close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

PL174430B1

код для вставкиСкачать
R ZE C ZPO SPO LITA
POLSKA
(12) OPIS PATENTOWY (19) PL
(21) Numer zgłoszenia:
(22) Data zgłoszenia:
(13) B1
313224
27.06.1994
(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
27.06.1994, PCT/GR94/00015
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej Polskiej
(11) 174430
(51) IntCl6:
A24D 3/16
(87) Data i numer publikacji zgłoszenia
międzynarodowego:
04.01.1996, WO96/00019,
PCT Gazette nr 02/96
)Sposób wytwarzania filtra do filtrowania dymu tytoniowego
4
(5
posiadającego osnowę włóknistą
(73)
(43)
Uprawniony z patentu:
Stavridis loannis, Ateny, GR
Deliconstantinos George, Ateny, GR
Zgłoszenie ogłoszono:
10.06.1996 BUP 12/96
(72)
Tw órcy wynalazku:
loannis Stavridis, Ateny, GR
George Deliconstantinos, Ateny, GR
(45)
O udzieleniu patentu ogłoszono:
31.07.1998 W U P 07/98
(74)
Pełnomocnik:
Dehnel Zofia, POLSERVICE
PL 174430
B1
(57)
1. Sposób w ytw arzania filtra do filtrow ania dymu tytoniowego posiadającego osnowę
w łóknistą, znamienny tym , że w zbogaca się filtr w substancję biologiczną w ybraną spośród
jednej lub większej liczby substancji zawierających żelazo, miedź i/lub m agnez skom plekso
wane z pierścieniem porfirynow ym i żelazo stereospecyficznie zw iązane w cząsteczkach
białka, przy czym m ateriał filtra im pregnuje się jedną lub kilkom a wym ienionym i substancjami i filtruje się otrzymany materiał aby usunąć niezaabsorbowane substancje biologiczne.
Sposób wytwarzania filtra do filtrowania dymu tytoniowego
posiadającego osnowę włóknistą
Zastrzeżenia
patentowe
1. Sposób w ytw arzania filtra do filtrow ania dymu tytoniowego posiadającego osnowę
włóknistą, znam ienny tym, że w zbogaca się filtr w substancję biologiczną w ybraną spośród
jednej lub większej liczby substancji zawierających żelazo, miedź i/lub magnez skompleksowane
z pierścieniem porfirynow ym i żelazo stereospecyficznie związane w cząsteczkach białka, przy
czym m ateriał filtra im pregnuje się jedną lub kilkom a wymienionymi substancjami i filtruje się
otrzymany m ateriał aby usunąć niezaabsorbowane substancje biologiczne.
2. Sposób w edług zastrz. 1, znamienny tym, że substancję biologiczną dostarcza się jako
roztw ór 1-10 m g/m l w roztw orze solanki buforowanej fosforanem o pH 7,4.
3. Sposób w edług zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że im pregnację m ateriału filtra
substancją biologiczną prowadzi się przez 30 m inut w tem peraturze pokojowej.
4. Sposób w edług zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się węgiel aktywowany wzbogacony substancją biologiczną.
5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako substancję biologiczną stosuje się
hem oglobinę i/lub lizat erytrocytów.
6. Sposób w edług zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że stosuje się substancje biologiczne
wybrane spośród jonów żelaza Fe2+ stereospecyficznie związanych z jedną lub z w iększą liczbą
substancji, takich ja k transferyna, katalaza, protoporfiryna, cytochrom C i chlorofil.
7. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 4, albo 5, znamienny tym, że w zbogaconą osnowę
włóknistą w łącza się do zwykłego filtra papierosowego, w którym jest ona flankow ana przez
osnowę w łóknistą nie wzbogaconą substancją biologiczną.
*
*
*
Przedm iotem wynalazku je st sposób w ytw arzania filtra do filtrow ania dymu tytoniowego
posiadającego osnow ę włóknistą, ograniczającego wdychanie szkodliwych zw iązków, takich
jak tlenki azotu, wolne rodniki, aldehydy, nadtlenek wodoru, tlenek węgla, pierw iastki śladowe
i rakotwórcze lotne związki nitrozowe, podczas palenia papierosów. Dotychczas substancje te
nie są skutecznie zatrzym yw ane przy użyciu znanych filtrów papierosowych.
W ogromnej ilości publikacji ogłaszanych w czasopism ach m iędzynarodow ych wykazuje
się, że dym papierosow y rozdziela się na dwie fazy: a) fazę stałą (smołę) i b) fazę gazową.
Rozdział taki następuje wówczas, gdy stosuje się typowy filtr z w łókna szklanego typu Cambridge, zatrzym ujący 99,9% cząstek o wielkości większej od 0,1 μm. Sm oła papierosow a zawiera
wyjątkowo wysokie stężenia bardzo trwałych wolnych rodników, które m ożna zaklasyfikować
do co najmniej czterech różnych kategorii. Semichinony w rów nowadze z chinonem i hydroksychinonami uw aża się za wolne rodniki o najbardziej interesujących własnościach chemicznych.
Układ chinonowy redukuje tlen cząsteczkow y z utw orzeniem ponadtlenku (O 2 ), który w wyniku
samorzutnej dysm utacji tworzy nadtlenek wodoru (H 2 O 2). W fazie gazowej w ystępuje ponad
1015 rodników organicznych wdychanych w jednym pociągnięciu dymu o czasie półtrwania
poniżej jednej sekundy. Pomim o tak krótkiego czasu półtrwania, paradoksalnie, rodniki te mogą
utrzym yw ać w ysokie poziom y aktyw ności w fazie gazow ej w czasie dłuższym niż 10 minut.
W rzeczywistości, stężenie tych rodników znacznie się zw iększa przy zbliżaniu się do końca
filtra papierosowego. To paradoksalne zjawisko tłumaczy się utrzym yw aniem się stanu ustalonego w w yniku ciągłego w ytw arzania wolnych rodników (Pryor W. A., Stone K., Ann. N. Y.
Acad. Sci. 686: 12-28, 1993).
174 430
3
Tlenek azotu (NO) je st najważniejszym wolnym rodnikiem w ystępującym w fazie gazowej
dymu papierosowego. Rodnik ten, podczas palenia uczestniczy w ciągu reakcji, w których
kolejno pow stają dw utlenek azotu, rodniki izoprenowe, rodniki nadtlenkow e i rodniki alkoksylowe. Dym papierosow y zaw iera również znaczną ilość aldehydów m ających swój udział w jego
niszczącym działaniu toksycznym . W ykazano, że nawet bardzo małe ilości aldehydów ekstrahowanych z dym u papierosow ego wywołują zarówno reakcje kataboliczne jak i utlenianie grup
tiolowych w białkach osocza. Te właściwości aldehydów są wynikiem reakcji między grupą
karbonylową tych aldehydów z grupami -SH i -NH 2 białek osocza. Przykładow o, akroleina z
dymu papierosow ego szybko reaguje z grupami -SH tw orząc związki karbonylow e (Alving K.,
Forhem C. i Lundberg J. M ., Br. J. Pharmacol. 110:739-746,1993). W sm ole z dymu papierosowego znajdują się pierw iastki śladowe, np. żelazo, miedź, mangan i kadm , zaangażow ane w
wiele reakcji, w których pow stają wolne rodniki i prowadzące do tw orzenia się wysoce
aktyw nych rodników drugorzędow ych (np. rodników nadtlenkow ych, rodników alkoksylowych, ponadtlenków, cytotoksycznych aldehydów i podobnych). W prow adzenie pierw iastk ó w ś la d o w y c h do p łu c p o d c z a s p a le n ia p a p ie ro só w p ro w a d z i do serii re a k c ji
oksydoredukcyjnych zarów no w płynach płuc jak i w m akrofagach pęcherzyków płucnych, w
wyniku czego pow stają bardzo aktywne rodniki hydroksylowe ( OH-). Te rodniki hydroksylow e
tworzą się głów nie w obecności żelaza w reakcji Fentona. M iedź m oże rów nież tworzyć rodniki
hydroksylowe na drodze reakcji z nadtlenkiem wodoru w płucach. M angan, w niskich stężeniach
( 10-7 M), stymuluje rozpuszczalną cyklazę guanylanową kom órek śródbłonkow ych płuc, w ywołując powstawanie tlenku azotu i ponadtlenku na drodze reakcji przebiegającej według
mechanizmu sprzężenia zw rotnego dodatniego (Youn Y. K., Lalonde C., Demling R., Free Rad.
Biol. Med. 12: 409-415, 1992).
Podczas tlenia się papierosa powstaje tlenek węgla. Znaczna ilość CO pozostaje w płucach
nawet po wydechu, w wyniku czego zachodzi stym ulacja rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej
po jej reakcji z resztą hem ową enzym ów komórek śródbłonkow ych i innych komórek tkanki
płucnej. Zwiększone poziom y cyklicznego GMP w kom órkach w połączeniu z m echanizm em
dodatniego sprzężenia zw rotnego dają wzrost produkcji tlenku azotu i ponadtlenku (W atson A.,
Joyce H., H opper L. i Pride N. B., Thorax 48: 119-124, 1993). Gazowy N O, który może być
wytwarzany przez wiele typów kom órek włącznie z kom órkam i śródbłonka komórek naczyń
krwionośnych i komórek śródbłonka układu siateczkowego, pow oduje rozluźnienie mięśni
gładkich (Lowenstein C. J., Dinerman J. L., Snyder S. H., Ann. Intern. M ed. 120:227-237,1994).
