close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

PL169635B1

код для вставкиСкачать
RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12) OPIS PATENTOWY (19)PL
(2 1) Numer zgłoszenia:
294938
(11) 169635
(13) B1
(51) IntCl6
:
C12P 17/12
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej Polskiej
(54)
(30)
(22) Data zgłoszenia:
17.06.1992
Mikrobiologiczny sposób wytwarzania kwasu 5-hydroksypirazynokarboksylowego
Pierwszeństwo:
(73)
(43)
Zgłoszenie ogłoszono:
(72)
22.02.1993 BUP 04/93
(45)
O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.08.1996 WUP 08/96
Uprawniony z patentu:
Lonza AG, Gampel/Wallis, CH
21.06.1991,CH,01843/91-3
Twórca wynalazku:
Andreas Kiener, Visp (Kanton Wallis), CH
(74)
Pełnomocnik:
Buczyński Edward, PHZ POLSERVICE
PL 169635
B1
( 5 7 ) 1. Mikrobiologiczny sposób wytwarzania kwasu 5-hydroksypirazynokarboksylowego i/lub jego soli, znamienny tym, że kwas pirazynokarboksylowy i/lub jego sole,
jako substrat, przeprowadza się za pomocą mikroorganizmów z rodzajów Pseudomonas
i/lub Achromobacter, i/lub Bacillus, i/lub Azorhizobium, i/lub Sarcina, i/lub Mycobacterium w kwas 5-hydroksypirazynokarboksylowy i/lub jego sole, przy czym ten ostatni
nagromadza się w środowisku.
Mikrobiologiczny sposób wytwarzania kwasu
5-hydroksypirazynokarboksylowego
Zastrzeżenia patentowe
1. Mikrobiologiczny sposób wytwarzania kwasu 5-hydroksypirazynokarboksylowego
i/lub jego soli, znamienny tym, że kwas pirazynokarboksylowy i/lub jego sole, jako substrat,
przeprowadza się za pomocą mikroorganizmów z rodzajów Pseudomonas i/lub Achromobacter, i/lub Bacillus, i/lub Azorhizobium, i/lub Sarcina, i/lub Mycobacterium w kwas
5-hydroksypirazynokarboksylowy i/lub jego sole, przy czym ten ostatni nagromadza się w
środowisku.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcję tę przeprowadza się za pomocą
mikroorganizmów gatunku Pseudomonas acidovorans DSM 4746 lub ich potomstwa i
mutantów.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcję tę przeprowadza się za pomocą
mikroorganizmów gatunku Pseudomonas putida NCIB 10521 i/lub za pomocą mikroorganizmów gatunku Pseudomonas putida NCIB 8176 lub jego potomstwa i mutantów.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że reakcję tę przeprowadza się za pomocą
mikroorganizmów gatunku Achromobacter xylosoxydans DSM 2402 i/lub za pomocą mikroorganizmów gatunku Achromobacter xylosoxydans DSM 2783 lub ich potomstwa i
mutantów.
5. Sposób według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4, znamienny tym, że reakcję tę
prowadzi się w warunkach jednokrotnego lub nieprzerwanego dodawania substratu tak,
żeby stężenie substratu nie przewyższało 20% wagowych.
6. Sposób według zastrz. 1, albo 2, albo 3, albo 4., znamienny tym, że reakcję tę
przeprowadza się w warunkach aerobowych wobec odczynu o wartości pH rzędu 4-10 i w
temperaturze 10-60°C.
*
*
*
Przedmiotem wynalazku jest nowy sposób wytwarzania kwasu 5-hydroksypirazynokarboksylowego i/lub jego soli za pomocą mikroorganizmów zużytkowujących
kwas nikotynowy i/lub jego sole, stosując jako związek wyjściowy kwas pirazynokarboksylowy i/lub jego sole.
W podanej następnie części opisu pod określeniami: kwas nikotynowy, kwas pirazynokarboksylowy i kwas 5-hydroksypirazynokarboksylowy rozumie się też ich sole, takie jak
ich sole litowcowe lub sole amoniowe.
Kwas 5-hydroksypirazynokarboksylowy można przykładowo stosować jako produkt
pośredni do wytwarzania farmaceutyków, np. do wytwarzania analogów nukleozydów
pirazynowych o działaniu cytostatycznym (M. Bobek, J. Heterocyclic Chem., 1991, 28,
strona 1131).
Wiadomo, że kwas 5-hydroksypirazynokarboksylowy w metabolizmie psów i ludzi
tworzy się z amidu pirazyny poprzez kwas pirazynokarboksylowy (J. Pharmacol. Exp. Ther.,
1972,180(2), 411-434).
Przykładowo omawia się (J. Heterocyclic Chem. 19, 1982, strona 402) 5-etapowy
chemiczny sposób wytwarzania kwasu 5-hydroksypirazynokarboksylowego z wyjściowego
furfuryloglioksalu. Ma on jednak tę wadę, że nie nadaje się do prowadzenia w skali
wielkoprzemysłowej.
Mikrobiologiczny sposób wytwarzania kwasu 5-hydroksypirazynokarboksylowego nie
był dotychczas znany.
169 635
3
Celem wynalazku jest opracowanie łatwego, ekonomicznego i ekologicznego sposobu
wytwarzania kwasu 5-hydrazynokarboksylowego.
Osiąga się ten cel za pomocą sposobu, który według wynalazku polega na tym, że kwas
pirazynokarboksylowy i/lub jego sole, jako substrat, przeprowadza się za pomocą mikroorganizmów, które rosną wraz z kwasem nikotynowym i/lub jego solami jako jedynym
źródłem węgla, azotu i energii, w kwas 5-hydroksypirazynokarboksylowy i/lub jego sole, przy
czym ten ostatni nagromadza się w środowisku.
Zasadniczo dla tego sposobu odpowiednie są wszystkie mikroorganizmy, które degradują kwas nikotynowy poprzez kwas 6-hydroksynikotynowy. Mikroorganizmy te można za
pomocą znanych technik mikrobiologicznych wyodrębniać np. z oczyszczalni ścieków z
kwasem nikotynowym jako substratem wzrostowym. Przykładowo można stosować mikroorganizmy z rodzajów Pseudomonas, Achromobacter, Bacillus, Azorhizobium, Sarcina i
Mycobacterium, które już omówiono w opisie EP-A nr 152 948. Reakcję tę można w
warunkach jałowych lub niejałowych przeprowadzać zarówno za pomocą mieszanin jak i
czystych izolatów tych mikroorganizmów.
Celowo sposób ten przeprowadza się za pomocą mikroorganizmów gatunku Pseudomonas acidovorans DSM 4746, Achromobacter xylosoxydans DSM 2402, Achromobacter
xylosoxydans DSM 2783, Pseudomonas putida NCIB 10521, Pseudomonas putida NCIB
8176 oraz ich potomstwa i mutantów, korzystnie za pomocą Pseudomonas acidovorans
DSM 4746.
Mikroorganizmy gatunku Pseudomonas acidovorans DSM 4746 złożono w dniu
25 lipca 1988 r. w Niemieckiej Kolekcji Mikroorganizmów i Kultur Komórkowych
Gm bH (o oryginalnej nazwie: die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH) z siedzibą w D-3300 Brunświk, Mascheroderweg 1b, RFN.
Mikroorganizmy gatunku A chrom obacter xylosoxydans DSM 2402 i DSM 2783
są również złożone we wspomnianym wyżej instytucie i są już omówione w opisie EP-A
nr 152 948.
Mikroorganizmy gatunku Pseudomonas putida NCIB 10521 i NCIB 8176 są złożone
w szkockiej kolekcji o nazwie National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research
Station, z siedzibą w Aberdeen AB98DC, 135 Abbey Road, Szkocja.
Zazwyczaj przed właściwą reakcją przeprowadza się hodowlę (hodowanie) jak i
indukcję tych mikroorganizmów za pomocą kwasu nikotynowego.
Hodowanie (hodowla) i indukcja korzystnie zachodzi za pomocą kwasu nikotynowego
jako jedynego źródła węgla, azotu i energii.
Przed dodaniem substratu (kwasu pirazynokarboksylowego) można wówczas mikroorganizmy te albo zebrać za pomocą znanych sposobów rozdzielania i ponownie
przeprowadzić w stan zawiesiny w świeżym środowisku, albo można substrat (kwas
pirazynokarboksylowy) dodawać bezpośrednio do mikroorganizmów w pierwotnym
środowisku wzrostowym. Dla właściwego sposobu w zawiesinie komórkowej wówczas
nastawia się przy 650 nm celowo absorbancję rzędu 1-100, korzystnie 10-30.
Jako środowiska, zarówno dla hodowania jak i dla reakcji właściwej, można stosować
środowiska uznawane przez fachowców. Korzystnie stosuje się środowisko, którego skład
podano niżej w tabeli.
S u b strat (kwas pirazynokarboksylow y) m ożna dodaw ać jednorazow o lub
nieprzerw anie.
Celowo to dodawanie substratu następuje tak, żeby stężenie substratu nie przewyższyło 20% wagowych, korzystnie 5% wagowych. Reakcja kwasu pirazynokarboksylowego i/lub
jego soli, prowadząca do kwasu 5-hydroksypirazynokarboksylowego i/lub jego soli, zachodzi
zwykle za pomocą śpiących komórek.
Celowo reakcję tę przeprowadza się w warunkach aerobowych wobec odczynu o
wartości pH rzędu 4-10, korzystnie wobec odczynu o wartości pH=6-8.
Reakcję prowadzi się celowo w tem peraturze 10-60°C, korzystnie w tem peraturze 15-45°C.
4
169 635
Po upływie znanego czasu trwania reakcji rzędu 4-100 godzin, można produkt strącić
drogą zakwaszenia roztworu pozbawionego komórek i otrzymać za pomocą metod obróbki
znanych dla fachowca. W przypadku soli sodowej kwasu 5-hydroksypirazynokarboksylowego produkt strąca się już podczas reakcji.
P r z y k ł a d I. Pseudomonas acidovorans DSM 4746 hodowano w środowisku soli
mineralnych (patrz tabela 1 niżej) w warunkach nieprzerwanego dodawania nikotynianu
sodowego (0,6 g/l/h) w fermentorze wobec odczynu o wartości pH=7,0 i w temperaturze
30°C, aż do osiągnięcia absorbancji 10 przy 650 nm. Następnie komórki te odwirowano i
ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 2 litrach roztworu, zawierającego 1 mol (146
g) soli sodowej kwasu pirazynokarboksylowego i wykazującego odczyn o wartości pH=7,0.
Absorbancja przy 650 nm wynosiła wówczas 20. Po okresie inkubacji rzędu 16 godzin w
warunkach aerobowych wobec odczynu o wartości pH = 7,0 i w tem peraturze 30°C nie
można było za pomocą spektroskopii w nadfiolecie wykryć już żadnej substancji wydzielanej. Część utworzonej soli sodowej kwasu 5-hydroksypirazynokarboksylowego wykrystalizowała już w tych warunkach postępowania. Wytrącony produkt odwirowano wraz
z biomasą.
Utworzony osad ponownie przeprowadzono następne w stan zawiesiny w 500 ml wody
i znowu odwirowano. Pozbawione komórek ciecze znad osadu połączono, zatężono za
pomocą wyparki obrotowej do objętości 300 ml i ochłodzono do temperatury 0°C. Utworzone kryształy odsączono i osuszono. Łącznie można było wyodrębnić 0,67 mola (108 g)
soli sodowej kwasu 5-hydroksypirazynokarboksylowego, co odpowiadało 67% wydajności,
w odniesieniu do wprowadzonej soli sodowej kwasu pirazynokarboksylowego.
P r z y k ł a d II. Pseudomonas acidovorans DSM 4746 hodowano w środowisku soli
mineralnych (patrz tabela 1 niżej) w warunkach nieprzerwanego dodawania nikotynianu
sodowego (0,6 g/1/h) w fermentorze wobec odczynu o wartości pH=7,0 i w temperaturze
30°C, aż do osiągnięcia absorbancji 10 przy 650 nm. Następnie komórki te odwirowano i
ponownie przeprowadzono w stan zawiesiny w 100 ml roztworu, zawierającego 0,056 mola
(7,9 g) soli amoniowej kwasu pirazynokarboksylowego i wykazującego odczyn o wartości
pH=7,0. Absorbancja przy 650 nm wynosiła wówczas 20. Po okresie inkubacji rzędu 24
godzin w warunkach aerobowych wobec odczynu o wartości pH =7,0 i w temperaturze 30°C
nie można było za pomocą spektroskopii w nadfiolecie wykryć już żadnej substancji wydzielanej. Pozbawioną komórek ciecz znad osadu zakwaszono stężonym kwasem siarkowym do
odczynu o wartości pH =2, by strącić kwas 5-hydroksypirazynokarboksylowy. Następnie
zawiesinę ochłodzono do temperatury 4°c i przesączono. Pozostałość po sączeniu przemyto dwukrotnie porcjami po 10 ml wody i osuszono. Łącznie można było wyodrębnić 0,054
mola (7,56 g) kwasu 5-hydroksypirazynokarboksylowego, co odpowiadało 96% wydajności,
w odniesieniu do wprowadzonej soli amoniowej kwasu pirazynokarboksylowego. Według
cieczowej chromatografii ciśnieniowej zawartość kwasu 5-hydroksypirazynokarboksylowego wyniosła powyżej 90%.
Tabela 1
Skład środowiska soli mineralnych
MgCl2-6H2O
0,8 g/l
CaCl2
0,16 g/l
Na2SO4
0,25 g/l
KH2PO4
0,4 g//l
Na2HPO4
0,9 g/l
SLF
1 ml/l
FeEDTA
15 ml/l
Skład mikropierwiastków (SLF) w środowisku soli mineralnych
KOH
15 g/l
EDTANa2 · 2H2O
100 g/l
ZnSO4 · 7H2O
9 g/l
MnCl2 · 4H2O
4 g/l
169 635
5
H 3BO 3
2,7 g/l
CoCl2 · 6H 2O
1,8
g/l
CuCl2 · 2H2O
1,5 g/l
NiCl2 · 6H2O
0,18 g/l
Na2MoO 4 · 2H2O
0,2 g/l.
Skład FeEDTA:
EDTANa 2 · 2H2O
5
g/l
FeSO 4 · 7H2O
2
g/l.
(Odczyn roztworu nastawiono na wartość pH=7,0).
P r z y k ł a d III. Mikroorganizm Bacillus sp. hodowano tak, jak opisuje Ensing &
Rittenberg (J. Biol. Chem., tom 239, nr 7 , 1964, strona 2285). Następnie komórki odwirowano odpowiednio do przykładu I i przeprowadzono do środowiska soli mineralnych
(tabela 1), zawierającego 0,65 mola (94,9 g) soli sodowej kwasu pirazynokarboksylowego.
Biotransformacja zachodziła w warunkach analogicznych do przykładu I. Łącznie można
było wyodrębnić 0,34 mola (54,8 g) kwasu 5-hydroksypirazynokarboksylowego, co odpowiadało 52,3% wydajności.
P r z y k ł a d I V I V. Mikroorganizmy Achromobacter xylosoxydans DSM 2783 i
Pseudomonas putida NCIB 10521 hodowano odpowiednio do opisu EP-A 152 948 i
następnie analogicznie do przykładu I stosowano do biotransformacji. Wyniki zestawiono
w tabeli 2 .
Tabela 2
Mikroorganizm
Edukt
Produkt
Wydajność
Achromabacter xylosoxydans DSM 2783
Sól sodowa kwasu pirazynokarboksylowego
(0,73 moli; 106,5 g)
Kwas 5-hydroksypirazynokarboksylowy
(0,59 moli; 63,7 g)
80%
Pseudomonas putida
NCIB 10521
Sól sodowa kwasu pirazynokarboksylowego
(0,85 moli; 124,1 g)
Kwas 5-hydroksypirazynokarboksylowy
(0,67 moli; 72,4 g)
78,8%
169 635
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.
Cena 2,00 zł
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
432 Кб
Теги
pl169635b1
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа