close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Векторные визуализирующие системы для МРТ диагностики патологических процессов нервной системы

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Абакумова
Татьяна Олеговна
Векторные визуализирующие системы для МРТ диагностики
патологических процессов нервной системы
Специальность: 03.01.04 – Биохимия
Автореферат на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва 2015
Работа была выполнена на базе отдела фундаментальной
нейробиологии Федерального государственного бюджетного учреждения
“Федеральный медицинский исследовательский центр имени В.П.Сербского”
Министерства здравоохранения Российской Федерации
Научный руководитель:
Чехонин Владимир Павлович академик РАН, профессор, доктор
медицинских наук
Официальные оппоненты:
Егоров Алексей Михайлович, доктор биологических наук, профессор
Ипатова Ольга Михайловна, доктор биологических наук, профессор
Ведущее учреждение:
Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего
профессионального образования Первый Московский государственный
медицинский университет имени И.М.Сеченова
Защита состоится «__»____________2015 г. в ___часов на заседании
Диссертационного совета ГБОУ ВПО РНИМУ имени Н.И.Пирогова Д
208.072.14 по биологическим и медицинским наукам по адресу: 117997, гор.
Москва, Островитянова, д.1
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО РНИМУ
им.Н.И.Пирогова МЗ РФ по адресу: 117997, г.Москва, ул.Островитянова, д.1
Автореферат разослан «__» ________ 2015 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор медицинских наук
Кягова А.А.
CПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
МРТ - магнитно-резонансная томография
ЦНС - центральная нервная система
ГЭБ – гематоэнцефалический барьер
Gd3+ – гадолиний (III)
PLL - полилизин
DTPA - диэтиленпентауксусная кислота
DOTA - 1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота
GFAP – глиофибриллярный кислый белок
Сх43 – коннексин 43
mAb anti-Cx43 - моноклональные антитела к коннексину 43
mAb anti-GFAP - моноклональные антитела к глиофибриллярному кислому
белку
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования
В настоящее время особую сложность в плане диагностики с помощью магнитнорезонансной томографии (МРТ) представляют заболевания центральной нервной системы
(Giesel et al. 2010). Для улучшения визуализации патологических очагов используются
контрастные агенты - вещества, влияющие на скорость релаксации протонов воды в
окружающих тканях и, тем самым, увеличивающих контраст между тканями на
изображении. Одними из наиболее хорошо изученных и эффективных контрастных
агентов для МРТ диагностики являются препараты на основе хелатных комплексов
гадолиния (III) (Burtea et al. 2008). Образование хелатных комплексов позволяет
многократно снизить токсичность Gd3+ и использовать такие комплексы в качестве
контрастного агента. Начиная с 1980-х годов применение хелатов Gd3+ привело к
значительному улучшению диагностики заболеваний ЦНС. Введение препаратов
пациентам с онкологическими заболеваниями позволило выявить метастазирование
опухоли в головной мозг, незамеченное другими методами исследования (Claussen et al.
1985).
Также
с
помощью
контраст-усиленной
МРТ
была
впервые
показана
множественность поражения головного мозга у пациентов с рассеянным склерозом (Rocca
et al. 2013). Однако, несмотря на достигнутые результаты, высокие дозы вводимых
препаратов и неспецифическое их распределение в организме оставляет открытым вопрос
разработки более эффективных контрастных агентов. На сегодняшний день существуют
различные подходы к улучшению свойств контрастирующих веществ: от конъюгации
хелатов
гадолиния
с
мультифункциональных
макромолекулами
систем
для
и
наночастицами
комбинированной
до
использования
визуализации
различными
методами (ПЭТ/МРТ (Kjaer et al. 2013), МРТ/флюоресцентная визуализация (Huang et al.
2013) и др.). Повышение чувствительности метода и улучшение физико-химических
свойств препаратов позволяет снизить вводимые дозы (Mitsumori et al. 2014), однако,
остается
актуальной
проблема
направленной
доставки
контрастных
агентов
и
селективности визуализации патологического очага. Неспецифическое распределение в
организме применяемых в клинике препаратов приводит к низкому уровню накопления и
недостаточной концентрации контрастных агентов в зоне патологического очага.
Создание систем направленной визуализации поражений ЦНС, способных селективно
связываться с нейроспецифичными антигенами клеток-мишеней, позволит увеличить
диагностическую и прогностическую ценность магнитно-резонансной томографии (Singh
& Lillard 2009). Векторизация контрастных агентов может быть выполнена за счет
конъюгации с низкомолекулярными лигандами (фолиевая кислота, RGD пептид,
аптамеры) или более крупными молекулами (например, моноклональные антитела). В
качестве перспективных мишеней для диагностики патологических процессов ЦНС
особый интерес представляют белки, экспрессия которых повышена при повреждении
нервной ткани в ходе развития заболевания. Так, диагностика опухолевых заболеваний
головного мозга может быть значительно улучшена за счет селективного связывания
контрастного агента с коннексином 43 (Сх43) – основным белком коннексонов,
структурной единицы щелевых контактов, высокоэкспрессированного на периферии
глиомы. В качестве белка-мишени для диагностики поражений ЦНС, в том числе
нейродегенеративных
изменений
ткани,
большой
интерес
представляет
глиофибриллярный кислый белок (GFAP). GFAP был впервые выделен у пациента с
рассеянным склерозом в 1959 году и является белком промежуточных филаментов в
цитоскелете
дифференцированных
астроцитов,
основным
маркером
реактивного
астроглиоза. Высокая селективность моноклональных антител к GFAP позволяет
рассматривать их в качестве перспективного вектора для конъюгации с контрастными
агентами для специфичной визуализации патологических очагов ЦНС (демиелинизации,
воспаления и др.). Таким образом, для улучшения диагностики опухолевых и
демиелинизирующих заболеваний головного мозга необходимо создание контрастных
агентов,
способных
селективно
связываться
с
белками-мишенями,
высокоэкспрессированными при заболеваниях ЦНС, и обладающих улучшенными
физико-химическими свойствами по сравнению с существующими аналогами. Данный
подход позволит улучшить не только первичную диагностику социально значимых
заболеваний ЦНС, но и оценить их течение и эффективность терапии (Poloni et al 2011,
Zhou & Lu 2012).
Цель работы:
Изучение перспектив применения конъюгатов на основе моноклональных антител
(mAb anti-GFAP и mAb anti-Cx43)
и хелатных комплексов гадолиния для МРТ
диагностики экспериментальных опухолей и демиелинизирующих заболеваний ЦНС.
Задачи:
1. Охарактеризовать и валидировать модели рассеянного склероза на мышах линии
С67BL/6 и мультиформной глиобластомы на крысах линии Wistar.
2. Разработать метод синтеза высокоселективных контрастных препаратов на основе
моноклональных антител (mAb anti-GFAP и mAb anti-Cx43) и хелатных
комплексов гадолиния.
3. Охарактеризовать
полученный
векторный
контрастирующий
препарат
по
следующим параметрам: 1) иммунохимическая активность конъюгата антител с
гадолинием; 2) релаксивность; 3) количество гадолиния на молекулу контрастного
агента; 4) цитотоксичность; 5) стабильность.
4. Оценить специфичность и эффективность связывания с антигеном антител,
конъюгированных с контрастным агентом, на культуре опухолевых клеток глиомы
и астроцитов человека in vitro.
5. Оценить селективность накопления синтезированных векторных контрастных
препаратов в опухолевой ткани крыс с экспериментальной ортотопической С6
глиомой при системном введении.
6. Оценить эффективность визуализации патологических очагов с помощью
полученных контрастных препаратов на мышах с купризон-индуцированной
демиелинизацией.
Научная новизна:
Продемонстрировано, что конъюгация моноклональных моноклональных антител
;анти-GFAP и анти-Cx-43) с контрастным агентом на основе модифицированных
полилизином
хелатных
комплексов
гадолиния
позволяет
получить
векторный
контрастирующий препарат, селективно накапливающийся в экспериментальной глиоме
С6 и очагах демиелинизации, а также достоверно улучшающих их МРТ визуализацию.
Практическая значимость:
Разработанный метод синтеза высокоселективных контрастирующих конъюгатов на
основе моноклональных анти-GFAP, анти-Cx-43 антител и хелатных комплексов
гадолиния позволяет получать эффективные визуализирующие препараты для МРТ
диагностики опухолей и демиелинизирующих заболеваний ЦНС.
Апробация, внедрение, публикации:
Апробация работы. Основные положения работы представлены и обсуждены на 25
российских и международных конференциях, в том числе: на VI-IX Международных
Пироговских научных медицинских конференциях студентов и молодых ученых (Москва,
2011-2014), на 2-ой Международной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых
системах. Безопасность и наномедицина» (Москва, 2011), на международном конгрессе
«Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2012), ХIХ-XXI
международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных
«Ломоносов»
(Москва,
2012-2014),
VII-VIII
Всероссийских
конференциях
с
международным участием молодых ученых по химии «Менделеев» (Санкт-Петербург,
2013 г. и 2014 г.), 10-ом Международном симпозиуме «Полимерные терапевтические
препараты: из лаборатории в клиническую практику» (Валенсия, Испания, 2014), на 12-ой
международной
конференции
«Наноструктурированные
материалы
NANO
2014»
(Москва, 2014) и 6-ой конференции «Наноматериалы: исследование и применение» (Брно,
Чехия, 2014), научной конференции имени Гордона «Наноматериалы в онкологии»(Вест
Довер, Вермонт, США, 2015).
Апробация работы была проведена на заседании Проблемного совета отдела
фундаментальной и прикладной нейробиологии ФГБУ «ФМИЦПН имени В.П.
Сербского» Минздрава РФ.
Внедрение:
Результаты исследования внедрены в лекционные курсы МГУ им.М.В.Ломоносова
и научную-практическую работу НИТУ «МИСиС».
Публикации
По материалам диссертации опубликовано 26 работ, из них 5 статей в ведущих
российских рецензируемых журналах, 2 статьи в зарубежном журнале, 19 тезисов в
материалах российских и международных конференций и симпозиумов.
Объем и структура диссертации:
Диссертация изложена на 111 машинописных страницах; состоит из введения, трех
глав, выводов, практических рекомендаций, библиографического указателя. В основных
главах работы приведены данные обзора литературы, характеристика объекта, методов
исследования, а также используемого материала, результаты собственных исследований и
их обсуждение. Диссертация иллюстрирована 33 рисунками и 3 таблицами.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Синтез контрастного агента
Для достижения цели настоящего исследования было разработано пять различных
методических протоколов для синтеза Т1-контрастного агента с улучшенными значениями
релаксивности и высокой селективностью к патологическим очагам опухолевых и
демиелинизирующих заболеваний головного мозга.
Релаксивность представляет собой удельную способность вещества изменять
времена релаксации протонов воды в окружающих тканях и является основным
параметром, характеризующим эффективность контрастного агента. В настоящем
исследовании
для
увеличения
значений
данного
параметра
по
сравнению
с
коммерческими аналогами были выбраны два похода: использование хелатирующих
агентов с различным координационным числом (DTPA или DOTA) и конъюгация c
макромолекулами (полилизин). Увеличение селективности контрастных агентов было
достигнуто за счет конъюгации полученных контрастных агентов с моноклональными
антителами, в высокой экспрессии представленных при опухолевых (mAb anti-Cx43) и
демиелинизирующих заболеваниях (mAb anti-GFAP).
Для синтеза контрастных агентов была использована различная степень
модификации NH2-групп полилизина молекулами хелатирующего агента, DTPA или
DOTA (10% или 100% степень модификации), и варьировались условия проведения
реакции (ДМСО или H2O). Cинтез контрастного агента «ветвистого типа» был
осуществлен за счет присоединения дополнительных цепей полимера с хелатирующим
агентом к свободным карбоксильным группам DTPA, конъюгированным с другим
полимером. На всех стадиях полученные контрастные агенты очищали от несвязавшихся
реагентов методом гель-фильтрационной хромотографии (Сефадекс G-25 и Cефароза CL6B, 0,1 M HEPES). В результате были получены следующие конъюгаты: 1) PLL-DTPA-Gd
10%; 2) PLL-DTPA-Gd 100%; 3) PLL-DOTA-Gd 100%; 4) PLL-DTPA-Gd 100% (ДМСО) и
5) контрастный агент «ветвистого типа»
Полученные контрастные агенты конъюгировали с моноклональными антителами к
Сх43 или GFAP с помощью водорастворимого карбодиимида (мольное соотношение
[mAb]: [PLL-DTPA] 1: 5 или 1:10), загружали гадолинием и очищали с помощью гельфильтрационной хроматографии (Cефароза CL-6B, 0,1 M HEPES), фильтровали
(шприцевые фильтры Fisherbrand, 0,45 мкм) и хранили при +4ºС.
Далее нами была поставлена задача сравнить методические протоколы по основным
критериям, характеризующим контрастные агенты: 1) релаксивности; 2) процент загрузки
гадолиния;
3)
иммунохимической
активности
антител;
4)
цитотоксичности;
5)
стабильности. На основании полученных результатов предполагалось выбрать наилучший
препарат и оценить его эффективность в экспериментах in vitro и in vivo.
Рисунок 1. Общая схема синтеза контрастного агента.
Характеристика контрастного агента
Значения релаксивности полученных контрастных агентов определяли на 7Tтомографе фирмы Bruker, согласно описанной методике (Tamura et al. 1995). Как видно из
Таблицы 1, релаксивность полученных контрастных агентов сопоставима или
превосходит
значения
релаксивности
коммерческого
аналога
Магневист®,
и,
следовательно, данные препараты могут быть рассмотрены в качестве возможного
контрастного агента для МРТ. Статистическая достоверность полученных результатов
была подтверждена с помощью однофакторного дисперсионного анализа. Было показано,
что PLL-DTPA-Gd 10%, PLL-DTPA-Gd 100% и PLL-DOTA-Gd 100% имеют статистически
значимо более высокие значения релаксивности, чем остальные препараты, и могут быть
использованы для дальнейших экспериментов in vitro и in vivo.
Таблица 1. Значения релаксивности для препаратов Т1-контрастного агента PLL-DTPAGd 10%, PLL-DTPA-Gd 100%, контрастного агента "ветвистого типа", PLL-DTPA-Gd
100% (ДМСО), также PLL-DOTA-Gd.
№
Название
контрастного агента
Среднее значение
релаксивности,
ммоль-1сек-1
1
Магневист
4,2±0,15
2
PLL-DTPA-Gd 10%
5,5±0,17
3
PLL-DTPA-Gd 100%
6,5±0,35
4
КА "ветвистого типа"
4,1±0,51
5
PLL-DTPA-Gd 100% ДМСО
4,2±0,75
6
PLL-DOTA-Gd 100%
8,0±0,25
Определение содержания гадолиния в полученных образцах с известной массой
(так называемая ёмкость загрузки) проводили методом рентгенофлуоресцентного анализа.
Было обнаружено, что наибольшими значениями емкости загрузки обладает образец PLLDTPA-Gd 100% (до 20% Gd в образце) по сравнению с PLL-DOTA-Gd 100% (12-15%) и
PLL-DTPA-Gd 10% (до 5%).
Иммунохимическая активность соответствующих антител (mAb anti-Cx43 или mAb
anti-GFAP), конъюгированных с контрастными агентами при различном соотношении
[mAb]:[PLL-DTPA]=1:5 или 1:10, была исследована методом иммуноферментного анализа
сразу после конъюгации, через неделю, а также после хранения в течение месяца, -20ºС
или лиофилизации. Было обнаружено, что сразу после конъюгации моноклональные
антитела сохраняют до 85% своей активности и до 75-80% активности при различных
условиях хранения (+4°С в течение 10 дней, -20°С в течение месяца, после
лиофилизации), что позволяет рассматривать исследуемые условия хранения в качестве
рекомендуемых.
Для более полной характеристики контрастного агента нами был проведен
аминокислотный анализ контрастных агентов. Было показано, что в случае конъюгации
PLL-DOTA-Gd 100% с моноклональными антителами к одной молекуле антитела
присоединяется 17 цепочек полилизина, что сопровождается увеличением молекулярной
массы контрастного агента (920 кДа). Высокий молекулярный вес, а также большее
количество цепей полилизина на одну молекулу антитела может объяснять повышение
значений релаксивности для данного конъюгата (до 8 ммоль -1сек-1) по сравнению со
значениями релаксивности коммерческого аналога Магневист® (4 ммоль -1сек-1). Для
конъюгатов контрастного агента с 10% или 100% модификацией лизина DTPA (mAb-PLLDTPA-Gd 10%, mAb-PLL-DTPA-Gd 100%) на одно антитело приходится 12 цепей
полилизина с DTPA, что, в зависимости от количества DTPA, соответствует
молекулярному весу 450 кДа (для 10% модификации остатков лизина) и 850 кДа (для
100% модификации лизина).
Для оценки степени модификации полилизина молекулами DTPA также был
проведен ЯМР-анализ контрастного агента PLL-DTPA-Gd 100%. Было показано, что в
случае наибольшей конъюгации DTPA на полилизин (100%) происходит модификация
около 50% аминогрупп PLL, что объясняет полученные выше значения емкости и
эффективности загрузки контрастного агента гадолинием.
Анализ цитотоксичности препаратов с помощью MTT-теста
Следующим шагом на пути к применению гадолиний-содержащих препаратов в
качестве Т1-контрастного агента является оценка их цитотоксичности. Цитотоксичность
полученных препаратов оценивали с помощью МТТ-теста. МТТ-тест основан на
способности
восстанавливать
бесцветную
соль
тетразолия
(МТТ-реагент)
митохондриальными и цитоплазматическими дегидрогеназами живых метаболически
активных клеток до нерастворимого остатка – формазана. Полученные препараты (mAbPLL-DTPA-Gd
10%,
mAb-PLL-DTPA-Gd
100%
и
mAb-PLL-DOTA-Gd
100%)
инкубировали в концентрации до 0,5 мг Gd3+/мл с клетками эмбрионального почечного
эпителия человека (HEK293, 2,5*104 клеток на лунку) в течение 24 часов. В качестве
контроля использовали клетки, которые не подвергались действию контрастных агентов
(100% выживших клеток).
Рисунок
2.
Цитотоксичность
препаратов контрастных агентов
1) mAb-PLL-DOTA-Gd 100%, 2)
mAb-PLL-DTPA-Gd 100% и 3)
mAb-PLL-DTPA-Gd
10%
по
отношению к клеткам культуры
HEK293.
Было показано, что среди
полученных препаратов контрастного агента только образец mAb-PLL-DTPA-Gd 10%
является токсичным (IC50 = 4 мкг Gd/мл) (Рисунок 2). Токсичность данного контрастного
агента можно связать с высоким
удельным положительным зарядом свободных
аминогрупп полилизина (Arnold et al. 1979). Препараты mAb-PLL-DTPA-Gd 100% и mAbPLL-DOTA-Gd 100% оказались нетоксичны при максимальной концентрации гадолиния
до 0,5 мг/мл, что в несколько раз превышает концентрацию Gd3+ в крови при применении
рекомендуемых доз контрастного агента в клинике у пациентов. Таким образом, для
дальнейших экспериментов были выбраны два препарата mAb-PLL-DTPA-Gd 100% и
mAb-PLL-DOTA-Gd
100%,
обладающие
наименьшей
токсичностью
и
высокими
значениями релаксивности.
Исследование специфичности контрастного агента на культуре клеток глиомы С6 и
астроцитов человека
Для получения четкого контрастного изображения патологических очагов ЦНС
вводимый
Т1-контрастный
релаксивности,
но
и
агент
должен
способность
иметь
не
специфически
только
высокие
связываться
с
значения
рецепторами,
высокоэкспрессированными на клетках, формирующих патологический очаг. C этой
целью был проведен иммунофлюоресцентный анализ синтезированных препаратов на
культуре астроцитов человека, экспрессирующих глиофибриллярный кислый белок, и
клетках глиомы С6, высокоэкспрессирующих белок щелевых контрактов Cx43. Для этого
клетки фиксировали, инкубировали с экспериментальными образцами в течение часа,
добавляли флуоресцентно-меченые вторичные антитела (козьи антитела к Fc-фрагменту
антител мыши, конъюгированные с Alexa 594 (для mAb anti-GFAP) или Alexa 488 (для
mAb anti-Cx43), Life Technologies).
Рисунок 3. Иммунофлюоресцентный
анализ Т1-контрастного агента на
фиксированных клетках глиомы С6.
Специфический контрастный агент
mAb anti-Cx43-PLL-DTPA-Gd (панель
А), неспецифический IgG-PLL-DTPAGd (панель Б) и PLL-DTPA-Gd
(панель
B)
инкубировали
с
вторичными козьими анти-мышиными
антителами с Alexa 488. Ядра
докрашивали DAPI.
Было показано, что контрастный агент, конъюгированный со специфическими
антителами
к
Cx43,
накапливается
клетками
гораздо
лучше,
чем
препарат,
конъюгированный с неспецифическими иммуноглобулинами, или контрастный агент без
антител (Рисунок 3). Аналогичные результаты были получены для контрастного агента,
конъюгированного со специфическими антителами к GFAP (Рисунок 4А), по сравнению с
неспецифическим контрастным агентом (IgG-PLL-DTPA-Gd), Рисунок 4Б.
Рисунок
4.
Иммунофлюоресцентный анализ Т1контрастного
агента,
конъюгированного
со
специфическими антителами
mAb
anti-GFAP
(А)
и
неспецифическими IgG (Б) на
культуре
астроцитов
человека.
Клетки
фиксировали и инкубировали
с козьими антителами к IgG
мыши, коньюгированные с
Alexa 594). Ядра докрашены
DAPI.
Для подтверждения того, что вся конструкция полученного контрастного агента
способна связываться с клетками, мы провели двойной иммунофлюоресцентный анализ
на живых клетках линии глиомы С6. Для этого флюоресцентно-меченый контрастный
агент добавляли к культуре опухолевых клеток, инкубировали в течение 45 минут и
добавляли вторичные антитела (козьи антитела к Fc-фрагменту антител мыши,
конъюгированные с Alexa 594). Полученные данные подтвердили предыдущие результаты
иммунофлюоресцентного анализа на фиксированной клеточной культуре: агент mAb antiCx43-PLL-DTPA-Gd специфически связывался с антигеном на мембране клеток глиомы
С6 по сравнению с IgG-PLL-DTPA-Gd. Колокализация двух меток (флуоресцеина и Alexa
594) подтверждает стабильность контрастного агента, конъюгированного с антителами:
PLL-DTPA-Gd остается стабильно связанным с антителом (Рисунок 3Б).
Рисунок
5.
Иммунофлюоресцентный
анализ
Т1 контрастного агента на живых
клетках
глиомы
С6.
Специфический
контрастный
агент
mAb
anti-Cx43-PLLDTPA-Gd
(панель
А)
и
неспецифический
IgG-PLLDTPA-Gd
(панель
Б),
конъюгировали
с
флуоресцеином
и
инкубировали
с
клетками
глиомы С6 в течение 45 минут, фиксировали, инкубировали с вторичными козьими антимышиными антителами с Alexa 594. Ядра докрашивали DAPI.
Для количественной оценки связывания полученных конъюгатов с клетками
использовали метод проточной цитофлуориметрии. В данном эксперименте к Т1контрастному агенту ковалентно присоединяли флуоресцеин, конъюгировали со
специфическими моноклональными антителами и оценивали специфичность связывания
опытного образца по сравнению с тем же контрастным агентом, конъюгированным с
неспецифическими иммуноглобулинами мыши. Как видно из Рисунка 6, захват клетками
контрастного агента, конъюгированного со специфическими антителами, значительно
превышает
захват
иммуноглобулинами.
контрастного
Это
агента,
свидетельствует
конъюгированного
о
высокой
с неспецифическими
аффинности
полученного
векторного контрастного агента. Также стоит отметить, что данный эффект зависит от
времени инкубации и концентрации контрастного агента. Так, захват клетками
специфического конъюгата был в 4 раза выше, чем препарата, конъюгированного с
неспецифическими IgG через 30 минут инкубации (Рисунок 6А). Как и ожидалось,
разница в накоплении уменьшалась при возрастании концентрации контрастного агента (
с 1 до 5 ммоль), Рисунок 6А. Более того, увеличение времени инкубации привело к
уменьшению разницы между специфическими и неспецифическими конъюгатами, что
объясняется насыщением клеток глиомы С6 препаратом, Рисунок 6Б.
%
по
ло
ж
ит
ел
ьн
ы
х
кл
ет
ок
A
%
по
ло
ж
ит
ел
ьн
ы
х
кл
ет
ок
Концентрация контрастного агента
(мкмоль)
Б
Концентрация контрастного агента
(мкмоль)
Рисунок 6. Анализ захвата клетками глиомы С6 контрастного агента, конъюгированного
со специфическими антителами (красным цветом) и контрастного агента,
конъюгированного c неспецифическими иммуноглобулинами (синим цветом) после 30
минут (А) и 1 часа (Б) инкубации.
Кроме таких важных параметров как сохранение иммунохимической активности и
увеличение релаксивности препаратов, важным аспектом является стабильность
контрастных агентов. Нами было показано, что полученные конъюгаты способны
сохранять иммунохимическую активность конъюгированных антител в буфере при
различных условиях хранения (4°С, 10 дней или -20°С, месяц), а также после
лиофилизации. Однако, помимо этого крайне важно оценить стабильность полученных
препаратов не только в буферном растворе, но также в сыворотке крови. В связи с этим,
полученные контрастные агенты были проинкубированы с сывороткой крови крысы (10%,
24 часа, 37°С), а также в буфере (HEPES, 4°С, 10 дней). В течение указанного срока в
растворе не наблюдалось преципитации, а также видимых агломератов препаратов, что
позволяет рассматривать исследуемые условия в качестве рекомендаций по хранению
контрастных
агентов.
На
основании
полученных
результатов
для
дальнейших
экспериментов были выбраны два препарата - mAb-PLL-DTPA-Gd 100% и mAb-PLLDOTA-Gd 100%.
Данные контрастные агенты обладают наибольшими значениями
релаксивности (до 8 ммоль-1сек-1), стабильностью, не токсичны в концентрациях,
используемых для диагностики (до 0,5 мг Gd/мл), и специфично связываются с клетками,
гиперэкспрессирующими
белки-мишени
для
направленной
визуализации
(Сх43-
позитивными клетками глиомы С6 или GFAP-положительными астроцитами человека).
Оценка эффективности препаратов in vivo
Для оценки эффективности разработанных контрастных агентов было проведено
моделирование патологических очагов ЦНС: интракраниальной глиомы С6 и купризониндуцированной модели рассеянного склероза. Была проведена полная характеристика
данных моделей (МРТ, гистологический и иммунохимический анализ срезов головного
мозга животных, ПЦР), оценена динамика развития патологических очагов и степень
экспрессии белков-мишеней. На основании полученных данных были выбраны сроки
введения препаратов животным с моделями глиомы С6 (14 сутки после стереотаксической
имплантации клеток) и купризон-индуцированной демиелинизации (на 4 неделе диеты
кормом, содержащим купризон).
Визуализация глиомы С6 in vivo с помощью T1-контрастных агентов
Для исследования возможностей диагностирования глиомы с помощью созданного
векторного Т1-контрастного агента мы использовали экспериментальную модель глиомы
С6 на крысах и различные типы агентов: специфический mAb anti-Cx43-PLL-DTPA-Gd
100%, неспецифический IgG-PLL-DTPA-Gd 100% и коммерческий препарат Магневист®.
Все агенты вводили в бедренную вену в концентрации гадолиния 0,05 ммоль/кг и
анализировали динамику накопления контрастного агента в головном мозге методом
МРТ.
МР-сканирование
головного
мозга
крыс
после
внутривенного
введения
специфического контрастного агента показало значительное усиление контраста на Т1взвешенных изображениях глиомы С6 по сравнению с контролем (Рисунок 7).
Рисунок 7. Т1-взвешенные
изображения мозга крыс
до и спустя 24 часа после
введения
Сх43-специфического контрастного
агента,
IgG-неспецифического контрастного
агента и коммерческого
аналога Магневист. T2взвешенные изображения
были получены на 14 день
после
имплантации
глиомы
с
целью
верификации
развития
опухоли.
Количественную оценку эффективности контрастных веществ проводили путем
измерения показателя контраст/шум (CNR). На ранних сроках (до 1 ч после инъекции) не
было существенных различий в накоплении между Cx43-специфическим контрастным
агентом и введенными контролями (все показали повышение CNR примерно в 1,5 раза по
сравнению с первоначальной интенсивностью сигнала), Рисунок 8А. Для Cx43специфического агента CNR значения увеличивались с течением времени, что указывает
на более контрастную визуализацию опухолевой ткани, и имели максимальное различие с
контрольной группой (более чем в 2 раза) через 24 ч после инъекции (Рисунок 8А).
Интересно, мы отметили резкое снижение CNR значений для неспецифических IgGконъюгатов через 1 ч после их инъекции, в то время как в случае Магневист® это
снижение CNR было более замедленное.
Рисунок 8. Графики изменения во времени: А) коэффициента контрастность/шум
(СNR) и Б) относительной визуализируемой области глиомы после внутривенного
введения 1) Сх43-специфического контрастного агента, 2) коммерческого аналога
Магневист® и 3) IgG-неспецифического контрастного агента. Данные представлены как
среднее ± SEM (n=4), * р <0,05, ** р <0,01, NS – нет статистических различий.
Кроме этого, было отмечено значительное увеличение визуализируемых границ
опухоли на МР-изображении через 24 ч после введения векторного Т1-контрастного
агента. Для Cx43-специфического контрастного агента оно составило 175 % от
первоначального размера опухоли до введения препарата (Рисунок 8Б) по сравнению с
коммерческим аналогом Магневист® и неспецифическим контрастным агентом (120 % и
95 % от размера опухоли до введения препарата, соответственно). Интересно, что первые
4 часа не было никаких существенных различий в визуализируемой площади опухоли
между Cx43-специфическим агентом и Магневист® (оба улучшали визуализацию границ
опухоли на 30%), в то время как неспецифический контрастный агент не изменил
визуализируемый объем глиомы (95% от начального объема), Рисунок 8Б. Эти данные
подтверждают, что векторные Т1 контрастные агенты способны улучшать визуализацию
глиомы С6 через 24 часа после в/в введения и более четко определять реальные границы
опухоли.
Визуализация очагов демиелинизации in vivo с помощью T1-контрастных агентов
Эффективность визуализации очагов демиелинизации исследовали на 4 неделе
моделирования путем внутривенного введения контрастного агента, конъюгированного с
антителами к GFAP, в дозе 0,2 ммоль Gd/кг. В качестве контроля использовали
контрастные агенты, конъюгированные с неспецифическими иммуноглобулинами мыши,
а также коммерческий аналог Омнискан®. Для этого были получены Т 2-взвешенные
изображения и Т1-взвешенные изображения до введения препарата, а также через 1, 5, 24
часов после введения. С целью количественной оценки на Т 1-взвешенных изображениях
анализировали отношение контраст/шум (CNR) Значения CNR в 1, 5, 24 часы после
введения контрастного агента представлены в процентном соотношении по отношении к
значению CNR до введения контраста. Было показано, что значения CNR через 5 часов
после введения GFAP-специфического контрастного агента в 3 раза превышают данный
параметр по сравнению с контрастным агентом, конъюгированным с неспецифическими
IgG, или коммерческим аналогом Омнискан® (Рисунок 9).
Рисунок 9. Графики изменения во
времени:
коэффициента
контрастность/шум (СNR) в течение,
до введении и 24 часов после введения
GFAP-специфического контрастного
агента в дозе 0,2 ммоль Gd/кг (GFAP
0,2),
коммерческого
аналога
Омнискан® (Omniscan 0,2) и IgG
неспецифичеcкого
контрастного
агента (IgG 0,2).
Полученные
данные,
демонстрирующие
высокий
уровень
накопления
макромолекулярных векторных контрастных агентов, можно объяснить с помощью
совместного эффекта двух механизмов доставки препаратов: пассивной доставки за счет
длительного времени циркуляции контрастного агента в крови и активной доставки за
счет специфического связывания контрастного агента с соответствующим антигеноммишенью на клетках (Cx43 или GFAP). Недостаточное накопление коммерческого
аналога Магневист® может быть связано с его быстрой элиминацией из мозга и
неспецифическим накоплением в окружающих тканях. В случае контрастного агента,
конъюгированного
с неспецифическими
иммуноглобулинами,
феномен
снижения
соотношения коэффициента контраст/шум может быть связано с неспецифическим
распределением контрастного агента и его захватом клетками ретикуло-эндотелиальной
системы.
Оценка накопления контрастного агента
Анализ накопления специфических и неспецифических контрастных агентов в
очаге экспериментальной глиомы С6 у крыс через 24 часа после в/в введения был
проведён с помощью IVIS Spectrum CT. Из Рисунка 10 видно преимущественное
накопление в опухоли и периопухолевом пространстве Сх43-специфических контрастных
агентов по сравнению с контролем (Alexa647-PLL-DTPA-IgG, Alexa647-PLL-DTPA).
Рисунок 10. Флюоресцентный анализ
накопления
Сх43-специфического
(mAb anti-Cx43 PLL-DTPA-Gd) и
неспецифического
контрастных
агентов
(IgG-PLL-DTPA-Gd)
в
головном мозге крыс с глиомой С6
через 24 часа после в/в введения,
полученный с помощью системы IVIS
Spectrum CT (А) и срезов головного
мозга с помощью флуоресцентного
микроскопа DMI 6000, Leica (Б).
Контроль - мозг крысы, которой не
вводили никакие агенты. Сх43специфические и неспецифические
контрастные
агенты
были
конъюгированы с флуоресцентной
меткой Alexa 647, ядра докрашены
DAPI.
Стоит отметить, что при моделировании глиомы С6 наряду с интракраниальными
иногда образуются экстракраниальные опухоли. Мы обнаружили, что при наличии
экстракраниальной опухоли накопление контрастного препарата происходит в большей
степени в ней (Рисунок 11). Если сравнить интенсивности в области интереса (ROI), то
видно, что при одинаковом накоплении агентов в интракраниальной глиоме (Рисунок 11,
нижняя панель), накопление в экстракраниальной глиоме выше в 7,5 и 25 раз для
неспецифического и Сx43-специфического агентов, соответственно.
При этом Сx43-
специфического агента накопилось в экстракраниальной глиоме в 3 раза больше, чем
неспецифического.
Рисунок 11. Сравнительное накопление Сx43специфического
и
неспецифического
контрастных агентов в головного мозге крыс с
экспериментальной глиомой С6 раздельно с
экстракраниальной (верх) и интракраниальной
(низ) частью.
Эти данные были также подтверждены с помощью флуоресцентного анализа
срезов головного мозга крыс на микроскопе DMI 6000 (Leica, Германия) (Рисунок 9Б).
Видно, что Сх43-направленные агенты накапливаются в опухоли и особенно интенсивно
накапливаются в периопухолевом
пространстве, где, как известно, происходит
наибольшая экспрессия Сх43 [Baklaushev VP et al., 2011]. Такой картины не наблюдалось
ни для невекторных Alexa647-PLL-DTPA, ни для неспецифических агентов Alexa647-PLLDTPA-IgG. Важно отметить, что обнаружен захват векторных контрастных агентов
опухолевыми клетками перитуморального пространства, где происходит инфильтрация и
миграция глиомных клеток в окружающие ткани (Рисунок 10Б). Следовательно, Сх43направленные агенты накапливаются не только в опухолевом очаге, но и доходят до
удаленных участков, где также лучше визуализируют границы опухоли. После
хирургического
удаления
опухолей
мозга,
именно
сохранившиеся
клетки
периопухолевого пространства являются причиной рецидивов. Интенсивная инвазия и
миграция глиомных клеток в паренхиму нервной ткани обеспечивает резистентность и
быструю прогрессию опухолей мозга. Поэтому возможность селективной диагностики
таких областей может значительно повысить эффективность лечения. Кроме этого,
данный агент (mAb anti-Cx43-PLL-DTPA-Gd) позволил значительно уменьшить вводимую
дозу при сохранении соответствующего уровня визуализации (0,05 по сравнению с 0,1
ммоль Gd/кг), используя в качестве вектора моноклональные антитела к Сх43.
Таким образом, использование векторных молекул к целевым белкам для
направленной доставки контрастных агентов и молекулярной визуализации является
многообещающим
направлением
в
диагностике
заболеваний
ЦНС.
Векторные
контрастные агенты обладают важными преимуществами, такими как антигеннаправленное накопление в патологическом очаге, низкая токсичность, высокие значения
релаксивности и стабильность. Применение таких контрастных направленных систем
позволит улучшить качество молекулярной визуализации и неинвазивной диагностики
заболеваний ЦНС.
Выводы:
1.
Ковалентная конъюгация анти-GFAP и Сх43 моноклональных антител и комплекса
PLL-DTPA-Gd позволяет получать стабильные в растворе конъюгаты, сохраняющие
иммунохимическую активность (до 8510% от первоначальной активности антител) и
обладающие высокими значениями релаксивности 8,00,15 ммоль-1сек-1.
2.
Иммунофлюоресцентный анализ GFAP выявил высокий уровень его экспрессии в
реактивных астроцитах в процессе ремиелинизации при купризоновом моделировании
рассеянного склероза на мышах линии С57Bl/6J, а также гиперэкспрессию Сх43
в
культуре глиомных клеток, а также на периферии опухоли при моделировании
глиобластомы на крысах линии Wistar.
3.
Иммунофлюоресцентный анализ взаимодействия конъюгатов контрастного агента
на основе PLL-DTPA-Gd с Сх43 и анти-GFAP моноклональными антителами выявил
высокую специфичность и эффективность связывания с соответствующими антигенамимишенями, экспрессированными на клетках глиомы С6 и астроцитах человека
соответственно.
4.
Векторные Т1-контрастные агенты на основе анти-Cx43 моноклональных антител
способны улучшать визуализацию глиомы С6 через 24 часа после в/в введения и
эффективнее контрастировать реальные границы опухоли. MРТ - количественная оценка
эффективности
векторных
контрастных
веществ,
проведенная
путем
измерения
показателя контраст/шум (CNR), показала более чем двукратное увеличение этого
показателя в глиоме по отношению к контрольной группе через 24 ч после введения.
Иммунофлюоресцентный анализ показал увеличение накопления препарата в головном
мозге в 5 раз по сравнению с невекторным контрастным агентом и в 3 раза по сравнению с
контрастным агентом, конъюгированным с неспецифическими иммуноглобулинами.
5.
Векторные Т1-контрастные агенты на основе анти-GFAP моноклональных антител
способны улучшать эффективность визуализации очагов демиелинизации при введении
контрастного агента в дозе 0,2 ммоль Gd/кг на 4 неделе моделирования рассеянного
склероза. MРТ - количественная оценка эффективности векторных контрастных веществ,
проведенная путем измерения показателя контраст/шум (CNR), показала более чем
трехкратное увеличение этого показателя в области мозолистого тела через 5 часов после
введения по сравнению с контрастным агентом, конъюгированным с неспецифическими
IgG, или коммерческим аналогом Омнискан®.
Список публикаций, опубликованных по теме диссертации:
1. Cандалова, Т.О. Опухоль-специфичный контрастный агент на основе
суперпарамагнитных наночастиц оксида железа для визуализации глиом методом
магнито-резонансной томографии / М.А.Абакумов, Н.Ф.Гриненко, В.П. Баклаушев,
Т.О. Сандалова, Н.В. Нуколова, А.В. Семенова, М. Сокольски-Папков, Х. Вишвасрао,
А.В. Кабанов, В.П. Чехонин // Бюллетень экспериментальной биологии и
медицины. - 2012. - Том 153.-№1.- C. 89-93.
2. Сандалова, Т.О. Визуализация экспериментальной глиомы С6 методом магнитнорезонансной томографии с помощью суперпарамагнитных наночастиц оксида железа,
конъюгированных с моноклональными антителами к фактору роста эндотелия сосудов
/ М.А. Абакумов, С.А. Шеин, Х. Вишвасрао, Н.В. Нуколова, М. Сокольски-Папков,
Т.О. Сандалова, И.Л. Губский, Н.Ф. Гриненко, А.В. Кабанов, В.П. Чехонин //
Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2012.- Том 154.- №2.- C.274277
3. Абакумова, Т.О. Адресная доставка цисплатина с помощью коннексин–43–векторных
наногелей в очаг экспериментальной глиомы С6 / Н.В. Нуколова, В.П. Баклаушев, Т.О.
Абакумова, П.А. Мельников, М.А. Абакумов, Г.М. Юсубалиева, Д.А. Бычков, А.В.
Кабанов, В.П. Чехонин // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.2014. - Том 157.- № 4 - C.524-529
4. Абакумова, Т.О. Контрастные веществ для магнитно-резонансной томографии при
диагностике рассеянного склероза / Т.О.Абакумова, Н.В. Нуколова, Е.И. Гусев,
В.П.Чехонин // Журнал неврологии и психиатрии имени С.С.Корсакова. - 2015. Том 115. - №1. - C.58-65
5. Абакумова, T.O. Купризоновая модель как инструмент для доклинического
исследования эффективности диагностики и терапии рассеянного склероза. /
Абакумова T.O., Кузькина А.А., Жарова М.E., Поздеева Д.А., Губский И.Л., Шепелева
И.И., Антонова О.М., Нуколова Н.В., Кекелидзе З.И., Чехонин В.П. // Бюллетень
экспериментальной биологии и медицины - 2015.- Том 159.-№ 1, C.111-115
6. Sandalova, T.O. VEGF-targeted magnetic nanoparticles for MRI visualization of brain tumor
/ M.A. Abakumov, N.V. Nukolova, M. Sokolsky-Papkov, S.A. Shein, T.O. Sandalova,
H.Vishwasrao, N.F. Grinenko, I.L. Gubsky, A.M. Abakumov, A.V. Kabanov, V.P.
Chekhonin // Nanomedicine. -2015.- Volume 11.- Issue 4.- P. 825-833
7. Abakumova, T.O. Connexin 43-targeted T1 contrast agent for MRI diagnosis of glioma /
T.O. Abakumova, M.A. Abakumov, S.A. Shein, P.S. Chelushkin, V.Yu. Mukhin, G.M.
Yusubalieva, N.F.Grinenko, A.V. Kabanov, N.V. Nukolova, V.P. Chekhonin // Contrast
media and molecular imaging. 11 Aug 2015. doi: 10.1002/cmmi.1653 (early view)
8. Сандалова, Т.О. T1-контрастный агент на основе полилизина и хелатного комплекса
гадолиний-ДТПА для визуализации опухолевых клеток глиомы С6 / Сандалова Т.О.,
Aбакумов M.A., Н.Ф. Гриненко, Г.М. Юсубалиева, А.В. Кабанов.Сборник материалов
VII Международной (XVI Всероссийская) Пироговской научной медицинской
конференции студентов и молодых ученых. – 2012. - С. 209
9. Сандалова, Т.О. T1-контрастный агент на основе полилизина и хелатного комплекса
гадолиний-ДТПА для визуализации опухолевых клеток глиомы С6 / Сандалова Т.О.,
Нуколова Н.В., Абакумов М.А., Гриненко Н.Ф., Юсубалиева Г.М., Кабанов А.В. и
Чехонин В.П. Сборник материалов международной конференции «Биотехнология состояние и перспективы развития».-2012. - С. 253-256
10. Сандалова, Т.О. T1-контрастный агент на основе полилизина и хелатного комплекса
гадолиний-ДТПА для визуализации опухолевых клеток глиомы С6 / Сандалова Т.О.,
Нуколова Н.В., Абакумов М.А., Гриненко Н.Ф., Юсубалиева Г.М., Кабанов А.В. и
Чехонин В.П. Материалы ХIХ международной научной конференции студентов,
аспирантов и молодых учёных «Ломоносов».-2012.-С.549
11. Sandalova, T.O. T1-contrast agent based on monoclonal antibody for MRI visualization of
tumor cells of glioma / T.O. Sandalova, N.V. Nukolova, M.A. Abakumov, N.F. Grinenko,
D.A. Bychkov, S.A. Shein, A.Y. Morozova, A.V. Kabanov, V.P. Chekhonin // Materials of
3rd Russian-Hellenic symposium with international participation. – 2012.-P.30
12. Сандалова, Т.О. Т1 контрастный агент на основе моноклональных антител для
визуализации опухолевых клеток глиомы С6 методом магнитно-резонансной
томографии / Т.О. Сандалова, Н.В. Нуколова, М.А. Абакумов, Н.Ф. Гриненко, А.В
Кабанов. и В.П. Чехонин // Материалы конференция «Информационные технологии в
медицине ХХI века».-2012.-С.251-252
13. Аbakumova, T.O. Targeted Т1-contrast agent based on monoclonal antibody for MRI
visualization of glioma / T.O. Аbakumova, M.A. Abakumov, S.A. Shein, D.A. Bychkov,
V.E. Mukhin, A.Y. Morozova A.V. , Kabanov, V.P. Chekhonin, N.V. Nukolova //
Материалы VIII Международной (XVII Всероссийской) Пироговской научной
медицинской конференции студентов и молодых ученых.-2013.-C.228-229
14. Сандалова, Т.О. T1-контрастный агент на основе полилизина и хелатного комплекса
гадолиний-ДТПА для визуализации опухолевых клеток глиомы С6 / Сандалова Т.О.,
Нуколова Н.В. // Материалы ХХ международной научной конференции студентов,
аспирантов и молодых учёных «Ломоносов».-2013.-C.652
15. Sandalova, T.O. Tumor specific Т1-contrast agent based on monoclonal antibodies for MRI
visualization of glioma / Sandalova T.O., Abakumov M.A, Bychkov D.A., Grinenko N.F.,
Kabanov A.V.,Chekhonin V.P. and Nukolova N.V. // Материалы VII Всероссийской
конференции молодых ученых, аспирантов и студентов с международным участием по
химии и наноматериалам «Менделеев-2013».-2013.-С.108-109
Абакумова, Т.О. Векторные визуализирующие системы для МРТ диагностики
патологических состояний нервной системы / Т.О. Абакумова Д.А. , Бычков, В.E
Мухин, М.А. Абакумов, Г.М., Юсубалиева, А.В. Кабанов, Н.В. Нуколова, В.П..
Чехонин // Материалы Первой Российской конференции по медицинской химии.2013.-С.191
17. Сандалова, Т.О. МРТ контрастные агенты на основе полилизина и моноклональных
антител / Т.О. Сандалова, Д.А. Бычков, М..А. Абакумов, С.А. Шеин, А.А. Корчагина,
А.В. Кабанов, Н.В. Нуколова, В.П. Чехонин // Материалы Шестой Всероссийской
Каргинской конференция «Полимеры — 2014».-2014.-С.532
18. Абакумова, Т.О. Tаrgeted T1-contrast agent for MRI visualization of demyelination / Т.О.
Абакумова // Материалы VIII Всероссийской конференции с международным
участием молодых ученых по химии «Менделеев 2014».-2014.-С.13-14
19. Абакумова, Т.О. Экспериментальная модель рассеянного склероза: оценка
нейропсихических функций и демиелинизации / М.Е Жарова, Т.О. Абакумова, В.П.
Чехонин и Н.В. Нуколова // Материалы Международной научнойя конференции
студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов-2014».-2014.-С.2-3
20. Абакумова, Т.О. МРТ диагностика рассеянного склероза с помощью селективных
контрастных агентов на основе моноклональных антител / Т.О. Абакумова, Н.В.
Нуколова, Д.А. Бычков, А.Д. Алексашкин, Ф.А. Кошкин, Г.М. Юсубалиева, П.А.
Мельников, В.П. Чехонин // Материалы XXI Российского национального конгресса
«Человек и лекарство».-2014.
21. Абакумова, Т.О. Направленная доставка МРТ контрастного агента для визуализации
глиомы С6 / Т.О. Абакумова, А.А. Кузькина, С.А. Шеин, М.А. Абакумов, А.В.
Кабанов, Н.В. Нуколова. и В.П. Чехонин // Материалы IX Международной
Пироговской научной медицинской конференции студентов и молодых ученых.-2014.С.278
22. Abakumova, T.O Targeted contrast agents for MRI diagnostics of multiple sclerosis / T.O.
Abakumova, A.A. Kuzkina, D.A. Pozdeeva, M.A. Abakumov, D.A. Bychkov, N.V.
Nukolova and V.P. Chekhonin // 5th International Congress «Biomaterials and
Nanobiomaterials: Recent Advances in Safety-Toxicology and Ecology Issues».-2014.-P.1718
23. Abakumova, T.O. T1 contrast agents for selective MRI visualization of brain pathologies /
T.O. Abakumova, D.A. Bychkov, M.A. Abakumov, S.A. Shein, A.A. Korchagina, V.P.
Chekhonin and N.V. Nukolova // Materials of 10th International Symposium on Polymer
Therapeutics: From Laboratory to Clinical Practice.-2014.-P.6
24. Abakumova, T.O. Selective visualization of brain tumor by targeted MRI contrast agents /
T.O. Abakumova, D.A. Bychkov, S.A. Shein, M.A. Abakumov, A.V. Kabanov, N.V.
Nukolova and V.P. Chekhonin // Materials of the 12th International Conference on
Nanostructured Materials.-2014.-P.176
25. Abakumova, T.O. Synthesis and comparison of targeted T1-contrast agents based on DOTA
and DTPA complexes / Abakumova T.O., Abakumov M.A., Bychkov D.A., Kabanov A.A.,
Nukolova N.N., Chekhonin V.P. // Materials of the 6th International Conference on
Nanomaterials - Research & Application.-2014.-С.63
26. Абакумова, Т.О. Направленная доставка контрастных агентов для визуализации
патологических очагов ЦНС с помощью магнитно-резонансной томографии / Т.О.
Абакумова, Д.А. Бычков, М.А. Абакумов, С.А. Шеин, П.А. Мельников, Н.Ф.
16.
Гриненко, А.В. Кабанов, Н.В. Нуколова и В.П. Чехонин. // Материалы 3-й
международной школы-Нано 2015. Наноматериалы и нанотехнологии в живых
системы. Безопасность и наномедицина.-2015.-C.153
Автор выражает глубокую благодарность:
Чехонину Владимиру Павловичу за грамотное и чуткое руководство и Нуколовой
Наталии Владимировне за методическую помощь, отзывчивость, внимание и поддержку в
течение всего времени работы. Шеину С.А. - за помощь в моделировании глиобластомы,
Гриненко Н. Ф. - за помощь в оценке цитотоксичности изучаемых препаратов, Абакумову
М.А. - за помощь в МРТ сканировании и измерении релаксивности, Бычкову Д.А и
Челушкину П.С - в проведении рентгенофлуоресцентного и аминокислотного анализов.
Заведующей виварием Ионовой К.П. за помощь в подготовке животных к эксперименту.
Работа была выполнена с использованием оборудования отдела медицинских
нанобиотехнологий РНИМУ им.Н.И. Пирогова и отдела фундаментальной нейробиологии
ФГБУ “ФМИЦПН” Минздрава РФ (НОЦ “Медицинские нанобиотехнологии”) при
финансовой поддержке гранта УМНИК Фонда содействия малых форм предприятий и
гранта РНФ №14-15-00698 (разработка протоколов МРТ сканирования).
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
5
Размер файла
1 131 Кб
Теги
визуализирующие, процессов, патологическая, мрт, векторных, система, диагностика, нервной
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа