных форм азота и фосфора в дозе N30P30. При этом удвоение
количества минеральных удобрений не приводит к достоверной прибавке
118
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
урожая (1, 2). Аналогичные результаты отмечены на горохе посевном (3).
В задачу нашей работы входила оценка влияния биопрепаратов (ризоторфина, грибов арбускулярной микоризы) и разных доз минеральных
удобрений на формирование симбиотической системы, биологическую
азотфиксацию, урожайность и качество семян.
Методика. Объектом исследований служили растения сои ультраскороспелого сорта Магева, районированного в Центрально-Черноземной
зоне. Эксперименты проводили в условиях севооборота (опытные участки
Всероссийского НИИ зернобобовых культу, Орловский р-н, 2004-2006 годы). Почва опытного участка ? темно-серая лесная, по гранулометрическому составу среднесуглинистая, по глубине пахотного слоя и обеспеченности питательными веществами среднеокультуренная. Содержание гумуса
и общего азота составляет соответственно 4,4-5,5 и 0,14-0,16 %, легкогидролизуемого азота ? 6,5-7,8, обменного калия (К2О) ? 8-12, подвижного фосфора (Р2О5) ? 9,2-11,3 мг/100 г почвы; гидролитическая кислотность ? 4,2-4,6; сумма поглощенных оснований ? 21,2-26,5 мг-экв/100 г
почвы; степень насыщенности основаниями ? 76-94 %; рН солевой вытяжки ? 5,5-6,3. Учетная площадь делянок составляла 15 м2, повторность
4-кратная, размещение рендомизированное. Агротехника сои в опыте ?
общепринятая для зоны. Норма высева ? 0,6 млн всхожих семян на 1 га.
Для инокуляции растений использовали ризоторфин ? биопрепарат клубеньковых бактерий Bradiorhizobium japonicum (штамм 646а) и препарат на
основе эндомикоризного гриба Glomus intraradices (штамм 8), представляющий собой смесь субстрата с микоризованными корнями суданской
травы (Sorghum sudanense) (оба препарата получены из Всероссийского
НИИ сельскохозяйственной микробиологии, г. Санкт-Петербург?Пушкин). Ризоторфином (200 г/га) обрабатывали семена перед посевом, препарат эндомикоризного гриба (300 кг/га) вносили в почву непосредственно при посеве.
Симбиотическую активность и продуктивность растений сои анализировали в следующих вариантах опыта: I ? абсолютный контроль (без
применения минеральных удобрений и биопрепаратов клубеньковых бактерий и гломуса); II ? без применения минеральных удобрений, но с совместной инокуляцией азотфиксирующими и фосфатмобилизирующими
микроорганизмами; III ? с внесением РК без инокуляции; IV ? с внесением РК на фоне совместной инокуляцией азотфиксирующими и фосфатмобилизирующими микроорганизмами; V ? на фоне N0,5РК без инокуляции. Минеральные удобрения рассчитывали на планируемую урожайность 30 ц/га и вносили под предпосевную культивацию. Азотфиксирующую способность растений оценивали по показателю нодуляции, числу и
массе клубеньков, их нитрогеназной активности и количеству фиксированного азота воздуха по общепринятым методикам (16). В лабораторных
условиях определяли также содержание жира и белка в семенах на ИКанализаторе N12-42 (Россия). Урожайность учитывали при уборке сплошным методом (комбайн Sampo-500, «Sampo Rosenlew Ltd.», Финляндия),
пересчитывая на 100 % чистоту и 14 % влажность семян.
Математическую обработку данных проводили с использованием
компьютерных программ Statistica v. 6.0 («StatSoft, Inc.», США) и Microsoft
Оffice Exсel 2010.
Результаты. У растений сои активность формируемой симбиотической системы зависела от условий минерального питания и применения
биопрепаратов (табл.).
119
Copyright ??? «??? «??????» & ??? «A???????? K????-C?????»
Характеристика азотфиксирующей активности, продуктивности и качества
семян у растений сои ультраскороспелого сорта Магева в зависимости от условий минерального питания и применения биопрепаратов азотфиксирующих
и фосфатмобилизующих микроорганизмов (опытный участок Всероссийского НИИ зернобобовых культур, Орловский р-н, 2004-2006 годы)
Показатель
контроль
I
II
Вариант опыта
РК
III
IV
V
Азотфиксирующая активность
Нодуляция, %
33,5
94,5
68,6
98,6
12,7
Число клубеньков, млн шт/га
2,2
7,0
6,1
10,7
1,5
Масса клубеньков, кг/га
50,9
251,9
251,3
332,7
22,6
100,1
314,5
259,8
390,2
20,5
Нитрогеназная активность, мкг N2/(раст.?ч)
Количество фиксированного N2 воздуха, кг/га
33
115
98
161
8
Продуктивность и качество семян
Урожайность, ц/га
11,9
19,2
17,6
24,1
22,7
Содержание белка, %
39,3
41,5
40,5
42,8
41,6
Содержание жира, %
17,9
17,4
17,6
17,1
17,1
П р и м е ч а н и е. I ? абсолютный контроль (без применения минеральных удобрений и биопрепаратов
клубеньковых бактерий и гломуса); II ? без применения минеральных удобрений, но с совместной инокуляцией азотфиксирующими и фосфатмобилизующими микроорганизмами; III ? с внесением РК без
инокуляции; IV ? с внесением РК на фоне совместной инокуляции азотфиксирующими и фосфатмобилизующими микроорганизмами; V ? на фоне N0,5РК без инокуляции.
Фосфорно-калийные удобрения повысили нодуляцию растений с
33,5 до 68,6 %, при этом число клубеньков и их масса возросли соответственно в 2,8 и 4,9 раза по отношению к абсолютному контролю. Нитрогеназная активность составила 259,8 мкг N2/(раст.?ч), а количество биологически фиксированного азота повысилось в 3,0 раза. Инокуляция с применением ризоторфина и гломуса в вариантах без использования удобрений
и на фоне внесения фосфорно-калийных удобрений приводила к дальнейшему повышению всех симбиотических показателей. Число клубеньков и
их масса были соответственно в 3,2-4,9 и 4,9-6,5 раз выше контроля, а количество симбиотически фиксированного азота составило соответственно
115 и 161 кг/га. В этих вариантах зафиксировали максимальную нодуляцию
растений. Применение половинной нормы азота на фоне фосфорно-калийных удобрений существенно снижало все симбиотические показатели, особенно активность нитрогеназы и долю биологического азота в урожае.
Наибольшее влияние на урожайность и качество семян сои оказала
совместная обработка растений азотфиксирующими и фосфатмобилизующими биопрепаратами (см. табл.). При естественном плодородии почвы с
одновременным использованием обоих биопрепаратов урожайность сои
повысилась на 7,3 ц/га, содержание белка ? на 2,3 %. Применение под
эту культуру расчетных норм фосфорно-калийных удобрений обеспечило
увеличение урожайности на 48,0 %. Содержание белка в семенах составило 40,5 % против 39,3 % в I варианте (абсолютный контроль). При совместной обработке семян сои ризобиумом и гломусом и внесении фосфорно-калийных удобрений улучшались условия симбиотрофного питания.
Доля азота, фиксируемого из атмосферы, увеличивалась, что положительно отражалось на продуктивности растений и качестве ?
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
404
Размер файла
2 829 Кб
Теги
2839
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа