PL171788B1

RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12) OPIS PATENTOWY (19)PL
(21) Numer zgłoszenia:
(22 ) Data zgłoszenia:
(13) B1
303989
01.12.1992
(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
01.12.1992, PCT/US92/10430
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej Polskiej
(5 4 )
( 30)
(87) Data i numer publikacji zgłoszenia
międzynarodowego:
Pierwszeństwo:
Zgłoszenie ogłoszono:
O udzieleniu patentu ogłoszono:
30.06.1997 W UP 06/97
PL
171788
B1
(57)
C12P 21/00
C12N 5/00
C12N 15/12
S p o só b wytwarzania rozpuszczalnego polipeptydu
wykazującego aktywność wiązania receptora ludzkiego czynnika wzrostu
pochodzącego z płytek
19.09.1994 B U P 19/94
(45)
(51) IntCl6:
10.06.1993, W093/11223,
P C T Gazette nr 14/93
(73)
Uprawniony z patentu:
COR THERAPEUTICS INC., South San
Francisco, US
02.12.1991,U S,07/801794
(43)
(12)171788
( 7 2 ) Twórcy wynalazku:
David Wolf, Palo Alto, US
James E. Tomlinson, Burlingame, US
(74)
Pełnomocnik:
Dehnel Zofia, POLSERVICE
1. Sposób wytwarzania rozpuszczalnego polipeptydu wykazującego aktywność
wiązania receptora ludzkiego czynnika wzrostu pochodzącego z płytek, znamienny tym, że
a) hoduje się linię komórkową, w której zachodzi ekspresja rozpuszczalnego polipeptydu,
możliwego do otrzymania dzięki mutagenezie delecyjnej, z użyciem antysensownego oligomeru mutagenezy wybranego z grupy obejmującej p Δ3, pΔ4, pΔ 5, p Δ103, pΔ 104 i pΔ 105
i b) wyodrębnia się rozpuszczalny polipeptyd od linii komórkowej, przy czym rozpuszczalny
polipeptyd ma stałą dysocjacji 0,2 nM lub mniejszą i ma co najmniej jedną domenę Ig.
Sposób wytwarzania rozpuszczalnego polipeptydu
wykazującego aktywność wiązania receptora ludzkiego
czynnika wzrostu pochodzącego z płytek
Zastrzeżenia patentowe
1. Sposób wytwarzania rozpuszczalnego polipeptydu wykazującego aktywność wiązania
receptora ludzkiego czynnika wzrostu pochodzącego z płytek, znamienny tym, że a) hoduje się
linię komórkową, w której zachodzi ekspresja rozpuszczalnego polipeptydu, możliwego do
otrzymania dzięki mutagenezie delecyjnej, z użyciem antysensownego oligomeru mutagenezy
wybranego z grupy obejmującej p Δ3, p Δ4, pA5, p Δ 103, p Δ 104 i p Δ 105 i b) wyodrębnia się
rozpuszczalny polipeptyd od linii komórkowej, przy czym rozpuszczalny polipeptyd ma stałą
dysocjacji 0,2 nM lub mniejszą i ma co najmniej jedną domenę Ig.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się linię komórkową, w której
zachodzi ekspresja receptora ludzkiego czynnika wzrostu pochodzącego z płytek.
3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako linię komórkową stosuje się linię
komórki jajowej chomika chińskiego.
4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się linię komórkową zawierającą
ponadto enzym egzogenny, który posttranslacyjnie modyfikuje rozpuszczalny polipeptyd.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że jako enzym stosuje się enzym glikozylacji.
6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że rozpuszczalny polipeptyd wydziela się
do pożywki wzrostu komórek.
7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że rozpuszczalny polipeptyd wyodrębnia się
z pożywki drogą chromatografii opartej na powinowactwie.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że do chromatografii opartej na powinowactwie
stosuje się przeciwciało monoklonalne jako reagent chromatografii immunopowinowactwa.
* * *
Wynalazek dotyczy sposobu wytwarzania rozpuszczalnego polipeptydu wykazującego aktywność wiązania ludzkiego czynnika wzrostu pochodzącego z płytek w szczególności, wynalazek
dotyczy wytwarzania linii komórkowych oraz sposobów przy użyciu tych linii komórkowych, które
umożliwiają wysokowydajne wytwarzanie rozpuszczalnych fragmentów oczyszczonego receptora
pochodzącego z płytek czynnika wzrostu, wykazujących funkcje wiązania ligandu.
Polipeptydowe czynniki wzrostu są mitogenami, które działają na komórki przez specyficzne wiązanie do receptorów umiejscowionych na błonie komórkowej. Pochodzący z płytek
czynnik wzrostu (PDGF) stymuluje zróżnicowaną grupę reakcji biochemicznych np. zmiany
przepływu jonów, aktywację różnych kinaz, zmianę kształtu komórki, transkrypcję różnych
genów i modulowanie czynności enzymatycznych związanych z metabolizmem fosfolipidów.
Zob. np. Bell i in. (1989) Circulation Research 65:1075-1065. Czynnik wzrostu pochodzący z
płytek jest czynnikiem polipeptydowym, który oddziałuje z receptorem związanym z błoną,
receptorem pochodzącego z płytek czynnika wzrostu (PDGF-R). Receptor ma miejsce wiązania,
które wiąże ligandy PDGF.
Z anormalnych oddziaływań receptor-ligand wynikają szczególne stany patologiczne.
Specyficzność wiązania pozwala na zastosowanie jednego partnera wiążącego, by określić,
jakościowo lub ilościowo, obecność innego i by wykryć anormalne oddziaływania. Takie
odczynniki diagnostyczne byłyby przydatne.
Ekspresji receptorów pochodzących z płytek czynnika wzrostu dokonywano w różnych
komórkach. Zob. np. Orchansky i in. (1988) J. Biol. Chem. 263:15159-15165: D uan i in. (1991)
J. Biol. Chem. 266:413-418; Heidaran i in. (1990) J. Biol. Chem. 265:18741-18744; ClaessonWelsh i in. (1988) Mol. and Celi. Biol. 8:3476-3486; i Escobedo i in. (1988)
Biol. Chem.
263:1482-1487.
171 788
3
Chociaż inni opisywali dokonywanie ekspresji receptorów PDGF lub ich fragmentów w
komórkach, fragmenty wiążące ligand wszystkie charakteryzowały się w przybliżeniu
nienaruszonymi pozakomórkowymi obszarami receptora. W wielu przypadkach byłby przydatny mniejszy i rozpuszczalny segment wiążący ligand. Np. rozpuszczalny fragment wiążący
ligand może służyć jako antagonista, by modulować efekt ligandów PDGF. Będą przydatni
antagoniści rozpuszczalni i mniejsi niż oryginalny receptor. Fizjologiczna biodostępność małych
rozpuszczalnych antagonistów będzie lepsza niż naturalnego, nienaruszonego receptora.
Nienaruszony receptor jest proteiną związaną z błoną i w typowym przypadku nie cyrkulowałby
we krwi. Rozpuszczalne fragmenty antagonisty np. które są krótsze niż miejsce wiążące
rodzimego receptora, będą w typowym przypadku wytwarzane w większych ilościach przy
niższych kosztach. Ponadto, mniejszy rozpuszczalny peptyd będzie z większym prawdopodobieństwem zdolny do osiągnięcia w organizmie obszarów odległych i o upośledzonym krążeniu.
Zatem istnieje potrzeba istnienia wysokoefektywnego sposobu wytwarzania
oczyszczonego obszaru wiążącego ligand, oraz rozpuszczalnych cząsteczek, które wykazują
aktywność wiązania PDGF. Pożądane są fragmenty mniejsze niż nienaruszony pozakomórkowy
obszar każdego receptora. Bardzo pożądane jest ekonomiczne i wysokowydajne wytwarzanie
protein wiążących ligand PDGF, np.fragmentów zawierających obszary decydujące o wiązaniu
ligandu. Niniejszy wynalazek spełnia te oraz inne potrzeby.
Niniejszy wynalazek dostarcza linie komórkowe oraz sposoby wysoko wydajnego wytwarzania rozpuszczalnych peptydów, które wiążą pochodzący z płytek czynnik wzrostu (PDGF).
Opisano linie komórkowe wydzielające fragmenty pozakomórkowego obszaru receptora PDGF
(PDGF-R) lub pokrewne peptydy, które wykazują aktywność wiązania ligandu PDGF. Wiele z
tych fragmentów pochodzi z delecji segmentów pozakomórkowego obszaru, które nie przyczyniają się do powinowactwa lub specyficzności wiązania ligandu. Dostarczone są również
sposoby stosowania tych linii komórkowych do wytwarzania polipeptydów wiążących się z
PDGF, np. z ludzkich receptorów.
Figura 1 podaje strategię mutagenezy delecyjnej in vitro rozpuszczalnych pozakomórkowych obszarów hPDGF-R, ukierunkowaną na oligonukleotydy. Wiele spośród tych konstruktów będzie rozpuszczalnymi peptydami lub mogą one być do takich zmodyfikowane.
Stosowane skróty:
PR - PDGF-R; nienaruszony
P = PDGF-R; obszar pozakomórkowy
TM = transmembrana
K = kinaza
S = sekwencja sygnałowa
Figura 2 przedstawia strukturę plazmidu pochodzącego z pcDL-Sα 296 stosowanego do
ekspresji różnych polipeptydów delecyjnych.
Figura 3 przedstawia strukturę plazmidu pBJΔ pochodzącego z p cD L 296. Zob. Takabe
i in. (1988) Mol. Cell. Biol. 8:466-472, którą to publikację załączono do treści niniejszego
zgłoszenia jako odsyłacz.
1. pcDL-SRα.296 przecięto Xhol.
2. Polilinker (Xhol - Xbal - Sfil - Notl - EcoRI - EcoRV - HindIII - CiaI - Sall) jest
wstawiony do wektora przecięcia Xhol.
3. Sall jest zgodny z miejscem Xhol; i tworzy zarówno miejsce Sall jak i Xhol.
4. Nie występuje już węzeł cięcia i składania SV40 16s.
Opis korzystnych wykonań.
Zgodnie z niniejszym wynalazkiem, dostarczone są nowe komórki dla wytwarzania
rozpuszczalnych polipeptydów, które wiążą ligandy pochodzącego z płytek czynnika wzrostu
(PDGF), oraz kompozycje zawierające takie fragmenty. Komórki te zawierają sekwencje kwasu
nukleinowego kodujące żądane fragmenty polipeptydowe. Komórki dokonują ekspresji kwasów
nukleinowych, wytwarzając tym samym znaczne ilości tych fragmentów. W korzystnych
wykonaniach, fragmenty są zwykle wydzielane do pożywki i dostępne dla oczyszczenia.
4
1 7 1 788
Kompozycje te są zdolne w szczególności do wiązania się do ligandów pochodzącego z płytek
czynnika wzrostu (PDGF), cechując się powinowactwem oraz specyficznością.
Fragmenty polipeptydowe znajdą zastosowanie jako kompozycje diagnostyczne oraz
terapeutyczne. Np. będą one przydatne jako antagoniści ligandów PDGF, lub jako reagenty dla
jakościowej lub ilościowej próby ligandu PDGF. Komórki można także zastosować w sposobach
wytwarzania dużych ilości wiążących polipeptydów, np. jako źródła wyjściowego materiału dla
procesów oczyszczania.
Analogi proteiny PDGF są nazywane Ugandami PDGF. Ligandy te w typowym przypadku
są agonistami PDGF-R. Ligandy PDGF będą zwykle typu protein, lecz mogą być innymi
związkami, wykazującymi cechy strukturalne ważne w oddziaływaniu z receptorami.
I. Linie komórkowe
Komórki według niniejszego wynalazku są w typowym przypadku zdolne do trwałego
wytwarzania drogą hodowli polipeptydu wiążącego ligand PDGF. Komórki te zwykle będą eukariotyczne, np. ze ssaka, który dostarcza komórek, którymi się łatwo manipuluje. Korzystnymi wykonaniami są komórki gryzoni np. myszy, chomika lub szczura. Korzystne będą komórki, które będą
przetwarzać lub modyfikować rozpuszczalne proteiny sposobami analogicznymi jak w przypadku
ludzkich protein. Szczególnie ważne są glikozylacja i inne modyfikacje protein.
W niektórych wykonaniach, komórki oraz konstrukty DNA są wyprowadzone z linii
komórek ludzkich. Szczególnie korzystne linie komórkowe obejmują pΔ l-5, która zawiera
wektor ekspresji dla wytwarzania fragmentu polipeptydowego PDGF-R typu B, oraz linię pΔα RF,
która zawiera wektor ekspresji dla wytwarzania fragmentu polipeptydowego PDGF-R typu A.
Każda z tych linii komórkowych skutecznie dokonuje ekspresji odpowiednich fragmentów
polipeptydu.
W niniejszym zgłoszeniu są dostarczone nowe linie komórkowe dla dokonywania ekspresji
fragmentów pozakomórkowego obszaru receptora pochodzącego z płytek czynnika wzrostu.
Fragmenty te wykazują nieoczekiwane właściwości, po części, ponieważ odkryto, że delecje
różnych części pozakomórkowego obszaru PDGF-R nie wpływają na wiązanie ligandu. Zidentyfikowano poszczególne segmenty pozakomórkowego obszaru receptora, które nie przyczyniają się znacząco do powinowactwa lub specyficzności wiązania ligandu. Delecja tych
ubocznych segmentów pozakomórkowego obszaru PDGF-R zwiększa rozpuszczalność
skróconego polipeptydu i zmniejsza jego immunogenność. Ponadto, bardziej wydajne wytwarzanie oraz niższe koszty dają znaczne korzyści handlowe.
Produkty komórkowe będą w typowym przypadku rozpuszczalnymi fragmentami polipeptydów receptora ludzkiego PDGF. Będą wytwarzane fragmenty receptorów typu A lub typu B.
Wskutek ich pochodzenia z organizmu człowieka, fragmenty wprowadzone do osobników
ludzkich powinny wykazywać niską immunogenność oraz funkcję jako bardziej skuteczne
odczynniki terapeutyczne. Ich homologia z naturalnymi proteinami ludzkimi powinna zmniejszyć prawdopodobieństwo niekorzystnych reakcji oraz efektów ubocznych wynikających z
podawania leczniczego.
Obszary wiązania ligandu (LBRs) są określone, w części, przez ich wpływ na powinowactwo lub specyficzność wiązania do ligandów PDGF. Naturalny, rodzimy PDGF-R o pełnej
długości wiąże się ze swoim naturalnym ligandem przy Kd około 0,2 nM. Zob. np. Duan i in.
(1991) J. Biol. Chem. 266:413-418, którą to pracę załączono do treści niniejszego zgłoszenia
jako odsyłacz. Obszar wiązania ligandu jest segmentem polipeptydowym, którego obecność
znacząco wpływa na wiązanie ligandu, np. absolutne powinowactwo i specyficzność. Wpływ na
powinowactwo będzie zwykle wyrażać się czynnikiem co najmniej około dwa, w typowym
przypadku co najmniej około 4, w bardziej typowym przypadku co najmniej około 8, a korzystnie
co najmniej około 12 lub więcej. Miary specyficzności są trudniejsze do ujęcia ilościowego, lecz
będą w typowym przypadku ocenione przez porównanie względnego powinowactwa do ligandów wykazujących podobne cechy strukturalne.
Przygotowanie komórek ssaków według niniejszego wynalazku można wykonać standardowymi sposobami transformowania wielu różnych typów komórek ssaków odpowiednimi
171 788
5
wektorami ekspresyjnymi. Zob. np. Ausubel i in. (1987 oraz suplementy) Current Protocols in
Molecular Biology. Greene Publishing/Wiley Interscience, New York, który dołączono do treści
niniejszego zgłoszenia jako odsyłacz. Właściwy wybór kombinacji właściwości komórkowych
oraz właściwości wektora ekspresyjnego może doprowadzić do ulepszonych metod wytwarzania
żądanego fragmentu receptora pochodzącego z płytek czynnika wzrostu.
Dostępne są różne metody dokonywania wysokiego poziomu ekspresji określonych protein. Można zastosować metody amplifikacji podobne do metod przy użyciu reduktazy dehydrofolanowej. Zob. np. Kaufman i in. (1985) Mol. Cell. Biol. 5:1750-1759. Można również
zastosować inne dobrze znane techniki ekspresji wysokiego poziomu.
Komórki te są szczególnie wybrane dla wysokiego poziomu ekspresji żądanych fragmentów receptora. Dane są linie komórkowe będące wynikiem transformacji przy użyciu wektorów
kodujących żądane peptydy. Różne wyizolowane transformanty będą miały różne ilości egzemplarzy oraz miejsca integracji dając w rezultacie inne poziomy ekspresji. Korzystne szczepy
komórkowe będą mieć zintegrowany DNA w pozycjach oraz ilościach dających szczególnie
wysoką ekspresję fragmentu receptora.
Co się tyczy konstruktów, p Δ l do PΔ9 odnoszą się do konstruktów DNA receptora typu
B wstawionych do miejsc klonowania w wektorach ekspresyjnych. Konstrukt PΔ l wstawiony
do wektora pBJ jest oznaczany przez pBJPΔ . Wektor jest przenoszony do tła konkretnej komórki
i różne transformanty klonalne są izolowane oraz oznaczane np. p Δ l-1, p Δ l-2 itd. Każdy
wyizolowany klon różni się od innych numerem kopii sekwencji oraz miejscami integracji, co
daje zmienność w poziomach ekspresji. pΔ l-5 jest szczególnie przydatnym wykonaniem linii
komórkowej dokonującym ekspresji wysokich poziomów obszarów wiązania ligandu typu B.
Linia komórkowa p Δ RF dokonuje ekspresji całego pozakomórkowego obszaru receptora
ludzkiego PDGF typu A. Kodującą sekwencję DNA wprowadzono do pBJ-1. Komórki CHO
przekształcono otrzymanym konstruktem DNA oraz wybrano zarówno do ekspresji neoplazmidu jak i do wytwarzania fragmentu receptora typu A.
II. Sposoby.
Niniejszy wynalazek dostarcza również sposobów wytwarzania opisanych fragmentów.
W szczególności, dostępne są hodowle komórkowe dla ekspresji opisanych kwasów nukleinowych. Zwykle fragmenty te są wydzielane, tym samym znacznie upraszczając oczyszczanie
fragmentów receptora. Komórki nie muszą być zniszczone, a zanieczyszczenie komórek jest
doprowadzone do minimum. Zatem komórki te będzie można oddzielić od wydzielonych
produktów za pomocą technik fizycznych z równoczesnym umożliwieniem odzyskania
nienaruszonych komórek. Zob. np. Ausubel i in. (1987 i suplementy) Current Protocols in
Molecular Biology. Greene/Wiley-Interscience, New York, zwłaszcza dział 10:Vii.
Zwykle będą wydzielane rozpuszczalne proteiny i będą podatne na odzyskanie z pożywki.
Dla oddzielenia w pożywkach rozpuszczalnych protein od komórek będą dostępne różne techniki
np. sączenie lub odwirowywanie. Hodowle komórkowe dołączone do stałych substratów będą
zwykle łatwo oddzielalne od pożywki przez sączenie lub odwirowywanie, podczas gdy kultury
zawiesinowe “kruchych” komórek będą zwykle poddawane odwirowywaniu.
Będzie się stosować standardowe metody oczyszczania protein np. chromatografię, odwirowywanie, wytrącanie, elektroforezę metody immunopowinowactwa oraz inne techniki dobrze znane
specjalistom w zakresie chemii protein i enzymologii. Zob. np. Deutscher i in. (1990) Protein
Purification, w Methods in Enzymology; oraz Ausubel i in. (1987 i suplementy) C-urrent
Protocols in Molecular Biology.
Szczególnie przydatne odczynniki do oczyszczania obejmują odczynniki powinowactwa
np. bądź kolumny powinowactwa PDGF-ligand lub kolumny immunopowinowactwa. Kolumna
powinowactwa PDGF-ligand będzie łatwo przygotowana przy użyciu sklonowanej sekwencji
PDGF-ligand lub analogu dla wyizolowania produktu proteiny, oraz przyłączenia do stałego
substratu. Kolumna immunopowinowactwa będzie łatwo przygotowana przez dołączenie immunoglobulin przygotowanych względem peptydów PDGF-R, albo wytworzonych przez komórki
według niniejszego wynalazku, lub innymi sposobami.
6
1 7 1 788
Przeciwciała monoklonalne specyficzne względem receptora PDGF o powinowactwach
wiązania 106M-1, korzystnie 107do 1010, lub silniejszych, będą w typowym przypadku wykonane
za pomocą standardowych procedur jak opisano np. w: Harlow i Lane, Antibodies: A Laboratory
Manual, CSH Laboratory (1988); lub Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice
(2d ed.) Academic Press, New York (1986), które dołączono jako odsyłacz do treści niniejszego
zgłoszenia. W skrócie przedstawia się to tak, że odpowiednie zwierzęta będą immunizowane;
po odpowiednim okresie czasu, śledziony takich zwierząt są wycinane i poszczególne komórki
śledziony poddawane fuzji, w typowym przypadku do immortalizowanych komórek szpiczaka.
Produkty fuzji są poddawane odpowiednim warunkom selekcji i klonalnie rozdzielane. Roztwory każdego klonu są badane na specyficzność przeciwciała względem wiązania żądanego
obszaru antygenu.
Inne odpowiednie techniki obejmują ekspozycję in vitro limfocytów na polipeptydy
antygeniczne lub alternatywnie na wybór bibliotek przeciwciał w fagu lub podobnych wektorach.
Zob. Huse i in. (1989) “Generation of a Large Combinatorial Library of the Immunoglobin
Repertoire in Phage Lambda”. Science 246:1275-1281; oraz Ward i in. (1989) “Binding activities
of a repertoire of single immunoglobulin variable domains secreted from Escherischia coli”
Nature 341:544-546; każdą z tych pozycji załączono do treści niniejszego zgłoszenia jako
odsyłacz. Polipeptydy i przeciwciała według niniejszego wynalazku można stosować po modyfikacji lub bez modyfikacji.
Odpowiedni odczynnik powinowactwa np. PDGF lub przeciwciało będzie zwykle dołączony
do substratu stałego. Typowe substraty obejmują matryce chromatograficzne np. CNBr-sefarozę,
kulki szklane oraz tworzywa sztuczne. Zwykle połączenie będzie kowalencyjne, chociaż w pewnych
warunkach mogą być wystarczające metody przyłączania niekowalencyjnego.
Skoro jest przygotowany odpowiedni odczynnik powinowactwa lub kombinacja odczynników powinowactwa, roztwory zawierające rozpuszczalne fragmenty będą przepuszczone
przez odczynnik powinowactwa na specyficzność wiązania i wymywania. Etapy te można
przeplatać z innymi etapami oczyszczania lub zatężania. Szczególnie przydatny sposób
oczyszczania fragmentu obejmuje substrat immunopowinowactwa z przeciwciałami monoklonalnymi. Fragmenty receptora są dołączone do unieruchomionych przeciwciał w kolumnie i
wymywane przy wysokim pH. Mogą być również włączone dodatkowe etapy specyficznego
usuwania zidentyfikowanych składników zanieczyszczających np. przez techniki usuwania
przez powinowactwo.
Wyizolowane fragmenty rozpuszczalnych peptydów można zastosować do różnych celów
np. jako odczynniki diagnostyczne lub jako odczynniki terapeutyczne. Komórki będą przydatne
do przeniesienia do zwierzęcia, np. do myszy, lub do utworzenia hodowli w odpowiednim
naczyniu do implantacji, które umożliwi rozprzestrzenienie się produktu do ciała organizmu
gospodarza. Opisano odpowiednie przyrządy do tworzenia hodowli komórkowych, które można
implantować u osobnika by wydzielać terapeutyczne produkty komórkowe, np: w opisach
patentowych USA 4806 355,4 402 694 oraz 3 093 831.
Część eksperymentalna
W ogólności, standardowe techniki technologii rekombinacyjnego DNA opisano w
różnych publikacjach np. Sambrook i in., (1988) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold
Spring Harbor Laboratory; Ausubel i in. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, t. 1 i 2
oraz suplementy; oraz Wu i Grossman (red.) (1987) Methods in Enzymology. Vol. 53 (Recombinant DNA Part D); wszystkie wymienione pozycje dołączono do treści niniejszego zgłoszenia
jako odsyłacze.
I. Ludzki obszar pozakomórkowy
Równoważne techniki konstrukcji, ekspresji oraz określenia fizjologicznego wpływu,
charakteryzujących się odcięciem lub delecją, analogów rozpuszczalnych pozakomórkowych
fragmentów receptora z ludzkiego receptora można zrealizować przy użyciu kwasu nukleinowego, polipeptydu i innych odczynników dostarczonych w niniejszym zgłoszeniu.
A. Segmenty typu B
171 788
7
Konstrukty polipeptydów receptora typu B wykonano jak następuje:
Fragment cDNA (EcoRI-Hindlll o 3,9 kb) z ludzkiego hPDGF-R typu B subklonowano
w miejscu EcoRI-HindIII M 13 Mp 18 dla wytworzenia wektora Mp 18PR. Odnośnie technik zob.
Maniatis i in. (1982) Molecular Cloning: Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, N.Y., który
załączono jako odsyłacz do treści niniejszego zgłoszenia. Weryfikację subklonowania wykonano
przez analizę poprzez trawienie enzymem restrykcyjnym oraz sekwencjonowanie zakończenia
łańcucha dideoksy, jak opisali Sanger i in. (1977) Proc. Nat’l Aca. Sci. USA 74:5463. Mutagenezę in vitro ukierunkowanąna oligonukleotydy wykonano według sposobu opisanego przez
Kunkela i in. (1987) Methiods in Enzymol., 154:367. Strategia delecyjnej mutagenezy
M p 18PR in vitro ukierunkowanej na oligonukleotydy jest wyłożona na fig. 1.
W skrócie, zaprojektowano szereg oligonukleotydów by utworzyć zagnieżdżony zbiór
rozpuszczalnych pozakomórkowych obszarów receptora hPDGF typu B przez mutagenezę
delecyjną. Poddano delecji nienaruszone domeny. Domeny te oznaczono jako Domena 1 do
Domena 5 (D1-D5), odpowiednie dla ekspresji w odpowiednim eukariotycznym układzie
ekspresyjnym. Przykładowe oligonukleotydy mutageniczne podano w tablicy 1. Te oligonukleotydy są komplementarne do obszarów receptora ludzkiego PDGF rozpinających różne
określone domeny IdG-podobne. Zob. np. Williams (1989) Science 243:1564-1570, załączone
do treści niniejszego zgłoszenia jako odsyłacz.
Tabl ic a
OLIGOMERY
[N. 8.
Δ1
są
MUTAGENEZY
one
P
3 ’ -GTG
TGA
(s e k w e n c j a n r
LUDZKIEGO
kom plem entarne
GGA
1)
ACG
PA2
3 ’ -GGA
AGC
TGG A T G
(se k w e n c j a n r :
2 )
;
PD GF- R
dane
GGA A A T
T C T A GT
CTC
PA4
3 ’ -ATG
T C T GAG
GTC
(se kw e ncja nr:
4)
CAC AGT
TYPU
B
3 ' - 5 ’]
TCA
TAA
PA3
3 ' -T AG
TGG CAC
CAA
(sekw encja nr:
3)
1
TCG A AG
GAC A T C
TCG A AG
GAC A T C
ATC
GAA
GGA
ATC
GA A
GGA C A T
TCG CCG
AGG
PA5
3’ - G A G
A C -5’
ATG TAG
(se kw e ncja
A AA
nr:
CAC
5)
GGT
CTA
PA6
3 ’ -GTC
G TA-5’
T A G A GA
(se kw e ncja
GTC
nr:
CCG
6)
GAC
CAG TGG CAC
PA7
3 ’ -GTC
T A G A GA
CAC G T C - 5 ’
(sekw encja nr:
7)
GT C
CCG GAC
CAG
GGG A T C
CCC
CCC
CA T
CGA-5'
CGA
C -5’
CCC CCG A C - 5 ’
CCC
CCG A C - 5 ’
G A A GGA C A T
CCG A AG
TAG T T G CAG AGA
CCC
CCG
GAG GGA
TTA
CAC T T G
CGT
PAS
3 ’ -GTC
GAC-5’
T A G A GA GTC
(se kw e ncja nr:
PA9
3 ’ -GTC
T A G AGA GTC
(sekw encja nr:
9)
CCG
8)
CCG GAC
GAC
CAG
CAG A T G
CAG GCT
CA C
CAC
GCC GAG GAC CCT
GAC CTC
GAT
CTC
TC A-5’
Otrzymane konstrukty są oznaczone jak wskazano w tablicy 2. Antysensowną nić zastosowano w pełnym zakresie do mutagenezy. Mutageneza PΔ 1, P Δ2, PΔ 3, P Δ4 oraz P Δ5 wykorzystywała Mp 18PR jako szablon a mutageneza PΔ6, P Δ7, PA8 oraz PΔ 9 wykorzystywała Mp 18
PΔ 1 jako szablon. PΔ 1, oligomer 41 bp, wprowadził kodon kończący TAG po lizynie 499 (K499)
8
171 788
z D5 i usunął transmembranę (TM) jak również całą wewnątrzkomórkową domenę kinazy (K),
wytwarzającą Mp 18 P Δl (zob. fig. 1).
T a b lic a
K o n stru kty
e k s p re s ji
R o z p u szcza ln y
2
lu d z k ie g o
PDGF-R
Z w ia za n u
z
typu
B
b ło n a
pBJPR
pBJP
Δ1
pBJP
Δ2
PBJP
Δ3
pBJP
Δ4
pBJP
Δ5
pBJP
Δ6
PBJP
Δ7
pBJP
ΔS
pBJP
Δ9
Konstrukty receptora ludzkiego PDGF były następnie subklonowane w miejscu EcoRIHind III pBJ1 (pochodzenia pCDL-SRa296), jak opisano w pracy Tanabe i in. (1988) Molec.
Celi Biol. 8:466, i współtransfekowane pSV2NEO, jak opisano w pracy Southern i Berga
(1982) J. Mol. Appl. Gen, 1:327, do komórek jajowych chomika chińskiego (CHO). Zob. fig. 2
oraz 3.
Funkcję oczyszczonych lub półoczyszczonych konstruktów pokazano jak następuje:
Próbkę 0,33 nM ligandu PDGF BB wstępnie inkubowano przez 1 godzinę w 4°C przy
następujących warunkach:
1. przeciwciało monoklonalne do ludzkiego PDGF (to przeciwciało rozpoznaje ludzkie
PDGF AA, PDGF BB oraz PDGF AB);
2. 18 nM (60-krotny nadmiar molowy w stosunku do PDGF BB) receptora ludzkiego
PDGF typu B;
3. roztwór soli, w którym są receptor i przeciwciało, buforowany fosforanem; lub
4. sam ligand bez żadnych dodatków.
W powtórzonym zestawie eksperymentów, 0,33 nM PDGF AA inkubowano przy trzech
spośród powyższych warunków preinkubacji, np. 2, 3 i 4 powyżej. Receptor ludzkiego PDGF
typu B nie rozpoznaje w dostrzegalnym stopniu PDGF AA, lecz ligand ten będzie wciąż
aktywował związany z komórką ludzki receptor PDGF typu A z komórek NIH3T3 i jest tym
samym kontrolą specyficzności receptora ludzkiego PDGF typu B oraz zależnej od PDGF BB
aktywacji względem niespecyficznego ogólnego efektu komórkowego, np., cytotoksyczności.
Wstępnie inkubowane materiały zajęły końcową objętość 0,5 ml. Umieszczono je w
jednym zagłębieniu każdej z płytek do hodowli tkankowej z sześcioma zagłębieniami
zawierającymi zlewającą się warstwę “wygłodzonych” (nieaktywnych) komórek NIH3T3
surowicy, które schłodzono do 4°C. Komórki i mieszaniny inkubacyjne mieszano, np. kołysząc,
w 4°C przez 2 godz. Następnie przemyto je dwukrotnie roztworem soli buforowanym fosforanem
w temperaturze 4°C. Dodano czterdzieści μl 125 mM Tris(hydroksymetylo)aminometanu (Tris),
pH 6,8, 20% gliceryny (objętościowo), 2% siarczanu dodecylosodowego (SDS) (wagowo-objętościowo), 2% 2-merkaptoetanolu (objętościowo) oraz 0,001% błękitu bromofenolowego
(znanego jako bufor próbny SDS) na zagłębienie do mikromiareczkowania, a następnie dodano
171 788
9
do komórek 40 μl 100 mM Tris, pH 8,0, 30 mM pirofosforanu sodowego, 50 mM fluorku
sodowego, 5 mM kwasu etylenodwuaminotetraoctowego (EDTA), 5 mM kwasu etylenobis(oksyetylenonitrylio)tetraoctowego, 1% SDS (wagowo-objętościowo), 100 mM ditiotreitolu, 2 mM
fenylometylosulfonylofluorku (PMSF) oraz 200 μM wanadanu sodowego. Komórki solubilizowano i do solubilizatu dodano jeszcze 40 μl próbnego bufora SDS. Otrzymaną mieszaninę
utrzymywano w stanie wrzenia przez 5 minut i załadowano do pojedynczego zagłębienia z
próbką żelu (zel poliakryloamidowy z 7,5% siarczanem dodecylowo-sodowym). Proteiny
komórkowe rozdzielono przez elektroforezę.
Rozdzielone proteiny przeniesiono do nitrocelulozy przez elektrotransfer, a otrzymany
“Western blot” inkubowano przy trzech zmianach 0,5% chlorku sodowego (wagowo-objętościowo), 5 mg/ml albuminy surowicy bydlęcej, 50 mM Tris, pH 7,5, (mianowany bufor
blokujący) przez 20 minut każde w temperaturze pokojowej. Rozcieńczone w stosunku 1/1000
PY20 (dostępne w handlu przeciwciało monoklonalne do fosfotyrozyny [ICN]) w buforze
blokującym inkubowano z plamą przez noc w 4°C. Plamę przemywano 3 razy każdorazowo
przez 20 minut w buforze blokującym w temperaturze pokojowej. Plamę inkubowano 4 μCi/40
ml 125I-proteiny A [Amersham] w buforze blokującym przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej i
przemyto 3 razy każdorazowo przez 20 minut w temperaturze pokojowej w buforze blokującym.
Plamę eksponowano na film rentgenowski przez 48 godzin z jednym ekranem wzmacniającym przy
-70°C i wywołano przy użyciu standardowych odczynników.
B. Sekwencja typu A
Podobne manipulacje można wykonać przy użyciu bądź oligonukleotydów mutagenicznych lub primerów PCR opartych na sekwencjach przedstawionych w tablicy 3. Odpowiednie oligonukleotydy są użyte do skonstruowania konstruktów typu A, jak wymieniono
w tablicy 4, które mogą być testowane co do ich funkcji za pomocą różnych formatów jak opisano
w próbach typu B wyszczególnionych powyżej.
T abl i ca
PROPONOWANE
[N . B
ΡΔ101
3 ' -C G A
są
one
GGG
(s e k w e n c ja
PΔ102
3 ' -C T T
O LIG O M E R Y
GA C
(s e k w e n c ja
MUTAGENEZY
k o m p le m e n ta rn e
TG G
n r:
GAC
L U D Z K IE G O
dane
AGA
CTT
3 ' - 5 '
ATT
P D G F -R
TYPU
A
AGC
TCC
C C -5 ’
TCC
C C -5 '
]
GAC
CG C
CTA
10)
AAT
n r:
GCA
;
3
TGA
GTT
CAA
GGA A T T
GAC
CGC
CTA
AGC
11 )
Δ
Ρ 103
3 ' -T A A
AGA
CA G
GTA
C C -5 '
(s e k w e n c ja n r : 12)
CTC
TTT
CCA
ATT
GA C
CGC
CTA
AGC
TCC
ΡΔ1 0 4
3 ' -A T A
CGA A A T T T T
(s e k w e n c ja n r:
13)
ΡΔ105
3 ’ -T A A
C C -5 ’
CGT
TGT
ATG
TAG
(s e k w e n c ja
ATA
n r :
GAT
TAG
(s e k w e n c ja
GAG A C G
n r:
15)
AGT
CAC GGT
14)
ATT
CTG
G AC
GGT
CGC
CTA
A T T GAC
AGC
TCC
C C -5 ’
CGC
CTA
AGC
TCC
ΡΔ106
3 ' -TC G
C C T -5 '
ΡΔ107
3 ’ -TC G
G A T T A G GAG
CGA G A A - 5 '
( s e k w e n c ja n r :
16)
ΡΔ108
3 ' -TC G
A A G -5ł
P
ACG
GTC
GTC
GAA
GAA
GAT
TAG
GAG A C G
GTC
(s e k w e n c ja n r :
17)
CTA
CAT
CGG
AAA
CAT
GGA
GAT
CTC
GAC
CTA
GAT
CTT
TAC
CTT
GAA
AAGT A A
AGT
AG G
CTT
TAG
TTT
GGG
TGG
CAG-
5 ‘
Δ1 0 9
3 ' -TC G
G A T T A G GA G
(s e k w e n c ja n r :
18 )
ACG
GTC
GAA
TAA
GAC
CTG
AAC
10
171 788
Tabl i c a
P roponow ane
k o n s tru k ty
R o z p u s z c z a ln y
4
e k s p re s ji
Zw i ą z a n y
lu d z k ie g o
z
b
PDGF-R
typ u
A
ło n ą
oARSR
pARS
Δ1
pARS
Δ2
pARS
Δ3
Δ
PARS 4
Δ
PARS 5
Δ
PARS 6
pARS
Δ7
pARS
Δ8
Δ
PARS 9
C. Próba płytkowa PDGF
Polistyrenowe płytki do mikromiareczkowania (Immulon, Dynatech Laboratories) pokryto fragmentem pozakomórkowego obszaru ludzkiego receptora PDGF typu B (opisanego
powyżej) przez inkubowanie w przybliżeniu 10-100 ng tej oczyszczonej proteiny na zagłębienie
w 100 μl 25 mM Tris, 75 mM NaCl, pH 7,75 przez 12 go 18 godz. w 4°C.
Proteinę poddano ekspresji w transfekowanych komórkach CHO i zebrano w pożywce nie
zawierającej surowicy (Gibco MEMa) przy stężeniu 0,2 - 1 (μg/ml, przy całkowitym stężeniu
protein od 150-300 μg/ml. Fragment obszaru pozakomórkowego ludzkiego receptora PDGF typu
B zatężono i częściowo oczyszczono przez przepuszczenie pożywki przez układ aglutynina
zarodka pszenicy-sefaroza w 4°C (przy 48 ml/godz) w obecności 1 mM PMSF. Po obfitym
przemywaniu, proteinę wymyto w 0,3 M N-acetyloglukozaminy, 25 mM Hepes, 100 mM NaCl, 1
mM PMSF, pH 7,4. Tę część następnie zastosowano do Sephacryl-u S-200 HR (Pharmacia) zrównoważonego w 0,15 M wodorowęglanu amonowego, pH 7,9. Frakcje zawierające receptor (310 ng/μl) wykryto przez SDS-PAGE i “Western blotting” z poliklonalnym przeciwciałem
królika, wykonanym standardowymi sposobami, wobec segmentu Domeny 1 (D 1) z zewnętrznego obszaru receptora. Te frakcje (3-10 ng/μl) zastosowano do pokrycia zagłębień do
mikromiareczkowania, jak opisano powyżej. Następnie z zagłębień usunięto zawartość, raz
przemyto 200 μl każdego z wymienionych: 0,5% żelatyny (Bio-Rad, klasa EIA), 25 mM Hepes,
100 mM NaCl, pH 7,4, i inkubowano przez 1-2 godz. w 24°C ze 150 μl tego samego roztworu.
Z zagłębień usunięto zawartość i przemyto dwukrotnie 0,3 % żelatyny, 25 mM Hepes, 100 mM NaCl,
przy pH 7,4 (każdorazowo 150 μ l). W każdym zagłębieniu umieszczono 90 μl roztworu 0,3% żelatyny
(w zagłębieniach stosowanych do badania wiązania niespecyficznego umieszczono 80 μl, a następnie
10 μl 0,01 mg/ml nieznaczonego PDGF w 0,3% roztworze żelatyny). PDGF BB (Amgen)
jodynowano w 4°C aż do 52000 CPM/ng za pomocą di jodo-odczynnika Boltona-Huntera
(Amersham) i dodano w przybliżeniu 40000 CPM na zagłębienie w 10 μl, zawierających 0,024%
BSA, 0,4% żelatyny, 20 mM Hepes, 80 mM NaCl, 70 mM kwasu octowego, pH 7,4. Płytkę
inkubowano przez 2-3 godz. w 24°C, po czym zagłębienia przemyto trzykrotnie każdorazowo
150 μl z 0,3% żelatyny, 25 mM Hepes, 100 mM NaCl (pH 7,4). Pozostającą radioaktywność
związaną solubilizowano z zagłębienia w 200 μl 1% SDS, 0,5% BSA i zliczono w liczniku gamma.
Niespecyficzne wiązanie oznaczono w obecności 150-krotnego nadmiaru nieznaczonego PDGF
BB (Amgen); wyniosło ono około 7% całkowitego związanego 125I-PDGF.
171 788
11
Podobne próby będą możliwe przy użyciu fragmentów receptora typu A. Jednak fragmenty
receptora typu A są bardziej czułe na obecność innych protein niż fragmenty typu B, i wydaje
się, że wymagają różnego od żelatyny odczynnika pokrywającego zagłębienie. Hemoglobinę
podstawia się w miejsce żelatyny przy jednej części na 1000.
Niniejsze próby wymagają mniej niż 500 ng/zagłębienie rozpuszczalnej formy receptora,
którą poddano ekspresji w transfekowanych komórkach CHO, i częściowo oczyszczono przez
chromatografię na zasadzie swoistej sorpcji oraz chromatografii żelowej. Przy użyciu jodowanego PDGF-BB, specyficzne wiązanie mniej niż 10 pg ligandu można wykryć przy objętości
próby 100 μg/zagłębienie. Przy 4°C, wiązanie 125I-PDGF BB do unieruchomionego receptora
jest nasycalne i ma wysokie powinowactwo. Kd otrzymane za pomocą analizy Scatcharda
wyniosło około 1 nM przy 1,4 x 10 10miejsc na zagłębienie. Wiązanie niespecyficzne, oznaczone
w obecności 100-krotnego nadmiaru zimnego PDGF BB, odpowiadało jedynie 5-10% całkowitego wiązania. Wiązanie było także specyficzne ze względu na izofermę ligandu, aż do takiego
stopnia, gdy nadmiarowy zimny PDGF AA nie inhibitował wiązania 125I-PDGF BB. Ponadto,
zewnętrzny obszar receptora PDGF typu B w roztworze współzawodniczy z jego
unieruchomioną formą względem wiązania jodowanego PDGF BB (IC50=5 nM). 125I-PDGF BB
związane po 4 godz. w 4°C jedynie powoli dysocjuje w buforze wiążącym (t1/2 > 6 godz.), lecz
jest całkowicie wypierane przez dodanie 150-krotnego nadmiaru nieznaczonego PDGF BB (t1/2
< 1 godz.).
D. Oczyszczanie fragmentów hPDGF-R
Fragment ludzkiego PDGF-R typu B przygotowano z komórek ujawnionych w niniejszej
pracy. Wydzielone fragmenty oczyszczono za pomocą chromatografii na zasadzie swoistej
sorpcji aglutyniny zarodków pszenicy oraz chromatografii sortowania według wymiarów S200.
Czystość określono przez SDS-PAGE i oceniono na około 70%.
Fragment ludzkiego PDGF-R typu A przygotowano z komórek ujawnionych w niniejszym
zgłoszeniu. Wydzielone fragmenty oczyszczono przez chromatografię jonowymienną, chromatografię na zasadzie swoistej sorpcji aglutyniny zarodków pszenicy oraz chromatografię sortowania według wymiarów S200. Czystość określono przez DSD-PAGE i oceniono na około 70%.
E. Utworzenie przeciwciał
Przeciwciała przygotowano przy użyciu standardowych technik. Zob. np. Harlow i Lane
(1990) Antibodies: A Laboratory Manuał. Cold Spring Harbor Press, New York; oraz Goding
(1986) Monoclonal Antibodies. Principles and Practice: obydwie te pozycje załączono do treści
niniejszego zgłoszenia jako odsyłacze. Będą utworzone przeciwciała poliklonalne lub monoklonalne.
Dwie myszy Balb/C immunizowano dla przygotowania przeciwciał monoklonalnych
specyficznych dla każdego typu fragmentów receptora: A oraz B. Każdej myszy wstrzyknięto
wewnątrzotrzewnowo około 100 μg odpowiedniego oczyszczonego fragmentu receptora.
Każdej myszy podano około 100 μ g proteiny. Mysz uśmiercono, a śledzionę wydobyto.
Śledzionę rozerwano, a komórki poddano fuzji z linią szpiczaka P3X przy użyciu glikolu
polietylenowego (PEG). Produkty fuzji komórkowej rozprowadzono do płytek do mikromiareczkowania przy granicznych rozcieńczeniach, by klonalnie wyizolować przeciwciało
wytwarzające hybrydomy. Klony wytwarzające przeciwciało zidentyfikowano za pomocą próby
z immunosorbentem powiązanym z enzymem (ELISA).
Wybrane klony wytwarzające przeciwciało wyhodowano w wystarczającej ilości i
wprowadzono do otrzewnej myszy dla wytworzenia płynu puchlinowego. W typowym przypadku wstrzykiwano do myszy około 1-1,5 x 106 komórek w 1 ml. Przeciwciała z płynu
puchlinowego oczyszczono standardowymi metodami.
Otrzymane przeciwciała zbadano pod kątem ich specyficzności wiązania oraz powinowactwa wiązania. Klon IC705 jest korzystnym przeciwciałem monoklonalnym o specyficzności
wiązania fragmentu receptora typu B; a klon 1H-2H8 jest korzystnym przeciwciałem monoklonalnym
o specyficzności wiązania fragmentu receptora typu A.
F. Przygotowanie fragmentów przy użyciu komórek i przeciwciał.
12
1 7 1 788
Odpowiednie fragmenty receptora będą łatwo wytworzone przy użyciu komórek
ujawnionych w niniejszym zgłoszeniu. Jako przykład, komórki P Δ 1-5 wyhodowano w bioreaktorach typu “hollow fiber” w 5-litrowej hodowli. Pożywki w postaci roztworu usunięto przez
odwirowywanie, a pozostałe komórki usunięto przez sączenie. Pożywki następnie poddano
ultrafiltracji i przepuszczono przez 50-cm kolumnę immunopowinowactwa przeciwciało
monoklonalne-trezyloagaroza. Kolumnę przemyto, a fragmenty związanego receptora wymyto
przy wysokim pH. Oczyszczony rozpuszczalny fragment receptora charakteryzował się
czystością co najmniej około 97% przy wydajności 50 mg z 5 litrów roztworu komórkowego.
Powyższe badania były możliwe dzięki dostępności preparatów czynnika wzrostu zasadniczo pozbawionych zanieczyszczenia innymi czynnikami wzrostu oraz dzięki zastosowaniu
układu ekspresji receptora, w którym wszystkie ze zmierzonych reakcji PDGF mogłyby być
przypisane temu pojedynczemu transfekowanemu cDNA receptora.
Wszystkie publikacje i zgłoszenia patentowe w niniejszym zgłoszeniu są załączone jako
odsyłacze w tym samym stopniu, jak każda poszczególna publikacja lub zgłoszenie patentowe
szczególnie i indywidualnie wskazane jako załączone jako odsyłacze. Po pełnym opisaniu
niniejszego wynalazku będzie oczywiste dla specjalistów, ze wiele zmian i modyfikacji można
wykonać bez odchodzenia bez ducha i zakresu załączonych zastrzeżeń.
171 788
WYKAZ
(1)
IN FORMACJ A
( I )
ZGŁASZAJĄCY
SEKWENCJI
OGÓL N A
;
W o lf,
D a v id
T o m lin s o n ,
James
E
( I I ) TYTU Ł WYNALAZKU: S p o s o b y w y t w a r z a n i a o c z y s z c z o n y c h
ro z p u s z c z a ln y c h fra g m e n tó w
lu d z k ie g o re c e p to ra
p o c h o d z ą c e g o z p ł y t e k c z y n n i k a w z r o s t u t y p u A i t y p u B.
(III)
L IC ZB A
( IV)
ADRES D LA K O R E S P O N D E N C J I:
( A ) A D R E S A T : W i l l i a m M. S m i t h .
(B) U L IC A :
One M a r k e t P l a ż a ,
S te u a rt
(C) M IASTO : San F r a n c i s c o
(D) STAN: C a l i f o r n i a
(E) KRAJ :
USA
(F) Z I P : 9 4 1 0 5
(V)
SEKWENCJ1
: 18
POSTAĆ C Z Y T A N A P R Z E Z KOMPUTER:
(A ) TYP N O Ś N IK A :
dysk e la s ty c z n y
( B ) K O M P U T E R : k o m p a t y b i l n y z I B M PC
(C ) SYSTEM OPERACYJNY: P C -D O S /M S -D O S
( D ) SOFTWARE: P a t e n t I n R e l e a s e # 1 . 0 ,
(VI)
B I E Ż Ą C E DANE DOTYCZĄCE Z G Ł O S Z E N I A
(A)
N UMER Z G Ł O S Z E N I A : P C T
(B ) DATA ZG ŁO SZEN IA :
(C) K L A S Y F IK A C J A :
(V)
P O P R Z E D N I E DANE D O T Y C Z Ą C E
( A ) NUMER Z G Ł O S Z E N I A : US
(B) DATA ZG ŁO SZEN IA :
2
(V I )
DANE
( IX)
Tow er,
WERSJA
ZGŁO SZEN IA
0 7 /8 0 1 ,7 9 4
GRUDZIEŃ 1991
DOTYCZĄCE P R A W N IK A /A G E N T A :
( A ) N A Z W I S K O : Smi t h ,
W i l l i a m M.
( B ) NUMER R E J E S T R A C J I : 3 0 , 2 2 3
( C ) NUMER O D N I E S I E N I A / R E J E S T R U :
INFORMACJA DOTYCZĄCA POŁĄCZEŃ:
(A) TELEFON:
415-326-2400
(B) TELEFAKS:
415-326-2422
12418-15
S u ite
#1.25
2000
14
(2 )
INFORMACJA
DLA
SEKWENCJI
NR:
1
:
( I ) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
( A ) DŁUGOŚĆ:
39 p a r z a s a d
(B) TYP: kw as n u k l e i n o w y
( C)
ILOŚĆ N I C I :
p o je d y ń c z a n ić
(D) TO PO LOG IA:
liniow a
( I I )
TYP
(X I )
OPIS
C Z Ą S T E C Z K I:
SE KW EN C JI:
AGCCCCCTAC
39
(2 )
DNA
SEKW ENCJA
AGGAAGCTAC
INFORMACJA
DLA
(genom ow y)
NUMER:
TTAAAGGGCA
SEKW ECJI
NR:
1
:
AGGAGTGTG
2
:
( I ) CHARAKTERYSTYKA SEKW ENCJI:
( A ) DŁUGOŚĆ: 3 9 p a r z a s a d
(B) TYP: kw as n u k l e i n o w y
( C)
ILOŚĆ N I C I :
p o je d y ń c z a n ić
(D) TOPOLOGIA:
liniowa
( I I )
TYP
C ZĄ STE CZK I:
(X I )
O P IS
D NA
SEKW EN C JI:
AGCCCCCTAC
(genom ow y)
SEKW ENCJA
AGGAAGCTAA
N U ME R: 2
TTGATCTGTA
:
GGTCGAAGG
39
(2 )
INFORMACJA
DLA
SEKWENCJI
NR:
3
:
( I ) CHARAKTERYSTYKA SEKW ENCJI:
( A ) DŁUGOŚĆ: 41 p a r z a s a d
(B) TYP: kw as n u k l e i n o w y
( C)
ILO Ś Ć N I C I :
p o je d y ń c z a n ić
(D) TOPOLOGIA:
liniowa
( I I )
TYP
(X I )
OPIS
C ZĄ STE CZK I:
CAGCCCCCTA
41
SEKW ENCJI:
CAGGAAGCTA
D NA
(genom owy)
SEKWENCJA
NU ME R:
3
:
GCCGCTCTCA ACCACGGTGA
T
171 788
(2 )
INFORMACJA
DLA
SEKWENCJI
NR:
4
:
( I ) CHARAKTERYSTYKA SEKW ENCJI:
( A ) DŁUGOŚĆ: 41 p a r z a s a d
(B) TYP:
kwas n u k l e i n o w y
( C)
ILOŚĆ N I C I :
p o je d y ń c z a n ić
(D) TOPO LOG IA:
liniow a
(II)
TYP
(X I )
OPIS
C ZĄSTE C ZK I:
SEKW EN C JI:
CAGCCCCCTA
41
(2)
DNA
SEKWENCJA
CAGGAAGCTA
INFORMACJA
DLA
(genom ow y)
N U M E R:
GGATGACACC
SEKWENCJI
NR:
4
:
TGGAGTCTGT
5
A
:
( I ) C H ARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
( A ) DŁUGOŚĆ:
44 p a r z a s a d
(B ) TYP: k w a s n u k l e i n o w y
( C)
I L O ŚĆ N I C I :
p o je d y ń c z a n ić
(D) TOPO LOG IA:
liniow a
( I I )
TYP
(X I )
OPIS
C Z Ą S T E C Z K I:
D NA
SEKW EN C JI:
GA G C CC CC TA
(genom ow y)
SEKWENCJA
CAGGAAGCTA
N U M E R:
GGG AT C T GGC
5
:
ACAAAGATGT
AGAG
44
(2 )
INFORMACJA
DLA
SEKWENCJI
NR:
6
:
(i)
CHARAKTERYSTYKA SEKW EN C JI:
(A ) DŁUGOŚĆ:
45 p a r za sa d
(B) TYP: k w a s n u k l e i n o w y
( C)
ILOŚĆ N I C I :
p o je d y ń c z a n ić
(D) TO P O LO G IA :
liniow a
( I I )
TYP
(XI)
O P IS
C ZĄ S TE C ZK I:
ATGATTAGGG
45
SE KW EN C JI:
AGGAAGCCCA
DNA
(genom ow y)
SEKWENCJA
NUMER:
C GGT GA CC A G
6
:
G C C C TG A G A G A T C T G
16
(2)
IN F O R M A C J A
DLA
SEKW ENCJI
NR:
7
:
( I ) C H AR AKTE RY STYK A SEKWENCJI :
(A ) DŁUGOŚĆ: 4 8 p a r z a s a d
(B) TYP:
kwas n u k le in o w y
( C)
ILO ŚĆ N I C I :
p o je d y ń c z a n ić
(D) TO PO LO G IA:
liniowa
(II)
TYP
( XI )
OPIS
C ZĄ S TE C ZK I:
SEKW ENCJI:
CTGCACTGCG
48
(2 )
D NA
SEKWENCJA
TTCACAGAGA
INFORMACJA
DLA
(genom owy)
N U M E R:
CGTTGATGAC
SEKWENCJI
7
:
CAGGCCCTGA
NR:
8
GAGATCTG
:
( I ) CHARAKTERYSTYKA SEKW ENCJI:
( A ) DŁUGOŚĆ: 4 5 p a r z a s a d
(B) TYP:
kwas n u k le in o w y
(C)
ILOŚĆ N I C I :
p o je d y ń c z a n ić
(D) TOPO LOG IA:
liniow a
( I I )
TYP
(X I )
OPIS
C ZĄ S TE C ZK I:
SE KW EN C JI:
CAGCTCTCCC
45
(2)
DNA
SEKWENCJA
A G GA GC CG C A
INFORMACJA
DLA
(genom ow y)
N U M E R:
CGTAGACCAG
SEKWENCJI
8
:
GCCCTGAGAG A T C T G
NR:
9
:
( I ) CHARAKTERYSTYKA SEKW EN C JI:
(A ) DŁUGOŚĆ: 4 2 p a r z a s a d
(B) TYP: k w a s n u k l e i n o w y
(C)
ILOŚĆ N I C I :
p o je d y ń c z a n ić
(D) TOPO LOG IA:
liniowa
( I I)
TYP
(XI)
OPIS
C ZĄ S TE C ZK I:
ACTTAGCTCC
42
SE KW ENCJI:
AGCACTCGGA
DNA
(genom ow y)
SEKWENCJA
N U M E R:
C GACCAGGCC
9
:
CTGAGAGATC
TG
171 788
(2)
INFORMACJA
DLA
SEKWENCJI
NR:
10
17
:
(i)
CHARAKTERYSTYKA SE KW EN C JI:
( A ) D Ł U G O Ś Ć : 41 p a r z a s a d
(B) TYP: kw as n u k l e i n o w y
( C)
ILOŚĆ N I C I :
p o je d y ń c z a n ić
(D) TO PO LOG IA:
liniow a
(i i)
TYP
C ZĄSTE C ZK I:
( X I )
OPIS
SEKW ENCJI:
CCCCTCGAAT
41
(2)
DNA
SEKWENCJA
CCGCCAGTTA
INFORMACJA
DLA
(genom ow y)
NUMER:
TTCAGAACGC
SEKWENCJI
NR:
10
:
AGGGTGGGAG
1
]1
C
:
(i)
CHARAKTERYSTYKA SE KW ENCJI:
( A ) D Ł U G O Ś Ć : 41 p a r z a s a d
(B) TYP: kw as n u k l e i n o w y
( C)
ILOSĆ N I C I :
p o je d y ń c z a n ić
(D) TOPO LOG IA:
liniow a
(II)
TYP
(XI)
OPIS
C ZĄSTE C ZK I:
SEKW ENCJI:
CCCCTCGAAT
41
(2)
DNA
SEKWENCJA
CCGCCAGTTA
INFORMACJA
DLA
(genom owy)
N U ME R:
AGGAACTTGA
SEKWENCJI
NR:
11
:
GTTAACAGTT
12
C
:
(I)
CHARAKTERYSTYKA SEKW EN C JI:
( A ) D Ł U G O Ś Ć : 41 p a r z a s a d
(B) TYP: kw as n u k l e i n o w y
(C)
ILOŚĆ N I C i :
p o je d y ń c z a n ić
(D) TO PO LOG IA:
liniow a
(II)
TYP
(x i )
OPIS
C Z Ą STE C ZK I:
CCCCTCGAAT
41
SEKW EN C JI:
CCGCCAGTTA
DNA
(genom owy)
SEKWENCJA
NUMER:
ACCTTTCTCA
12
:
TGGACAGAAA
T
18
171 788
(£)
IN FOR M A C JA
DLA
SEKWENCJI
NR:
(i)
(A)
(B)
(C)
(D)
CHARAKTERYSTYKA SEKW ENCJI:
D Ł U G O Ś Ć : 41 p a r z a s a d
TYP: k w a s n u k l e i n o w y
! LOSĆ N I C I :
p o je d y ń c z a n ić
TOPOLOGIA:
liniow a
(II)
TYP
(xi)
OPIS
C ZĄ S TE C ZK I:
SEKW ENCJI:
CCCCTCGAAT
41
(S)
D NA
INFORMACJA
DLA
:
(genom ow y)
SEKWENCJA
CCGCCAGTTA
13
N U ME R:
TGATGTTGCT
SEKWENCJI
13
:
TTTAAAGCAT
NR:
U
A
:
(i)
CHARAKTERYSTYKA SEKW ENCJI:
( A ) DŁUGOŚĆ: 4 4 p a r z a s a d
(B ) TYP: k w a s n u k l e i n o w y
(C)
ILOSĆ N I C I :
p o je d y ń c z a n ić
(D) TOPO LOG IA:
liniowa
( ii )
TYP
( x i )
OPIS
C Z Ą STE C ZK I:
SEKW ENCJI:
C C C C T C G AA T
44
(S)
D NA
SEKWENCJA
CCGCCAGTTA
INFORMACJA
DLA
(genom ow y)
N U ME R:
T GG G TC TG G C
SEKWENCJI
NR:
14
:
A C A T A G A T GT
15
AAAT
:
(i)
CHARAKTERYSTYKA SEKW ENCJI:
( A ) DŁUGOŚĆ:
45 p a r z a s a d
(B) TYP: k w a s n u k l e i n o w y
( C)
ILOŚĆ N I C I :
p o je d y ń c z a n ić
(D) TOPOLOGIA:
liniowa
(
i i
( X I )
)
TYP
C Z Ą STE C ZK I:
O PIS
TCCTAGAGGT
45
SEKW EN C JI:
ACAAAGGCTA
D NA
(genom owy)
SEKWENCJA
N U ME R:
CATCAAGCTG
15
:
GCAGAGGATT
AGGCT
171 788
(2)
INFORMACJA
DLA
SEKWENCJI
NR:
16
19
:
( I ) CHARAKTERYSTYKA SEKW EN C JI:
(A ) DLUGOSć:
49 p a r zasad
(B) TYP: k w a s n u k l e i n o w y
( C)
IL OŚĆ N I C I :
p o je d y n c z a n ić
(D) TOPOLOGIA:
liniow a
( ii )
TYP
C ZĄ S TE C ZK I:
(X I )
OPIS
SE KW EN C JI:
AAGAGCTTCC
49
(2)
DNA
SEKW ENCJA
ATTTCTAGAT
INFORMACJA
DLA
(genom owy)
NUMER:
CCGACTCCAA
SEKWENCJI
NR:
16
:
GCTGGCAGAG
17
GATTAGGCT
:
(i)
CHARAKTERYSTYKA SEKW ENCJI:
( A ) DŁUGOŚĆ:
45 p a r zasad
(B ) TYP: k w a s n u k l e i n o w y
( C)
ILOŚĆ N I C I :
p o je d y ń c z a n ić
(D) TOPO LOG IA:
liniow a
( I I )
TYP
C Z Ą S T E C Z K I:
(X I )
OPIS
GAAGGT GGGT
45
(2)
SE KW EN C JI:
TTGATTTCAA
IN FOR M A C JA
DLA
DNA
(genom ow y)
SEKWENCJA
N U M E R:
TGAAAAGCTC
SEKWENCJI
NR:
17
:
GCAGAGGATT
18
AGGCT
:
( i ) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI :
( A ) DŁUGOŚĆ:
42 p a r z a s a d
(B) TYP: k w a s n u k l e i n o w y
( C)
IL OŚĆ N I C I :
p o je d y ń c z a n ić
(D) TOPOLOGIA:
liniow a
( I I ) TYP
(X I )
C ZĄ S TE C ZK I:
OPIS
GA CC AA G T CC
42
SEKW ENCJI:
AGAATGGATG
DNA
(genom ow y)
SEKW ENCJA
N U ME R:
AAAGCTCGCA
18
:
GAGGATTAGG
CT
171 788
171 788
FIG.2.
FIG. 3.
171 788
FIG 1.
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.
Cena 4,00 zł