Istnieją rów nież egzogenne źródła NO. Uważa się, że są one w podobny sposób odpow iedzialne
za powodowanie uszkadzania naczyń krwionośnych i innych tkanek. Jednoznacznie ustalono,
że drugorzędowe i trzeciorzędowe aminy m ogą reagować z azotynem i z innymi środkami
nitrozylującymi, w wyniku czego pow stają N-nitrozoaminy (Low enstem C. J., Dinerm an J. L.,
Snynder S. H., Ann. Intern. Med. 120:227-237,1994). Począw szy od 1974 roku, w wielu pracach
wykazano, że podczas zbioru i przerobu tytoniu, a następnie podczas jego palenia, obecne w nim
alkaloidy ulegają nitrozowaniu do specyficznych dla tytoniu N -nitrozoam in (TSNA). Spośród
związków zidentyfikow anych w tytoniu i/lub w dymie tytoniow ym silnymi środkami rakotw órczymi dla zwierząt okazały się: N -nitrozonornikotyna(NNN), 4'-(metylonitrozoamino)-1-(3-pirydylo)-1-butanon(N N K) i 4-(m etylonitrozoam ino)-1-(3-pirydylo)-1-butanol(NNAL). NNN
wywołuje raka płuc u myszy, raka tchawicy u chom ików i now otw ory jam y nosowej i raka
przełyku u szczurów. N N K pow oduje nowotwory płuc u m yszy, chom ików i szczurów a także
nowotwory wątroby, jam y nosowej i trzustki u szczurów. Pędzlow anie jam y ustnej m ieszaniną
NNN i NNK wywołuje nowotwory w jam ie ustnej i w płucach szczurów. Typow a ilość N NK i
NNN w strum ieniu dym u papierosow ego wynosi 200 ng/papieros (Hecht S. S., Spratt T. E. i
Trushin N., Carcinogenesis 9: 161-165, 1988).
Nasze w łasne badania nad wpływem dymu papierosow ego na tkankę płucną ujawniły, że
NO reaguje z ponadtlenkiem tworząc silnie utleniający rodnik, nadtlenoazotyn (ONOO-),
powodujący wtórne, w yniszczające reakcje w kluczowych cząsteczkach biologicznych. D ziałanie m etaboliczne i niszczące NO w komórkach było badane w naszym laboratorium w dośw iadczeniach in vitro i in vivo.
4
174 430
W obecności tlenu NO ulega utlenieniu do dwutlenku azotu (N O 2). Szybkość tego
utleniania zależy od stężenia tlenu i kwadratu stężenia NO. D w utlenek azotu jest wyraźnie
cytotoksyczny, w roztworach w odnych przechodzi w azotyn i w azotan. Ponadto, NO tworzy
kom pleksy z metalami śladowymi i/lub z metaloproteinami, np. z hem oglobiną (W ink D. A.,
D arbyshire J. F., Nims R. W., Saavedra J. E. i Ford P. E., Chem. Res. Toxicol. 6: 23-27, 1993).
NO, który reaguje z ponadtlenkiem z wytworzeniem szkodliwego związku ONOO' może
tłum aczyć niektóre typy toksyczności ponadtlenków. Biorąc pod uwagę wysoki potencjał
utleniający ONOO- (+1,4 V), je st on nadzwyczaj stabilny. Podczas jego rozkładu pow stają silnie
utleniające pochodne, w tym rodnik hydroksylowy, dwutlenek azotu i jon nitroniowy. W skutek
tego, każda m odyfikacja w pow staw aniu NO i ponadtlenku w tkankach m oże prowadzić do
tw orzenia się rodników silnie utleniających wtórnie (Deliconstantinos G., V iliotou V., Stavrides
J. C., Cancer Mol. B ol. 1:77-86,1994). W końcu, O NO O - i jego estry (RO-ONO albo RO-ONO 2)
m ają tendencję do pow odow ania inaktywacji inhibitora alfa-1-proteinazy ( a 1PI). M ożna to
w ytłum aczyć tym, że a) sam nadtlenek wodoru nie powoduje szybkiej inaktywacji inhibitora
a1PI a działa jedynie w obecności NO, prowadząc do pow staw ania O NO O - i szybkiej inaktywacji
a 1PI, b) roztwory tert-butylonadtlenoazotynu (RO-O-O-NO 2 ) albo ONOO- w yw ołują same
inaktywację a 1PI i c) aminy i am inokwasy chronią a 1PI-proteinazę przed szybką inaktyw acją
(M oreno J. J. i Pryor W . A., Chem. Res. Toxicol. 5: 425-431,1992). Oprócz wolnych rodników
zawartych w dymie papierosow ym , innym ważnym źródłem wytw arzania w olnych rodników u
palaczy są aktywowane m akrofagi pęcherzyków płucnych. M akrofagi pęcherzyków płucnych
aktywowane dymem papierosow ym ulegają rozrywaniu podczas oddychania, przez co zwiększa
się wytwarzanie w olnych rodników tlenowych (głównie O 2- , NO i H 2 O 2).
W ykazano, że palacze m ają zwiększoną ilość zarówno makrofagów pęcherzyków płucnych jak i krążących neutrofili. W olne rodniki tlenu w dymie papierosow ym rów nież uczestniczą
w procesie pow staw ania nowotworu płuc. W dychany dym papierosow y pow oduje zwiększone
utlenianie w kom órkach płuc, co powoduje zm niejszenie stężenia w ewnątrzkom órkowych
substancji antyutleniających. H 2 O 2 reaguje z DNA kom órek na drodze produkcji rodników
hydroksylowych, powodując przerw anie podwójnej nici. Przerwaniu podwójnej nici DNA
m ożna zapobiec przez dodanie katalazy, co pośrednio potw ierdza uszkadzające działanie H 2 O 2
i rodników hydroksylow ych na komórkowy DNA (Leanderson P., Ann. N. Y. Acad. Sci. 686:
249-261, 1993). Poza tym, H 2O 2 może powodować zmiany transform acyjne w warstwie śród
błonkow ej tchaw icy płuc i w iąże się go z rozw ojem raka oskrzelopochodnego u palaczy.
Tak więc, istnieją przypuszczenia, że H 2O 2 (zawarty w dymie z papierosów ) w yw iera niszczące
działanie na komórki płuc i odgryw a rolę w rozwoju raka płuc. Smoła z dymu papierosowego
zaw iera zarówno rodniki sem ichinonow e jak i żelazo, co daje układ w ytw arzania rodników
hydroksylowych. Różne pierwiastki śladowe zawarte w smole z dymu papierosow ego (Fe, Cu,
M n, Cd) m ogą działać zarów no wewnątrzkom órkowo jak i poza komórką. Fe2+ w dobrze znanej
reakcji Fen tona:
Fe2+ + H 2 O 2 -------------------- » Fe3+ + OH + OHpowoduje wiele reakcji utleniania przebiegających poprzez rodniki hydroksylowe. Podobne wytwarzanie rodników hydroksylow ych można uzyskać stosując C d2+. Jon M n2+ jest
charakterystycznym stym ulatorem aktywności rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej. Cd2+ zawarty w dym ie papierosow ym je st wyjątkowo toksyczny w stosunku do płuc. W płucach palaczy
występuje dw ukrotnie większe w stosunku do normy stężenie Cd2+. Przypuszcza się, że Cd2+
wypiera Zn2+ w stanie praw idłow ym w śródbłonku naczyń płucnych (Kostial K. w publikacji:
"Trace Elements in Human and Animal Nutrition", wyd. W. M ertz) wyd. V, tom 2: 319-345,
Academ ic Press, Inc. Orlando, FI., 1986). Obecne w dym ie papierosow ym aldehydy reagują z
grupami -SH i -NH 2 białek, pow odując, że stają się one obojętne. Aldehyd krotonow y (aldehyd
α , β-nienasycony zawarty w dym ie papierosow ym obniża stężenie grup -SH i zw iększa stężenie
białek z grupami karbonylowym i (Stadtman E. R., Science 257: 1220-1224, 1991).
Obecnie poleca się filtry do papierosów. Ostatecznym celem dodaw ania filtrów do
papierosów jest uzyskanie m aksym alnej retencji szkodliwych związków występujących żarów-
174 430
5
no w fazie gazowej jak i w smole z dymu papierosowego. Badania epidem iologiczne u palaczy
wykazały, że istnieje zależna od dawki odpowiedź, niezależnie od tego, czy dym papierosowy
był podawany w fazie gazowej, w fazie stałej, czy w fazach połączonych (Surgeon General of
the U. S. Public Health Service. The health consequences of using sm okeless tobacco, N. H.
Publ. nr. 86-2874, Bethesda, M D, 1986). Udowodniono, że m odyfikacja papierosa je st sam a w
sobie praktycznym podejściem do zm niejszenia ilości szkodliwych zw iązków zawartych w
dymie papierosowym. Początkowo uzyskano to stosując zwykłe filtry, następnie zm ieniając
skład tytoniu na drodze przetwarzania chem icznego. D okonywano rów nież zm iany w procesie
w ytwarzania papierosów, stosując porowaty papier Iub papier sporządzony z liści tytoniowych.
W ostatnich 15 latach czyniono wiele w ysiłków w celu obniżenia niszczącego wpływu palenia
na zdrowie palaczy poprzez: zm niejszenie ilości dymu w jednym papierosie; zm iany średnicy
papierosa; przez stosowanie perforow anych filtrów. Filtry perforow ane pozw alają na rozcieńczenie dymu papierosow ego pow ietrzem do 50%. W połączeniu z perforow anym i filtrami
stosowano rów nież węgiel aktywowany. B yło to związane ze znacznym obniżeniem ilości smoły
i nikotyny w dymie. Techniki te stosuje się, zw łaszcza w krajach rozw iniętych, takich jak Austria,
Kanada, Francja, Niemcy, Szwecja, W ielka Brytania i Stany Zjednoczone Ameryki. Średnią
ilość smoły i nikotyny w papierosach am erykańskich obniżono odpow iednio z 38 mg i 2,7 mg
w 1955 do 13 mg i 1 mg w 1991 r. W Unii Europejskiej ciągle kontynuuje się prace w kierunku
zm niejszenia ilości smoły i nikotyny w dym ie papierosowym. Górnym dopuszczalnym limitem
dla smoły od stycznia 1993 r je st 15 mg. Ilość ta ma być obniżona do 12 mg do stycznia 1998
roku. Jednakże w innych krajach ilość smoły w dymie papierosow ym wynosi 22 mg (M itacek
E. J., Brun N em an K. D., Pollednak A. P., H offm an D. i Suttajit M ., Prev. M ed. 20: 764-773,
1991). Zmiany dokonywane w produkcji papierosów prow adzą do specyficznego usunięcia z
dymu papierosow ego niektórych substancji toksycznych; w prowadzono zw łaszcza filtry z
octanu celulozy, co pozw oliło na częściow e usunięcie trudno-lotnych fenoli i lotnych N -nitroz
oamin (Brunnemann K. D., Hoffman D., R ecent Adv. Tobacco Res. 17: 71-112, 1989). Tlenek
węgla selektywnie redukuje się przez zastosow anie filtrów perforow anych. Stężenie rakotw órczych polijądrow ych węglowodorów aromatycznych (PAH) selektywnie obniża się stosując
tytoń wzbogacony w azotyn. Jednakże, obniżenie zaw artości PA H w tytoniu przez użycie
wysokich stężeń azotynu prowadzi do niepożądanego zw iększenia rakotw órczych N -nitrozo
amin. Zaistniała więc potrzeba obniżenia stężenia PAH metodam i alternatywnym i (Hoffman D.,
Hoffman I., W ynder E. I., Lung Cancer and the Changing Cigarette in R elevance to Human
Cancer of N-nitroso-com pounds, Tobacco Smoke and M ycotoxins (wyd. O 'N eil, I. K., Chen J.,
Bartsch H, tom 105: 449-459, 1991).
Z pow yższego opisu wyraźnie wynika, że istnieje potrzeba produkow ania filtra um ożliw iającego zatrzymanie szkodliwych tlenków azotu, w olnych rodników , nadtlenku wodoru,
aldehydów i rakotw órczych związków nitrozowych, które są ciągle odpow iedzialne za niszczący
wpływ dymu papierosow ego na układ oddechow y i sercowo-naczyniowy. W celu identyfikacji
tych szkodliwych związków zawartych w dym ie papierosow ym przeprow adzono badania eksperymentalne chem iczne i biologiczne. D o przeprow adzonych badań chem icznych należały:
a) identyfikacja i oznaczanie ilościowe NO i NOx z zastosow aniem nowej metody
chemicznej i biologicznej (m etoda ta została opracow ana w naszym laboratorium ).
b) id e n ty fik a c ja w o ln y ch ro d n ik ó w m eto d am i ch em ilu m in escen c y jn y m i w ykorzystującymi reakcje zależne od lucygeniny.
c) identyfikacja aldehydów i chinonów przez stym ulowanie układu enzym atycznego:
lucyferyna - lucyferaza (ta m etoda rów nież została opracow ana w naszym laboratorium).
d) identyfikacja i oznaczanie ilościow e pierwiastków śladowych m etodą utleniania lucyferyny lucyferazą wobec A TP (m etoda rów nież opracow ana w naszym laboratorium ).
e) identyfikacja i oznaczanie ilościowe H 2 O 2 m etodą chem ilum inescencyjną z w ykorzystaniem reakcji zależnej od izolum inom ikroperoksydazy.
f) identyfikacja i ilościowe oznaczanie ONOO- m etodą spektrofotom etryczną oraz metodą
chem ilum inescencyjną ze w zm ocnieniem luminolem.
g) identyfikacja rakotw órczego zw iązku nitrozowego m etodą chem ilum inescencyjną ze
w zm ocnieniem luminolem.
6
174 430
Przeprow adzono rów nież następujące badania biologiczne:
a) identyfikację NO z zastosow aniem jako param etru funkcji aktywności izolowanej
rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej,
b) identyfikację O N O O - przez ocenę utleniania erytrocytów ludzkich indukowanych przez
ONOO-,
c) identyfikację CO z użyciem jako param etru funkcji aktywności izolowanej rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej.
Ponadto przeprow adzono następujące doświadczenia in vitro:
a) izolację m akrofagów z pęcherzyków płucnych szczura,
b) ocenę utleniania m akrofagów z pęcherzyków płucnych indukowanego tert-butylow odoronadtlenkiem (t-BHP),
c) oznaczenie N O /N O 2- /O N O O - wytwarzanych przez makrofagi pęcherzyków płucnych,
d) oznaczanie H 2 O 2 w ytw arzanego przez makrofagi pęcherzyków płucnych,
e) wpływ egzogennego H 2O 2 na powstawanie NO w m akrofagach pęcherzyków płucnych.
D ośw iadczenia in vivo przeprow adzono z udziałem ochotników, oznaczając następujące
związki:
a) NO w w ydychanym pow ietrzu nie-palaczy,
b) NO w w ydychanym pow ietrzu palaczy,
c) NO w w ydychanym dym ie papierosowym,
d) ONOO w w ydychanym dym ie papierosowym,
e) wolne rodniki w w ydychanym dymie papierosowym,
f) aldehydy w w ydychanym dymie papierosowym.
W celu oznaczenia NO i NOx zawartych w a) dymie papierosow ym , b) uw alnianych przez
makrofagi pęcherzyków płucnych po prowokacji dym em papierosow ym i c) w dym ie papierosowym w ydychanym przez ochotników, zaprojektowano i wykonano komorę ze stałych prętów
o średnicy 2,5 cm z przezroczystego Plexiglasu. N a jednym końcu każdego pręta wykonano na
tokarce otwór, uzyskując identyczne stożkowe wgłębienie w każdym pręcie. Pręty poddano
dalszej obróbce maszynow ej i polerowaniu na otwartych końcach, w ykonując dopasowane
połączenie na ucios, tworząc bardzo ścisłe łącze pomiędzy dw om a stożkowymi wgłębieniami.
Pomiędzy tymi konstrukcjam i um ieszczono cienki arkusz teflonu (arkusz politetrafluoroetylenowy o grubości 0,00381 cm) i ściśnięto śrubami skrzydełkowymi. Zainstalow ane rurkowe
otwory, po dw a z każdej z obu stron membrany, pozw alają na wstrzykiwanie, usuwanie Iub
modyfikację próbek wykazujących aktywność biologiczną i substancji reaktywnych w przedziałach po obu stronach m embrany (fig. 1).
A. Oznaczanie NO m etodą chem ilum inescencyjną
S tandardow y roztw ór N O przygotow ano w edług przepisu z p iśm ien n ictw a (Deliconstantinos G., Viliotou V., Fassitsas C., J. Cardiovasc. Pharmacol. 12, S63-S65, 1992 i
Deliconstantinos G., Viliotou V., Stavrides J. C , w publikacji: "Biology of N itric Oxide", wyd.
Feelish M., Busse R., M oncanda S., Portland Press, w druku). Roztw ór reakcyjny składał się z
roztworu soli zrów noważonego roztworem Hanka (HBSS) o wartości pH = 7,4, nadtlenku
wodoru (500 μM ) i lum inolu (30 μ M) a jego całkowita objętość w ynosiła 500 μ l. Fiolkę
energicznie w ytrząsano, po czym notowano emisję w lum inom etrze B edrthold'a typu AutoLum at LB953.
B. Chem iczne oznaczanie N O/NO 2
Chem iczne oznaczanie NO oparto na dwuazowaniu sulfanilamidu przez NO w środowisku
kw aśnym i następnym utlenieniu skopoletyny, którą m ożna wykrywać fluorom etrycznie w
sposób opisany uprzednio (Deliconstantinos G., Viliotou V., Fassitsas C., J. Cardiovasc. Pharmacol, 12: S63-S65, 1992). Makrofagi pęcherzyków płucnych w HBSS ( 106 kom órek/m l)
m ieszano z ilością 100μ l odczynnika składającego się z 20% sulfanilamidu w 20% roztw orze
H 3P O 4 i 25 μ M skopoletyny. Zanikanie fluorescencji m onitorowano w tem peraturze pokojowej
(22°C) w spektrofotom etrze fluorescencyjnym Aminco SPF-500. Fluorescencję m onitorow ano
w sposób ciągły, w funkcji czasu, dopóki daw ało się m ierzyć nachylenie linii (przez około
8 minut). W yniki pom iarów nachylenia krzywej przeliczano następnie na nonam ole NO, stosując
do tego celu krzyw ą standardową sporządzoną na podstawie pom iarów dla różnych stężeń
174 430
7
czystego NO. Azotyn (NO 2 ), produkt końcowy syntezy NO, oznaczano w ykorzystując jego
kum ulow anie się w supernatantach hodowanych kom órek, prow adząc reakcję azotynu z
odczynnikiem Griess'a.
C. Spektroskopow e oznaczanie nadtlenoazotynu (ONOO-)
ONOO- syntetyzowano, m iareczkowano i przechowyw ano w sposób opisany poprzednio
(Deliconstantinos G., Viliotou V., Stavrides J. C. w publikacji: "Biology o f nitric oxide", wyd.
Feelish M ., Busse R., M oneada S., Portland Press, w druku). Z powodu nietrwałości O N O O - w
środowisku o wartości pH 7,4, pomiary widm UV prow adzono bezpośrednio po zm ieszaniu
roztworu H 2 O 2 i NO. Stężenie ONOO- oznaczano w oparciu o wartość ekstrakcji ε302 nm równej
1670 M -1 cm -1. W idm a U V przedstawiono po odjęciu bazow ego widm a U V nadtlenku wodoru
przy odpowiednich stężeniach.
D. O znaczanie wolnych rodników
O znaczanie w olnych rodników prowadzono m etodą chem ilum inescencji, stosując lucyge
ninę z indukcją odczynnikiem DAM CO ( 1,4-diazabicyklo-[2,2,2]oktan), w sposób opisany
uprzednio (D eliconstantinos G., Krueger G. R. F., J. Viral Dis. 1:22-27, 1993). M ieszanina
reakcyjna zaw ierała HBSS (pH 7,4), lucygeninę (30 μM) i odczynnik D A M C O (100 μM). Fiolkę
energicznie m ieszano i notow ano emisję w lum inom etrze B edrtholda typu A utoLum at LB953.
Jako utleniaczy w olnych rodników użyto SOD (dysmutazę ponadtlenkow ą), mannitol, histydynę
i metioninę.
E. Oznaczanie pierw iastków śladowych i aldehydów
O znaczenia oparto na katalizowanym lucyferazą utlenianiu D -lucyferyny wobec soli
magnezowej ATP, przebiegającym według reakcji:
lucyferaza
LH2+ATPM g2++O2 --------------------- >Oksylucyferyna+ATP+O2+Ppi+Mg2++światło
Pierwiastki śladowe C d2+, Cu2+, Fe2+ zwiększają aktywność lucyferazy i zw iększa się
maksym alna odpow iedź chem ilum inescencyjną proporcjonalnie do stężeń pierw iastków śladowych aż do w artości 10 μg. R eakcje przebiegają w H BSS (pH 7,4) w całkow itej objętości
0,5 ml roztworu.
Do oznaczania aldehydów użyto taki sam układ enzym atyczny: lucyferyna/lucyferaza, ale
reakcję prow adzono w nieobecności ATP. Aldehydy reagują z układem enzym atycznym pow odując chem ilum inescencję bez obecności ATP. U żyte odczynniki pochodziły z zestawu do
oznaczania A TP (Calbiochem -Novabiochem CA, Stany Zjednoczone).
F. Izolow anie m akrofagów pęcherzyków płucnych
Pokrótce, szczury zabijano przez dożylną iniekcję soli sodowej pentobarbitalu, otwierano
klatkę piersiową, z płuc w ypłukiwano krew m etodą perfuzji roztw orem zimnej (4°C) soli
fizjologicznej bez jonów C a +, buforowanej fosforanem (PBS; pH = 7,4) i usuw ano je nienaruszone z klatki piersiowej. H om ogenat z płuc szczura uzyskiw ano przez wielokrotne przeciąganie
tkanki przez strzykaw kę i następne przepuszczanie jej przez siatki ze stali nierdzewnej o
sukcesywnie zmniejszających się otworach, w zakresie wartości mesh 32, 62 i 68 porów/2,54 cm,
przy stałym przepływ ie zrów noważonego roztworu soli Finkelstein'a (FBSS, pH 7,4). K ońcow ą
zawiesinę makrofagów pęcherzyków płucnych zebrano, przefiltrowano i wirowano przy 300 x g
przez 10 minut. O trzym aną peletkę komórek, składającą się z ponad 98% m akrofagów przem yto
i zaw ieszono w roztw orze R ingera. N astępnie procedurę tę pow tórzono jeszcze dw a razy.
Z jednego szczura w yizolowano około 10 x 108 makrofagów. Żyw otność tych kom órek oceniano
m etodą w ykluczenia błękitem trypanowym.
F. Identyfikacja związków nitrozowych
Związki nitrozow e identyfikowano przez pow olne uw alnianie tlenku azotu (NO) po
działaniu na nie nadtlenkiem wodoru. Roztwór reakcyjny składał się z dim etylonitrozoam iny
i/lub dietylonitrozoam iny (1 μM ), H 2O 2 (500 μM ) i lum inolu (30 μM) w HBSS (pH 7,4) w
całkowitej objętości 0,5 ml. Fiolkę energicznie m ieszano i notowano em isję w lum inom etrze
Bedrtholda typu A utoLum at LB953. D o identyfikacji tw orzącego się O N O O - użyto m annitol
(100 mM), D M SO (100 mM ) i cysteinę (3,0 mM).
8
174 430
G. Izolowanie makrofagów z pęcherzyków płucnych
Pokrótce, szczury zabijano przez dożylną iniekcję soli sodowej pentobarbitalu, otwierano
klatkę piersiową, z płuc wypłukiw ano krew m etodą perfuzji roztw orem zimnej (4°C) soli
fizjologicznej bez jonów Ca+ , buforowanej fosforanem (PBS; pH 7,4) i usuw ano je nienaruszone
z klatki piersiowej. H om ogenat z płuc szczura uzyskiw ano przez wielokrotne przeciąganie tkanki
przez strzykawkę i następne przepuszczanie jej przez siatki ze stali nierdzewnej o sukcesywnie
zm niejszających się otworach, w zakresie wartości mesh 3 2 ,6 2 i 68 porów /2,54 cm, przy stałym
przepływie zrównoważonego roztworu soli Finkelstein'a (FBSS, pH 7,4). K ońcow ą zawiesinę
m akrofagów pęcherzyków płucnych zebrano, przefiltrow ano i w irow ano przy 300 x g przez
10 minut. O trzym aną peletkę komórek, składającą się z ponad 98% m akrofagów przem yto i
zaw ieszo n o w ro ztw o rze R in g era. N a stęp n ie p ro ced u rę tę p o w tó rzo n o je s z c z e dw a razy.
Z jednego szczura wyizolowano około 10 x 108 m akrofagów. Żyw otność tych kom órek oceniano
m etodą wykluczenia błękitem trypanowym.
H. Utlenianie makrofagów pęcherzyków płucnych indukowane tert-butylo-1-wodoronadtlenkiem (t-BHP)
Generow anie wolnych rodników tlenowych przez makrofagi pęcherzyków płucnych
indukowane przez t-BH P (2,5 mM) oznaczano m etodą chem ilum inescencji z użyciem luminolu.
O dpowiedź chem ilum inescencyjną rejestrowano w lum inom etrze B edrthorda typu AutoLum at
LB953 w sposób opisany powyżej (Deliconstantinos G., K rueger G. R. F., J. Viral Dis. 1,22-27,
1993).
I. O znaczanie nadtlenku wodoru (H 2O 2 )
Przygotow ano układ: izolum inol/m ikroperoksydaza zawierający 100 m M boran sodowy,
1 mM izoluminol, 0,01 mM m ikroperoksydaza w m ieszaninie 70% wody i 30% metanolu o
wartości pH 8. Ilość 50 μl tego odczynnika m ieszano z izolowanymi m akrofagam i pęcherzyków
płucnych ( 106 kom órek) w HBSS, w całkowitej objętości 0,5 ml roztw oru. Odpowiedź
chem ilum inescencyjną wyrażano w nanom olach H 2 O 2, w ykorzystując krzyw ą standardową
sporządzoną na podstaw ie różnych stężeń czystego H 2 O 2 .
J. Przygotowanie i oczyszczanie rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej (sGC) do oznaczania CO
Oczyszczano sGC z ludzkich kom órek śródbłonka m etodą chrom atografii na agarozie
GTP. N a kolum nę agarozową-G TP o w ymiarach 1,8 x 9 cm, wstępnie zrów now ażoną 25 mM
buforem Tris-HCl (pH 7,6) zaw ierającym 250 mM sacharozy i 10 mM M nC l2 dodano cytosole
(10 mg białka). Następnie z kolumny eluowano sGC ilością 5 ml buforu do równoważenia
kolum ny plus 10 m M GTP.
K. Oznaczanie cyklicznego GM P
Stężenia cG M P oznaczano m etodą radioim m unologiczną po acetylacji próbek bezw odnikiem octow ym (Delikonstantinos G., K opeikina L., Anticancer Res. 9: 753-760, 1989). Próby
prow adzono w m ieszaninie reakcyjnej zawierającej chlorowodorek trójetanoloam iny (50 mM),
fosforan kreatyny (5 mM), M gC l2 (3 mM), izobutylom etyloksantynę (1 mM ), kinazę kreatyno
wą (0,6 jednostek), G TP (1 mM ) i rozpuszczalną cyklazę guanylanową (1 μg białka) w całkowitej
objętości 150 μl roztworu. Reakcje inicjowano dodaniem GTP i następnie m ieszaniny reakcyjne
inkubow ano przez 10 m inut w tem peraturze 37°C. M ieszaninę inkubacyjną zasysano i ekstrahow ano cG M P przez dodanie oziębionego na lodzie 0,1 M roztworu H C l. Po 10 minutach próbki
przenoszono na now ą płytkę, suszono i rekonstytuowano w 5 mM roztw orze octanu sodowego
(pH 4,75) w celu oznaczenia zawartości cGM P. Powstały cG M P oznaczano w zestawie do
oznaczeń cG M P (Amersham).
Celem wynalazku jest opracowanie sposobu wytwarzania filtra, w którym stosuje się
substancje biologiczne reagujące swoiście i wiążące następujące związki:
a) NO i NOx,
b) CO,
c) H 2O 2,
d) wolne rodniki,
e) aldehydo-chinony,
f) rakotw órcze związki nitrozowe oraz przeprowadza się
174 430
9
g)
zatrzym anie pierw iastków śladowych, kadmu, miedzi, m anganu, żelaza i innych pierwiastków, które są w dychane podczas palenia.
Przedm iotem wynalazku je st sposób wytw arzania filtra do filtrow ania dymu tytoniowego
posiadającego osnowę włóknistą, polegający na tym, że w zbogaca się filtr w substancję biologiczną wybraną spośród jednej lub większej liczby substancji zaw ierających żelazo, miedź i/lub
m agnez skom pleksowane z pierścieniem porfirynow ym i żelazo stereospecyficznie związane w
cząsteczkach białka, przy czym materiał filtra impregnuje się jedną lub kilkom a wymienionymi
substancjami i filtruje się otrzymany materiał aby usunąć niezaabsorbowane substancje biologiczne.
Substancję biologiczną dostarcza się korzystnie jako roztw ór 1-10 mg/ml w roztworze
solanki buforowanej fosforanem o pH 7,4.
Im pregnację materiału filtra substancją biologiczną prowadzi się korzystnie przez 30 minut
w tem peraturze pokojowej.
Rów nież korzystnie stosuje się węgiel aktywowany w zbogacony substancją biologiczną.
K orzystną substancją biologiczną je st hem oglobina i/lub lizat erytrocytów. Również
korzystne substancje biologiczne wybrane są spośród jonów żelaza Fe + stereospecyficznie
związanych z jedną lub z większą liczbą substancji, takich jak transferyna, katalaza, protopor
firyna, cytochrom C i chlorofil.
W zbogaconą osnowę w łóknistą włącza się korzystnie do zw ykłego filtra papierosowego,
w którym jest ona flankow ana przez osnowę w łóknistą nie w zbogaconą substancją biologiczną.
W ynalazek w znacznej mierze opiera się na obserwacjach, że:
a) istnieje w ybór odpowiednich związków wiążących, takich jak hem oglobina albo lizaty
erytrocytów lub innych substancji zawierających stereospecyficznie zw iązane żelazo,
b) istnieje w ybór związków wiążących, które zaw ierają pierścień porfirynow y z żelazem
(np. protoporfiryna),
c) istnieje w ybór związków wiążących zawierających pierścień porfirynow y, które niekoniecznie zaw ierają żelazo,
d) istnieje w ybór związków wiążących zawierających pierścień porfirynow y skom plekso
wany z innymi m etalami, np. z M g2+, Cu +,
e) na tej podstawie zaprojektow ano proces biotechniczny służący do w zbogacania znanych, konw encjonalnych materiałów, które są obecnie stosowane do produkcji filtrów papierosowych, zawierających wyżej wym ienione substancje biologiczne.
K luczow a idea wynalazku polega na pom yśle wzbogacania impregnacji powszechnie
stosowanych filtrów papierosow ych i/lub filtrów zawierających węgiel aktywow any substancjami biologicznym i charakteryzującym i się obecnością jonów metali Fe2+, Cu2+ i M g2+ skompleksow anych z pierścieniem porfirynow ym , a także Fe2+ zw iązanego stereospecyficznie z
cząsteczkam i białka, co pozw ala na zatrzym anie szkodliwych zw iązków zaw artych w papierosie
przed tym, zanim palacz zaciągnie się dym em papierosowym. Ten fakt jest głów ną cechą
charakterystyczną w ynalazku i stanowi niezaprzeczalną innowację o dużych możliw ościach
zastosow ań przem ysłowych.
W ynalazek w ykonano w niżej opisany sposób, mając na w zględzie jego stosowalność w
produkcji przem ysłowej.
Przygotow ano roztw ór (1 mg/ml) hem oglobiny i/lub lizatu erytrocytów w buforow anym
fosforanem roztworze soli (PBS) o wartości pH 7,4 i dodano go do 100 mg węgla aktywowanego.
M ieszaninę inkubowano przez 30 m inut w temperaturze pokojowej i przefiltrow ano przez bibułę
filtracyjną marki S&S Carl Schleicher & Schuell Co U. S. A. Ilość niezaabsorbowanej hem oglobiny oznaczano w przesączu m etodą spektrofotom etryczną. W ęgiel aktywowany wzbogacony
hem oglobiną pozostaw iono do w ysuszenia w tem peraturze pokojowej. Ilość 200 mg suchego
w ęgla aktywowanego w zbogaconego hem oglobiną um ieszczono pom iędzy dw om a zwykłymi
filtram i tak, aby ciągnięty przez nie dym papierosowy kontaktow ał się z grupam i aktywnymi
cząsteczek (Fe +, Fe +, -SH, -NH; fig. 2). Takie zgodne materiały są gotowe do użycia do
w ytw arzania nowych filtrów papierosow ych, które od tej części niniejszego opisu nazywane są
filtrami biologicznym i.
A lternatyw nie, hem oglobinę m ożna zastąpić substancjami biologicznym i charakteryzującymi się obecnością jonów metali Fe2+, Cu2+, M g + skompleksowanych z pierścieniem porfiry-
10
174 430
nowym, a także jonem Fe2+ zw iązanym stereospecyficznie z cząsteczkami białka, takim i jak
transferyna, kataliza, protoporfiryna, cytochrom C, chlorofil.
Alternatywnie, przygotow ano roztwór (5 mg/ml) hem oglobiny i/lub lizatu erytrocytów w
buforow anym fosforanem roztworze soli (PBS) o wartości pH 7,4 i skanowano go w tem peraturze 25°C stosując spektrofotom etr rejestrujący typu A cta Beckm an. Pik absorbancji obserw owano przy 540 nm i 575 nm, zgodnie z doniesieniem S m ith'a R. P. i K ruszym a'y H. (J. Pharmacol.
Exper. Ther. 191, 557-563, 1974). Tym i roztworami im pregnow ano pow szechnie stosowane
filtry papierosow e i suszono na pow ietrzu w tem peraturze 25-35°C. Takie zgodne m ateriały są
gotowe do użycia do w ytw arzania nowych filtrów papierosow ych, które od tej części niniejszego
opisu nazywane są filtrami biologicznym i. Te nowe filtry biologiczne sprawiają, że dym, który
jest wdychany, całkow icie wchodzi w kontakt z grupam i aktywnym i cząsteczek hem oglobiny
i/lub lizatów zawartymi w filtrze bez zmiany własności fizycznych i smaku dymu papierosowego.
Ze względów estetycznych, do widocznego końca tego biologicznego filtra m ożna dołączyć
niewielką część (3 mm ) zwykłego filtra.
Do alternatywnych sposobów produkcji przem ysłowej należy następujący sposób:
Przygotow ano roztw ór 5 mg/ml protoporfiryny w roztw orze buforu (PBS) o w artości pH
7,4 i analizow ano go w tem peraturze 25°C, stosując rejestrujący spektrofotom etr typu A cta
Beckman. W zbudzenie protoporfiryny światłem ultrafioletow ym (498-408 nm) dało pom arań
czow o-czerwoną fluorescencję w zakresie 620-630 nm. Pow yższym roztw orem im pregnowano
(moczono w nim) pow szechnie stosowane filtry i suszono je gorącym pow ietrzem (25-35°C).
A lternatywnie, roztw ór (5 mg/ml) transferyny w buforze PBS o wartości pH 7,4 analizowano, stosując rejestrujący spektrofotom etr typu A cta Beckm an. Transferyna z żelazem w ykazuje charakterystyczne w idm o przy 470 nm. Do impregnacji filtrów będących obecnie w
pow szechnym użyciu zastosow ano wyżej opisane sposoby.
A lternatyw nie, przygotow ano roztw ór (5 m g/m l) katalazy w PBS o w artości pH 7,4.
Do w ytw orzenia filtra biologicznego zastosowano wyżej opisany sposób.
Alternatywnie, przygotow ano roztwór (5 mg/ml) cytochrom u C w PBS o wartości pH 7,4.
Do w ytw orzenia filtra biologicznego zastosowano wyżej opisany sposób.
A lternatyw nie, przygotow ano roztw ór (5 m g/m l) chlorofilu w PBS o w artości pH 7,4.
Do wytw orzenia filtra biologicznego zastosowano wyżej opisany sposób.
Alternatywnie, wyżej wym ienione substancje biologiczne w postaci stałej um ieszczano
pomiędzy dw om a zw ykłym i filtrami tak, aby ciągnięty przez nie dym papierosowy kontaktow ał
się z grupami aktywnymi cząsteczek (Fe2+, Fe3+, -SH, -N H 2 ).
Z analizy wyników okazało się, że różne substancje biologiczne użyto do w zbogacenia
powszechnie stosowanych filtrów zatrzym ują toksyczne związki (NO, CO, wolne rodniki, H 2 O 2 ,
aldehydy, pierw iastki śladow e i związki nitrozowe) z dym u papierosow ego w różnym stopniu,
co je st przedstawione w poniższej tabeli:
Zmiatacze
NO
CO
wolne
%
%
rodniki
H 2O2
%
Aldehydy
%
%
Nitrozo
związki
%
Pierwiastki śladowe
(%)
Hemoglobina
90
90
90
80
90
90
Transferyna
85
90
60
60
60
75
Katalaza
85
90
90
90
80
50
80
Protoporfiryna
85
90
70
80
70
80
Cytochrom C
75
85
80
70
80
80
60
Chlorofil
60
15
10
40
70
15
10
10
80
95
Uzyskano wysoki stopień zatrzym ania wysoce w yniszczających organizm substancji z
dymu papierosowego. D ym papierosowy (20 ml) filtrowany przez filtr biologiczny porów nano
174 430
11
z dymem (20 ml) filtrow anym przez filtr konwencjonalny. Jedynie 1 ml dymu papierosow ego
przepuszczanego przez filtr konwencjonalny porów nano z ilością 40 ml dymu papierosow ego
przepuszczanego przez filtr biologiczny. Okazało się, że filtry biologiczne m ają 40-krotnie
wyższą zdolność zatrzym yw ania pierwiastków śladowych w porów naniu z filtrami zwykłymi.
W celu lepszej prezentacji aktywności tych substancji biologicznych, poniżej przedstaw iono reprezentatywne w yniki szczegółowo opisanych badań eksperym entalnych.
a) Identyfikacja N O zawartego w dymie papierosow ym m etodą chem ilum inescencji:
N O id e n ty fik o w a n o sto su jąc o p isan ą w czę śc i e k sp ery m e n taln ej m e to d ę ch emiluminescencji ze w zm ocnieniem luminolem. Fig. 3 i fig. 4 przedstaw iają typow y eksperym ent
identyfikacji i oznaczania NO oraz jego wiązanie po przepuszczeniu dymu papierosow ego przez
filtr biologiczny. O kazało się, że powyżej 90% N O było zatrzym yw ane przez hem oglobinę.
Skuteczność tego filtra biologicznego jest wyraźna zarów no w zatrzym yw aniu jak i neutralizowaniu NO, który uczestniczy w toksycznych reakcjach w kom órkach płuc i w płynach
płucnych, a zw łaszcza je st zaangażowany w tworzenie się silnego środka utleniającego, ONOO-.
b) Identyfikacja w olnych rodników zawartych w dym ie papierosow ym m etodą chem iluminescencyjną:
W olne rodniki w dym ie papierosow ym identyfikow ano m etodą odpow iedzi che
miluminescencyjnej wywołanej przez układ lucygenina/DAM CO po jego reakcji z wolnymi
rodnikami. Fig. 5 przedstaw ia charakterystyczny pik w ystępujący w ciągu 2 sekund odpowiedzi
chem ilum inescencyjnej, która była w 100% ham owana po przepuszczeniu dymu papierosow ego
przez filtr biologiczny. Zatrzym yw anie wolnych rodników przez filtry biologiczne oznacza, że
uzyska się zm niejszenie utleniania w makrofagach pęcherzyków płucnych, które je st pow odowane przez zwykły dym papierosowy.
c) Identyfikacja H 2 O 2 zawartego w dymie papierosow ym m etodą chem ilum inescencji:
Nadtlenek w odoru oznaczano m etodą odpowiedzi chem ilum inescencyjnej wywoływanej
przez układ: izolum inol/m ikroperoksydaza. N a fig. 6 przedstawiony je st charakterystyczny pik
chem ilum inescencji oznaczający obecność H 2O 2 w dym ie papierosowym. W obecności katalazy
(100 jednostek/m l) odpow iedź ta jest ham owana w około 90%. Po przepuszczeniu dymu
papierosowego przez filtr biologiczny obserwuje się 80% ham owanie odpow iedzi chem iluminescencyjnej. Układ: izoluminol/m ikro peroksydaza je st specyficzny dla identyfikacji H 2O 2 .
Wolne rodniki zaw arte w dym ie papierosowym w ywołują niewielką odpow iedź chem ilum inescencyjną po ich interakcji z izoluminolem. Ta niew ielka chem ilum inescencja stanowi około
10% całkowitej chem ilum inescencji powodowanej przez H 2O 2 w obecności wolnych rodników,
gdyż katalaza ham uje m aksym alną odpowiedź chem ilum inescencyjną w stopniu osiągającym
wartość do 90%. Zatrzym anie H 2O 2 wyraźnie zm niejsza utlenianie i w ytw arzanie NO przez
makrofagi pęcherzyków płucnych.
d) Identyfikacja pierw iastków śladowych i aldehydów zawartych w dymie papierosow ym
z użyciem układu enzym atycznego: lucyferyna/lucyferaza.
Pierwiastki śladow e zawarte w dymie papierosow ym identyfikow ano wykorzystując ich
zdolność do stym ulow ania aktywności lucyferazy. Fig. 7 przedstawia:
1) odpowiedź chemiluminescencyjną wywołaną przez utlenienie lucyferyny w obecności ATP,
2) w zm ocnioną odpow iedź chem ilum inescencyjną w obecności jonów C d2+ (0.5 mg),
3) w zm ocnioną odpow iedź chem ilum inescencyjną w obecności jonów Cu2+ (0.5 mg),
4) wzmocnioną odpow iedź chem ilum inescencyjną spow odow aną dymem papierosow ym
(1 ml) i
5) ham owanie odpowiedzi chem ilum inescencyjnej (w odniesieniu do odpow iedzi spowodowanej dymem papierosow ym ) wywołanej przez 40 ml dymu papierosow ego po przepuszczeniu przez papierosow y filtr biologiczny. Odpowiedź chem ilum inescencyjną pow odow ana przez
pierwiastki śladowe zaw arte w zwykłym dymie papierosow ym jest ponad 40 krotnie w yższa od
tej, jaką się obserwuje po przepuszczeniu dymu przez filtr biologiczny. Zatrzym yw anie pierw iastków śladowych przez filtry biologiczne może dawać efekty krótko- i długoterm inowe. Efekty
krótkoterminowe obejm ują ham owanie reakcji utleniania w płucach (Fe, Mn), a do efektów
długotrwałych m ożna zaliczyć ham owanie uszkadzania składników krwi i substancji zawartych
w krwi (Cd).
12
174 430
Aldehydy zawarte w dymie papierosow ym identyfikowano i oznaczano ilościowo, stosując ten sam układ enzymatyczny: lucyferyna/lucyferaza w nieobecności ATP. Aldehydy mają
zdolność utleniania lucyferyny. N a fig. 8 przedstawiona jest charakterystyczna odpowiedź
chem ilum inescencyjną, która może trwać dłużej niż godzinę. T a odpow iedź chem ilum inescencyjną była ham ow ana w 100%, jeśli użyty do oznaczenia dym papierosow y był uprzednio
przepuszczony przez filtr biologiczny, co wskazuje na fakt, że skuteczność tego biologicznego
filtra pod w zględem zatrzym yw ania toksycznych aldehydów jest znacząca.
e) Identyfikacja związków nitrozowych w dymie papierosowym.
Zw iązki nitrozowe zawarte w dym ie papierosow ym identyfikow ano oznaczając powolne
uwalnianie N O ze związków nitrozowych po działaniu nadtlenkiem wodoru. Jak to je st przedstawione na fig. 9, pik odpowiedzi chem ilum inescencyjnej uzyskano w czasie około 900 sekund.
Po przepuszczeniu dymu papierosow ego przez filtr biologiczny zaobserw ow ano 90% ham owanie odpowiedzi chem ilum inescencyjnej, a pik wystąpił po około 1200 sekundach. Przedstawione
jest rów nież pow olne uw alnianie NO przez nitroprusydek sodu (SNP) po działaniu nadtlenkiem
wodoru. Fig. 10 przedstaw ia pow olne uwalnianie NO z obydwu zw iązków nitrozowych,
dietylonitrozoam iny i dim etylonitrozoam iny oraz z hem oglobiny w zbogaconej w związki nitrozowe pochodzące z dymu papierosow ego traktowanego przez H 2O 2 . Jest jasne, że uwalnianie
NO przez związki nitrozowe zawarte w dym ie papierosowym , które to zw iązki tw orzą addukty
z hem oglobiną, podlegają tym samym zasadom uw alniania NO co zw iązki nitrozowe, dietylonitrozoam ina i dim etylonitrozoam ina. Fig. 11 przedstaw ia uw alnianie N O przez związki nitrozowe
dymu papierosow ego, które to związki tw orzą addukty z hem oglobiną po naprom ienianiu przez
minutę tych adduktów: hem oglobina-związek nitrozowy dawką UVB w ynoszącą 100 mJ/cm2.
Uwalnianie NO oznaczano w obecności H 2O 2 , otrzymując odpow iedź chem ilum inescencyjną w
ciągu sekundy. Stopniowy wzrost obserw owany na fig. 11 w ynika z działania H 2 O 2 na hem oglobinę (reakcja Fentona).
f) W ytw arzanie NO przez m akrofagi płuc:
Przeprow adzono doświadczenia in vitro, w ykorzystując specjalną kom orę, skonstruowaną
w naszym laboratorium . K om ora ta je st przedstaw iona na fig. 1. M em brana teflonow a rozdzielająca dw a przedziały komory je st przepuszczalna dla gazowego NO a nieprzepuszczalna dla
N O 2- i O NO O -. N ieprow okowane m akrofagi płuc izolowano w sposób podany w sekcji eksperymentalnej, w roztworze buforu HBSS (1 x 106 komórek/ml) i um ieszczano w przedziale A
komory. W przedziale B um ieszczano 2,5 ml odczynnika G riess'a albo odczynnika: sulfanilamid/skopoletyna. N O uwalniany przez m akrofagi w przedziale A dyfunduje przez membranę
teflonow ą do przedziału B i wiąże się z odczynnikami G riess'a i/lub sulfonam id/skopoletyna,
gdzie jest wyłapywany. To wskazuje na fakt, że makrofagi płuc w ytw arzają gazowy NO.
Następnie wyliczano ilość NO obecnego w przedziale B m etodą spektrofotom etryczną Iub
fluorofotom etryczną. O znaczano rów nież ilości O NO O - i NO 2- zaw artych w przedziale A
komory, stosując odczynniki G riess'a i/lub sulfanilamid/skopoletyna. Pow yższe doświadczenia
powtórzono po prow okacji m akrofagów dym em papierosowym przed um ieszczeniem ich w
przedziale A. W yniki doświadczenia przedstaw ione na fig. 12 wykazują, że dym papierosowy
zm niejsza ilość w ytw arzanego NO, zwiększając produkcję O NO O - w m akrofagach płuc, co
pośrednio świadczy o olbrzym im w ytw arzaniu zarówno NO jak i O 2 , które ze sobą reagują
tworząc O N O O -.
Pow tórzenie tych doświadczeń z użyciem filtrów biologicznych (to znaczy takich, w
których dym papierosow y je st przepuszczany przez filtr biologiczny) wykazało, że użyte
substancje biologiczne w ytw arzają takie same ilości N O 2- oraz O NO O - w przedziale A i podobne
ilości N O w przedziale B, jak ie w ytw arzałyby makrofagi nie prow okow ane dym em papierosowym. W tym kontekście, użyto rów nież substancje biorące udział w reakcji G riess'a dla zbadania
kinetyki nitrozow ania przez produkt bądź produkty pośrednie generow ane podczas reakcji
N O/O 2 w roztw orze w odnym przy pH fizjologicznym. Dodanie dym u papierosow ego (50 ml)
do 100 mM roztworu fosforanu (pH 7,4) zawierającego 25 mM sulfanilam iny i 2,5 mM
dichlorowodorku N -(1-naftyloetylenodiam iny) (NEDD) generowało absorpcję przy długości
fali λ nmx = 496 mm charakterystyczną dla azo-związku pow stającego w reakcji nitrowania.
Godne rozw ażenia są im plikacje niniejszych obserwacji w odniesieniu do spodziewanych
174 430
13
reaktywności N O w odpowiednich warunkach fizjologicznych, gdzie m aksym alne stężenia NO
w m ikrośrodowisku komórki szacuje się na wartości mieszczące się w zakresie 0,5 - 10 μM.
Podczas palenia papierosów dramatycznie wzrastają stężenia NO z niszczącym działaniem na
komórki płuc.
g) Utlenianie makrofagów płuc:
W yniki badań w pływu dymu papierosow ego na utlenianie m akrofagów płuc są przedstawione na fig. 13. O szacow ania utleniania z użyciem t-BH P wykazały, że dym papierosowe
powoduje dw ukrotnie większy utleniania niż to, jakie występuje w m akrofagach nie prow okowanych. Jeśli dym papierosowy przepuści się przez filtr biologiczny, w ówczas obserwowany
utlenianie jest podobne do tego, jaki występuje w makrofagach nie prow okowanych. W ykazano
jednoznacznie wyeliminowanie utlenianie makrofagów wywoływanego przez dym papierosowy.
Obecnie dym papierosowy jest wolny od substancji powodujących utlenianie makrofagów płuc.
h) H 2 O 2 w ytw arzany przez makrofagi płuc:
M akrofagi prow okowane dymem papierosowym wytw arzają H 2 O 2 w ilości przeszło
10-krotnie większej niż makrofagi nie prowokowane. Użycie filtra biologicznego wykazało
spadek w ytw arzania H 2 O 2 o 90% (fig. 14) w porównaniu do filtrów pow szechnie używanych.
Jest oczywiste, że jeśli dym papierosowy wywołuje utlenianie w m akrofagach, tym samym
zwiększa w ytw arzanie toksycznego H 2O 2 przez te komórki.
i) D ośw iadczenia z rekonstytuowaniem:
O znaczano ilość cyklicznego GM P wytwarzanego przez NO uw alniany przez makrofagi
pęcherzyków płucnych w komorze przedstawionej na fig. 1. Cyklazę guanylanow ą umieszczano
w przedziale A, a makrofagi pęcherzyków płucnych um ieszczano w przedziałe B. Ilości NO
wytwarzanego przez makrofagi oznaczano w czasie 50 minut, z udziałem i bez udziału kom órek
prow okow anych dym em papierosow ym . M akrofagi prow okow ane dym em papierosow ym
(10 ml) uw alniały około 10 razy m niejszą ilość NO w porównaniu z kom órkam i nietraktow any
mi, co świadczy o 10-krotnie mniejszym wytwarzaniu cyklicznego GM P. Pow yższe doświadczenie p o w tó rz o n o stosując dym p ap iero so w y p r z ep u szcz o n y przez filtr
b i o l o g i c z n y . W odniesieniu do makrofagów nie prowokowanych (kontrola), wykazano różnicę
nieznam ienną statystycznie (fig. 15). Gromadzenie się NO w przedziale B w zrastało ponad
5-krotnie, jeśli makrofagi pęcherzyków płucnych traktowano 5 mM roztw orem nadtlenku
wodoru (fig. 16). To sugeruje, że H 2 O 2 zw iększa wytwarzanie NO w edług m echanizm u dodatniego sprzężenia zwrotnego. Szlak m etaboliczny L-arginina/NO w m akrofagach jest zgodny z
założeniem, że dym papierosowy powoduje uwalnianie N O /O N O O -.
k) Identyfikacja tlenku węgla (CO) w dym ie papierosowym:
Obecność CO w dymie papierosowym oznaczano m etodą biologiczną opartą na stymulacj i
rozpuszczalnej cyklazy guanylanowej przez CO.
W prow adzenie HBSS nasyconych dymem papierosowym do przedziału A komory, w
obecności ponadtlenku w celu neutralizacji NO, oraz w prowadzenie rozpuszczalnej cyklazy
guanylanowej do przedziału B, pow odowało wzrost wytw arzania cyklicznego G M P w wyniku
dyfundowania CO z przedziału A do przedziału B. Przepuszczenie dym u papierosow ego przez
filtr biologiczny zm niejsza ilość wytwarzanego cyklicznego G M P o około 80% (fig. 17).
Powyższe dane w skazują, że szkodliwe substancje, NOx i CO zaw arte w dym ie papierosowym,
są zatrzym ywane i neutralizowane przez filtry biologiczne.
Przeprow adzono następujące doświadczenia in vivo:
a)
Na początku potw ierdzono obecność N O i O NO O - w w ydychanym dym ie papierosowym. Ochotnicy palący papierosy stosowali zwykłe filtry. N O obecny w wydychanym
dymie papierosow ym identyfikowano po wprowadzeniu w ydychanego dymu do roztw oru kwasu
(50 ml, pH 4). Stężenie NO oznaczano m etodą chem ilum inescencji ze w zm ocnieniem lum inolem, opisaną w części eksperymentalnej, stosując krzywe standardowe wykonane dla handlowego NO. O znaczone stężenie NO wynosiło 0,045 mM. B adania pow tórzono stosując filtry
biologiczne. Stężenie NO w wydychanym dymie było około 70% niższe niż przy stosowaniu
filtrów konw encjonalnych (fig. 18). Stężenie ONOO- oznaczano stosując 1,2 M roztw ór NaOH.
Obserwowano (fig. 19) wzrost absorpcji przy 303 nm ( ε303 nm = 1670 M -1cm -1). D ośw iadczenia
wykazały, że podczas palenia w ydychany dym zawiera ogrom ne ilości O N O O - (wprowadzenie
14
174 430
50 ml w ydychanego dym u do 5 ml 1,2 M roztworu NaO H dawało 0,9 m M roztw ór ONOO-).
Oznaczony stosunek N O /O N O O - w w ydychanym dymie wynosił 1:20.
Z pow yższych doświadczeń wynika, że w płucach N O x jest przekształcany do ONOO- w
reakcji z ponadtlenkiem . Ponadtlenek uw alnia się zarów no z m akrofagów jak i w reakcjach
oksydoredukcyjnych przebiegających w płucach podczas palenia. D ym papierosow y ciągnięty
pom pą nie zaw iera O NO O -, jednak pew na ilość NO x reaguje z ponadtlenkiem albo z tlenem z
utw orzeniem jonów azotynowych (NO 2 ). O NO O - pow oduje tylko wówczas, gdy dym papierosow y dociera do płuc. U życie filtrów biologicznych zm niejsza ilości w ydychanych NO i
O N O O - o 70% .
b) O N O O ' reaguje z jonam i dw uwęglanow ym i ludzkich erytrocytów w edług reakcji:
O NO O - + H C O 3 ------------ > HCO 3 + N O2 + OHRodnik dw uwęglanow y utlenia luminol oraz cząsteczki arom atyczne i heterocykliczne.
Alternatywnie, O N O O - może utleniać dw uwęglan do nadtlenodw uwęglanu, innego środka silnie
utleniającego. Z drugiej strony, dysm utaza ponadtlenkow a (SOD) katalizuje w białkach nitrowanie przez O N O O - i szeroki zakres zw iązków fenolowych, włącznie z tyrozyną.
Tak więc, istnieje szereg potencjalnych mechanizmów, według których dwuwęglany i
SOD m ogą wywierać wpływ na ogólną reaktywność ONOO- w komórkach. O becność ONOOpow stającego w płucach na skutek w dychania dym u papierosow ego pow oduje gwałtowne
zwiększenie utleniania w erytrocytach, co wykryto m etodą odpowiedzi chem ilum inescencyjnej
pojawiającej się w ciągu 5 sekund. To samo doświadczenie przeprow adzone z użyciem filtra
b io lo g ic z n e g o w y k azało praw ie 100% zah a m o w an ie u tle n ia n ia w ery tro c y ta c h lu d zkich
(fig. 20). Ekspozycja hem oglobiny lub lizatów erytrocytów na ONOO- (zaw arty w wydychanym
dymie papierosow ym ) pow odowała zanik dwu pików przy 540 i 575 nm, występujących
norm alnie w hem oglobinie. W yniki reprezentatywnego doświadczenia, podobnego do opisanego p o w y żej, p rzep ro w ad zo n e g o z u d ziałem 12 o ch o tn ik ó w są p rz e d sta w io n e na fig. 21.
Jeśli hem oglobinę i/lub lizat wystaw iono na działanie małej ilości w ydychanego dym u (10 ml),
wówczas obserw ow ano przesunięcie pików z 540 i 575 nm do odpow iednio 525 i 555 nm,
oznaczające pow stanie nitrozylo-hem oglobiny. D ośw iadczenia pow tórzono stosując filtry biologiczne. O bserw ow ane piki zachowały charakterystyczne dla nich długości fali.
d) Aldehydy identyfikow ano w w ydychanym przez ochotników dym ie papierosow ym w
oparciu o charakterystyczny pik chem ilum inescencji. D ośw iadczenia pow tórzono stosując filtry
biologiczne. Obserwow ano 90% zm niejszenie się odpowiedzi chem ilum inescencyjnej w porównaniu do maksym alnej odpowiedzi chem ilum inescencyjnej obserwowanej przy stosowaniu
zwykłych filtrów (fig. 22). Jest oczywiste, że filtry biologiczne zatrzym ują i zobojętniają
aldehydy w dym ie papierosowym , zatrzym ując środki utleniające, przez co w w idoczny sposób
ham ują reakcje oksydoredukcyjne w płucach, co powodowałoby w ytw arzanie endogennych
aldehydów.
e) W olne rodniki identyfikowano w w ydychanym przez ochotników dym ie papierosowym
na podstaw ie ich charakterystycznego piku chem ilum inescencji. O chotnicy palili papierosy,
stosując filtry zwykłe i biologiczne. Ochotnicy ci byli pouczeni, aby w ydychali dym do roztworu
kwasu (50 ml; 0,01 N H C l; pH 6). O dpowiedź chem ilum inescencyjną oznaczano po 5 minutach
i po 60 m inutach. Przy wartości pH równej 6 wydychany O N O O - ulegał samorzutnemu
rozkładowi. W czasie 5 m inut wystąpił 160% wzrost odpowiedzi chem ilum inescencyjnej w
w ydychanym dym ie przy stosowaniu zw ykłego filtra w porównaniu z tą, ja k ą obserw ow ano przy
stosowaniu filtra biologicznego (fig. 23). Jeśli ten nasycony dym em papierosow ym roztwór
kwasu pozostaw iono na godzinę, w ówczas różnica w odpowiedzi chem ilum inescencyjnej wzrastała ze 160% do 250% (fig. 24). Obserwacje te są zgodne z koncepcją, że reakcje oksydoredukcyjne przebiegają w dym ie papierosow ym w sposób ciągły, poprzez rodniki chinonowe, z
wytworzeniem serii aktywowanych związków tlenu, które m ogą pow odow ać niszczenie biologiczne.
Badania te wykazały, ze tak jak inne komórki, m akrofagi pęcherzyków płucnych posiadają
endogenną syntetazę N O i potrafią uw alniać N O /O N O O - przez długie okresy czasu po ustaniu
174 430
15
ekspozycji na dym papierosowy. Ponadto, jeśli już komórki zaczną uwalniać NO, jego produkcja
staje się sam ostym ulująca, naw et po usunięciu bodźca. N a drodze tej reakcji, NO pochodzący z
dymu papierosowego może stym ulować makrofagi pęcherzyków płucnych tak, aby uwalniały
NO i ONOO- przez czas kilku godzin po usunięciu bodźca. R eakcja ta może być inicjow ana
przez wytwarzanie H 2O 2 w płucach w wyniku stymulowania makrofagów pęcherzyków płucnych przez dym papierosowy. N adtlenek wodoru może stymulować aktywność syntetazy NO w
komórkach płuc w kierunku produkcji NO i ONOO- w czasie przekraczającym godzinę po
usunięciu bodźca. Te badania wykazały, że przepuszczenie dymu papierosowego przez filtr
biologiczny pow oduje 90% obniżenie (w porównaniu z filtrem konw encjonalnym ) utleniania w
makrofagach pęcherzyków płucnych szczura. Rodnik O NO O - tw orzący się w płucach być może
atakuje i inaktywuje inhibitor proteinazy a 1 (a 1PI). Ham owanie a 1PI w płucach człow ieka często
pow oduje rozedmę, w której zm niejsza się pojemność płuc. Istnieje dow ód pochodzący z analiz
statystycznych, wykazujący, że palenie papierosów daje skłonność do rozwoju rozedm y (Southon P. A., Pwis G., Free Radicals in M edicine. Involvem ent in human Disease. M ayo Clin. Proc.
63: 390-408, 1988). W doświadczeniach przeprowadzonych in vivo z udziałem 12 palaczyochotników w ykazano 90% obniżenie ilości wydychanego N O /ONOO- wówczas, gdy wciągany
dym papierosowy przechodził przez filtr biologiczny.
W olne rodniki tlenow e są również zaangażowane w patogenezie zapalenia pęcherzyków
płucnych indukowanego kom pleksem im munologicznym IgA. W stępne podanie zwierzętom
dysmutazy ponadtlenkow ej, katalazy, chelatorażelaza-desferioksam iny albo związku wiążącego
wolne rodniki w odorotlenow e, D M SO , spowalnia postęp w yniszczenia płuc. Płuca nietraktowanych zwierząt stanowiących kontrolę pozytywną charakteryzują się natom iast zw iększoną
ilością makrofagów pęcherzykowych. W ystępują poza tym rozedm a śródm iąższow a i krw aw ienia. Ponadto, w tym modelu niszczenia płuc wysoce ochronną rolę odgryw a L-arginina, co
objawia się zm niejszoną przepuszczalnością naczyń, zm niejszonym i krwawieniami naczyniowymi i m niejszym i uszkodzeniam i kom órek śródbłonka naczyń i kom órek nabłonka pęcherzyków. Te spostrzeżenia sugerują, że makrofagi stanowią źródło uszkodzeń pow odowanych przez
związki NO, O 2 , H 2O 2 i O H O - (M ullingan M. S., Jonhson K. J., W ard P. A. w publikacji:
"Biological Oxidants: G eneration and Injurous Consequences (wyd. Cochrane C. G. i Gilbrone
M. A., Ju., Academic Press 157-172, 1992).
Zatrzym ywanie i neutralizacja środków utleniających zaw artych w dymie papierosow ym
przez filtry biologiczne m oże odgryw ać ważną rolę w zm niejszaniu aktywności enzymów
oksydoredukcyjnych, które są bezpośrednio związane z utlenianiem w kom órkach płucnych.
Filtry biologiczne gw ałtownie obniżają utlenianie pow odowane przez wdychany dym papierosowy. Utlenianie w m akrofagach płuc i w komórkach nabłonka naczyń płucnych może być
indukowane przez NO, NOx, rodniki tlenowe i/lub aldehydy zaw arte w dymie papierosowym.
Ponadto, zatrzym ywanie aldehydów i pierwiastków śladowych (zw łaszcza Cd) przez filtry
biologiczne może mieć pow ażne długotrwałe znaczenie w zachow yw aniu antyutleniających
substancji osocza i w ham owaniu rozwoju miażdżycy. H em oglobina zaw iera wiele centrów
obojętnochłonnych, które w chodzą w reakcje kowalencyjne z elektrofilam i. Te centra indukują
N -końcowe reszty waliny łańcucha α- i β- , atomy N 1 i N3 reszt histydynowych i grupy
sulfhydrylowe reszt cysteinowych. Rakotwórczy związek nitrozowy, 4-(m etylonitrozoam ino)-1
-(3-pirydylo)-1-butanon (NNK), występujący w tytoniu, przechodzi do dymu podczas palenia
papierosa a jego poziomy w głów nym strumieniu dymu m ogą wynosić od 4 do 1700 ng na
papieros. NNK może tw orzyć addukty z hem oglobiną (Hecht S. S., Karan S., C arm ella S. G. w
publikacji "Human carcinogen expose", wyd. Garmer R. C., Farm er P. B., Stell G. I. i W ncht A.
S., IRI Press, str. 267-274, 1991). Oczywiście, jedną drogą uniknięcia chorób związanych z
tytoniem jest pow strzym anie się od żucia i palenia tytoniu. Jednakże badania statystyczne
wykonane na palaczach w skazują, że istnieje silna potrzeba zm niejszenia ekspozycji na substancje rakotwórcze zawarte w papierosach i m odyfikowania m echanizm u ich działania. Głównymi
podejściam i do tego celu są: 1) m odyfikow anie produktów tytoniow ych, 2) ham owanie aktywacji metabolicznej środków rakotw órczych zawartych w tytoniu i ich endogennego w ytw arzania
przez mikro- i m akroodżywki oraz chem iczne środki zapobiegaw cze i 3) zatrzym anie tytoniowych środków rakotwórczych przez stosowanie odpowiednich filtrów, które będą dołączone do
16
174 430
FIG.
2
tytoniu w papierosie. W ynalazek polegający na użyciu substancji biologicznych do produkcji
filtrów biologicznych oparty jest na odkryciu, że związki nitrozow e zawarte we w dychanym
dymie papierosowym są zatrzym yw ane przez substancje biologiczne, co chroni zdrow ie nie tylko
palaczy lecz rów nież niepalaczy.
FIG.
3
174 430
174 430
FIG.
4
FIG.
5
174 430
FIG.
6
174 430
FIG.
7
174 430
FIG.
8
174 430
FIG.
9
174 430
FIG.
10
174 430
FIG.
11
174 430
174 430
FIG.
12
174 430
FIG. 13
FIG. 14
174 430
FIG. 15
174 430
F IG.
16
174 430
FIG. 17
FIG.
18
174 430
174 430
F IG . 19
FIG.
20
174 430
174 430
FIG. 2-1
FIG.
22
174 430
FIG.
23
174 430
FIG.
24
174430
174 430
FIG. 1
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz.
Cena 6,00 zł
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
1 333 Кб
Теги
pl174430b1
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа