PL178252B1

(12) OPIS PATENTOWY (19)PL
R Z E C Z P O S P O L IT A
PO LSK A
(21 ) Numer zgłoszenia: 3 1 1 0 3 7
(22) Data zgłoszenia:
29.03.1994
86)Data
(
i numer zgłoszenia międzynarodowego:
29.03 .19 94 . PCT/U S94/03256
(87) Data i numer publikacji zgłoszenia
międzynarodowego:
U rząd Patentowy
Rzeczypospolitej Polskiej
( 5
4
)
(11) 178252
(13)B1
13.10.1994, W094/22494,
PCT Gazette nr 23/94
(51) IntCl6:
A61K
C07K
A61K
A61K
A61K
5 1 /0 8
7/64
103:10
103:20
123:00
Nowe cykliczne pochodne aminokwasowe
i nowe znakowane cykliczne pochodne aminokwasowe
(73)
Uprawniony z patentu:
DuPont Pharmaceuticals Company,
Wilmington, US
(43)
Zgłoszenie ogłoszono:
(72)
22.01.1996 BUP 02/96
(45)
O udzieleniu patentu ogłoszono:
31.03.2000 WUP 03/00
Twórcy wynalazku:
William F. DeGrado, Moylan, US
Shaker A. Mousa, Lincoln University, US
Michael Sworin, Newark, US
John A. Barrett, West Groton, US
David S. Edwards, Burlington, US
Thomas D. Harris, Salem, U S
Milind Rajopadhye, Westford, US
Shuang Liu, Chelmsford, US
(74 )
Pełnomocnik:
Sulima Zofia, SULIM A-G RABO W SKA-SIERZPUTO W SKA,
Biuro Patentów i Znaków Towarowych s.c.
PL 178252
B1
(57)1 Nowe cykliczne pochodne aminokwasowe o ogólnym wzorze (QLn)dCh, w którym d oznaczał lub 2, Q oznacza ugrupowanie o ogól-
w którym J oznacza ugrupowanie D-waliny, ugrupowanie D-lizyny lub ugrupowanie kwasu D-2-aminomasłowego, Ln oznacza grupę mostkową o ogólnym wzorze NHC(O)-(CH2)h-Y-M lub C(O)-(CH2)h-Y-M, w których to wzorach M oznacza wiązanie, grupę fenyleno-CH2,
grupę cykloheksylo-CH 2 , (CH 2 ) 2 lub (CH 2 )3 , Y oznacza wiązanie lub NHC(O), a h oznacza 0, 1, 2, 3 lub 5, przy czym grupa Ln jest
przyłączona do ugrupowania o wzorze (I) poprzez ugrupowanie D-lizyny stanowiące grupę J lub w pozycji 5 pierścienia fenylowego
ugrupowania o wzorze (I), gdy J oznacza ugrupowanie D-waliny lub ugrupowanie kwasu D-2-aminomasłowego, aChOznaczachelator
metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2, A1-W-A -W-A3 lub A 1-W-A2-W-A3-W-A4, w których to wzorach A 1 oznacza N H 2 ,
20 Nowe znakowane cykliczne pochodne aminokwasowe stanowiące związek komplek- sowy cyklicznej pochodnej aminokwasowej o
ogólnym wzorze (QLn)dCh 1 radionuklidu wybranego spośród 99mTc ewentualnie schelatowanego chelatorem metalu Ch, 99mTcO 1 111In,
przy czym d oznacza 1 lub 2, Q oznacza ugrupowanie o ogólnym wzorze (1)
w którym J oznacza ugrupowanie D-waliny, ugrupowanie D-lizyny lub ugrupowanie kwasu D-2-aminomaslowego, Ln oznacza grupę
mostkową o ogólnym wzorze NHC(O)-(CH2)h-Y-M lub C(O)-(CH2)h-Y-M, w których to wzorach M oznacza wiązanie, grupę fenyleno-CH 2 , grupę cykloheksylo-CH 2 , (CH 2 )2 lub (CH 2 b , Y oznacza wiązanie lub NHC(O), a h oznacza 0 ,1 ,2 ,3 , lub 5, przy czym grupa Lnjest
przyłączona do ugrupowania o wzorze (I) poprzez ugrupowanie D-lizyny stanowiące grupę J lub w pozycji 5 pierścienia fenylowego ugrupowania o wzorze (I) gdy J oznacza ugrupowanie D-waliny lub ugrupowanie kwasu D-2-amm om asłowego, a Ch oznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A 1-W-A2, A'-W -A -W-A3 lub A1-W-A2-W-A -W-A4, w których to wzorach A 1 oznacza N H 2 ,
Nowe cykliczne pochodne aminokwasowe
i nowe znakowane cykliczne pochodne aminokwasowe
Z astrzeżenia patentowe
1.
Nowe cykliczne pochodne aminokwasowe o ogólnym wzorze (QLn)dCh, w którym d oznacza 1 lub 2; Q oznacza ugrupowanie o ogólnym wzorze (I):
w którym J oznacza ugrupowanie D-waliny, ugrupowanie D-lizyny lub ugrupowanie kwasu
D-2-aminomasłowego; Ln oznacza grupę mostkową o ogólnym wzorze NHC(O)-(CH2)h-Y-M
lub C(O)-(CH2)h-Y-M, w których to wzorach M oznacza wiązanie, grupę fenyleno-CH2, grupę
cykloheksylo-CH2, (CH2)2lub (CH2)3, Y oznacza wiązanie lub NHC(O), a h oznacza 0,1,2,3
lub 5, przy czym grupa Lnjest przyłączona do ugrupowania o wzorze (I) poprzez ugrupowanie
D-lizyny stanowiące grupę J lub w pozycji 5 pierścienia fenylowego ugrupowania o wzorze (I),
gdy J oznacza ugrupowanie D-waliny lub ugrupowanie kwasu D-2-aminomasłowego; a Ch
oznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2, A1-W-A2-W-A3 lub A1-W-A2-W-A3-W-A4,
w których to wzorach A 1oznacza NH2, N=C(C1-C3-alkil)2, grupę o wzorze N(CH2O0 2H),
w którym atom azotu stanowi miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln, S, SH lub S(Pg);
A2 oznacza N, NH, grupę o wzorze NH-pirydyl, w którym atom pierścienia pirydylu stanowi
miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln, lub N(CH2CO2H); A3 oznacza N, N stanowiący
miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln, NH, grupę o wzorze N(CH2CO2H), w którym atom
azotu stanowi miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln, lubN(CH2CO2H)2; A4 oznaczaN, N
stanowiący miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln, NH, S, SH, lub S(Pg); W oznacza
wiązanie, (CH2)2, CH2C(O), CH(CH3)C(O), C(O)CH2, grupę o wzorze CH2CH, w którym
CH stanowi miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln, lub grupę o wzorze
, w którym * stanowi miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln, a Pg oznacza
grupę zabezpieczającą ugrupowanie tiolu zdolną do podstawienia radionuklidem, a także ich
farmaceutycznie dopuszczalne sole.
178 252
3
2. Związek według zastrz. 1, w którym Q oznacza ugrupowanie o ogólnym wzorze (I), w
którym J oznacza ugrupowanie D-lizyny związane z grupą mostkową Ln o ogólnym wzorze
C(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza wiązanie, grupę fenyleno-CH2 lub (CH2)2.
3. Związek według zastrz. 2, w którym d oznacza 1; Choznacza chelator metalu o ogólnym
wzorze A1-W-A2, A1-W-A2-W-A3lub A1-W-A2-W-A3-W-A4, w których to wzorach A3 oznacza
N, N stanowiący miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln, NH lub N(CH2CO2H)2; a A4 oznacza N stanowiący miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln, S, SH lub S(Pg).
4. Związek według zastrz. 3, w którym Q oznacza ugrupowanie o ogólnym wzorze (I), w
którym J oznacza ugrupowanie D-lizyny połączone z grupą mostkową Ln o ogólnym wzorze
C(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza wiązanie, Y oznacza wiązanie, a h oznacza O; a Choznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2, w którym A1 oznacza NH2 lub N=C(C1C3-alkil)2; A2 oznacza grupę o wzorze NH-pirydyl, w którym atom pierścienia pirydylu stanowi
miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln; a W oznacza wiązanie.
5. Związek według zastrz. 3, w którym Q oznacza ugrupowanie o ogólnym wzorze (I), w
którym J oznacza ugrupowanie D-lizyny połączone z grupą mostkową Ln o ogólnym wzorze
C(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza wiązanie, Y oznacza wiązanie, h oznacza 1; a Ch oznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2-W-A3, w którym A1 oznacza grupę o wzorze
N(CH2CO2H), w którym atom azotu stanowi miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln; A2
oznacza N(CH2CO2H); A3 oznacza N(CH2CO2H)2; a W oznacza (CH2)2
6. Związek według zastrz. 3, w którym Q oznacza ugrupowanie o ogólnym wzorze (I), w
którym J oznacza ugrupowanie D-lizyny połączone z grupą mostkową Ln o ogólnym wzorze
C(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza grupę fenyleno-CH2, Y oznacza wiązanie, a h oznacza
O; Choznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2-W-A3-W-A4, w którym A1oznacza S,
SH lub S(Pg); A2 oznacza N lub NH; A3 oznacza N stanowiący miejsce przyłączenia do grupy
mostkowej Ln; A4 oznacza S, SH lub S(Pg); a W oznacza (CH2)2 lub C(O)CH2.
7. Związek według zastrz. 3, w którym Q oznacza ugrupowanie o ogólnym wzorze (I), w
którym J oznacza ugrupowanie D-lizyny połączone z grupą mostkową Ln o ogólnym wzorze
C(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza wiązanie, Y oznacza wiązanie, a h oznacza 1 lub 3; a Ch
oznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2-W-A3-W-A4, w którym A1oznacza S, SH
lub S(Pg); A2 oznacza N lub NH; A3 oznacza N lub NH; A4 oznacza N stanowiący miejsce
przyłączenia do grupy mostkowej Ln; a W oznacza (CH2)2 CH2C(O) lub CH(CH3)C(O).
8. Związek według zastrz. 3, w którym Q oznacza ugrupowanie o ogólnym wzorze (I), w
którym J oznacza ugrupowanie D-lizyny połączone z grupą mostkową Ln o ogólnym wzorze
C(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza wiązanie, Y oznacza wiązanie, a h oznacza 2; a Choznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2-W-A3-W-A4, w którym A1oznacza S, SH lub
S(Pg); A2 oznacza N lub NH; A3 oznacza N lub NH; A4 oznacza S, SH lub S(Pg); W oznacza
wiązanie, CH2C(O), C(O)CH2 lub grupę o wzorze CH2CH, w którym CH stanowi miejsce
przyłączenia do grupy mostkowej Ln.
9. Związek według zastrz. 3, w którym Q oznacza ugrupowanie ogólnym wzorze (I), w
którym J oznacza ugrupowanie D-lizyny połączone z grupą mostkową Ln o ogólnym wzorze
C(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza wiązanie, Y oznacza wiązanie, a h oznacza 0; a Choznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2-W-A3-W-A4, w którym A1 oznacza S, SH lub
S(Pg); A2 oznacza N lub NH; A3 oznacza N lub NH; A4 oznacza S, SH lub S(Pg); W oznacza
wiązanie, CH2C(O), C(O)CH2 lub grupę o wzorze
przyłączenia do grupy mostkowej Ln.
, w którym * stanowi miejsce
4
178 252
10. Związek według zastrz. 2, w którym d oznacza 2, Q oznacza ugrupowanie o ogólnym
wzorze (I), w którym J oznacza ugrupowanie D-lizyny związane z grupą mostkową Lno ogólnym
wzorze C(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza wiązanie, Y oznacza wiązanie, a h oznacza 1;
a Ch oznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2-W-A3, w którym A1oznacza grupę o
wzorze N(CH2O 2H), w którym atom azotu stanowi miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln;
A2oznacza N(CH2CO2H); A3 oznacza grupę o wzorze N(CH2CO2H), w którym atom azotu stanowi miejsce przyłączenia do grupy Ln; a W oznacza (CH2)2.
11. Związek według zastrz. 1, w którym d oznacza 1; Q oznacza ugrupowanie o ogólnym
wzorze (I), w którym J oznacza ugrupowanie D-waliny lub kwasu D-2-aminomasłowego; Lnoznacza grupę mostkową Ln o ogólnym wzorze NHC(O)-(CH2)h-Y-M, w którym Y oznacza
NHC(O), a h oznacza 5, przy czym grupa Lnjest przyłączona w pozycji 5 pierścienia fenylowego
ugrupowania o wzorze (I); a Ch oznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2 lub
A1-W-A2-W-A3-W-A4, w których to wzorach A1oznacza NH2, N=C(C1-C3-alikil)2, S, SH, lub
S(Pg); A2 oznacza N, NH lub grupę o wzorze NH-pirydyl, w którym atom pierścienia pirydylu
stanowi miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln; A3 oznacza N, N stanowiący miejsce
przyłączenia do grupy mostkowej Ln lub NH; a W oznacza wiązanie, (CH2 ), CH2C(O),
CH(CH3)C(O), C(O)CH2 lub grupę o wzorze CH2CH, w którym CH stanowi miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln.
12. Związek według zastrz. 11, w którym Ln oznacza grupę mostkową Ln o ogólnym wzorze NHC(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza wiązanie; a Ch oznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2, w którym A1 oznacza NH2 lub N=C(C1-C3-alkil)2; A2 oznacza grupę o
wzorze NH-pirydyl, w którym atom pierścienia pirydylu stanowi miejsce przyłączenia do grupy
mostkowej Ln; a W oznacza wiązanie.
13. Związek według zastrz. 12, w którym J oznacza ugrupowanie D-waliny.
14. Związek według zastrz. 12, w którym J oznacza ugrupowanie kwasu D-2-aminomasłowego.
15. Związek według zastrz. 11, w którym Lnoznacza grupę mostkowąLn o ogólnym wzorze NHC(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza grupę fenyleno-CH2, grupę cykloheksylo-CH2,
(CH2)2 lub (CH2)3; a Ch oznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2-W-A3-W-A4, w
którym A1 oznacza S, SH lub S(Pg); A2 oznacza N lub NH; a W oznacza (CH2)2, CH2C(O),
CH(CH3)C(o ), C(O)CH2lub grupę o wzorze CH2CH, w której CH stanowi miejsce przyłączenia
do grupy mostkowej Ln.
16. Związek według zastrz. 11, w którym Lnoznacza grupę mostkową Ln o ogólnym wzorze NHC(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza grupę fenyleno-CH2; a Ch oznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2-W-A3-W-A4, w którym A1 oznacza S, SH, lub S(Pg); A2
oznacza N lub NH; A3 oznacza N stanowiący miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln; A4
oznacza S, SH lub S(Pg); a W oznacza (CH2)2 lub CH2C(O).
17. Związek według zastrz. 11, w którym Ln oznacza grupę mostkowąLn o ogólnym wzorze NHC(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza grupę cykloheksylo-CH2 lub (CH2)3; a Ch oznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2-W-A3-W-A4, w którym A1oznacza S, SH lub
S(Pg); A2oznacza N lub NH; A3oznaczaN lubNH; A4oznaczaN stanowiący miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln; a W oznacza CH2C(O) lub CH(CH3)C(O).
18. Związek według zastrz. 11, w którym Ln oznacza grupę mostkową Ln o ogólnym wzorze NHC(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza grupę fenyleno-CH2, grupę cykloheksylo-CH2,
(CH2)2 lub (CH2)3; a Ch oznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2-W-A3-W-A4, w
którym A1oznacza S, SH lub S(Pg); A2 oznacza N lub NH; A3oznacza N lub NH; A4 oznacza S,
SH lub S(Pg); a W oznacza CH2C(O), C(O)CH2lub grupę o wzorze CH2CH, w którym CH stanowi miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln.
178 252
19. Związek według zastrz. 1 wybrany z grupy obejmującej:
5
6
178 252
Nowe znakowane cykliczne pochodne aminokwasowe stanowiące związek komplek20.
sowy cyklicznej pochodnej aminokwasowej o ogólnym wzorze (QLn)dCh i radionuklidu wybranego spośród 99mTc ewentualnie schelatowanego chelatorem metalu Ch, 99mTcO i 111In, przy czym
d oznacza 1 lub 2; Q oznacza ugrupowanie o ogólnym wzorze (I):
w którym J oznacza ugrupowanie D-waliny, ugrupowanie D-lizyny lub ugrupowanie kwasu D-2-aminomasłowego; Lnoznacza grupę mostkowąo ogólnym wzorze NHC(0)-(CH2)h-Y-M
lub C(O)-(CH2)h-Y-M, w których to wzorach M oznacza wiązanie, grupę fenyleno-CH2, grupę
cykloheksylo-CH2, (CH2)2 lub (CH2)3, Y oznacza wiązanie lub NHC(O), a h oznacza 0,1 ,2 , 3,
lub 5, przy czym grupa Lnjest przyłączona do ugrupowania o wzorze (I) poprzez ugrupowanie
D-lizyny stanowiące grupę J lub w pozycji 5 pierścienia fenylowego ugrupowania o wzorze (I)
gdy J oznacza ugrupowanie D-waliny lub ugrupowanie kwasu D-2-aminomasłowego; a Choznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2, A'-W-A2-W-A3 lub A1-W-A2-W-A3-W-A4, w
których to wzorach A1 oznacza NH2, N=C(C1-C3-alkil)2, grupę o wzorze N(CH2CO2H), w której
atom azotu stanowi miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln, S, SH lub S(Pg); A2oznaczaN,
NH, grupę o wzorze NH-pirydyl, w którym atom pierścienia pirydylu stanowi miej sce przyłączenia do grupy mostkowej Ln, lub N(CH2CO2H); A3oznaczaN, N stanowiący miejsce przyłączenia
178 252
7
do grupy mostkowej Ln, NH, grupę o wzorze N(CH2CO2H), w którym atom N stanowi miejsce
przyłączenia do grupy mostkowej Ln, lub N(CH2CO2H)2; A4 oznacza N, N stanowiący miejsce
przyłączenia do grupy mostkowej Ln, NH, S, SH lub S(Pg); W oznacza wiązanie, (CH2)2
CH2C(O), CH(CH3)C(O), C(O)CH2, grupę o wzorze CH2CH, w którym CH stanowi miejsce
przyłączenia do grupy mostkowej Ln, lub grupę o wzorze
'
x , w którym * stanowi
miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln, a Pg oznacza grupę zabezpieczającą ugrupowanie tiolu zdolną do podstawienia radionuklidem, a także ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.
21. Związek według zastrz. 20, w którym Q oznacza ugrupowanie o ogólnym wzorze (I), w
którym J oznacza ugrupowanie D-lizyny związane z grupą mostkową Ln o ogólnym wzorze
C(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza wiązanie, grupę fenyleno-CH2lub (CH2)2.
22. Związek według zastrz. 21, w którym d oznacza 1; Ch oznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2, A’-W-A2-W-A3lub A 1-W-A2-W-A3-W-A4, wktórychto wzorach A3oznacza N, N stanowiący miej sce przyłączenia do grupy Ln, NH lub N(CH2CO2H)2; a A4oznacza N
stanowiący miejsce przyłączenia do grupy Ln, S, SH lub S(Pg).
23. Związek według zastrz. 22, w którym Q oznacza ugrupowanie o ogólnym wzorze (I), w
którym J oznacza ugrupowanie D-lizyny połączone z grupą mostkową Ln o ogólnym wzorze
C(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza wiązanie, Y oznacza wiązanie, a h oznacza 0; a Choznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A'-W-A2, w którym A 1oznacza NH2 lub N=C(C 1-C3-alkil)2; A2 oznacza grupę o wzorze NH-pirydyl, w którym atom pierścienia pirydylu stanowi
miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln; a W oznacza wiązanie.
24. Związek według zastrz. 22, w którym Q oznacza ugrupowanie o ogólnym wzorze (I), w
którym J oznacza ugrupowanie D-lizyny połączone z grupą mostkową Ln o ogólnym wzorze
C(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza wiązanie, Y oznacza wiązanie, a h oznacza 1; a Choznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A 1-W-A2-W-A3, w któiym A 1 oznacza grupę o wzorze
N(CH2CO2H), w którym atom azotu stanowi miejsce przyłączenia do grupy Ln; A2 oznacza
N(CH2CO2H); A3oznacza N(CH2CO2H)2; a W oznacza (CH2)2.
25. Związek według zastrz. 22, w którym Q oznacza ugrupowanie o ogólnym wzorze (I), w
którym J oznacza ugrupowanie D-lizyny połączone z grupą mostkową Ln o ogólnym wzorze
C(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza grupę fenyleno-CH2, Y oznacza wiązanie, a h oznacza
0; a Choznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2-W-A3-W-A4, w którym A 1oznacza
S, SH lub S(Pg); A2oznaczaN lubNH; A3oznaczaN stanowiący miejsce przyłączenia do grupy
mostkowej Ln; A4oznacza S, SH, lub S(Pg); a W oznacza (CH2)2lub C(O)CH2.
26. Związek według zastrz. 22, w którym Q oznacza ugrupowanie o ogólnym wzorze (I), w
którym J oznacza ugrupowanie D-lizyny połączone z grupą mostkową Ln o ogólnym wzorze
C(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza wiązanie, Y oznacza wiązanie, a h oznacza 1 lub 3; a Ch
oznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A 1-W-A2-W-A3-W-A4, w którym A 1oznacza S, SH
lub S(Pg); A2 oznacza N lub NH; A3 oznacza N lub NH; A4oznacza N stanowiący miejsce
przyłączenia do grupy mostkowej Ln; a W oznacza (CH2)2, CH2C(O) lub CH(CH3)C(O).
27. Związek według zastrz. 22, w którym Q oznacza ugrupowanie o ogólnym wzorze (I), w
którym J oznacza ugrupowanie D-lizyny połączone z grupą mostkową Ln o ogólnym wzorze
C(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza wiązanie, Y oznacza wiązanie a h oznacza 2; a Choznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2-W-A3-W-A4, w którym A 1 oznacza S, SH lub
S(Pg); A2oznacza N lub NH; A3oznacza N lub NH; A4oznacza S, SH lub S(Pg); a W oznacza
wiązanie, CH2C(O), C(O)CH2 lub grupę o wzorze CH2CH, w którym CH stanowi miejsce
przyłączenia do grupy mostkowej Ln.
8
178 252
28.
Związek według zastrz. 22, w którym Q oznacza ugrupowanie o ogólnym wzorze (I), w
którym J oznacza ugrupowanie D-lizyny połączone z grupą mostkową Ln o ogólnym wzorze
C(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza wiązanie, Y oznacza wiązanie, a h oznacza 0; a Choznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2-W-A3-W-A4, w którym A1oznacza S, SH lub
S(Pg); A2 oznacza N lub NH; A3 oznacza N lub NH; A4 oznacza S, SH lub S(Pg); W oznacza
wiązanie, CH2C(O), C(O)CH2 lub grupę o wzorze
, w którym * oznacza miejsce
przyłączenia do grupy mostkowej Ln
29. Związek według zastrz. 21, w którym d oznacza 2, Q oznacza ugrupowanie o ogólnym
wzorze (I), w którym J oznacza ugrupowanie D-lizyny związane z grupą mostkową Ln o ogólnym wzorze C(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza wiązanie, Y oznacza wiązanie, a h oznacza
1; a Ch oznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2-W-A3, w którym A1oznacza grupę
o wzorze N(CH2CO2H), w którym atom azotu stanowi miejsce przyłączenia do grupy mostkowej
Ln; A2 oznacza N(CH2CO2H); A3 oznacza grupę o wzorze N(CH2CO2H), w którym atom azotu
stanowi miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln; a W oznacza (CH2)2.
30. Związek według zastrz. 20, w którym d oznacza 1; Q oznacza ugrupowanie o ogólnym
wzorze (I), w którym J oznacza ugrupowanie D-waliny lub kwasu D-2-aminomasłowego; Lnoznacza grupę mostkową Ln o ogólnym wzorze NHC(O)-(CH2)h-Y-M, w którym Y oznacza
NHC(O), a h oznacza 5, przy czym grupa Lnjest przyłączona w pozycji 5 pierścienia fenylowego ugrupowania o wzorze (I); a Ch oznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2 lub
A1-W-A2-W-A3-W-A4, w których to wzorach A1 oznacza NH2, N=C(C1-C3-alkil)2, S, SH lub
S(Pg); A2 oznacza N, NH lub grupę o wzorze NH-pirydyl, w którym atom pierścienia pirydylu
stanowi miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln; A3 oznacza N, N stanowiący miejsce
przyłączenia do grupy mostkowej Ln lub NH; a W oznacza wiązanie, (CH2)2, CHo2C ( ) ,
CH(CH3)C(O), C(O)CH2 lub grupę o wzorze CH2CH, w którym CH stanowi miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln.
31. Związek według zastrz. 30, w którym Ln oznacza grupę mostkową Ln o ogólnym wzorze NHC(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza wiązanie; a Ch oznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2, w którym A1 oznacza NH2 lub N=C(C1-C3-alkil)2; A2 oznacza grupę o
wzorze NH-pirydyl, w którym atom pierścienia pirydylu stanowi miejsce przyłączenia do grupy
Ln; a W oznacza wiązanie.
32. Związek według zastrz. 31, w którym J oznacza ugrupowanie D-waliny.
33. Związek według zastrz. 31. w którym J oznacza ugrupowanie kwasu D-2-aminomasłowego.
34. Związek według zastrz. 30, w którym Ln oznacza grupę mostkową Ln o ogólnym wzorze NHC(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza grupę fenyleno-CH2, grupę cykloheksylo-CH2,
(CH2)2 lub (CH2)3; a Ch oznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2-W-A3-W-A4, w
którym A1 oznacza S, SH lub S(Pg); A2 oznacza N lub NH; a W oznacza (CH2)2, CH2C(O),
CH(CH3)C(O), C(O)CH2 lub grupę o wzorze CH2CH, w którym CH stanowi miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln.
35. Związek według zastrz. 30, w którym Ln oznacza grupę mostkowąLn o ogólnym wzorze NHC(0)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza grupę fenyleno-CH2; a Choznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2-W-A3-W-A4, w którym A1 oznacza S, SH lub S(Pg); A2
oznacza N lub NH; A3 oznacza N stanowiący miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln; A4
oznacza S, SH lub S(Pg); a W oznacza (CH2)2 lub CH2C(O).
36. Związek według zastrz. 30, w którym Ln oznacza grupę mostkowąLn o ogólnym wzorze NHC(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza grupę cykloheksylo-CH2 lub (CH2)3; a Chozna-
178 252
9
cza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2-W-A3-W-A4, w którym A1oznacza S, SH lub
S(Pg); A2oznaczaN lubNH; A3oznaczaN lubNH; A4oznaczaN stanowiący miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln; a W oznacza CH2C(O) lub CH(CH3)C(O).
37. Związek według zastrz. 30, w którym Ln oznacza grupę mostkową Ln o ogólnym wzorze NHC(0)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza grupę fenyleno-CH2, grupę cykloheksylo-CH2,
(CH2)2 lub (CH2)3; a Ch oznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A 1-W-A2-W-A3-W-A4,
w którym A1oznacza S, SH lub S(Pg); A2 oznaczaN lub NH; A3 oznaczaN lub NH; A4 oznacza
S, SH lub S(Pg); a W oznacza CH2C(O), C(O)CH2lub grupę o wzorze CH2CH, w którym CH stanowi miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln.
38. Związek według zastrz. 20 wybrany z grupy obejmującej:
10
178 252
178 252
13
14
178 252
* * *
Przedmiotem wynalazku są nowe cykliczne pochodne aminokwasowe i nowe znakowane
cykliczne pochodne aminokwasowe otrzymywane z tych nowych cyklicznych pochodnych aminokwasowych. Pochodne znakowane stanowią radiofarmaceutyki do obrazowania miejsc gromadzenia się płytek krwi u ssaków, a zatem do diagnozowania skrzeplin żylnych i tętniczych,
przy czym zarówno nie znakowane, jak i znakowane związki mają działanie antagonizujące płytkowy glikoproteinowy kompleks IIb/IIIa.
Rozpoznanie kliniczne żylnych i tętniczych chorób zakrzepowo-zatorowych jest niepewne, ponieważ brak mu jest zarówno czułości jak i wybiórczości. Biorąc pod uwagę sytuację
stwarzającą potencjalne zagrożenie życia, konieczność szybkiej diagnozy chorób zakrzepowozatorowych opartej na metodzie nieinwazyjnej stanowi zapotrzebowanie kliniczne, dotychczas
niezaspokojone. Aktywacja płytek i wynikająca z tego agregacja stowarzyszona jest, jak to wykazano, z rozmaitymi stanami patofizjologicznymi, włączając w to zakrzepowo-zatorowe choroby sercowo-naczyniowe i naczyniowo-mózgowe, takie jak dławica niestabilna, zawał mięśnia
sercowego, przejściowy atak niedokrwienia mózgu w zwężeniu jednej z tętnic szyjnych, udar,
miażdżyca tętnic i cukrzyca. Udział płytek krwi w tych procesach chorobowych wywodzi się z
ich zdolności do tworzenia agregatów, lub skrzeplin płytkowych, zwłaszcza w ścianie tętnicy w
następstwie jej uszkodzenia. Patrz, ogólnie: Fuster i in., JACC, tom 5, nr 6, str. 1758-1838 (1985);
Rubensteiniin., Am. Heart J.,tom 102, str. 363-367 (1981);Hammiin., J.. Celi. Cardiol.,tom 10,
str. 998-1006 (1987); orazDavies i in., Circulation, tom 73, str. 418-427 (1986). Ostatnio, zidentyfikowano płytkowy glikoproteinowy kompleks IIb/IIIa (GPIIb/IIIa) jako białko błony, pośredniczące w agregacji płytek przez zapewnienie typowego szlaku dla znanych agonistów płytek
krwi. Patrz: Philips i in., Cell, tom 65, str. 359362 (1991).
Sądzi się, również, że aktywacja płytek i ich agregacja odgrywająznaczącą rolę w żylnych
chorobach zakrzepowo-zatorowych takich, jak zakrzepowe zapalenie żył i następujące po nim
zatory płucne. Jest także rzeczą znaną, że pacjenci, u których krew przepływa obok powierzchni
sztucznie uformowanych, takich jak protezowe syntetyczne zastawki serca zastępcze, narażeni
są na ryzyko tworzenia przez płytki czopów, skrzeplin i zatorów. Patrz, ogólnie: Fuster i in.,
JACC, tom 5, nr 6, str. 175B-183B (1985); Rubenstein i in., Am. Heart J., tom 102, str. 363-367
(1981); Hamm i in., J. Am. Coll. Cardiol., tom 10, str. 998-1006 (1987); oraz Davies i in., Circulation, tom 73, str. 418-427 (1986).
Wysoce użyteczny byłby sposób nadający się do dokonywania nieinwazyjnej diagnozy i
kontroli u pacjentów cierpiących na tego rodzaju potencjalne choroby zakrzepowo-zatorowe, w
związku z czym dokonano wielu usiłowań zmierzających do opracowania środków znakowanych izotopami radioaktywnymi, nakierunkowanych na płytki, w celu nieinwazyjnego obrazowania z udziałem radionuklidów. I tak np. przeprowadzono badania eksperymentalne stosując
99mTc-monoklonalne przeciwciało antyfibrynowe w celu diagnostycznego zobrazowania
skrzeplin tętniczych. Patrz: Cerqueira i in., Circulation, tom 85, str. 298-304 (1992). Autorzy donoszą o potencjalnej przydatności tego rodzaju środków do obrazowania świeżo uformowanej
skrzepliny tętniczej. Doniesiono również o monoklonalnych przeciwciałach znakowanych 131I,
swoistych dla aktywnych płytek krwi ludzkiej, i ich potencjalnej możliwości wykorzystania w
diagnozowaniu skrzeplin tętniczych i żylnych. Jednakże, racjonalny stosunek skrzeplina/krew
(cel/tło) osiągalny był zaledwie w ciągu 4 godzin od podania przeciwciała znakowanego izotopem radioaktywnym. Patrz: Wu i in., Clin. Med. J.,tom 105, str. 533-559 (1992). Ostatnie opisano także użycie znakowanego izotopem radioaktywnym 1251,131I, 99Tc i 111In monoklonalnego
przeciwciała 7E3 dlatrombocytów, do obrazowania skrzeplin. Celler i in., publikacja zgłoszenia
patentowego PCT nr WO 89/11538 (1989). Jednakże, znakowane izotopem radioaktywnym
przeciwciało 7E3 ma tę wadę, że stanowi cząsteczkę o bardzo dużej masie cząsteczkowej. Inni
badacze stosowali enzymatycznie inaktywowany t-PA, znakowany izotopami radioaktywnymi
123I, l25I i I31I do wykrywania i lokalizacji skrzeplin. Patrz Ordm i inni, Circulation, tom 85, str.
178 252
11
12
178 252
178 252
15
288-297 (1992). Jeszcze inne podejście do radiologicznej detekcji zakrzepów z zatorami opisano
np. w Koblik i in., Semin. Nuci. Med., tom 19, str. 221-237.
Istnieje zatem pilne zapotrzebowanie na nowe i lepsze znakowane izotopami radioaktywnymi środki do nieinwazyjnego obrazowania z użyciem radionuklidów. Nieoczekiwanie
okazało się, że takimi radiofarmaceutykami są nowe znakowane cykliczne pochodne aminokwasowe według wynalazku, których wytworzenie stało się możliwe dzięki opracowaniu nowych
związków o wzorze (QLn)dCh, nadających się do znakowania radioligandami.
Tak więc wynalazek dotyczy nowych cyklicznych pochodnych aminokwasowych
o ogólnym wzorze (QLn)dCh, w którym d oznacza 1 lub 2; Q oznacza ugrupowanie o ogólnym
wzorze (I):
(I)
w którym J oznacza ugrupowanie D-waliny, ugrupowanie D-lizyny lub ugrupowanie kwasu D-2-aminomasłowego; Ln oznacza grupę mostkową ogólnym wzorze NHC(O)-(CH2)h-Y-M
lub C(O)-(CH2)h-Y-M, w których to wzorach M oznacza wiązanie, grupę fenyleno-CH2, grupę
cykloheksylo-CH2, (CH2)2lub (CH2)3, Y oznacza wiązanie lub NHC(O), a h oznacza 0,1,2, 3
lub 5, przy czym grupa Lnjest przyłączona do ugrupowania o wzorze (I) poprzez ugrupowanie
D-lizyny stanowiące grupę J lub w pozycji 5 pierścienia fenylowego ugrupowania o wzorze (I)
gdy J oznacza ugrupowanie D-waliny lub ugrupowanie kwasu D-2-aminomasłowego; a Choznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2, A1-W-A2-W-A3 lub A 1-W-A2-W-A3-W-A4, w
których to wzorach A 1oznacza NH2, N=C(C1-C3-alkil)2, grupę o wzorze N(CH2CO2H), w której
atom azotu stanowi miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln, S, SH lub S(Pg); A2oznaczaN,
NH, grupę o wzorze NH-pirydyl, w którym atom pierścienia pirydylu stanowi miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln, lubN(CH2CO2H); A3oznaczaN, N stanowiący miejsce przyłączenia
do grupy mostkowej Ln, NH, grupę o wzorze N(CH2CO2H), w której atom azotu stanowi miejsce
przyłączenia do grupy mostkowej Ln, lubN(CH2CO2H)2; A4 oznaczaN, N stanowiący miejsce
przyłączenia do grupy mostkowej Ln, NH, S, SH lub S(Pg); W oznacza wiązanie, (CH2 ),
CH2C(O), CH(CH3)C(O), C(O)CH2, grupę wzorze CH2CH, w którym CH stanowi miejsce
przyłączenia do grupy mostkowej Ln, lub grupę o wzorze
; w którym * stanowi
miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln, a Pg oznacza grupę zabezpieczającą ugrupowanie
tiolu zdolną do podstawienia radionuklidem, a także ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.
Korzystne są związki o wzorze (QLn)dCh, w którym d oznacza 1 lub 2; Q oznacza ugrupowanie o ogólnym wzorze (I), w którym J oznacza ugrupowanie D-lizyny związane z grupą mostkową Ln o ogólnym wzorze C(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza wiązanie, grupę fenyleno-CH2 lub (CH2)2, Y oznacza wiązanie lub NHC(O), a h oznacza 0, 1, 2, 3 lub 5; a Ch ma
znaczenie podane w zastrz. 1, a także związki o wzorze (QLn)dCh, w którym d oznacza 1; Q oznacza
16
178 252
ugrupowanie o ogólnym wzorze (I), w którym J oznacza ugrupowanie D-lizyny połączone z grupą mostkowąLno ogólnym wzorze C(O)-(CH2)i1-Y-M, w którym M oznacza wiązanie, grupę fenyleno-CH2 lub (CH2)2, Y oznacza wiązanie lub NHC(O), a h oznacza 0, 1, 2, 3 lub 5; a Ch
oznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2, A1-W-A2-W-A3lub A1-W-A2-W-A3-W-A4,
w których to wzorach A1 oznacza NH2, N=C(C1-C3-alikil)2, grupę o wzorze N(CH2CO2H), w
którym atom azotu stanowi miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln, S, SH lub S(Pg); A2oznacza N, NH, grupę o wzorze NH-pirydyl, w którym atom pierścienia pirydylu stanowi miejsce
przyłączenia do grupy mostkowej Ln, lub N(CH2CO2H); A3 oznacza N, N stanowiący miejsce
przyłączenia do grupy mostkowej Ln, NH lub N(CH2CO2H)2; A4 oznacza N stanowiący miejsce
przyłączenia do grupy mostkowej Ln, S, SH lub S(Pg); W oznacza wiązanie, (CH2)2, CH2C(O),
CH(CH3)C(O), C(O)CH2, grupę o wzorze CH2CH, w którym CH stanowi miejsce przyłączenia
do grupy mostkowej Ln, lub grupę o wzorze
; w którym * stanowi miejsce
przyłączenia do grupy mostkowej Ln, a Pg oznacza grupę zabezpieczającą ugrupowanie tiolu
zdolną do podstawienia radionuklidem, a także jego farmaceutycznie dopuszczalne sole.
Wśród nich szczególnie korzystne są:
1) związki o wzorze (OLJ nCh, w którym d oznacza 1; Q oznacza ugrupowanie o ogólnym
wzorze (I), w którym J oznacza ugrupowanie D-lizyny połączone z grupą mostkową Ln o ogólnym wzorze C(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza wiązanie, Y oznacza wiązanie, a h oznacza
0; a Ch oznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2, w którym A1 oznacza NH2 lub
N=C(C 1-C3-alikil)2; A2oznacza grupę o wzorze NH-pirydyl, w którym atom pierścienia pirydylu
stanowi miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln; a W oznacza wiązanie,
2) związki o wzorze (QLn)dCh, w którym d oznacza 1; Q oznacza ugrupowanie o ogólnym
wzorze (I), w którym J oznacza ugrupowanie D-lizyny połączone z grupą mostkową Ln o ogólnym wzorze C(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza wiązanie, Y oznacza wiązanie, a h oznacza
1; a Choznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A 1-W-A2-W-A3, w którym A 1oznacza grupę o
wzorze N(CH2CO2H), w którym atom azotu stanowi miejsce przyłączenia do grupy mostkowej
Ln; A2 oznacza N(CH2CO2H); A3 oznacza N(CH2CO2H)2; a W oznacza (CH2)2,
3) związki o wzorze (QLn)dCh, w którym d oznacza 1; Q oznacza ugrupowanie o ogólnym
wzorze (I), w którym J oznacza ugrupowanie D-lizyny połączone z grupą mostkową Ln o ogólnym wzorze C(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza grupę fenyleno-CH2, Y oznacza wiązanie,
a h oznacza 0; a C hoznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2-W-A3-W-A4, w którym
A1oznacza S, SH lub S(Pg); A2oznaczaN lub NH; A3oznaczaN stanowiący miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln; A4 oznacza S, SH lub S (Pg); W oznacza (CH2)2 lub C(O)CH2; a Pg
oznacza grupę zabezpieczającą ugrupowanie tiolu zdolną do podstawienia radionuklidem,
4) związki o wzorze (QLn)dCh, w którym d oznacza 1; Q oznacza ugrupowanie o ogólnym
wzorze (I), w którym J oznacza ugrupowanie D-lizyny połączone z grupą mostkową Ln o ogólnym wzorze C(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza wiązanie, Y oznacza wiązanie, a h oznacza
1 lub 3; a Choznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2-W-A3-W-A4, w którym A1oznacza S, SH lub S(Pg); A2 oznacza N lub NH; A3 oznacza N lub NH; A4 oznacza N stanowiący
miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln; W oznacza (CH2)O
2, CH2C ( ) lub CH(CH3)C(O);
a Pg oznacza grupę zabezpieczającą ugrupowanie tiolu zdolną do podstawienia radionuklidem,
5) związki o wzorze (QLn dCh, w którym d oznacza 1; Q oznacza ugrupowanie o ogólnym
wzorze (I), w którym J oznacza ugrupowanie D-lizyny połączone z grupą mostkową Ln o ogólnym wzorze C(O)HCH2 -Y-M, w którym M oznacza wiązanie, Y oznacza wiązanie, a h oznacza 2; a
Ch oznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2-W-A3-W-A4, w którym A1oznacza S,
178 252
17
SH lub S(Pg); A2oznaczaN lub NH; A3oznaczaN lub NH; A4oznacza S, SH lub S(Pg); W oznacza wiązanie, CH2C(O), C(O)CH2 lub grupę o wzorze CH2CH, w którym CH stanowi miejsce
przyłączenia do grupy mostkowej Ln; a Pg oznacza grupę zabezpieczającą ugrupowanie tiolu
zdolną do podstawienia radionuklidem,
6) związki o wzorze (QLn)dCh, w którym d oznacza 1; Q oznacza ugrupowanie o ogólnym
wzorze (I), w którym J oznacza ugrupowanie D-lizyny połączone z grupą mostkową Ln o ogólnym wzorze C(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza wiązanie, Y oznacza wiązanie, a h oznacza 0; a Ch oznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2-W-A3-W-A4, w którym A1
oznacza S, SH lub S(Pg); A2oznaczaN lubNH; A3oznaczaN lub NH; A4oznacza S, SH lub S(Pg);
W oznacza wiązanie, CH2C(O), C(O)CH2 lub grupę o wzorze /
, w którym * stanowi
miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln; Pg oznacza grupę zabezpieczającą ugrupowanie
tiolu zdolną do podstawienia radionuklidem, a także ich farmaceutycznie dopuszczalne sole,
Korzystne są również związki o wzorze (QLn)dCh, w którym d oznacza 2, Q oznacza ugrupowanie o ogólnym wzorze (I), w którym J oznacza ugrupowanie D-lizyny związane z grupą mostkową Ln o ogólnym wzorze C(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza wiązanie, Y oznacza
wiązanie, a h oznacza l ; a C h oznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A 1-W-A2-W-A3,
w którym A1 oznacza grupę o wzorze N(CH2CO2H), w którym atom azotu stanowi miejsce
przyłączenia do grupy mostkowej Ln; A2 oznacza N(CH2CO2H); A3 oznacza grupę o wzorze
N(CH2CO2H), w którym atom azotu stanowi miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln;
a W oznacza (CH2)2, a także ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.
Korzystną grupę tworzą również związki o wzorze (QLn)dCh, w którym d oznacza 1;
Q oznacza ugrupowanie o ogólnym wzorze (I), w którym J oznacza ugrupowanie D-waliny
lub kwasu D-2-aminomasłowego; Ln oznacza grupę mostkową Ln o ogólnym wzorze
NHC(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza wiązanie, grupę fenyleno-CH2, grupę cykloheksylo-CH2, (CH2)2lub (CH2)3, Y oznacza NHC(O), a h oznacza 5, przy czym grupa Lnjest przyłączona w pozycji 5 pierścienia fenylowego ugrupowania o wzorze (I); a Choznacza chelator metalu o
ogólnym wzorze A1-W-A2 lub A'-W-A2-W-A3-W-A4, w których to wzorach A1 oznacza NH2,
N=C(C1-C3-alkil)2, S, SH lub S(Pg); A2 oznaczaN, NH lub grupę o wzorze NH-pirydyl, w którym atom pierścienia pirydylu stanowi miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln; A3oznacza
N, N stanowiący miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln lub NH; A4 oznacza N, N stanowiący miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln, NH, S, SH lub S(Pg); W oznacza wiązanie,
(CH2)2, CH2C(O), CH(CH3) C ( ) , C(O)CH2 lub grupę o wzorze CH2CH-Ln; a Pg oznacza grupę
zabezpieczającą ugrupowanie tiolu zdolną do podstawienia radionuklidem, a także ich farmaceutycznie dopuszczalne sole.
Wśród nich szczególnie korzystne są:
1) związki o wzorze (QLn)dCh, w którym d oznacza 1 lub 2; Q oznacza ugrupowanie o ogólnym wzorze (I), w którym J oznacza ugrupowanie D-waliny lub kwasu D-2-aminomasłowego;
Ln oznacza grupę mostkową Ln o ogólnym wzorze NHC(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza
wiązanie, Y oznacza NHC(O), a h oznacza 5; a Ch oznacza chelator metalu o ogólnym wzorze
A1-W-A2, w którym A1oznacza NH2 lub N=C(C1-C3- alkil)2; A2oznacza grupę o wzorze NH-pirydyl, w którym atom pierścienia pirydylu stanowi miejsce przyłączenia do grupy Ln; a W oznacza wiązanie,
2) związki wzorze (QLn)dCh, w którym d oznacza 1; Q oznacza ugrupowanie o ogólnym
wzorze (I), w którym J oznacza ugrupowanie D-waliny lub kwasu D-2-aminomasłowego; Ln oznacza grupę mostkową Ln o ogólnym wzorze NHC(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza grupę
fenenylo-CH2, grupę cykloheksylo-CH2, (CH2)2 lub (CH2)3, YoznaczaNHC(O), a h oznacza 5;
18
178 252
a Choznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2-W-A3-W-A4, w którym A1oznacza S,
SH lub S(Pg); A2oznaczaN lubNH; A3 oznaczaN,N stanowiący miejsce przyłączenia do grupy
mostkowej Ln, lub NH; A4oznacza N, N stanowiący miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln,
NH, S, SH lub S(Pg); W oznacza (CH2)2, CH2C(O), CH(CH3)C(O), C(O)CH2 lub grupę o wzorze CH2CH, w którym CH stanowi miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln; a Pg oznacza
grupę zabezpieczającą ugrupowanie tiolu zdolną do podstawienia radionuklidem,
3) związki o wzorze (QLn)dCh, w którym d oznacza 1; Q oznacza ugrupowanie o ogólnym
wzorze (I), w którym J oznacza ugrupowanie D-waliny lub kwasu D-2-aminomasłowego; Ln oznacza grupę mostkową Ln o ogólnym wzorze NHC(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza grupę
fenyleno-CH2, Y oznacza NHC(O), a h oznacza 5; a Choznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2-W-A3-W-A4, w którym A1oznacza S, SH lub S(Pg); A2 oznacza N lub NH; A3 oznacza N stanowiący miejsce przyłączenia do grupy mostkowej Ln; A4 oznacza S, SH lub S(Pg);
W oznacza (CH2)2 lub CH2C(O); a Pg oznacza grupę zabezpieczającą ugrupowanie tiolu zdolną
do podstawienia radionuklidem,
4) związki o wzorze (QLn)dCh w którym d oznacza 1; Q oznacza ugrupowanie o ogólnym
wzorze (I), w którym J oznacza ugrupowanie D-waliny lub kwasu D-2-aminomasłowego;
Lnoznacza grupę mostkowąLno ogólnym wzorze NHC(O)-(CH2)n-Y-M, w którym M oznacza
grupę cykloheksylo-CH2 lub (CH2)3, Y oznaczaNHC(O), a h oznacza 5; a Ch oznacza chelator
metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2-W-A3-W-A4, w którym A1oznacza S, SH lub S(Pg), A2 oznacza N lub NH; A3 oznacza N lub NH; A4oznacza N stanowiący miejsce przyłączenia do grupy
mostkowej Ln; W oznacza CH2C(O) lub CH(CH3)C(O); a Pg oznacza grupę zabezpieczającą
ugrupowanie tiolu zdolną do podstawienia radionuklidem,
5) związki o wzorze (QLn)dCh, w którym d oznacza 1; Q oznacza ugrupowanie o ogólnym
wzorze (I), w którym J oznacza ugrupowanie D-waliny lub kwasu D-2-aminomasłowego; Ln oznacza grupę mostkową Ln o ogólnym wzorze NHC(O)-(CH2)h-Y-M, w którym M oznacza grupę
fenyleno-CH2, grupę cykloheksylo-CH2, (CH2)2lub (CH2)3, Y oznacza NHC(O), a h oznacza 5; a
Ch oznacza chelator metalu o ogólnym wzorze A1-W-A2-W-A3-W-A4, w którym A1oznacza S,
SH lub S(Pg); A2oznaczaN lub NH; A3oznaczaN lubNH; A4oznacza S, SH lub S(Pg); W oznacza CH2C(O), C(O)CH2 lub grupę o wzorze CH2CH, w którym CH stanowi miejsce przyłączenia
do grupy mostkowej Ln; a Pg oznacza grupę zabezpieczającą ugrupowanie tiolu zdolną do podstawienia radionuklidem, a także jego farmaceutycznie dopuszczalne sole.
Szczególnie korzystne są następujące konkretne związki o wzorze (QLn)dCh:
178 252
19
20
178 252
Nowe znakowane cykliczne pochodne aminokwasowe według wynalazku stanowią związek
kompleksowy cyklicznych pochodnych aminokwasowych o ogólnym wzorze (QLn)dCh, w którym
wszystkie symbole mają wyżej podane znaczenie, i radionuklidu wybranego spośród 99mTc
ewentualnie schelatowanego chelatorem metalu Ch, 99mTcO i 111In.
Te nowe znakowane cykliczne pochodne aminokwasowe według wynalazku, zwane tu
„radiofarmaceutykami według wynalazku”, korzystnie stanowią związki kompleksowe z wyżej
wymienionymi korzystnymi związkami o wzorze (QLn)dCh.
Szczególnie korzystnymi radiofarmaceutykami według wynalazku są następujące związki:
178 252
22
178 252
178 252
23
24
178 252
178 252
25
Stosowane to określenie „C1-C3-alkil” oznacza metyl, etyl, n-propyl lub izopropyl, przy
czym podstawniki alkilowe mogą być jednakowe lub różne.
Radiofarmaceutyki według wynalazku znajdują zastosowanie w sposobie uwidaczniania
miejsc odkładania się płytek u ssaków poprzez obrazowanie, zgodnie z którym ssakowi podaje
się obrazująco skuteczną ilość radiofarmaceutyku według wynalazku, po czym bada się rozmieszczenie i ilość izotopu z użyciem odpowiedniej aparatury.
W radiofarmaceutykach według wynalazku znacznik radioizotopowy może znaleźć się
albo w łańcuchu bocznym związanym z pierścieniowym układem cyklicznej pochodnej aminokwasowej poprzez grupę J, albo w łańcuchu bocznym związanym z pozycją 5 pierścienia fenylowego stanowiącego część ugrupowania kwasu 3-(aminometylo)masłowego wbudowanego
w ten układ pierścieniowy. Gdy d oznacza 2, radionuklid może znajdować się w ugrupowaniu
chelator a metalu pomiędzy dwoma cyklicznymi ugrupowaniami aminokwasowymi.
Związki według wynalazku zawierają centra asymetrii i zakresem wynalazku są objęte
wszelkie postacie chiralne, diastereoizomeryczne i racemiczne tych związków. Związki te mogą
także występować jako izomery ze względu na obecność wiązań podwójnych C=N, izomery
przestrzenne, itd., i wszystkie one są także objęte zakresem wynalazku. Związki według wynalazku można wyodrębniać w postaci optycznie czynnej lub racemicznej. Sposoby wytwarzania
związków optycznie czynnych są dobrze znane i w tym celu stosuje się rozdzielanie racematów
lub syntezę z użyciem optycznie czynnych związków wyjściowych. Znane jest istnienie izomerów cis i trans wiązania peptydowego i obie te postacie mogą występować w przypadku
związków według wynalazku. O ile nie zaznaczono inaczej, ugrupowania J, N-MeArg, Gly i Asp
w cyklicznym układzie aminokwasowym mają izomerię L, jednak istnieje także możliwość
użycia związków o innej izomerii, jak również wszelkich możliwych postaci chiralnych,
diasteroizomerycznych i racemicznych, a także wszelkich izomerów geometrycznych, o ile
specjalnie nie zaznaczone konkretnej stereochemii lub konfiguracji. Izomery D i L poszczegól-
26
178 252
nych aminokwasów oznaczono powszechnie przyjętymi skrótami trzyliterowymi, np. D-Val,
D-Lys lub D-Abu.
Znakowanie nowych cyklicznych pochodnych aminokwasowych prowadzi się z użyciem
znanych sposobów, albo bezpośrednio, to znaczy przez włączenie radionuklidu pierwiastkowego
wprost do związku o wzorze (QLn)dCh, albo pośrednio, to znaczy przez włączenie radionuklidu
juz schelatowanego chelatorem metalu Ch, który to chelator wraz z pierwiastkiem promieniotwórczym zostaje włączony do znakowanego związku, tworząc nierozłączną całość.
Rozróżnia się znakowanie izotopowe lub nieizotopowe, przy czym to pierwsze polega na
zastąpieniu izotopem radioaktywnym grupy obecnej w cząsteczce związku o wzorze (QLn)dCh,
np. grupy Pg, a drugie na wprowadzeniu izotopu radioaktywnego bez zastępowania nim jakiejkolwiek grupy. Zarówno związki znakowane izotopowoja k i związki znakowane nieizotopowo
są objęte definicją znakowanych cyklicznych pochodnych aminokwasowych („radiofarmaceutyków”) według wynalazku. Znakowane związki muszą być trwałe chemicznie i metabolicznie,
zgodnie z obowiązującymi normami.
Znakowanie radionuklidami nie powinno wpływać na właściwą związkom o wzorze
(QLn)dCh zdolność wiązania się z receptorami GP IIa/IIIa, to znaczy powinowactwo i swoistość
wiązania nie powinny ulec pogorszeniu o więcej niż 3, korzystnie o więcej niż 2, a zwłaszcza nie
więcej niż o 1 jednostkę logarytmiczną, przy czym najkorzystniej nie powinny one ulegać żadnym zmianom.
Stosowane w opisie określenie „grupa zabezpieczająca grupę aminową” oznacza dowolną
taką grupę znaną w chemii organicznej, np. grupy wyszczególnione w Greene, „Protective
Groups in Organie Synthesis”, John Wiley & Sons, Nowy Jork (1981) oraz w „The Peptides:
Analysis, Synthesis, Biology, tom 3, Academic Press, Nowy Jork (1981). Przykładowymi grupami zabezpieczającymi grupę aminową są lecz nie wyłącznie, 1) grupy acylowe, np. formyl,
trifluoroacetyl, ftaloil i p-toluenosulfonyl, 2) aromatyczne ugrupowania karbaminianowe, np.
benzyloksykarbonyl (Cbz lub Z) i podstawione grupy benzyloksykarbonylowe, grupa 1-(p-bifenylilo)-1-metyloetoksykarbonylowa i grupa 9-fluorenylometoksykarbonylowa (Fmoc), 3) typ
alifatycznych grup karbaminianowych, takich jak grupa tert-butoksykarbonylowa (Boc), grupa
etoksykarbonylowa, grupa diizopropylometoksykarbonylowa i grupa alliloksykarbonylowa;
4) typ cykloalkilowych grup karbaminianowych, takich jak grupa cyklopentyloksykarbonylowa
i grupa adamantyloksykarbonylowa; 5) typ grup alkilowych, takich jak grupa trifenylometylowa
i grupa benzylowa; 6) typ trialkilosilanu, takiego jak trimetylosilan; oraz 7) typ grup zawierających tiol, takich jak grupa fenylotiokarbonylowa i grupa ditiasukcynoilowa. Określenie „grupa
zabezpieczająca grupę aminową” obejmuje także grupy acylowe takie, jak grupa azydobenzoilowa, grupa p-ben-zoilobenzoilowa, grupa o-benzylobenzoilowa, grupa p-acetylo-benzoilowa, grupa dansylowa, grupa glicylo-p-benzoilobenzo-ilowa, grupa fenylobenzoilowa, grupa
m-benzoilobenzoilowa i grupa benzoilobenzoilowa.
Stosowane w opisie określenie „farmaceutycznie dopuszczalne sole” odnosi się do pochodnych ujawnionych związków, w przypadku których macierzysty związek o wzorze (I) zostaje zmodyfikowany przez utworzenie soli związku o wzorze (I) z kwasami lub zasadami. Do
przykładowych farmaceutyczne dopuszczalnych soli należą, ale bez ograniczania się tylko do
nich, sole z kwasami organicznymi lub mineralnymi ugrupowań zasadowych, takich jak ugrupowania amin; sole reszt kwasowych, takich jak reszty kwasów karboksylowych, z metalami alkalicznymi lub zasadami organicznymi; itp.
Farmaceutycznie dopuszczalne sole związków według wynalazku można wytwarzać w
sposób polegający na poddaniu tych związków w postaci wolnego kwasu lub wolnej zasady reakcji z użytymi w ilości stechiometrycznie zasadą lub kwasem, w środowisku wodnym lub w środowisku rozpuszczalnika organicznego. Na ogół, korzystne okazują się środowiska niewodne,
takie jak eter, octan etylu, etanol, izopropanol lub acetonitryl. Wykazy odpowiednich soli znajdują się w: Remington's Pharmaceutical Sciences, wyd. 17, Mack Publishing Company, Easton,
PA, 1985, str. 1418.
178 252
27
Stosowane w opisie określenie „aminokwas” oznacza związek organiczny zawierający zarówno zasadową grupę aminową, jak i kwasową grupę karboksylową. Określenie to obejmuje
aminokwasy modyfikowane i rzadziej występujące, takie jak aminokwasy ujawnione np. w Roberts i Vellaccio, The Peptides, 5,342-429 (1983). Do aminokwasów modyfikowanych lub rzadziej występujących, które można stosować do wytwarzania związków według wynalazku,
należą (ale bez ograniczania się tylko do nich) D-aminokwasy, hydroksylizyna, 4-hydroksyprolina,
omityna, kwas 2,4-diamino-masłowy, homoarginina, norleucyna, kwas N-metyloaminomasłowy,
naftyloalanina, fenyloglicyna, β-fenyloprolina, tert-leucyna, 4-aminocykloheksyloalanina,
N-metylonorleucyna, 3,4-dehydro-prolina, kwas 4-aminopiperydyno-4-karboksylowy, kwas
6-amino-heksanowy, kwas trans-4-(aminometylo)cykloheksanokarboksylowy, kwas 2-, 3- i
4- (aminometylo)benzoesowy, kwas 1-aminocy-klopentanokarboksylowy, kwas 1-aminocyklopropanokarboksylowy i kwas 2-benzylo-5-aminowalerianowy.
Stosowane w opisie określenie „reszta aminokwasowa” oznacza tę część aminokwasu (j ak
zdefiniowano w opisie), która jest obecna w peptydzie.
Stosowane w opisie określenie „peptyd” oznacza związek liniowy złożony z dwóch, lub
większej liczby aminokwasów (jak zdefiniowano w opisie) połączonych ze sobą wiązaniem
peptydowym. Określenie „peptyd” obejmuje także związki zawierające zarówno ugrupowania
peptydowe jak i niepeptydowe, takie jak ugrupowania pseudopeptydów lub peptydów mimetycznych, albo inne ugrupowania nie będące aminokwasami. Tego rodzaju związek zawierający
zarówno ugrupowania peptydowe jak i niepeptydowe można określić także jako „analog peptydu”.
„Pseudopeptydem” lub „peptydem mimetycznym” jest związek naśladujący strukturę reszty aminokwasowej lub peptydu, np. przez wykorzystanie grup wiążących innych niż wiązania
amidowe pomiędzy peptydem mimetycznym i resztą aminokwasową (wiązania pseudopeptydowe)
i/lub przez wykorzystanie podstawników nieaminokwasowych i/lub reszty modyfikowanego
aminokwasu.
Określenie „reszta pseudopeptydu” oznacza tę część pseudopeptydu lub peptydu mimetycznego (jak zdefiniowano w opisie), która jest obecna w peptydzie.
Określenie „wiązanie peptydowe” oznacza kowalencyjne wiązanie amidowe utworzone
w wyniku utraty cząsteczki wody w reakcji grupy karboksylowej jednego aminokwasu z grupą
aminową drugiego aminokwasu.
Określenie „wiązanie pseudopeptydowe” obejmuje izostery wiązaniapeptydowego, które
można wykorzystać zamiast, lub w zastępstwie, normalnego wiązania amidowego. Takie zastępcze
lub amidowe „równoważne” wiązania tworzone są przez kombinacje atomów normalnie nie
spotykanych w peptydach lub białkach, które naśladują przestrzenne wymagania wiązania
amidowego i które stabilizują cząsteczkę z punktu widzenia rozkładu enzymatycznego.
Określenia „Ln”, „grupa wiążąca” i „grupa mostkowa”, stosowane zamiennie w całym
tekście opisu, oznaczają grupę atomów oddzielających Q od chelatora metalu o symbolu Ch
Określenia „aktywna grupa o symbolu Ln”, „aktywny Ln”, „aktywna grupa mostkowa”
i „aktywny mostek”, stosowane zamiennie w całym tekście opisu, odnosząsię do grupy wiążącej,
obejmującej jedną lub większą liczbę grup aktywnych, zdolnych do reagowania z chelatorem lub
grupą o symbolu Q i tworzenia z nimi wiązań.
Określenia „Ch”, „chelator metalu” i „chelator” stosowane są zamiennie w całym tekście
opisu do oznaczenia ugrupowania chemicznego zdolnego do wiązania się z metalicznym nuklidem lub do tworzenia z nim kompleksu.
Określenie „ugrupowanie cyklizujące” oznacza związek pośredni służący jako prekursor
dla grupy występującej w grupie o symbolu Q.
Określenie „ugrupowanie cyklizujące podstawione w pierścieniu” oznacza ugrupowanie
cyklizujące zawierające podstawnik (podstawniki) w jednym, lub w większej liczbie swych pierścieni karbocyklicznych lub heterocyklicznych.
Określenie „ugrupowanie cyklizujące modyfikowane grupą mostkową” odnosi się do
ugrupowania cyklizującego zawierającego aktywną grupę o symbolu Ln.
28
178 252
Określenie „półprodukt związku cyklicznego” oznacza półprodukt służący jako prekursor
dla grupy o symbolu Q w zastrzeganych związkach.
Określenie „półprodukt związku cyklicznego modyfikowany grupą mostkową” oznacza
prekursor związku cyklicznego zawierający aktywną grupę o symbolu Ln
W opisie stosowano następujące skróty:
Acm
acetamidometyl
D-Abu
kwas D-2-aminomasłowy
5-Aca
5-aminokaproamid (5-aminoheksanoamid)
ADP
adenozynodifosforan
Boc
tert-butoksykarbonyl
Boc-Mamb (kwas)
kwas tert-butoksykarbonylo-3 -amino-metylobenzoesowy
Boc-ON
[2-(tert-butoksykarbonyloksyloimino)-2-fenyloacetonitryl]
BOP-Cl
chlorek bis(2-okso-3-oksazolidynylo)fosfiny
dichlorobenzyl
Cl2Bzl
CBZ, Cbz lub Z
karbobenzyloksy
dicykloheksylokarbodiimid
DCC
spektroskopia masowa z bezpośrednią jonizacją chemiczną
DCI-MS
diizopropyloetyloamina
DIEA
spektroskopia masowa z elektrorozpylaniem
ESI-MS
4-dimetyloaminopirydyna
DMAP
heksafluorofosforan 2-( 1H-benzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrameHBTU
tylouroniowy
stała dysocjacji
Kd
N-[4-karboksybenzylo]-N,N'-bis(merkaptoetylo)glicynamid
MAMA
ester etylowy N-merkaptoetyloaminoacetylo-L-cysteiny
MA-MAMA
NMeArg lub MeArg a-N-mety loarginina
kwas a-N-metyloasparaginowy
NMeAsp
NMeGly lub MeGly N-metyloglicyna
kwas N-metylo-3-aminometylobenzoesowy
NMe-Mamb
N -metylomorfolina
NMM
O-cykloheksyl
OcHex
O-benzyl
OBzl
O-sukcynoimidyl
OSu
tetrafluoroboran 2-(1H-benzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetraTBTU
metylouroniowy
2-(trimetylosililo)etyloksykarbonyl
Teoc
tosyl
Tos
trifenylometyl
Tr
karbodiimid rozpuszczalny w wodzie
WSCD
W opisie stosowano następujące, powszechnie przyjęte trzyliterowe skróty nazw aminokwasów, natomiast nie stosowano jednoliterowych skrótów nazw aminokwasów.
- alanina
Ala
= arginina
Arg
= asparagina
Asn
= kwas asparaginowy
Asp
= cysteina
Cys
= glicyna
Gly
= izoleucyna
Ile
= leucyna
Leu
= lizyna
Lys
= norleucyna
Nle
- fenyloalanina
Phe
178 252
29
Phg
= fenyloglicyna
Pro
= prolina
Ser
= seryna
Tyr
= tyrozyna
Val
- walina
Związki według wynalazku można syntetyzować z zastosowaniem typowych metod syntezy znanych fachowcom. Do korzystnych metod należą, ale bez ograniczania się tylko do nich,
metody opisane poniżej.
Ogólnie, peptydy wydłuża się przez odblokowanie α-aminy reszty C-końcowej i sprzęgnięcia następnego, odpowiednio zabezpieczonego aminokwasu poprzez wiązanie peptydowe
przy użyciu opisanych metod. Ten sposób postępowania obejmujący odblokowanie i sprzęganie
powtarza się tak długo, aż uzyska się pożądaną sekwencję. Sprzęgnięcia tego można wykonać
z udziałem składowych aminokwasów w sposób stopniowy, albo na drodze kondensacji fragmentów (od dwóch do kilku aminokwasów), albo za pomocą kombinacji obydwu procesów,
albo na drodze syntezy peptydów w fazie stałej, według metody pierwotnie opisanej przez Merrifielda [J. Am. Chem. Soc., 85, 2149-2154 (1963)].
Związki według wynalazku można także syntetyzować przy użyciu zautomatyzowanego
urządzenia do syntezy peptydów. Ponadto, sposoby postępowania przy syntezie peptydów
opisane są w: Steward i Young, „Solid Phase Peptide Synthesis”, wyd. 2, Pierce Chemical Co.,
Rockford, IL (1984); Gross, Meienhofer, Udenfriend, (red.), „The Peptides. Analysis, Synthesis,
Biology”, tom 1, 2, 3, 5 i 9, Academic Press, New York (1980-1987); Bodanszky, „Peptide
Chemistry. A. Practical Textbook”, Springer-Verlag, New York (1988); oraz Bodanszky i in.,
„The Practice of Peptide Synthesis”, Springer-Verlag, New York (1984).
Sprzęgnięcie zachodzące między dwiema pochodnymi aminokwasów, między aminokwasem i peptydem, między dwoma fragmentami peptydów lub na drodze cyklizacji peptydu, można
przeprowadzić z zastosowaniem typowych metod sprzęgania, takich jak metoda azydkowa, metoda mieszanych bezwodników kwasów karboksylowych (chloromrówczan izobutylu), metoda
karbodiimidowa (dicykloheksylokarbodiimid, diizopropylokarbodiimid lub rozpuszczalne w
wodzie karbodiimidy), metoda aktywnego estru (ester p-nitrofenylowy, imidoester N-hydroksysukcynylowy), metoda z użyciem odczynnika K, Woodwarda, metoda karbonylodiimidazolowa
i metoda z użyciem odczynników fosforowych, takich jak BOP-C1 lub metoda utlenienia-redukcji. Niektóre z tych metod (zwłaszcza metodę karbodiimidową) można polepszyć przez dodanie
1-hydroksybenzotriazolu. Tego rodzaju reakcje sprzęgania można przeprowadzić albo w roztworze (w fazie ciekłej), albo w fazie stałej. Grupy funkcyjne składowych aminokwasów muszą
być zabezpieczone w trakcie przeprowadzania reakcji sprzęgania, a to w celu uniknięcia tworzenia się niepożądanych wiązań. Grupy zabezpieczające, których można użyć w tym przypadku,
wyszczególnione są w: Greene, „Protective Groups in Organie Synthesis”, John Wiley & Sons,
New York (1981), oraz w: „The Peptides. Analysis, Synthesis, Biology, tom 3, Acadamic Press,
New York (1981).
Grupę α-karboksylową reszty C-końcowej zazwyczaj zabezpiecza się przez utworzenie
estru, który można odszczepić, w wyniku czego otrzymuje się kwas karboksylowy. Do tego rodzaju grup zabezpieczających należą: 1) estry alkilowe, takie jak ester metylowy i tert-butylowy,
2)estry arylowe, takie jak ester benzylowy i podstawiony benzylowy, albo 3) estry dające się odszczepić przez podziałanie słabą zasadą lub słabym środkiem redukującym, takie jak ester trichloroetylowy i ester fenacylowy. W przypadku syntezy w fazie stałej, C-końcowy aminokwas
zostaje związany z nierozpuszczalnym nośnikiem (zazwyczaj polistyrenowym). Nośniki nierozpuszczalne tego rodzaju zawierajągrupę, która reaguje z grupą karboksylową, z utworzeniem
wiązania, wykazującego stabilność w warunkach wydłużania peptydu, ale które później łatwo
ulega rozszczepieniu. Przykładowymi takimi nośnikami są: żywica oksymowa [DeGrado i Kaiser, J. Org. Chem., 45, 1295-1300 (1980)], żywica chloro- lub bromometylowa, żywica hydroksymetylowa i żywica aminometylowa. Wiele z tych żywic jest dostępnych w handlu i to już z
włączonym pożądanym aminokwasem C-końcowym.
30
178 252
Grupa α-aminowa każdego aminokwasu musi być zabezpieczona. Można w tym przypadku użyć jakiejkolwiek grupy zabezpieczającej znanej w tej dziedzinie techniki. Przykładowymi
tego rodzaju grupami są: 1) typ grup acylowych, takich jak grupa formylowa, trifluoroacetylowa,
ftalilowa i p-toluenosulfonowa; 2) typ grup tworzących aromatyczne karbaminiany, takich jak
grupa benzyloksykarbonylowa (Cbz) i podstawione grupy benzyloksykarbonylowe, grupa
1-(p-bifenylo)-1-metyloetoksykarbonylową i grupa 9-fluorenylornetyloksykarbonylowa
(Fmoc); 3) typ grup tworzących alifatyczne karbaminiany, takich jak grupa tert-butoksykarbonylowa (Boc), grupa etoksykarbonylowa, grupa diizopropylometoksykarbonylowa i grupa
alliloksykarbonylowa; 4) typ grup tworzących cykloalkilowe grupy karbaminianowe, takich jak
grupa cyklopentyloksykarbonylowa i grupa adamantyloksykarbonylowa; 5) typ grup alkilowych, takich jak grupa trifenylometylowa i grupa benzylowa; 6) typ trialkilosilanu, takiego jak
trimetylosilan; oraz 7) typ grup zawierających tiol, takich jak grupa fenylotiokarbonylowa i
grupa ditiasukcynoilowa. Korzystną grupą zabezpieczającą grupę aminową jest albo Boc,
albo Fmoc. W handlu dostępnych jest wiele pochodnych aminokwasów odpowiednio zabezpieczonych, nadających się do syntezy peptydów.
Grupa zabezpieczająca grupęa-aminowązostaje odszczepiona przed sprzęgnięciem następnego aminokwasu. W przypadku użycia grupy Boc, metodami z wyboru są: metoda z użyciem
kwasu trifluorooctowego, samego lub w dichlorometanie, albo metoda z użyciem HCl w dioksanie. Następnie, utworzoną tak sól amoniową zobojętnia się albo przed przeprowadzeniem sprzęgania, albo in situ przy użyciu roztworów zasadowych takich, jak wodne bufory, lub aminy
trzeciorzędowe w dichlorometanie lub dimetyloformamidzie. W przypadku użycia grupy Fmoc,
odczynnikami z wyboru są: piperydyna lub podstawiona piperydyna w dimetyloformamidzie,
jednakże można użyć jakiejkolwiek aminy drugorzędowej lub wodnych roztworów zasadowych.
Odblokowania dokonuje się w temperaturze w zakresie od 0° do temperatury pokojowej.
Wszystkie aminokwasy z grupami funkcyjnymi w łańcuchach bocznych muszą być zabezpieczone podczas syntezy peptydu i dokonuje się tego przy użyciu grup zabezpieczających powyżej wyszczególnionych. Fachowcy zdadzą sobie sprawę z tego, że wybór i wykorzystanie
odpowiednich grup zabezpieczających tego rodzaju grupy funkcyjne w łańcuchach bocznych zależeć będzie od rodzaju aminokwasu i obecności innych grup zabezpieczających w peptydzie.
Dobranie odpowiedniej tego rodzaju grupy zabezpieczającej jest ważne z tego powodu, że nie
może ona być usunięta w trakcie odblokowywania i sprzęgania grupy α-aminowej. I tak np. w
przypadku wybrania Boc do zabezpieczenia α-aminy, dopuszczalne jest użycie następujących
grup zabezpieczających: w przypadku argininy ugrupowania p-toluenosulfonylowe (tosyl) i grupa nitrowa; w przypadku lizyny podstawione grupy beznyloksykarbonylowe, grupa tosylowa i
grupa trifluoroacetylowa; w przypadku kwasu glutaminowego i kwasu asparaginowego estry
benzylowe lub alkilowe, takie jak ester cyklopentylowy; w przypadku seiyny i treoniny etery
benzylowe; w przypadku tyrozyny etery benzylowe, podstawione etery benzylowe lub grupa 2bromobenzyloksykarbonylowa; w przypadku cysteiny grupa p-metylobenzylowa, grupa p-metoksybenzylowa, grupa acetamidometylowa, grupa benzylowa lub grupa tert-butylosulfonylowa, indol w tryptofanie może pozostać niezabezpieczony, względnie można go zabezpieczyć
przy użyciu grupy formylowej.
W przypadku wybrania Fmoc do zabezpieczenia grupy aminowej, zazwyczaj nadają się do
przyjęcia grupy zabezpieczające oparte na tert-butylu. I tak np. w przypadku lizyny można użyć
Boc, w przypadku seryny, treoniny i tyrozyny eteru tert-butylowego, a w przypadku kwasu glutaminowego i kwasu asparaginowego estru tert-butylowego.
Po zakończeniu wydłużania i cyklizacji peptydu, wszystkie grupy zabezpieczające usuwa
się. W przypadku syntezy prowadzonej w fazie ciekłej, grupy zabezpieczające usuwa się w jakikolwiek sposób podyktowany wyborem danej grupy zabezpieczającej. Takie sposoby postępowania są dobrze znane fachowcom. W przypadku syntezy w fazie stałej, peptyd powinien być
usunięty z żywicy bez jednoczesnego usunięcia grup zabezpieczających grupy funkcyjne, które
mogłyby przeszkadzać w procesie cyklizacji. I tak, jeżeli cyklizację peptydu ma się przeprowadzić w roztworze, warunki odszczepienia należy tak dobrać, aby doszło do utworzenia wolnej
178 252
31
grupy a-karboksylanowej i wolnej grupy a-aminowej, bez jednoczesnego usunięcia innych grup
zabezpieczających. Alternatywnie, peptyd można usunąć z żywicy na drodze hydrazynolizy, po
czym poddać go sprzęganiu metodąazydkową. Inna, bardzo dogodna metoda, polega na przeprowadzeniu syntezy peptydów na żywicy oksymowej, po której następuje wewnątrzcząsteczkowe
nukleofilowe wyparcie z żywicy, w wyniku czego powstaje cykliczny peptyd [Osapay, Profit i
Taylor, Tetrahedron Letters, 43,6121 -6124 (1990)]. W przypadku użycia żywicy oksymowej, na
ogół wybiera się schemat zabezpieczania z udziałem Boc. Tak więc, korzystny sposób usuwania
grup zabezpieczających łańcuch boczny obejmuje, ogólnie, obróbkę przy użyciu bezwodnego
HF zawierającego dodatki, takie jak sulfid dimetylowy, anizol, tioanizol lub p-krezol w temperaturze 0°C. Odszczepienia peptydu można dokonać także przy użyciu innych odczynników kwaśnych, takich jak mieszaniny kwasu trifluorometanosulfonowego i kwasu trifluorooctowego.
Rzadziej spotykane aminokwasy, stosowane do wytwarzania związków według wynalazku, można syntetyzować z wykorzystaniem metod typowych, znanych fachowcom [„The Peptides: Analysis, Synthesis, Biology, tom 5, str. 342-449, Academic Press, New York (1981)].
N-alkiloaminokwasy można wytworzyć z wykorzystaniem sposobów postępowania poprzednio
opisanych [Cheung i in., Can. J. Chem., 55, 906 (1977); Freidinger i in., J. Org. Chem., 48, 77
(1982)].
Pochodne kwasu Boc-aminometylobenzoesowego użyteczne jako ugrupowania cyklizujące w syntezie związków według wynalazku, wytwarza się z zastosowaniem typowych sposobów postępowania, np. takich, jakie opisano w: Tett. Lett., 4393 (1975); H.O. House, Modem
Synthetic Reactions (1972); lub Harting i in., J. Am. Chem. Soc., 50,3370 (1928), jak to przedstawiono na schemacie 1.
Schemat 1
Kwasy tert-butoksykarbonylo-3-aminofenylooctowe, użyteczne jako związki pośrednie w
syntezie związków według wynalazku, wytwarza się z zastosowaniem typowych sposobów postępowania, np. takich, jakie opisano w: Collman i Groh, J. Am. Chem. Soc., 104 (1391) (1982),
jak to przedstawiono na schemacie 2.
Schemat 2
Kwas 1-aminometylobenzoesowy. HCl i kwas 2-aminometylofenylooctowy. HCl,
użyteczne jako związki pośrednie w syntezie związków według wynalazku, wytwarza się
z zastosowaniem typowych sposobów postępowania, np. takich, jakie opisano w: Naito
i in., J. Antibiotics, 30,698 (1977) lub Young i Sweet, J. Am. Chem. Soc., 80,800 (1958), jak to
przedstawiono na schemacie 3.
32
178 252
TMSN3 - azydek trimetylosililu
Syntezy cyklicznych związków pośrednich można dokonać zgodnie ze sposobami postępowania opisanymi przez Moshera i in. [Tett. Lett., 29, 3183-3186] i jak to przedstawiono na
schemacie 4. Ten sam sposób postępowania stanowi, na ogół, użyteczną metodę przekształcania
aminy pierwszorzędowej w guanidynową grupę funkcyjną.
Schemat 4
Syntezę pewnych cyklicznych związków pośrednich przedstawiono na schemacie 5.
Schemat 5
178 252
33
Cykliczne związki pośrednie można również wytwarzać z zastosowaniem innych typowych sposobów postępowania, np. tak jak to opisano w: Garigipati, Tett. Lett., 31, 1969-1972
(1990) oraz w kanadyjskim opisie patentowym nr 2008311 i jak przedstawiono na schemacie 6.
Grupę kwasu asparaginowego można zabezpieczyć (np. zabezpieczającą grupą fenacylową) w
celu uniknięcia zachodzenia reakcji ubocznych.
Schemat 6
34
178 252
Cykliczne związki pośrednie o poniższym wzorze
w którym oznacza grupę 2-propylową, etylową lub p-hydroksyfenylometylową, a X2
oznacza H, czyli: cyklo(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-CH2NHX2), cyklo(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-CH2NHX2) i cyklo(D-Tyr-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-CH2NHX2) można
wytworzyć z wykorzystaniem sposobów opisanych powyżej przy użyciu podstawionego w pierścieniu ugrupowania cyklizującego, w którym Y oznacza CH2NH2.
Poniżej omówiono syntezę pewnych cyklicznych związków pośrednich. Są to związki pośrednie służące jako prekursory grupy o symbolu Q w związkach o wzorze (QLn)dCh. Związki te
można bezpośrednio znakować izotopami radioaktywnymi, albo można poddać modyfikacji
przez przyłączenie grupy wiążącej (grup wiążących) i chelatora (chelatorów).
Kwas tert-butoksykarbonylo-3-aminometylobenzoesowy (Boc-Mamb) sprzęga się z żywicą oksymowąz zastosowaniem modyfikacji metody opisanej przez DeGrado i Kaisera [J. Org.
Chem., 45,1295 (1980)], przy użyciu 1 równoważnika kwasu 3-aminometylobenzoesowego (w
odniesieniu do poziomu podstawienia żywicy), 1 równoważnika HBTU i 3 równoważników
NMM. Alternatywnie, Boc-Mamb (1 równoważnik) można poddać sprzęganiu z żywicą oksymową przy użyciu 1 równoważnika tak DCC jak i DMAP w środowisku chlorku metylenu. Czas
sprzęgania mieści się w zakresie od 15 do 96 godzin. Następnie oznacza się poziom podstawienia, z zastosowaniem albo testu z użyciem kwasu pikrynowego [Sarin, Kent, Tam i Merrifiels,
Anal. Biochem., 117, 145-157 (1981)], albo ilościowej metody ninhydrynowej [Gisin, Anal.
Chim. Acta, 58, 248-249 (1972)]. Nieprzereagowane grupy oksymowe zostają zablokowane
przy użyciu 0,5 M chlorku trimetyloacetylu/0,5 M diizopropyloaminy w DMF w ciągu 2 godzin.
Odblokowania grup zabezpieczających Boc dokonuje się przy użyciu 25% TFA w DCM w ciągu
30 minut. Pozostałe aminokwasy lub pochodne aminokwasów sprzęga się przy użyciu od dwukrotnego do dziesięciokrotnego nadmiaru (w przeliczeniu na wsad pierwszego aminokwasu lub
pochodnej aminokwasu) odpowiedniego aminokwasu lub pochodnych aminokwasu i HBTU w
środowisku około 8 ml DMF. Następnie zobojętnia się żywicę in situ przy użyciu 3 równoważników NMM (w przeliczeniu na ilość użytego aminokwasu). Czas sprzęgania mieści się w zakresie
od 1 godziny do kilku dni. Całkowitość sprzęgnięcia kontroluje się z zastosowaniem jakościowej
metody ninhydrynowej lub metody z użyciem kwasu pikrynowego w przypadku, gdy aminokwas sprzęgany był z aminą drugorzędową. W oparciu o uzyskane tak wyniki, aminokwasy poddaje się, jeżeli jest to potrzebne, powtórnemu sprzęganiu.
Po złożeniu liniowego peptydu usuwa się N-końcową grupę Boc przez podziałanie 25%
TFA w DCM w ciągu 30 minut. Następnie żywicę zobojętnia się przez podziałanie 10% DIEA
w DCM. Cyklizacji z jednoczesnym odszczepieniem peptydu dokonuje się z zastosowaniem metody, którą podali Osapay i Taylor [J. Am. Chem. Soc., 112, 6046 (1990)], przez zawieszenie
178 252
35
żywicy w DMF użytym w ilości około 10 ml/g, dodanie 1 równoważnika HO Ac (w przeliczeniu
na wsad pierwszego aminokwasu) i mieszanie w temperaturze 50-60°C w ciągu 60-72 godzin. Po
przesączeniu przez lejek z filtrem ze spiekanego szkła, otrzymany przesącz DMF odparowuje
się, pozostałość rozpuszcza w HOAc lub mieszaninie acetonitrylu i wody 1:1 i liofilizuje, w wyniku czego otrzymuje się zabezpieczony produkt cykliczny. Alternatywnie, wytworzony produkt
można rozpuścić w metanolu i wytrącić eterem, w wyniku czego otrzymuje się zabezpieczony
produkt cykliczny. Poddaje się go następnie działaniu (przeprowadzonemu z zastosowaniem typowych sposobów postępowania) bezwodnego fluorowodoru [Stewart i Young, „Solid Phase Peptide Synthesis”, wyd. 2, Pierce Chemical Co., 85 (1984)] zawierającego 1 ml/g m-krezolu lub
anizolu jako akceptora rodników, w temperaturze 0°C, w ciągu 20-60 minut, w celu usunięcia
grup zabezpieczających łańcuchy boczne. Tak otrzymany produkt surowy można poddać oczyszczaniu metodą HPLC z odwróconymi fazami przy użyciu 2,5 cm preparatywnej kolumny
Vydac Cl 8, przy liniowym gradiencie acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA, w wyniku czego
otrzymuje się czysty produkt cykliczny.
W syntezach tych użyć można następujących N-α-Boc-zabezpieczonych aminokwasów:
Boc-Arg(Tos), Boc-N-a-MeArg(Tos), Boc-Gly, Boc-Asp(OcHex), kwas Boc-3-aminometylo-4-jodobenzoesowy, Boc-D-Ile, Boc-NMeAsp-(OcHex), Boc-NMe-Mamb, Boc-D-Phg,
Boc-D-Asp(OBzl), Boc-L-Asp(OcHex), Boc-a-Me-Asp(OcHex), Boc-bMe-Asp(OcHex),
Boc-L-Ala, Boc-L-Pro, Boc-D-Nle, Boc-D-Leu, Boc-D-Val, kwas Boc-D-2-aminomasłowy
(Boc-D-Abu), Boc-Phe, Boc-D-Ser(Bzl), Boc-D-Ala, kwas Boc-3-aminometylobenzoesowy
(Boc-Mamb), Boc-D-Lys (2-C1Z), Boc-p-Ala, Boc-D-Pro, Boc-D-Phe, Boc-D-Tyr(Cl2Bzl),
Boc-Nme-Amf(CBZ), kwas Boc-aminotetralinokarboksylowy, kwas Boc-aminometylonaftoesowy, kwas Boc-4-aminometylobenzoesowy lub Boc-NMeGly.
Korzystnymi N-α-Boc-zabezpieczonymi aminokwasami użytecznymi w omawianych
syntezach są: Boc-Arg(Tos), Boc-N-\α-MeArg(Tos), Boc-Gly, Boc-Asp(OcHex), Boc-D-Leu,
Boc-D-Val, kwas Boc-D-2-aminomasłowy (Boc-D-Abu), Boc-Phe, Boc-D-Ser(Bz1), Boc-D-Ala,
kwas Boc-3-aminometylobenzoesowy (Boc-Mamb), Boc-D-Lys(2-ClZ), Boc-Ala, Boc-D-Pro
lub Boc-NMeGly.
Cykliczne związki pośrednie modyfikowane grupą mostkową można syntetyzować albo
przez włączenie odpowiednio zabezpieczonej grupy mostkowej do ugrupowania cyklizującego,
z następującym po tym wytworzeniem cyklicznego związku pośredniego modyfikowanego
grupą mostkową, albo przez przyłączenie grupy mostkowej do cyklicznego związku pośredniego.
Modyfikowane grupą mostkową ugrupowania cyklizujące można syntetyzować albo poprzez przyłączenie grupy mostkowej do podstawionego w pierścieniu ugrupowania cyklizującego wytworzonego sposobem powyżej opisanym, albo przez włączenie odpowiednio
zabezpieczonej grupy mostkowej w tok syntezy ugrupowania cyklizującego.
Grupę mostkową można przyłączyć do podstawionego w pierścieniu ugrupowania cyklizującego, w którym Y oznacza NH2. Jak to uwidoczniono na schemacie 7, w rezultacie zhydrolizowania estru metylowego Boc-zabezpieczonego estru metylowego kwasu 3-aminometylo-5-ami nobenzoesowego w łagodnych warunkach zasadowych, z następującą po tym obróbką z udziałem
akrylanu benzylu (Lancaster Synthesis, In.) i kwasu octowego jako katalizatora, otrzymuje się produkt addycji Michaela. Nawet pomimo tego, że to modyfikowane grupą mostkową ugrupowanie
cyklizujące zawiera niezabezpieczoną aminę drugorzędową, może ono być użyte bezpośrednio
w syntezie w fazie stałej. Jednakże, jeżeli jest to pożądane, można przeprowadzić zabezpieczenie
grupy aminowej przez podziałanie chloromrówczanem benzylu i słabą zasadą.
Schemat 7
36
178 252
Grupę mostkową można także włączyć w tok syntezy ugrupowań cyklizujących, jak w przypadku syntezy modyfikowanego grupą mostkową ugrupowania cyklizującego 5-Aca-Mamb opisanej w przykładach.
Na schemacie 8 pokazano, jak można zsyntetyzować także grupę mostkową przyłączoną
do ugrupowania cyklizującego poprzez przeciwną amidową grupę fiinkcyjną. W wyniku redukcji grupy nitrowej estru monometylowego kwasu 3-nitroizoftalowego (Flu-ka) przy użyciu
katalizatora palladowego na węglu, otrzymuje się ester monometylowy kwasu 3-aminoizofitalowego, który można przekształcić w odpowiedni nitryl metodą Sandmayera. Reakcja wspomnianego estru, z mono-zabezpieczoną diaminą prowadzi do otrzymania odpowiedniego amidu.
Grupa zabezpieczająca diaminy musi wytrzymywać warunki uwodornienia. Na schemacie uwidoczniono użycie Teoc (grupy 2-trimetylosililoetoksykarbonylowej), ale dla fachowca będzie
rzeczą oczywistą zastosowanie w tym przypadku także i innych grup zabezpieczających. Po redukcji nitrylu przy użyciu katalizatora palladowego na węglu otrzymuje się modyfikowane
grupą mostkową ugrupowanie cyklizujące.
Schemat 8
178 252
37
Grupy mostkowe przyłączone w pozycji Y podstawionych w pierścieniu ugrupowań cyklizujących poprzez wiązanie eterowe można syntetyzować z zastosowaniem jako związku
wyjściowego kwasu 3-hydroksy-5-aminobenzoesowego. Do przekształcenia aminy w kwas
3-hydroksy-5-cyjanobenzoesowy wykorzystać można reakcję Sandmeyera. Grupa mostkowa
wprowadzona zostaje za pomocą alkilowaniajak wyżej. W wyniku redukcji nitrylu z zastosowaniem katalizatora palladowego na węglu otrzymuje się grupę aminometylową. Zabezpieczenie
grupy aminowej grupą Boc przy użyciu diwęglanu di-tert-butylu zapewnia uzyskanie modyfikowanych grupą mostkową ugrupowań cyklizujących gotowych do użycia w syntezie w fazie
stałej. Pokazano to na schemacie 9.
Schemat 9
Grupy mostkowe kończące się na grupie karboksylowej można syntetyzować z zastosowaniem bezwodników cyklicznych. Schemat 10 objaśnia tego rodzaju syntezę z użyciem
bezwodnika bursztynowego. Reakcja zabezpieczonego grupą Boc estru metylowego kwasu
3-aminometylo-5-aminobenzoesowego z bezwodnikiem bursztynowym prowadzi do otrzymania grupy mostkowej jako kwasu karboksylowego. Po zaktywowaniu kwasu karboksylowego i
kondensacji z karbazanem benzylu (Lancaster Synthesis, Inc.) otrzymuje się zabezpieczony hydrazyd. Hydrazyd ten służy do zabezpieczania kwasu karboksylowego w dalszej części syntezy.
38
178 252
Po hydrolizie estru metylowego otrzymuje się modyfikowane grupą mostkową ugrupowanie
cyklizujące w postaci gotowej do użycia w syntezie w fazie stałej. Po doprowadzeniu syntezy
do końca, usunięcie grupy zabezpieczającej Cbz z hydrazydu otwiera drogę do wytworzenia
azydku i sprzęgnięcia azydku z chelatorem [Hofmann, Magee i Lindenmann, J. Amer. Chem.
Soc., 72, 2814 (1950)]. Przedstawiono to na schemacie 10.
Schemat 10
Sposób wytwarzania grupy mostkowej wywodzącej się z glikolu tetraetylenowego, powyżej omówiony, jest przedstawiony na schemacie 11. Synteza rozpoczyna się od 1-amino-11 -azydo-3,6,9-trioksaundekanu [Bertozzi i Bednarski, J. Org. Chem., 4326-4329 (1990)]. W wyniku
redukcji azydku z udziałem katalizatora palladowego na węglu otrzymuje się aminę, która jest
zabezpieczona grupą Cbz (oznaczonąsymbolem „Z” na schemacie 11 i w dalszym ciągu opisu).
Następnie alkohol zostaje przekształcony w p-toluenosulfonian przy użyciu chlorku toluenosulfonylu i zasady.
Schemat 11
178 252
39
Na następnym schemacie pokazano drugi typ grupy mostkowej złożonej z jednostek glikolu
etylenowego. Taka grupa mostkowa zawiera na jednym swym końcu grupę karboksylową, co
umożliwia mu przyłączanie się do ugrupowań cyklizujących zawierających aminowe grupy
funkcyjne. Synteza rozpoczyna się od opisanego powyżej aminoalkoholu zabezpieczonego
grupą Cbz. Reakcja alkoholu z diazooctanem etylu i dimerem octanu rodu (II) prowadzi do otrzymania estru kwasu ε-glikolowego z „ogonem” glikolu tetraetylenowego. Po hydrolizie estru
etylowego otrzymuje się grupę mostkową gotową do sprzężenia z ugrupowaniem cyklizującym.
Przedstawiono to na schemacie 12.
Schemat 12
Jak powyżej wskazano, tych modyfikowanych grupą mostkową ugrupowań cyklizujących
używać można do syntetyzowania modyfikowanych grupą mostkową cyklicznych związków
pośrednich.
Grupy mostkowe można także przyłączyć do cyklicznych związków pośrednich, jak to
opisano w przykładach.
Szereg różnych modyfikowanych grupą mostkową związków cyklicznych można syntetyzować przy użyciu dwufunkcyjnych odczynników sieciujących, opracowanych w celu otrzymywania pochodnych białek. Odczynniki te składają się z dwu grup elektrofilowych, takich jak
aktywne estry lub izocyjaniany, rozdzielonych elementem dystansującym. Odczynniki te mogą
być odczynnikami homodwufunkcyjnymi, co oznacza, że obie grupy aktywne są takie same, albo
odczynnikami heterodwufunkcyjnymi. Elementem dystansującym może być grupa alifatyczna
lub aromatyczna i może zawierać dodatkową grupę funkcyjną w celu modyfikowania lipofilowości koniugatów, lub w celu umożliwiania rozszczepiania łańcucha. Poniżej objaśniono zastosowanie szeregu dostępnych w handlu odczynników sieciujących przy użyciu jako związku
wyjściowego cyklicznego związku pośredniego wytworzonego z udziałem jednostki 4-aminometylo-Mamb.
Przykładowo, związek cykliczny zadaje się nadmiarem DSS (heksanodikarboksylan disukcynyloimidylu, Pierce Chemical Co.) w środowisku wodnym albo rozpuszczalnika organicznego, przy pH w zakresie od 7 do 9. Są to typowe warunki reakcji w przypadku omawianych
odczynników sieciujących. Nadmiar takiego odczynnika sieciującego minimalizuje ilość utworzonego dimerycznego związku chemicznego. Zakres pH 7-9 umożliwia grupie aminowej przereagować z racjonalną szybkością ale bez znaczniejszej hydrolizy drugiej grupy aktywnej i
zapobiega reakcji z grupą guanidynowąargininy. Aktywny ester na końcu grupy mostkowej jest
w dostatecznym stopniu stabilny, aby możliwe było dokonanie oczyszczenia metodą HPLC lub
chromatografii rzutowej. Po przeprowadzeniu oczyszczania, modyfikowany grupą mostkową
związek cykliczny można skoniugować z chelatorem zawierającym grupę nukleofilową, takąjak
grupa aminowa lub tiolowa. Przedstawiono to na schemacie 13.
40
178 252
Schemat 13
Odczynniki heterodwufunkcyjne stosuje się, typowo, do uzyskiwania bardzo wybiórczej
aktywacji peptydów i białek. Na przykład można stosować SMPB (4-(p-maleimidofenylo)-maślan sukcynoimidylu, Pierce Chemical Co.) do modyfikowania zawierającego grupę aminową
związku cyklicznego i przygotowania go do sprzęgania z chelatorem zawierającym grupę tiolową. Reakcja związku cyklicznego z SMPB w łagodnych warunkach zasadowych prowadzi do
otrzymania modyfikowanego grupą mostkową związku cyklicznego, w którym grupa mostkowa
kończy się grupą maleimidową. Wybiórczość uzyskuje się dlatego, że grupa maleimidowa przejawia niższą reaktywność w stosunku do grup aminowych i zminimalizowana jest dimeryzacja.
Po dokonaniu oczyszczenia, grupę maleimidową można sprzęgnąć z chelatorem zawierającym
grupę tiolową. Przedstawiono to na schemacie 14.
Schemat 14
Grupy mostkowe zawierające wewnętrzne grupy funkcyjne można wytworzyć przy
użyciu odczynników pokazanych na schemacie 15. EGS (bis(sukcynoimidylosukcynoimi-
178 252
41
dan glikolu etylenowego); Sigma Chemical Co.) jest estrem bis-sukcynoimidylowym, który
reaguje preferencyjnie z aminami. 3,3'-Ditiobispropionoimidan dimetylu (DTBP, nazywany także odczynnikiem Wanga i Richardsa; Pierce Chemical Co.) także w sposób preferencyjny reaguje z aminami. Disulfid zostaje rozszczepiony przez tiole. Meares i współpracownicy wykazali
[Int. J. Cancer, Supplement, 2,99-102 (1988)], że znakowane 111In koniugaty przeciwciało-chelat połączone grupą mostkową zawierającą ugrupowanie disulfidu, szybciej zapewniają klirens
radioaktywność w przypadku myszy niż czyniąto koniugaty, które nie zawierająrozszczepialnej
grupy mostkowej. Schemat 15 ilustruje zastosowanie BSOCOES (sulfon bis[2-(sukcynoimidooksykarbonyloksy)etylowy], Pierce Chemical Co., homodwufunkcyjny odczynnik sieciujący zawierający wewnętrzną grupę sulfonową). Odczynnik ten przy koniugowaniu z aminą
wytwarza grupę karbaminianową.
Schemat 15
Schemat 16 objaśnia zastosowanie bisizocyjanianów i bisizotiocyjanianów do wytwarzania modyfikowanych grupą mostkową związków cyklicznych. Odczynniki te reagują z aminami
z utworzeniem, odpowiednio, grup mocznikowych lub tiomocznikowych. Odczynników tych
używa się w nadmiarze w celu zminimalizowania tworzenia się dimerów. Grupy izocyjanianowe
i izotiocyjanianowe na końcu grup mostkowych są w wystarczającym stopniu stabilne, aby umożliwić przeprowadzenie oczyszczania produktów.
42
178 252
można wytworzyć na drodze reakcji cyklo(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) z boc-Tyr-OSu w środowisku rozpuszczalnika takiego jak DMF w obecności zasady, takiej jak trietyloamina, z następującym potem odblokowaniem.
Modyfikowany grupą mostkową związek cykliczny, cyklo((N-ε-(4-aminofenyloacetylo)-D-Lys)-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)
178 252
43
można wytworzyć na drodze reakcji cyklo(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) z fmoc-4-aminofenylooctanem sukcynoimidylu w środowisku rozpuszczalnika takiego jak DMF w
obecności zasady, takiej jak trietyloamina, z następującym potem odblokowaniem.
Modyfikowany grupą mostkową związek cykliczny, cyklo((N-ε-(4-amino-2-hydroksybenzoilo)-D-Lys)-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)
można wytworzyć na drodze reakcji cyklo(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) z 4-amino2-hydroksybenzoesanem sukcynoimidylu, w środowisku rozpuszczalnika takiego jak DMF lub
THF, w obecności zasady, takiej jak trietyloamina.
Do wytwarzania radiofarmaceutyków według wynalazku stosuje się nowe odczynniki.
Odczynniki te złożone są z chelatora, o symbolu Ch, połączonego poprzez grupę mostkową
o symbolu L, z cyklicznym związkiem pośrednim, o symbolu Q. Odczynniki takie można syntetyzować rozmaitymi sposobami, albo za pomocą przyłączenia chelatora do modyfikowanego
grupą mostkową cyklicznego związku pośredniego, albo przez przyłączenie chelatora z grupą
mostkową do cyklicznego związku pośredniego. Korzystnie, chelator przyłączany jest do modyfikowanego grupą mostkową cyklicznego związku pośredniego.
Zgodnie z wynalazkiem stosować można dowolny chelator, pod warunkiem, że tworzy on
stabilny kompleks z izotopem radioaktywnym. Typowo, izotopem radioaktywnym jest metal lub
metal przejściowy, a kompleksem z chelatorem jest kompleks metal-chelator. Przykładami kompleksów chelatowych metalu są kompleksy przytoczone w ostatnim przeglądzie podanym w pracy S. Jurissona i in. [Chem. Rev., 93,1137-1156 (1993)]. Chelatory przyłączyć można do grup
mostkowych różnymi sposobami, znanymi fachowcom. Ogólnie, grupa aktywna mostka może
reagować z chelatorem, albo, alternatywnie, grupa aktywna chelatora może reagować z grupą
mostkową. Do odpowiednich grup aktywnych należą estry aktywne, aktywne izotioizocyjaniany, aktywne halogenki alkilowe i arylowe, aktywne aminy, aktywne tiole, aktywne hydrazyny,
aktywne maleimidy itp. W poniższych przykładach opisano szereg modyfikowanych grupą mostkową związków cyklicznych zawierających grupy aktywne.
Do reprezentatywnych chelatorów należą: kwas dietylenotriaminopentaoctowy
(DTPA), kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA), kwas 1,4,7,10-tetraazacyklododekano-N,N',N",N"'-tetraoctowy (DOTA), kwas 1,4,7,10-tetraazacyklododekano-N,N',N"-trioctowy,
kwas hydroksybenzyloetylenodiaminodioctowy, N,N-dioctan, N,N'-bis(pirydoksylo-5-fosforano)etylenodiaminy, kwas 3,6,9-triaza-12-oksa-3,6,9-trikarboksymetyleno-10-karboksy-13-fenylotridekanowy, kwas 1,4,7-triazacyklononano-N,N',N"-trioctowy, kwas 1,4,8,11-tetraazacyklotetradekano-N,N',N”,N"'-tetraoctowy, kwas 2,3-bis(S-benzoilo)merkaptoacetamidopropionowy oraz
chelatory opisane poniżej. Innymi chelatorami mogą być wiążące metal regiony wywodzące się z
wiążących metale białek takich, jak np. metalotioniny, stanowiące bogate w grupy sulfhydrylowe
białka cytoplazmatyczne występujące u kręgowców, bezkręgowców i grzybów.
Chelator w postaci kwasu 4,5-bis((S-benzoilo)merkaptoacetamido)-walerianowego
(mapt) syntetyzuje się zgodnie ze sposobem opisanym przez Fritzberga i in, [Appl. Radiat. Isot.,
42, 525-530(1991)].
44
178 252
Chelator w postaci (S-benzoilo)merkaptoacetyloglicyloglicyloglicyny (MAG3) syntetyzuje się zgodnie ze sposobem opisanym przez W. Brandaiia i in. [Appl. Radiat. Isot., 39,121-129
(1998)].
Chelator w postaci 6-Boc-hydrazynopirydyno-3-karboksylanu sukcynoimidylu (SHNH)
syntetyzuje się zgodnie ze sposobem opisanym przez Schwartza i in. [Europejskie zgłoszenie patentowe 90301949.5 (1990)].
Syntezę chelatora zawierającego jedną grupę karboksylową zdatną do przyłączenia grupy
mostkowej przedstawiono na schemacie 17. Synteza rozpoczyna się od N-alkilowania
Cys(Acm)OMe przy użyciu acetalu dimetylowego bromoacetaldehydu. Następnie, aminę drugorzędową w produkcie alkilowania zabezpiecza się przed zachodzeniem dalszej reakcji grupą
Teoc. Można w tym przypadku posłużyć się także innymi grupami zabezpieczającymi, które wykazują stabilność zarówno w łagodnych warunkach kwasowych jak i w łagodnych warunkach
zasadowych i które dają się usunąć w obecności siarki. Grupę Teoc wprowadza się przy użyciu
p-nitrofenylowęglanu 2-(trimetylosililo)etylu. Następnie poddaje się acetal hydrolizie przez podziałanie wodnym roztworem słabego kwasu, po czym przeprowadza się aminowanie redukcyjne aldehydu z udziałem S-trifenylometylo-2-aminoetanotiolu. Wolną grupę aminową chelatora
zabezpiecza się grupą Teoc, po czym ester metylowy poddaje się hydrolizie przy użyciu wodnego
roztworu zasady, w wyniku czego otrzymuje się kwas karboksylowy gotowy do użycia w reakcji
z grupą aktywną modyfikowanego grupą mostkową związku cyklicznego.
Schemat 17
Syntezy chelatora zawierającego jedną dodatkowągrupę aminową dostępnąjeśli chodzi o
koniugację z modyfikowanym grupą mostkową związkiem cyklicznym dokonać można zgodnie
ze sposobem postępowania uwidocznionym na schemacie 18. Kwas tioglikolowy zabezpieczony
grupą Acm zostaje sprzężony z N-tert-butoksykarbonyloetylenodiaminą, z zastosowaniem typowych metod sprzęgania używanych w syntezie peptydów. Usuwa się grupę zabezpieczającąBoc
przy użyciu TFA i otrzymaną aminę sprzęga z Boc-Cys(Acm)-OH. Po usunięciu grupy zabezpieczającej Boc otrzymuje się S-zabezpieczony chelator w postaci odpowiedniej do wejścia w reakcję z aktywną grupą modyfikowanego grupą mostkową związku cyklicznego.
178 252
45
Wynalazek dotyczy odczynników o wzorze (QLn)dCh, przeznaczonych do znakowania
izotopami radioaktywnymi, zwierających jeden modyfikowany grupą mostkową cykliczny
związek pośredni połączony z chelatorem, jak również odczynników zawierające dwa cykliczne
związki pośrednie związane ze wspólną grupą mostkową, połączoną także z chelatorem.
Przykład odczynnika zawierającego dwa modyfikowane grupą mostkową cykliczne
związki pośrednie przyłączone do chelatora przedstawiono poniżej (schematy 19 i 20). Inne
reprezentatywne przykłady pokazano na następujących schematach. Według tego schematu
grupy aminowe występujące w dwóch związkach pośrednich z grupą mostkową reagują z pokazanymi dwoma aktywnymi grupami estrowymi z utworzeniem związku według wynalazku o wzorze (QLn)2ChSchemat 19
46
178 252
Grupą zabezpieczającą siarkę, o symbolu Pg, pokazaną powyżej, jak również wszelkimi
grupami o symbolu Pg zastrzeganymi w opisie, mogą być jakiekolwiek grupy zabezpieczające
siarkę dające się wyprzeć w wyniku reakcji z nuklidem metalu. Tego rodzaju grupy zabezpieczające są dobrze znane fachowcom. Przykłady odpowiednich grup zabezpieczających podane
są w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4897255, 4965392 i 4980147.
Schemat 20
Chelatory użyteczne w syntezie tych odczynników opisali Chervu i in. w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki 4883862 oraz Bergstein i in. opisie patentowym Stanów
Zjednoczonych Ameryki nr 5279811. Syntezę innych przydatnych chelatorów przedstawiono na
poniższych schematach.
Na schemacie 21 pokazano syntezę ligandu N2S2zawierającego dwie grupy karboksylowe,
z którymi może zostać skoniugowany docelowy związek cykliczny. Synteza rozpoczyna się od
reakcji alkilowania dwu grup aminowych kwasu DL-2,3-diaminobursztynowego (Sigma Chemical Co.), przy użyciu S-trifenylometylo-2-bromoetanodiolu. Następnie aminy drugorzędowe
należy zabezpieczyć w celu uniknięcia samokondensacji w przypadku aktywacji grup karboksylowych. Można tego dokonać przy użyciu jakiejkolwiek typowej grupy zabezpieczającej grupę
aminową. Dobrym wyborem może okazać się użycie grupy o symbolu Z, ponieważ grupę tę można usunąć w warunkach kwasowych (HBr/HOAc lub TFA/kwas trifluorometanosulfonowy) w
tym samym czasie, co trifenylometylowe zabezpieczenie siarki.
178 252
47
Schemat 21
Syntezę drugiego ligandu o wzorze N2S2, zawierającego dwie grupy karboksylowe przedstawiono na schemacie 22. Alkilowanie kwasu etylenodiamino-N,N'-dipropionowego (American Tokyo Kasei) przy użyciu S-trifenylometylo-2-bromoetanotiolu prowadzi do otrzymania
N2S2gotowego do użycia w reakcji koniugacji. W tym przypadku ma się do czynienia z aminami
trzeciorzędowymi i nie potrzebne jest żadne dodatkowe zabezpieczenie.
Schemat 22
Na schemacie 23 przedstawiono w sposób ogólny syntezę ligandu o wzorze N2S2 zawierającego dwie dodatkowe grupy aminowe do koniugowania z docelowymi związkami cyklicznymi,
w których występują aktywne grupy elektrofilowe (np. estry aktywne). Reakcja aminowania
redukcyjnego, zachodząca między benzyloaminą a glioksalem, prowadzi do utworzenia
N,N'-dibenzyloetylenodiaminy. Alkilowanie dwu grup aminowych przy użyciu N-(3-bromopropylo)ftalimidu daje całkowicie zabezpieczonątetraaminę. Usuwa się benzylowe zabezpieczenie
dwu amin drugorzędowych za pomocą redukcji katalitycznej, po czym wolne aminy poddaje się
alkilowaniu przy użyciu S-trifenylornetylo-2-bromoetanotiolu, w wyniku czego otrzymuje się
całkowicie zabezpieczony ligand. Wybiórcze odblokowanie amin pierwszorzędowych przeprowadza się z udziałem hydrazyny.
Schemat 23
48
178 252
Syntezę odczynników zawierających dwie grupy docelowe i jeden chelator związany ze
wspólną grupą mostkową można przeprowadzić zgodnie ze sposobem postępowania przedstawionym na schemacie 24. Benzyloaminę poddaje się reakcji z N-(3-bromopropylo)ftalimidem,
w wyniku czego otrzymuje się N,N-bis(3-ftalimidopropylo)ftalimid [Niitsu i Samejima, Chem.
Pharm. Buli., 34, 1032-1038 (1986)]. Podziałanie hydrazyną prowadzi do usunięcia fitalimidowych grup zabezpieczających. Następnie N,N-bis(3-aminopropylo)benzyloaminę poddaje się
reakcji z bezwodnikiem bursztynowym, w wyniku czego otrzymuje się dwukwas, który zostaje
przekształcony w aktywny dwuester przy użyciu DCC i N-hydroksysukcynoimidu. Ten aktywny
dwuester sprzęga się z modyfikowanym grupą mostkową związkiem cyklicznym. Po uwodornieniu, wykonanym w celu usunięcia benzylowej grupy zabezpieczającej i koniugacji z aktywnym chelatorem otrzymuje się produkt końcowy.
Schemat 24
178252
49
Syntezę znakowanych izotopami radioaktywnymi cyklicznych związków typu glikoproteinowego kompleksu IIb/IIIa płytek krwi według wynalazku przeprowadzić można z zastosowaniem typowych metod syntezy znanych fachowcom, przy użyciu radioaktywnych izotopów
chlorowców (takich jak chlor, fluor, brom i jod), technetu i indu, jak również innych pierwiastków. Do korzystnych izotopów radioaktywnych należą: 99mTc i 111In.
Cykliczne związki typu płytkowego kompleksu glikoproteinowego IIb/IIIa według wynalazku można znakować albo bezpośrednio (to znaczy, przez włączenie znacznika radioizotopowego bezpośrednio do wspomnianych związków), albo pośrednio (to znaczy, przez włączenie
znacznika radioizotopowego do tych związków poprzez chelator, który zostaje włączony do
związków). W przypadku znakowania bezpośredniego, jak jest to wiadome fachowcom, znakowanie
może być typu izotopowego lub nieizotopowego. W przypadku znakowania izotopowego, jedną
z grup juz obecnych w związku cyklicznym zastępuje się (wymienia się) izotopem radioaktywnym.
W przypadku znakowania nieizotopowego, izotop radioaktywny wprowadza się do związków cyklicznych z pominięciem zastąpienia (wymiany) grupy już obecnej w danym związku.
Ogólnie, związki znakowane wytwarza się z zastosowaniem sposobów postępowania polegających na wprowadzeniu znakowanego atomu w późniejszym etapie syntezy. Pozwala to
uzyskać maksymalną wydajność radiochemiczną i skrócić czas manipulowania materiałami radioaktywnymi. W przypadku posługiwania się izotopami o krótkim okresie półtrwania, główne
znaczenie ma czas potrzebny do przeprowadzenia poszczególnych czynności w procesie syntezy
i oczyszczania. Protokoły syntezy radiofarmaceutyków opisane są w: Tubis i Wolf (red.), „Radiopharmacy, Wiley-Intersciences, New York (1976); Wolf, Christman, Fowler, Lambrecht,
„Synthesis of Radiopharmaceuticals and Labeled Compounds Using Short-Lived Isotopes” w
Radiopharmaceuticals and Labeled Compounds, tom 1, str. 345-381 (1973).
Do wytworzenia związków według wynalazku znakowanych radioaktywnymi izotopami
technetu lub indu posłużyć się można różnymi metodami. Sposobów tych używa się do znakowania związków o wzorze (QLn)dCh. Przykładowymi sposobami postępowania w przypadku tego
rodzaju znakowania technetem lub indem są metody ujawnione w: Cerqueira i in. [Circulation,
tom 85, nr 1, str. 298-304 (1992)]; Pak i in. [L.Nucl. Med., tom 30, nr 5, str. 793,36th Ann. Meet.
Soc. Nuci. Med. (1989)]; Epps i in. [J. Nuci. Med., tom 30, nr 5, str. 794, 36 th Ann. Meet. Soc.
Nuci. Med. (1989)]; Pak i in. [J. Nuci. Med., tom 30, nr 5, str. 794 (36th Ann. Meet. Soc. Nuci.
Med. (1989)] oraz Dean i in. [J. Nuci. Med., tom 30, nr 5, str. 794, 36th Ann. Meet. Soc. Nuci.
Med. (1989)].
Inna użyteczna metoda znakowania cyklicznych związków według wynalazku polega na
wytworzeniu chelatora 99mTc (na poziomie wskaźnika) i sprzęgnięciu go albo z cyklicznym
związkiem pośrednim, albo z modyfikowanym grupą mostkową związkiem cyklicznym. Metoda
ta określana jest jako podejście prechelatowe. Jak to pokazano, np. na poniższym schemacie, kwas
4,5-bis(S-benzoilo)merkaptoacetamido-pentanowy (1) kompleksuje się z 99mTcO4‘ w warunkach
redukujących z utworzeniem (2). Następnie związek (2) przekształca się w aktywny ester (3) zawierający grupę tetrafluorofenylową. Następnie kompleks (3) można poddać reakcji z odpowiednim cyklicznym związkiem pośrednim, takim jak związek (5) lub (6), w wyniku czego otrzymuje
się znakowane izotopami radioaktywnymi związki (4). Innym stosownym chelatorem technetu jest
kwas 2,3-bis(S-benzoilo)merkaptoacetamidopropanowy (7). Oczyszczenia kompleksu 99mTc metodą HPLC dokonać można w każdym etapie. Podejście te przedstawiono na schemacie 25.
Schemat 25
50
178 252
Związki według wynalazku znakowane izotopami radioaktywnymi są użyteczne jako
radiofarmaceutyki przeznaczone do obrazowania skrzepliny takiej, jaka może występować u
pacjenta cierpiącego na dławicę niestabilną, zawał mięśnia sercowego, przejściowy atak niedokrwienia mózgu w zwężeniu jednej z tętnic szyjnych, udar, miażdżyca tętnic, cukrzyca, zakrzepowe zapalenie żył, zator tętnicy płucnej lub protezowe elementy mechaniczne stosowane w
sercu, takie jak zastawki serca zastępcze, dzięki czemu mogą być stosowane do diagnozowania
tego rodzaju chorób, istniejących lub potencjalnych. Pacjentami mogą być rozmaite ssaki, ale korzystnie, pacjentem jest człowiek. Związki znakowane izotopami radioaktywnymi można stosować jako takie lub w kompozycji z radiofarmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem i/lub w
połączeniu z innymi środkami diagnostycznymi lub terapeutycznymi. Stosowne nośniki radiofarmaceutyków i właściwe ich ilości są dobrze znane i można je znaleźć, np. w: Remington's
Pharmaceutical Sciences, red. A. R. Gennaro, Mack Publishing Company, Easton, PA (1985)
oraz w The United States Pharmacopia - The National Formulary, 22nd Revision, Mack Printing
Company, Easton, PA (1990), ogólnie przyjętych informatorach w dziedzinie farmacji. Jeżeli jest
to dogodne, można również dodać inne substancje, w celu stabilizowania kompozycji, znane
fachowcom, w tym przeciwutleniacze, takie jak wodorosiarczyn sodu, siarczyn sodu, kwas
askorbinowy, kwas gentyzynowy lub kwas cytrynowy (lub ich sole), albo sól sodową kwasu
etylenodiaminotetraoctowego (EDTA-Na), jak to dobrze jest znane w tej dziedzinie techniki.
178 252
51
Tego rodzaju inne substancje także są opisane w Remingtons Pharmaceutical Sciences and The
United States Pharmacopia - The National Formulary, powyżej przytoczonej.
Związki według wynalazku są stosowane w zestawach radiofarmaceutycznych. Zestawy
takie mogą zawierać znakowane związki w postaci gotowych liofilizatów i mogą obejmować pojemnik z radiofarmaceutycznie dopuszczalnym płynem przeznaczonym do odtwarzania leku.
Odpowiednie płyny do odtwarzania leku ujawnione są w powyżej przytoczonej Remingtons
Pharmaceutical Sciences and The United States Pharmacopia - The National Formulary. Alternatywnie, omawiane zestawy mogą obejmować jałowy pojemnik z kompozycją zawierającą znakowane izotopami radioaktywnymi związki według wynalazku. Jeżeli jest to pożądane, zestawy
takie mogą obejmować także inne typowe składniki zestawów, takie jak np. jeden, lub większąliczbę nośników, jedną, lub większą liczbę fiolek do mieszania. Do zestawu można także dołączyć
instrukcje, albo w postaci wkładek albo jako etykietki, wskazujące na ilość znakowanych
związków według wynalazku, oraz nośników, wskazówki dotyczące mieszania ze sobą tych
składników i protokoły odnoszące się do stosowania. Sterylizacji pojemników i jakichkolwiek
materiałów zawartych w zestawie, a także liofilizacji (określanej także jako suszenie sublimacyjne) znakowanych związków według wynalazku dokonać można z zastosowaniem typowych metod wyjaławiania i liofilizacji, znanych fachowcom.
Związki znakowane izotopami radioaktywnymi podaje się, na ogół, dożylnie, przez
wstrzyknięcie jednej dużej dawki, aczkolwiek można je podawać jakimkolwiek sposobem zapewniającym kontakt omawianych związków z płytkami krwi. Odpowiednie podawane ilości
łatwo mogą być ustalone przez fachowców na podstawie opisu. Oczywiście dawkowanie będzie
się zmieniać w zależności od takich znanych czynników jak rodzaj konkretnego podawanego
związku, wiek, stan zdrowia i masa ciała pacjenta lub charakter i rozmiary wszelkich objawów
występujących u chorego, poziom znakowania izotopami radioaktywnymi i rodzaj radionuklidu
użytego jako znacznik radioizotopowy, a także szybkość klirensu z krwi związków znakowanych
izotopami radioaktywnymi. Dopuszczalne zakresy stosowania materiałów znakowanych izotopami radioaktywnymi zestawione są tabelarycznie, np. w: Physicians Desk Reference (PDR) for
Nuclear Medicine, opracowaniu opublikowanym przez Medical Exonomics Company, dobrze
znanym, ogólnie przyjętym informatorze w tej dziedzinie. Omówienie niektórych spośród powyżej wymienionych zagadnień i rozważań podane jest w: Eckelman i in., J. Nuci. Med., tom. 209,
str. 350-357 (1979). Jako ogólną informację można podać, że zakres dawkowania znakowanych
izotopami radioaktywnymi związków według wynalazku mieści się w granicach od około 1 do
około 40 mCi.
Po podaniu znakowanych izotopami radioaktywnymi związków według wynalazku,
obecność skrzeplin można uwidocznić przy użyciu typowego układu obrazowania radioscyntograficznego, takiego jak np. gammakamera lub skomputeryzowane urządzenie tomograficzne i
w ten sposób wykryć choroby zakrzepowo-zatorowe. Takie układy pozwalające otrzymać obraz
scyntograficzny są dobrze znane i są omówione np. w: A. Macovski, Medical Imaging Systems,
Information and Systems Science Series, red. T. Kailach, Prentice-Hall, Inc., Englewood Cliffs,
NJ (1983). Szczególnie korzystne są następujące metody: tomografia komputerowa z emisją pojedynczych fotonów (SPECT) oraz emisyjna tomografia pozytronowa (PET). W szczególności,
otrzymania obrazu dokonuje się za pomocą skanowania całego ciała pacjenta lub konkretnego
regionu, odnośnie którego podejrzewa się, że utworzyła się tam skrzeplina, z wykorzystaniem
układu radioscyntograficznego i wychwycenia sygnału wysyłanego przez radioizotop. Wychwycony sygnał przetwarza się następnie w tym układzie w obraz skrzepimy. Tak otrzymane obrazy
powinny być odczytywane przez doświadczonego obserwatora, takiego jak np. lekarza specjalistę
w dziedzinie medycyny nuklearnej. Opisany powyżej sposób postępowania określany jest
w opisie określeniem „obrazowanie” pacjenta. Ogólnie, obrazowanie takie przeprowadza się po
upływie od około 1 minuty do około 48 godzin od podania znakowanego izotopem radioaktywnym związków według wynalazku. Dokładne wyznaczenie czasu obrazowania zależeć będzie od
takich czynników, jak półokres trwania użytego radioizotopu i szybkość klirensu podanego
52
178 252
związku, jak to jest oczywiste dla fachowców. Korzystnie, obrazowanie przeprowadza się w
okresie od około 1 minuty do około 4 godzin od podania związku.
Dla fachowców stanie się oczywista korzyść wynikająca ze stosowania znakowanych izotopami radioaktywnymi związków według wynalazku, zdolnych do specyficznego rozmieszczania się i z wysokim powinowactwem w stosunku do skrzeplin, do wykrywania obecności
skroplin i/lub do diagnozowania chorób zakrzepowo-zatorowych u pacjenta.
Znakowanych izotopami radioaktywnymi związków według wynalazku można także używać do diagnozowania innych istniejących lub potencjalnych stanów chorobowych, w których
dochodzi do nadprodukcji receptorów GPIIb/IIIa, tak jak ma to miejsce w przypadku przerzutowych komórek rakowych. Przedmiotowe związki można skutecznie stosować w niskich dawkach, dzięki czemu minimalizuje się ryzyko działania toksycznego. Także, przedmiotowe
związki mają o wiele mniejsze rozmiary w porównaniu np. ze znanymi w tej dziedzinie znakowanymi izotopami radioaktywnymi przeciwciałami 7E3, co pozwala na łatwiejsze osiąganie
właściwego stosunku cel/tło (T/B) przy diagnostyce skrzeplin. Wykorzystanie znakowanych
izotopami radioaktywnymi związków według wynalazku jest w dalszym ciągu opisane w ponizszej części opisu.
Stwierdzono ponadto, że powyższe związki znakowane izotopami radioaktywnymi są
użyteczne jako inhibitory glikoproteiny IIb/IIIa (GPIIb/IIIa), w wyniku czego znakowanych izotopami radioaktywnymi związków według wynalazku można także używać w celach terapeutycznych, oprócz zastosowań diagnostycznych, powyżej opisanych. Jak to powyżej omówiono,
GPIIa/IIIb pośredniczy w procesie aktywacji i agregacji płytek krwi. Znakowane izotopami radioaktywnymi związki według wynalazku hamują aktywację i agregację płytek, wywoływane
przez wszystkie znane endogenne płytkowe substancje o działaniu agonistycznym.
Nowe cykliczne związki typu kompleksu glikoprotein IIb/IIIa według wynalazku mogą
także odznaczać się skutecznością trombolityczną, a to oznacza, że są one zdolne do lizowania
(rozbijania) już utworzonych bogatopłytkowych skrzeplin fibryny krwi, a przez to mogą być
użyteczne w leczeniu stanów z tworzeniem się skrzeplin, jak tego dowiedziono na podstawie ich
aktywności wykazanej w testach poniżej opisanych. Do korzystnych związków cyklicznych
według wynalazku, nadających się do użycia w trombolizie, należą związki o wartości IC50(stężenie molowe związku cyklicznego, przy którym zapewnione jest uzyskanie 50% lizy skrzepu)
poniżej około 1 mM, korzystniej o wartości IC50mniejszej od około 0,1 mM, jeszcze korzystniej
o wartości IC50mniejszej od około 0,01 mM, wyjątkowo korzystnie o wartości IC50mniejszej od
około 0,001 mM, a najkorzystniej o wartości IC50poniżej około 0,0005 mM.
Oznaczenia IC50dokonać można w standardowym teście trombolitycznym, poniżej opisanym. Inna grupa korzystnych związków o działaniu trombolitycznym według wynalazku obejmuje te związki, w przypadku których Kdwynosi mniej niż 100 nM, korzystnie mniej niż 10 nM,
a najkorzystniej od 0,1 do 1,0 nM.
Użyteczność związków według wynalazku wykazano w poniższych próbach.
A. Tętniczo-żylny model bocznikowy
Dorosłe psy mieszańce obu płci (9-13 kg) znieczulono przez dożylne podanie soli sodowej
pentobarbitalu użytej w ilości 35 mg/kg, i.v., podając im powietrze pokojowe przez rurę tchawiczą(12 suwów/min, 25 ml/kg). W celu oznaczenia ciśnienia tętniczego, w lewą szyjną tętnicę
wprowadzono kaniulę z wypełnionym fizjologicznym roztworem soli polietylenowym cewnikiem (PE-240) i przyłączono do przetwornika ciśnienia Stathama (P23ID, Oxnard, CA). Średnie
ciśnienie tętnicze określano przez tłumienie pulsującego sygnału ciśnienia. Częstość akcji serca
śledzono przy użyciu kardiotachometru (Biotach, Grass Quincy, MA) wyprowadzonego z przewodu elektrokardiograficznego II utworzonego przez odprowadzenia kończynowe. Do żyły
szyjnej wprowadzono kaniulę (PE240) do podawania leku. Do tętnic udowych i żył udowych
wprowadzono kaniule w postaci silikonowego (Sigmacote, Sigma Chemical Co. St. Louis, MO),
wypełnionego fizjologicznym roztworem soli polietylenowego przewodu rurowego (PE-200) i
połączono z 5 cm odcinkiem silikonowanego przewodu rurowego (PE-240) z utworzeniem pozaustrojowych boczników tętniczo-żylnych (A-V). Drożność tych boczników śledzono i kontrolo-
178 252
53
wano z zastosowaniem dopplerowskiego układu przepływowego (model VF-1, Crystal Biotech
Inc, Hopkinton, MA) i zgłębnika przepływowego (2-2,3 mm, Titronics Med. Inst., Iowa City, IA)
umieszczonego jak najbliżej miejsca, w którym znajduje się bocznik. Wszystkie parametry śledzono i kontrolowano w sposób ciągły przy użyciu Polygraph Recorder, model 7D (Grass) przy
szybkości przesuwu papieru 10 mm/min lub 25 mm/s.
Po zakończeniu 15-minutowego okresu stabilizacji pooperacyjnej, utworzono skrzeplinę
zamykającą przez wprowadzenie do bocznika tworzącej skrzeplinę powierzchni (spleciona nić
chirurgiczna 4-0 jedwabna, o długości 5 cm, Ethicon Inc., Somerville, NJ), przy czym drugi bocznik służył w celach kontrolnych. Badania prowadzono w ciągu dwóch kolejnych 1-godzinnych
okresów bocznikowania, przy czym badany związek podawano w postaci wlewu w ciągu 5 minut, rozpoczynając podawanie na 5 minut przed wprowadzeniem powierzchni tworzącej skrzeplinę. Po zakończeniu każdego 1-godzinnego okresu bocznikowania, jedwab ostrożnie usunięto,
po czym obliczono % włączenia poprzez pomiar licznikiem wnękowym. Ciężar skrzepliny obliczono przez odjęcie ciężaru jedwabiu przed jego umieszczeniem w boczniku od całkowitego ciężaru jedwabiu po wyjęciu z bocznika. Otrzymane wyniki przedstawiono w tabeli 1. Krew
tętniczą pobierano przed pierwszym bocznikowaniem i co 30 minut po nim, w celu oznaczenia
stopnia klirensu krwi, indukowanej kolagenem agregacji płytek pełnej krwi, degranulacji płytek
indukowanej trombiną (uwalnianie ATP płytek), czasu protrombinowego i liczby płytek. Oznaczano również, w 30-minutowych przedziałach czasowych, standardowy czas krwawienia.
Tabela 1
Dane doświadczalne uzyskane przy wykorzystaniu tętniczo-żylnego modelu bocznikowego
(średnia ± SE M , T/B = skrzeplina/tło)
Przykład
nr
Warunki tętnicze
Warunki żylne
W ych w yt (% id/g)
Stosunek T/B
W ych w yt (% id/g)
Stosunek T/B
8
0 ,25 ± 0 , 1 5
19 ± 9
1,8 1 ± 0 ,1 8
1 7 3 ± 22
9
0,45 ± 0 , 1 1
8± 3
2,60 ± 0,05
44 ± 4
10
12
0 ,16 ± 0 ,0 2
7 ± 0 ,6
5,00 ± 0 ,5 1
0,46 ± 0 ,1 9
7,0 ± 2
6 ,15 ± 0 ,6 6
221 ± 16
111 ± 6
13
1,6 4 ± 1,3 2
33 ± 2 7
8,50 ± 0,20
16 3 ± 14
16
0,08
14
0,95 ± 0,29
12 8 ± 24
18
0,04 ± 0 , 1
13 ± 3
0,47 ± 0 , 1 2
14 7 ± 4 4
19
0,58 ± 0,22
13 ± 4
5 ,7 5 ± 1,28
1 4 2 ± 24
21
22
0,06 ± 0,03
4,0 ± 2
1,6 ± 0 , 1 2
113 ± 1
0,045 ± 0,02
7 ± 4
1,2 8 ± 0 ,4 4
15 8 ± 5
23
0 ,2 1 ± 0 ,0 5
7 ± 0 ,4
5 ,4 1 ± 0 ,7 0
19 5 ± 39
32
0
0
7, 4
102
B. Psi model zakrzepicy żył głębokich
Model ten obejmuje triadę zjawisk: stan nadkrzepliwości, okres zastoju i środowisko o
małej zdolności fragmentowania, istotnych z punktu widzenia tworzenia się żylnej, bogatej w fibrynę, aktywnie rozwijającej się skrzepliny. Przyjęto następujący sposób postępowania.
Dorosłe psy mieszańce obu płci (9-13 kg) znieczulone przez dożylne podanie soli sodowej
pentobarbitalu (w dawce wynoszącej 35 mg/kg), podając im powietrze pokojowe przez rurę dotchawiczą(12 suwów/min, 25 ml/kg). W celu oznaczenia ciśnienia tętniczego, w prawą tętnicę
udową wprowadzono kaniulę w wypełnionym fizjologicznym roztworem soli cewnikiem polietylenowym (PE-240) i przyłączone do przetwornika ciśnienia Stathama (P23ID, Oxnard, CA).
54
178 252
Średnie ciśnienie tętnicze określano przez tłumienie pulsującego sygnału ciśnienia. Częstość
akcji serca śledzono przy użyciu kardiotachometru (Biotach, Grass Quincy, MA) wyprowadzonego z przewodu elektrokardiograficznego II utworzonego przez odprowadzenia kończynowe.
Do prawej żyły udowej wprowadzono kaniulę (PE-240) z przeznaczeniem do podawania leku.
5-centymetrowy odcinek obu żył szyjnych wyizolowano, oczyszczono z powięzi i okręcono jedwabną nicią chirurgiczną. Na naczyniu służącym jako pośrednia miara przepływu żylnego umieszczono zgłębnik mikrotermistorowy. Do wywołania 15-minutowego okresu zastoju użyto
cewnika z balonikiem do embolektomii, po którym to okresie wywołano stan nadkrzepliwości
przy użyciu 5 jednostek trombiny (American Diagnostica, Greenwich, CT), wprowadzonej do
zaokludowanego odcinka. Po upływie 15 minut przywrócono przepływ przez wypuszczenie
gazu z balonika. W ciągu pierwszych 5 minut ponownego przepływu prowadzono wlew badanego środka i śledzono szybkość włączania z wykorzystaniem gammascyntygrafii. Wyniki odnoszące się do związków z przykładów 10 i 17 przedstawiono na fig. 1.
C. Test agregacji płytek
Do 10 ml probówek cytrynianowanych (Vacutainer) zebrano krew psów. Krew wirowano
w ciągu 15 minut przy 150 x g, w temperaturze pokojowej; po czym usunięto osocze bogatopłytkowe (PRP). Pozostałą krew wirowano w ciągu 15 minut przy 1500 x g w temperaturze pokojowej, po czym usunięto osocze ubogopłytkowe (PPP). Próbki badano przy użyciu agrometru
(PAP-4 Platelet Aggregation Profiler) przy użyciu PPP jako ślepej próby (transmitancja 100%).
Do każdej mikroprobówki dodano po 200 µl PRP i poziom transmitancji ustawiono na 0%. Do
każdej probówki wprowadzono po 20 µl różnych agonistów (ADP, kolagen, arachidonian, epinefryna, trombina) i naniesiono na wykres profile agregacji (% transmitancji w funkcji czasu).
Otrzymane wyniki wyrażano jako % zahamowania indukowanej przez agonistę agregacji płytek.
W przypadku oceny IC50, związki badane wprowadzano, w różnych stężeniach, przed zaktywowaniem płytek.
D Test wiązania ptytka-fibrynogen
Związania I25I-fibrynogenu z płytkami dokonano sposobem opisanym przez Bennetta i in.
[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80,2417-2422 (1983)] z pewnymi zmianami, jak to poniżej opisano. Na kolumnę Sepharose wprowadzono ludzkie PRP (h-PRP) w celu oczyszczenia frakcji
płytek. Porcje płytek (5 x 108komórek) wraz z 1 mM chlorku wapnia wprowadzono na usuwalne
płytki o 96 studzienkach, przed zaktywowaniem ludzkich płytek oczyszczonych w żelu (h-GPP).
Aktywacji ludzkich płytek oczyszczonych metodą żelową dokonano przy użyciu ADP, kolagenu, arachidonianu, epineftyny i/lub trombiny, w obecności ligandu, 125I-fibrynogenu. I25I-fibrynogen związany z aktywnymi płytkami oddzielono od fibrynogenu w stanie wolnym przez
wirowanie. Następnie dokonano pomiaru licznikiem promieniowania y. W celu oszacowania
IC50związki badane dodawano w różnych stężeniach przed zaktywowaniem płytek.
E. Test trombolityczny
Krew żylnąpobrano z ramienia zdrowego człowieka-dawcy, nie przyjmującego leku i aspiryny w ciągu co najmniej dwóch tygodni przed pobraniem krwi. Krew tę umieszczono w 10 ml probówkach cytrynianowanych (Vacutainer). Krew wirowano w ciągu 15 minut przy 1500 x g w
temperaturze pokojowej i usunięto osocze bogatopłytkowe (PRP). Następnie, do PRP dodano 1 x
10-3M agonistów: ADP, epineftyny, kolagenu, arachidonianu, serotoniny lub trombiny, albo ich
mieszaniny, po czym PRP inkubowano w ciągu 30 minut. PRP wirowano w ciągu 12 minut przy
2500 x g w temperaturze pokojowej. Następnie Supernatant odlano, a płytki pozostałe w probówce ponownie zawieszono w osoczu ubogopłytkowym (pPP), służącym jako źródło plazminogenu. Otrzymaną zawiesinę zbadano przy użyciu licznika Coultera (Coulter Electronics, Inc.,
Hialeah, FL) w celu ustalenia liczby płytek w czasie zero. Po uzyskaniu punktu dla czasu zero,
dodano związki badane, w rozmaitych stężeniach. Próbki do badań pobierano w różnym czasie i
płytki liczone przy użyciu licznika Coultera. W celu oznaczenia procentowości lizy, liczbę płytek
oznaczoną w punkcie czasowym następującym po momencie dodania związku badanego odjęto
od liczby płytek w punkcie czasowym zero i otrzymaną liczbę podzielono przez liczbę płytek w
czasie zero. Po przemnożeniu otrzymanego wyniku przez 100 otrzymano procentową wartość
178 252
55
lizy skrzepu dla danego związku badanego. W przypadku oceny IC50, związki badane wprowadzano w różnych stężeniach i obliczano procentową wartość lizy powodowanej przez badane
związki.
Figura 1 przedstawia typowe obrazy otrzymane z zastosowaniem związku radiofarmaceutycznego z przykładu 10, podanego dożylnie w dawce 1 mCi/kg, w psim modelu zakrzepicy
żył głębokich. W modelu tym skrzepliny zostały utworzone w żyle szyjnej w okresie zastoju, po
którym następuje ponowny przepływ krwi. Związki podawano wraz z rozpoczęciem ponownego
przepływu. Pokazano pobranie w szybko rozwijającej się skrzeplinie żylnej po 15,60 i 120 minutach od podania.
Figura 1b przedstawia typowe obrazy otrzymane z zastosowaniem związku radiofarmaceutycznego z przykładu 17, podanego dożylnie w dawce 1 mCi/kg, w psim modelu zakrzepicy
żył głębokich. W modelu tym skrzepliny zostały utworzone w żyle szyjnej w okresie zastoju, po
którym następuje ponowny przepływ krwi. Związki podawano wraz z rozpoczęciem się ponownego przepływu. Pokazano pobranie w szybko rozwijającej się skrzeplinie szyjnej po 15,60 i 120
minutach od podania.
Wynalazek ilustrują poniższe przykłady, przy czym przykłady 1-30 dotyczą wytwarzania
związków według wynalazku, a pozostałe przykłady dotyczą wytwarzania związków wyjściowych i pośrednich.
Syntezę peptydów w fazie stałej prowadzono w 25 ml polipropylenowych probówkach filtracyjnych dostarczonych przez firmę BioRad Inc., lub w 60 ml naczyniach reakcyjnych typu
„klepsydra”, dostarczonych przez firmę Peptides International. Żywicę oksymową(poziom podstawienia = 0,96 mmol/g) przygotowano zgodnie z opublikowanymi sposobami postępowania
[DeGrado i Kaiser, J. Org. Chem., 45,1295 (1980)] albo dostarczona została przez firmę Novabiochem (poziom podstawienia = 0,62 mmola/g). Wszystkie chemikalia i rozpuszczalniki (stopień czystości odczynników) stosowano w takiej postaci, w jakiej zostały dostarczone przez
wyżej wymienione firmy, bez dalszego oczyszczania. tert-Butoksykarbonylo (Boc)-aminokwasy i inne wyjściowe aminokwasy można otrzymać w handlu z firmy Bachem Inc., Bachem
Biosciences Inc., (Philadelphia, PA), Advanced ChemTech (Louisville, KY), Peninsula Laboratories (Belmont, CA) lub Sigma (St. Louis, MO). Heksafluorofosforan 2-(1H-benzotriazol-1-ilo)-1,1,3,3-tetrametylouroniowy (HBTU) i TBTU otrzymano z firmy Advanced ChemTech. N-Metylomorfolinę (NMM), m-krezol, kwas D-2-aminomasłowy (Abu), chlorek trimetyloacetylu,
diizopropyloetyloaminę
(DIEA),
kwas
3-cyjanobenzoesowy
i
[2-(tert-butoksykarbonyloksyloimino)fenyloacetonitryl] (Boc-ON) otrzymano z firmy Aldrich
Chemical Company. Dimetyloformamid (DMF), octan etylu, chloroform (CHCl3), metanol
(MeOH), pirydynę i kwas chlorowodorowy (HCl) otrzymano z firmy Baker. Acetonitryl, dichlorometan (DCM), kwas octowy (HOAc), kwas trifluorooctowy (TFA), eter etylowy, trietyloaminę, aceton i siarczan magnezu otrzymano z firmy FM Science. Katalizator palladowy na węglu
(10% Pd) otrzymano z firmy Fluka Chemical Company. Etanol absolutny otrzymano z firmy Quantum Chemical Corporation. Chromatografię cienkowarstwową wykonywano na płytkach Silica Gel 60 F254 TLC (grubość warstwy 0,2 mm), dostarczonych z firmy EM Separations. Do
wizualizacji w metodzie TLC stosowano UV, jod, natrysk ninhydryną i/lub natrysk Sakaguchi.
Temperaturę topnienia oznaczano przy użyciu aparatu do mierzenia temperatury topnienia Thomas Hoover lub Electothermal 9200 i odczytów nie korygowano. Analizę HPLC prowadzono
albo w układzie Hewlett Packard 1090, Waters Delta Prep 3000, Rainin, albo DuPont 8800. Widma NMR rejestrowano przy użyciu spektrometru General Electric QE-3 00 (300 MHz), Varian
300 lub Varian 400. Oznaczeń metodą spektrometrii masowej z bombardowaniem szybkimi
atomami (FAB-MS) dokonywano przy użyciu spektrometru masowego z podwójnym ogniskowaniem VG Zab-E, z wyrzutnią jonową Xenon FAB jako źródłem jonów lub urządzeniem
Finnigan MAT 8230.
Przykłady 1 - 7 ilustrują wytwarzanie odczynników do znakowania izotopami radioaktywnymi.
56
178 252
P r z y k ł a d 1. Koniugat cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb-(5-Aca))-N-[4-(karboksy)benzylo]-N,N'-bis[(2-trifenylometylotio)etylo]glicynoamid.
Roztwór 0,017 mmola estru N-hydroksysukcynoimidowego N-[4-(karboksy)benzylo]-N,N'-bis[(2-trifenylometylotio)etylo]glicynoamidu, 13,9 mg (0,015 mmola) cyklo-(D-ValNMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-Aca)) i 6,25 µl (0,045 mmola) Et3N w 350 µl DMF mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu 14 godzin. Postęp reakcji śledzono i kontrolowano metodą TLC z
normalnymi fazami (CHCl3/MeOH/HOAc 90:8:2) z zastosowaniem metody ninhydrynowej i
metody Sakaguchi. DMF usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymany koniugat poddano
oczyszczaniu metodą HPLC z odwróconymi fazami na preparatywnej kolumnie Vydac C18
(2,1 cm) przy 1,0%/min gradiencie 18-36% acetonitrylu zawierającego 0,1 % TFA. Po liofilizacji
otrzymano 11 mg (53%) soli związku tytułowego z TFA w postaci puszystej, bezbarwnej
substancji stałej.
FAB-MS: [M+H] = 1369,3
P r z y k ł a d 2. Koniugatcyklo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)-N-[4-(karboksy)benzylo]-N,N'-bis[(2-trifenylometylotio)etylo]glicynoamid.
Roztwór 30 mg (0,033 mmola) estru N-hydroksysukcynoimidowego N-[4-(karboksy)benzylo]-N,N'-bis[(2-trifenylometylotio)etylo]-glicynoamidu, 23,8 mg (0,029 mmola)
cyklo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) i 12 |ul (0,087 mmola) Et3N w 60 ml DMF mieszano
w temperaturze pokojowej w ciągu 63 godzin. Postęp reakcji śledzono i kontrolowano metodą
TLC z normalnymi fazami (CHCl3/MeOH/HOAc 90:8:2) z zastosowaniem metody ninhydrynowej i metody Sakaguchi. DMF usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymany koniugat
poddano oczyszczaniu metodą HPLC z odwróconymi fazami na preparatywnej kolumnie Vydac
Cl 8(2,1 cm) przy 0,9%/min gradiencie 18-36% acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA. Po liofilizacji otrzymano 24 mg (60%) soli związku tytułowego z TFA w postaci puszystej, bezbarwnej
substancji stałej.
ESI-MS: [M] = 1397,3
P r z y k ł a d 3. Sól cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb-(N-boc-hydrazynonikotynylo-5-Aca)) z TFA.
Część A. Synteza soli cyklo(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(N-hydrazynonikotynylo-5-Aca)) z TFA.
Do roztworu 10 mg (0,11 mmola) cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb-(5-Aca),
4,6 mg (0,0132 mmola) boc-hydrazynonikotynianu sukcynoimidylu w 0,3 ml DMF dodano
0,0061 ml (0,044 mmola) trietyloaminy i otrzymaną mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej w atmosferze azotu w ciągu 24 godzin. Następnie rozpuszczalnik odparowano
pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość rozpuszczono w roztworze acetonitrylu w wodzie,
po czym liofilizowano przez noc, w wyniku czego otrzymano substancję stałą o barwie białawej.
Część produktu poddano oczyszczaniu metodą HPLC z odwróconymi fazami na preparatywnej
kolumnie Vydac C18 przy 2,0%/min gradiencie 6,3-72% wodnego roztworu acetonitrylu zawierającego 0,1 TFA i zliofilizowano, w wyniku czego otrzymano sól związku tytułowego z TFA
w postaci puszystej substancji stałej.
MS (M+H) -938,4849 (obliczono 938,4848).
Część B. Odblokowanie z otrzymaniem soli cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(N-hydrazynonikotynylo-5-Aca)) z TFA.
Sól cyklo(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(N-boc-hydrazynonikotynylo-5-Aca) z TFA
rozpuszczono w mieszaninie TFA i anizolu 98:2, użytej w ilości 2 ml, po czym otrzymaną
mieszaninę reakcyjną mieszano w ciągu 15 minut. Usunięto rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość rozpuszczono w roztworze acetonitrylu w wodzie, po czym zliofilizowano, w wyniku czego otrzymano substancję stałą o barwie białej. Oczyszczenia dokonano
metodą HPLC z odwróconymi fazami na preparatywnej kolumnie Vydac C-18, przy 2,0%/min
gradiencie 6,3-72% wodnego roztworu acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA. Po liofilizacji
otrzymano sól związku tytułowego z TFA w postaci puszystej substancji stałej.
MS (M+H) = 838,4324 (obliczono 838,4324)
178 252
57
P r z y k ł a d 4. Sól cyklo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(N-hydrazynonikotynylo-5-Aca)) z TFA.
Część A. Synteza soli cyklo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(Nboc-hydrazynonikotynylo-5-Aca)) z TFA.
Do roztworu 10 mg (0,0109 mmola) soli cyklo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb-(5-Aca),
z TFA i 4,55 mg (0,0131 mmola) boc-hydrazynonikotynianu sukcynoimidylu w 0,4 ml DMF
wprowadzono 0,0061 ml (0,044 mmola) trietyloaminy i otrzymaną mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej, w atmosferze azotu, w ciągu 24 godzin. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość rozpuszczono w roztworze acetonitrylu w
wodzie, a następnie zliofilizowano przez noc, w wyniku czego otrzymano substancję stałą o barwie białawej. Część produktu poddano oczyszczaniu metodą HPLC z odwróconymi fazami na
preparatywnej kolumnie Vydac C-18przy 2,0%/min gradiencie 6,3-72% wodnego roztworu acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA. Po liofilizacji otrzymano sól związku tytułowego z TFA w
postaci puszystej substancji stałej.
MS (M+H) = 924,4699 (obliczono 924,4692).
Część B. Odblokowanie z otrzymaniem soli cyklo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(N-hydrazynonikotynylo-5-Aca)) z TFA.
Sól cyklo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(N-hydrazynonikotynylo-5-Aca)) z TFA:
Sól cyklo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(N-boc-hydrazynonikotynylo-5-Aca)) z TFA
rozpuszczono w mieszaninie TFA i anizolu 98:2, użytej w ilości 2 ml, po czym otrzymaną
mieszaninę reakcyjną mieszano w ciągu 15 minut. Usunięto rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość rozpuszczono w roztworze acetonitrylu w wodzie, po czym zliofilizowano, w wyniku czego otrzymano substancję stałąo barwie białej. Oczyszczenia dokonano
metodą HPLC z odwróconymi fazami na preparatywnej kolumnie Vydac C-18, przy 2,07%/min
gradiencie 6,3-85,5% wodnego roztworu acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA. Po liofilizacji
otrzymano sól związku tytułowego z TFA w postaci puszystej substancji stałej.
MS (M+H) = 823,3428 (obliczono = 823,3439).
P r z y k ł a d 5 . Sól cyklo((N-ε-hydrazynonikotynylo-D-Lys)-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)
z TFA.
Część A. Synteza soli cyklo((N-ε-boc-hydrazynonikotynylo-D-Lys)-NMeArg-Gly-AspMamb) z TFA.
Do roztworu 4,2 mg (0,005 mmola) cyklo(D-Lys-NMeArg-GlyAsp-Mamb).2TFA i 2,1 mg
(0,006 mmola) boc-hydrazynonikotynianu sukcynoimidylu w 0,15 ml DMF dodano 0,003 ml
(0,02mmola) trietyloaminy i otrzymaną mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej , w atmosferze azotu, w ciągu 48 godzin. Rozpuszczalnik usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość rozpuszczono w roztworze acetonitrylu w wodzie, po czym zliofilizowano
przez noc, w wyniku czego otrzymano substancję stałą o barwie białawej. Oczyszczania dokonano metodą HPLC z odwróconymi fazami na preparatywnej kolumnie Vydac C-18 przy 1,7%/min
gradiencie 6,3-85,5% wodnego roztworu acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA, po czym zliofilizowano, w wyniku czego otrzymano sól związku tytułowego z TFA w postaci substancji stałej
o konsystencji puszystej.
MS (M+H) = 839,4157 (obliczono 839,4164).
Część B Odblokowanie z otrzymaniem soli cyklo((N-ε-hydrazynonikotynylo-D-Lys)-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) z TFA.
Sól cyklo((N-ε-hydrazynonikotynylo-D-Lys)-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) z TFA:
3 mg soli cyklo((N-ε-boc-hydrazynonikotynylo-D'Lys)-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) z TFA
rozpuszczono w mieszaninie TFA i anizolu 98:2, użytej w ilości 2 ml, po czym otrzymaną mieszaninę reakcyjną mieszano w ciągu 15 minut. Następnie usunięto rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość rozpuszczono w roztworze acetonitrylu w wodzie, po czym
zliofilizowano, w wyniku czego otrzymano substancję stałąo barwie białej. Oczyszczenia dokonano
metodą HPLC z odwróconymi fazami na preparatywnej kolumnie Yydac C-18, przy 2,0%/min
58
178 252
gradiencie 6,3-72% wodnego roztworu acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA. Po liofilizacji
otrzymano sól związku tytułowego z TFA w postaci puszystej substancji stałej.
MS (M+H) = 739,3629 (obliczono 739,3640).
P r z y k ł a d 6. Koniugatcyklo-([DTPA-D-Lys]-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)(DTPA = kwas
dietylenotriaminopentaoctowy)
Do roztworu 250 mg (2 mmoli) cyklo(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) w 208 ml 0,1M
buforu boranowego (pH 9,88) dodano w temperaturze pokojowej, przy ciągłym mieszaniu, 743 mg
(10 mmoli) bezwodnika DTPA. Mieszaninę reakcyjną mieszano w ciągu 2 godzin. Po usunięciu
rozpuszczalnika otrzymano surową mieszaninę produktów, którą poddano oczyszczaniu metodą
HPLC na preparatywnej kolumnie Vydac C18, przy gradiencie 0-50% ACN zawierającego 0,1 % TFA,
w ciągu 60 minut, przy szybkości przepływu wynoszącej 20 ml/min. Wyodrębniono dwa główne
składniki.
Składnikiem A jest cyklo-([DTPA-D-Lys-]-NMeArg-Gly-Asp-Mamb).
MS: 979,1 (M+H+).
P r z y k ł a d 7. Koniugat [cyklo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asg-Mamb]2-DTPA.
Składnikiem B pochodzącym z syntezy opisanej w przykładzie 6jest [cyklo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb]2-DTPA.
MS: 1565,4 (M+).
Przykłady 8- 30 ilustrują wytwarzanie związków znakowanych izotopami radioaktywnymi.
P r z y k ł a d 8. 99mTcO(MAMA)-Cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-Aca))).
Część, A- Odblokowanie
Usuwa się trifenylometylowe grupy zabezpieczające występujące w odczynniku opisanym w przykładzie 1. Do osobnej, czystej 10 cm3fiolki wprowadzono odczynnik i 0,1 ml kwasu
trifluorooctowego (TFA). Substancja stała rozpuściła się, w wyniku czego utworzył się roztwór o
barwie żółtej.
Część B. Synteza 99mTc-glukoheptonianu.
Zawartości fiolki Glucoscan® roztworzono w 1,0 ml Milli-Q H2ó. Pobrano 0,2 ml
utworzonego roztworu i dodano do czystej 10-cm 3 fiolki, po czym wprowadzono do niej
około 200 mCi 99mTcO4 Prowadzono reakcję w temperaturze pokojowej w ciągu 20 minut.
Część C. Synteza 99mTcO(MAMA)-Cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-Aca)).
Do odblokowanego odczynnika z części A, w postaci roztworu, dodano 0,2 ml 5 N NaOH i
0,4 ml 0,2 M buforu fosforanowego pH 6. Zmierzono pH i doprowadzono, w miarę potrzeby, do
wartości 6. Tak otrzymany roztwór bezzwłocznie dodano do fiolki z roztworem 99mTc-glukoheptonianu i po zakapslowaniu fiolki, ogrzewano całość w temperaturze 100°C w ciągu 15 minut. Po
ochłodzeniu w ciągu około 2 minut, 20 ;µl roztworu poddano analizie metodąHPLC, z zastosowaniem metody 1. (Patrz tabela 2).
P r z y k ł a d 9. 99mTcO(MAMA)-Cyklo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb).
Część A. Odblokowanie.
Usuwa się trifenylometylowe grupy zabezpieczające występujące w odczynniku opisanym w przykładzie 2. Do osobnej, czystej 10-cm3fiolki wprowadzono odczynnik i 0,1 ml kwasu
trifluorooctowego (TFA). Substancja stała rozpuściła się, w wyniku czego utworzył się roztwór o
barwie żółtej.
Część B. Synteza 99mTcO(MAMA)-Cyklo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb).
Do roztworu odblokowanego odczynnika z części A dodano 0,2 ml 5 N NaOH i 0,4 ml 0,2 M
buforu fosforanowego pH 6. Zmierzono pH i doprowadzono, w miarę potrzeby, do wartości 6.
Tak otrzymany roztwór bezzwłocznie dodano do fiolki z roztworem 99mTc-glukoheptonianu, wytworzonym sposobem opisanym w przykładzie 8, część B. Po zakapslowaniu, fiolkę ogrzewano
w temperaturze 100°C w ciągu 15 minut. Po ochłodzeniu w ciągu około 2 minut, 20 µl roztworu
poddano analizie metodą HPLC, z zastosowaniem metody 1. (Patrz tabela 2).
178 252
59
P r z y k ł a d 10. 99mTc(trycyno)2-cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(hydrazynonikotynylo-5-Aca)).
Do roztworu 70 mg trycyny w 1,0 ml wody dodano 0,05 ml 1,0 N NaOH w celu podwyższenia wartości pH do 7. Następnie dodano 0,1-1,0 ml roztworu 99mTc04- w wodnym roztworze
chlorku sodu (10-100 mCi), a potem 10 µg odczynnika opisanego w przykładzie 3, rozpuszczonego w 100 µl 0,1 N HC1 i 100 µg SnCl2-2H2O, rozpuszczonego w 0,1N HCl. Reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej w ciągu 45 minut. Wytworzony produkt poddano analizie metodą
HPLC, z zastosowaniem metody 1oraz metodąTLC, z zastosowaniem metody 2. (Patrz tabela 2).
P r z y k ł a d 11. 99mTc(EDDA)-Cyklo(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(hydrazynonikotynylo-5-Aca)).
Do roztworu 10 mg kwasu etylenodiamino-N,N'-dioctowego (EDD A) w 1,0 ml wody dodano 0,05 ml i N NaOH w celu podwyższenia wartości pH do 7. Następnie dodano 0,1-1,0 ml
roztworu 99mTcO4 w wodnym roztworze chlorku sodu (10-100 mCi), a potem 50 µg odczynnika
opisanego w przykładzie 2, rozpuszczonego w 100 µl 0,1 N HCl i 100 µg SnCl2-2H2O, rozpuszczonego w 0,1 N HCl. Reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej w ciągu 45 minut.
Wytworzony produkt poddano analizie metodą HPLC, z zastosowaniem metody 1, oraz metodą
TLC, z zastosowaniem metody 2. (Patrz tabela 2).
P r z y k ł a d 12. 99mTc(trycyno)2-cyklo(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(hydrazy nonikotynylo-5 -Aca)).
Do roztworu 70 mg trycyny w 1,0 ml wody dodano 0,05 ml 1,0 NaOH w celu podwyższenia
wartości pH do 7. Następnie dodano 0,1-1,0 ml 99mTc04 w wodnym roztworze chlorku sodu
(10-100 mCi), a potem 10 µg odczynnika opisanego w przykładzie 4, rozpuszczonego w 100 µl
0,1 NHCl i 100 µg SnCl2-2H2O, rozpuszczonego w 0,1 NH Cl. Reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej w ciągu 45 minut. Wytworzony produkt poddano analizie metodą HPLC, z
zastosowaniem metody 1, oraz metodąTLC, z zastosowaniem metody 2. (Patrz tabela 2).
P r z y k ł a d 13.99mTc(trycyno)2-cyklo(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(hydrazynonikotynylo-5-Aca)).
Do roztworu 70 mg trycyny w 1,0 ml wody dodano 0,05 ml 1,ON NaOH w celu podwyższenia wartości pH do 7. Następnie dodano 0,1 -1,0 ml roztworu 99mTc04 w wodnym roztworze
chlorku sodu (10-100 mCi), a potem 10 µg odczynnika opisanego w przykładzie 5, rozpuszczonego w 100 µl 0,1 N HCl i 100 µg SnClo
2.2HO
2, rozpuszczonego w 0,1N HCl. Reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej w ciągu 45 minut. Produkt poddano analizie metodą HPLC, z
zastosowaniem metody 1, oraz metodą TLC, z zastosowaniem metody 2. (Patrz tabela 2).
Tabel a
2
Dane analityczne i dotyczące wydajności odnoszące się do odczynników znakowanych 99mTc
Przykład nr
H PLC Czas retencji (min)
Wydajność (% )
8
20,4
66
9
19,6
95
10
11
12
13,4
95
1 1 ,5
60
1 1 ,5
97
8,8
90
13
P r z y k ł a d 14. Cyklo-([111In-DTPA-D-Lys]-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)
50 µl 111InCl3(około 100 mCi/ml) w 0,05 M HCl, otrzymanego z firmy DuPont-NEN Products, Billerica, MA, połączono z taką samą objętością świeżo sporządzonego 1,0 M roztworu
octanu amonu. Po upływie około 5 minut, dodano 0,1 -1 mg odczynnika opisanego w przykładzie 6,
60
178 252
rozpuszczonego w 0,25 wody. Reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej w ciągu 34 minut. Wytworzony produkt poddano analizie metodą HPLC, z zastosowaniem metody 3.
P r z y k ł a d 15. 111In-DTPA-[Cyklo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)]2
Do 0,5 ml roztworu odczynnika opisanego w przykładzie 7 w wodzie, przy stężeniu
0,9 mg/ml wprowadzane 111InCl3(około 3 mCi) w 0,5 ml 1 N roztworu NH 4OAc. Mieszaninę
odstawiono w temperaturze pokojowej na 30 minut, po czym poddano analizie metodą HPLC,
z zastosowaniem metody 3. (Patrz tabela 3).
Tabela 3
Dane analityczne i dotyczące wydajności odnoszące się do odczynników znakowanych 1 1 1in
Przykład nr
H P LC Czas retencji (min)
Wydajność (% )
14
13 ,3
97
15
14 ,5
98
Część C. Odczynniki znakowane 99mTc wytwarzane zgodnie z podejściem prechelatowym.
Znakowane 99mTc odczynniki opisane w przykładach wytworzono zgodnie z podejściem
prechelatowym. Podejście prechelatowe przewiduje przeprowadzenie następujących etapów:
1) chelatacja 99mTc przez chelator; 2) aktywacja nieskoordynowanej grupy karboksylowej
obecnej w wytworzonym kompleksie przez utworzenie estru tetrafluorofenylowego (TFP),
oraz 3) sprzężenie kompleksu, w którym występuje ester TFP, w wyniku utworzenia wiązania amidowego, z cyklicznym związkiem pośrednim lub z modyfikowanym grupą mostkową
związkiem cyklicznym.
P r z y k ł a d 16. Cyklo-([[99mTcO(mapt)]"-D-Lys]-NMeArg-Gly-Asp-Mamb).
Część A. Chelatacja 99mTc.
Do czystej 10-cm3fiolki wprowadzono 0,35 ml Bz-mapt (3,0 mg/ml w 1 NNaOH), 0,10 ml
SnCl2. 2H2O) (10 mg/ml w 1 N HCl) i 200 mCi 99mTcO4 w wodnym roztworze chlorku sodu.
Fiolkę zakapslowano i umieszczono w 100°C łaźni wodnej na okres 25 minut. Po ochłodzeniu
w ciągu około 2 minut, pobrano 10 roztworu w celu wykonania analizy metodą HPLC, z zastosowaniem metody 1.
Część B. Aktywacja.
Do roztworu z części A dodano 0,3 ml 0,5 M roztworu fosforanu sodu, pH 6, 0,3 ml
2,3,5,6-tetrafluorofenolu (100 mg/ml w 90% acetonitrylu), 0,3 ml 1-(3-dimetyloaminopropylo)-3-etylokarbodiimidu (100 mg/ml w 90% acetonitrylu) i około 0,1 ml 1 N HCl. pH doprowadzano, w miarę potrzeby, do wartości 6. Fiolkę zakapslowano i ogrzewano w temperaturze 40°C
w ciągu 25 minut. Po ochłodzeniu w ciągu około 2 minut, pobrano 20 µl w celu wykonania analizy metodą HPLC, z zastosowaniem metody 1.
Część C. Sprzęganie.
W 0,3 ml 0,5 M buforu fosforanowego pH 9 rozpuszczono 1,0-2,5 mg cyklicznego
związku pośredniego cyklo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) i otrzymany roztwór dodano do
roztworu z części B. pH doprowadzono do 9 przy użyciu 1 N NaOH. Otrzymaną mieszaninę
reakcyjną ogrzewano w temperaturze 40°C w ciągu 30 minut. Po ochłodzeniu w ciągu około
2 minut, pobrano 25 µl roztworu w celu wykonania analizy metodą HPLC, z zastosowaniem
metody 1. (Patrz tabela 4).
P r z y k ł a d 17. Cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb([99mTcO(mapt)]'-5-Aca)).
W 0,3 ml 0,5 M buforu fosforanowego pH 9 rozpuszczono 1,0-2,5 mg modyfikowanego
grupą mostkową związku cyklicznego cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-Aca)) i
otrzymany roztwór dodano do roztworu z przykładu 16, część B. pH doprowadzono do wartości 9 przy użyciu 1 N NaOH. Otrzymaną mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze
40°C w ciągu 30 minut. Po ochłodzeniu w ciągu około 2 minut, pobrano 25µ roztworu w celu
wykonania analizy metodą HPLC, z zastosowaniem metody 1. (Patrz tabela 4).
178 252
61
P r z y k ł a d 18. Cyklo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb([99mTcO(mapt)]'-5-Aca)).
W 0,3 ml 0,5 M buforu fosforanowego pH 9 rozpuszczono 1,0-2,5 mg modyfikowanego
grupą mostkową związku cyklicznego cyklo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-Aca)) i
otrzymany roztwór wprowadzono do roztworu z przykładu 16, część B. pH doprowadzono do
wartości 9 przy użyciu 1 N NaOH. Otrzymaną mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze 40°C w ciągu 30 minut. Po ochłodzeniu w ciągu 2 minut, pobrano 25 µl roztworu w celu
wykonania analizy HPLC, z zastosowaniem metody 1 (patrz tabela 4).
P r z y k ł a d 19. Cyklo-([([99mTcO(mapt)]'-5-Aca)D-Lys]-NMeArg-Gly-Asp-Mamb).
W 0,3 ml 0,5 M buforu fosforanowego pH 9 rozpuszczono 1,0-2,5 mg modyfikowanego
grupą mostkową związku cyklicznego cyklo-((5-Aca)-D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) i
otrzymany roztwór dodano do roztworu z przykładu 16, część B. pH doprowadzono do wartości 9
przy użyciu 1 N NaOH. Otrzymaną mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze 40°C
w ciągu 30 minut. Po ochłodzeniu w ciągu około 2 minut, pobrano 25µl roztworu w celu wykonania analizy metodą HPLC, z zastosowaniem metody 1. (Patrz tabela 4).
P r z y k ł a d 20.Cyklo-(L[[99mTcO(MeMAG2gaba)]'-D-Lys]-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)
(gaba - kwas y-aminomasłowy), MAG2= merkaptoacetyloglicyloglicyna)
Część A. Chelatacja.
Do 10-cm3fiolki wprowadzono 100-250 mCi 99mTcO4 w 1,0 ml wodnego roztworu chlorku sodu i 1,0 ml roztworu BzMeMAG2gaba (lmg/1 ml w 0,5 M buforze fosforanowym pH 12),
po czym dodano 0,15-0,20 ml roztworu SnCl2-2H2O (15 mg/3 ml w 1N HCl). pH doprowadzono
do wartości około 11, po czym otrzymaną mieszaninę ogrzewano w temperaturze 100°C w ciągu
30 minut. Otrzymany roztwór poddano analizie metodą HPLC, z zastosowaniem metody 1.
Część B. Aktywacja.
Do roztworu z części A dodano 0,2 ml i 1N HCl, 0,5 ml roztworu tetrafluorofenolu (100 mg/ml
w 90% CH3CN) i 0,5 ml roztworu chlorku (l-[3-(dimetyloamino)propylo]-3-etylokarbodiimidu
(100 mg/ml w 90% CH3CN). pH doprowadzono do 6,0, po czym otrzymaną mieszaninę ogrzewano w temperaturze 50°C w ciągu 30 minut.
Część C. Sprzęganie.
W 0,3 ml 0,5 M buforu fosforanowego pH 9 rozpuszczono 1,0-2,5 mg cyklicznego
związku pośredniego cyklo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) i otrzymany roztwór dodano
do roztworu z części B. Przy użyciu 1 N NaOH doprowadzono pH do wartości 9. Otrzymaną
mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze 40°C w ciągu 30 minut. Po ochłodzeniu w
ciągu około 2 minut, 25 µl roztworu poddano analizie metodą HPLC, z zastosowaniem metody 1.
(Patrz tabela 4).
Pr z y kł a d 21. Cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(99mTcO(MeMAG2gaba)]‘-5-Aca))
W 0,3 ml 0,5 M buforu fosforanowego pH 9 rozpuszczone 1,0-2,5 mg modyfikowanego
grupą mostkową związku cyklicznego cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-Aca)) i otrzymany roztwór dodano do roztworu z przykładu 20, część B. Przy użyciu 1N NaOH doprowadzono pH do wartości 9. Otrzymaną mieszaninę reakcyjnąogrzewano w temperaturze 40°C w ciągu
30 minut. Po ochłodzeniu w ciągu około 2 minut, 25 µl roztworu poddano analizie metodą HPLC,
z zastosowaniem metody 1. (Patrz tabela 4).
Pr z ykł a d 22. Cyklo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb([99mTcO(MeMAG2gaba)]‘-5-Aca))
W 0,3 ml 0,5 M buforu fosforanowego pH 9 rozpuszczono 1,0-2,5 mg modyfikowanego
grupą mostkową związku cyklicznego cyklo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-Aca)) i
otrzymany roztwór dodano do roztworu z przykładu 20, część B. Przy użyciu 1 N NaOH pH doprowadzono do wartości 9. Otrzymaną mieszaninę reakcyjnąogrzewano w temperaturze 40°C w
ciągu 30 minut. Po ochłodzeniu w ciągu około 2 minut, 25µ l roztworu poddano analizie metodą
HPLC, z zastosowaniem metody 1. (Patrz tabela 4).
P r z y k ł a d 23. Cyklo-([[99mTcO(MAG3)]-D-Lys]-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)
Syntezę w tym przykładzie przeprowadzono zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w przykładzie 20, ale z użyciem Bz-MAG3jako chelatora. (Patrz tabela 4).
62
178 252
P r z y k ł a d 24. Cyklo-([[99mTcO(Me-MAG3)]-D-Lys]-NMeArg-Gly-Asp-Mamb).
Syntezę w tym przykładzie przeprowadzono zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w przykładzie 20, ale z użyciem Bz-Me-MAG jako chelatora. (Patrz tabela 4).
P r z y k ł a d 25. Cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb([99mTcO(MeMAG2ACA)] -5-Aca)).
Związek tytułowy wytworzono zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w przykładzie 20, ale z użyciem Bz-Me-MAG2ACA (patrz przykład 58), jako chelatora w części A i
z użyciem cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-Aca)) jako zmodyfikowanego grupą
mostkową związku cyklicznego w części C. (Patrz tabela 4).
P r z y k ł a d 26. Cyklo-([[99mTcO[MABA)-D-Lys]-NMeArg-Gly-Asp-Mamb).
Część A. Chelatacja.
Do 10 ml fiolki wprowadzono 50-300 mCi 99mTcO4 w 0,5 ml wodnego roztworu chlorku
sodu, a następnie 0,5 ml roztworu Bz-MABA (1 mg/ml w 0,5 M buforze fosforanowym pH 12) i
0,15 ml roztworu Na2S2O4 (5 mg/ml w 0,5 M buforu fosforanowym pH 11,5). pH doprowadzono
do wartości 10-12 przy użyciu 1 N NaOH i otrzymaną mieszaninę ogrzewano w ciągu 30 minut
w temperaturze 100°C, po czym poddano analizie metodą HPLC, z zastosowaniem metody 1.
Część B. Aktywacja.
Do roztworu z części A dodano 0,2 ml 1 N HCl, 0,5 ml roztworu TFP (50 mg/0,5 ml
w 90% CH3CN) i 0,5 ml roztworu DCI (chlorku 1-[3-(dimetyloamino)propylo]-3-etoksykarbodiimidu) (50 mg w 0,5 ml 90% CH3CN). pH doprowadzono, w miarę potrzeby, do wartości 6 i otrzymaną mieszaninę ogrzewano w temperaturze 45-50°C w ciągu 30 minut, a następnie poddano analizie metodą HPLC, z zastosowaniem metody 1.
Część C. Sprzęganie.
Do roztworu z części B dodano 2-3 mg cyklicznego związku pośredniego cyklo-(DLys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) rozpuszczonego w 0,5 ml 0,5 M buforu fosforanowego pH 9,
po czym pH doprowadzone do wartości 9,5-10. Otrzymany roztwór ogrzewano w temperaturze 50°C w ciągu 30 minut, a następnie poddano analizie metodą HPLC, z zastosowaniem
metody 1. (Patrz tabela 4).
P r z y k ł a d 27. Cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb([99mTcO(MABA)]'-5-Aca)).
Związek tytułowy zsyntetyzowano zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w
przykładzie 26, ale z tą różnicą, że zamiast cyklicznego związku pośredniego cyklo-(D-LysNMeArg-Gly-Asp-Mamb) użyto w części C modyfikowanego grupą mostkową cyklicznego
związku cyklo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-Aca)).
P r z y k ł a d 28. Cyklo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb([99mTcO(MABA)]'-5-Aca)).
Związek tytułowy zsyntetyzowano zgodnie ze sposobem postępowania opisanym w
przykładzie 26, ale z tą różnicą, że zamiast cyklicznego związku pośredniego cyklo-(D-LysNMeArg-Gly-Asp-Mamb) użyto w części C modyfikowanego grupą mostkową cyklicznego
związku cyklo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-Aca)).
P r z y k ł a d 29. Cyklo-([[99m
TcO(MA-MAMA)]-D-Lys]-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)
Część A. Odblokowanie.
Grupy trifenylometylowe obecne w chelatorze MA-MAMA (patrz przykład 60) usunięto za pomocą rozpuszczenia 6 mg w 1 ml bezwodnego kwasu trifluorooctowego (TFA).
Utworzony roztwór odstawiono na 5 minut w temperaturze pokojowej. Do roztworu o barwie
żółtej dodano 0,5 ml trietylosilanu, w wyniku czego otrzymano klarowną mieszaninę dwuwarstwową. Substancje lotne usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymano pozostałość o barwie białej.
Część B. Hydroliza estru etylowego.
Do pozostałości o barwie białej z części A dodano 0,5 ml 5 N NaOH i 1 ml THF.
Otrzymaną mieszaninę ogrzewano w łaźni wodnej (100°C) w ciągu 5 minut i w tym czasie
178 252
63
większość THF odparowała. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodano 3 ml 0,5 M buforu
fosforanowego pH 11,5. pH doprowadzono do wartości 10-12, po czym dodano 15-30 mg
podsiarczynu sodu. Otrzymaną mieszaninę przesączono i objętość doprowadzono w całości
do 6ml przy użyciu 0,5 M buforu fosforanowego pH 11,5.
Część C. Chelatacja.
Do 10 ml fiolki wprowadzono 50-150 mCi 99mTcO4' w 0,5 ml wodnego roztworu chlorku sodu, a następnie 0,5 ml roztworu ligandu z części B. pH doprowadzono do wartości 10-12
przy użyciu 1 N NaOH, po czym otrzymaną mieszaninę ogrzewano w ciągu 30 minut w temperaturze 100°C, a następnie poddano analizie metodą HPLC, z zastosowaniem metody 1.
Część D. Aktywacja.
Do roztworu z części C dodano 0,2 ml 1 N HCl, 0,5 ml roztworu TFP (50 mg/0,5 ml
90% CH3CN) i 0,5 ml roztworu DCI (50 mg w 0,5 ml 90% CH3CN). pH doprowadzono do
wartości 6 (jeżeli okazało się to potrzebne), po czym mieszaninę ogrzewano w temperaturze 4560°C w ciągu 30 minut, a następnie poddano analizie metodą HPLC, z zastosowaniem metody 1.
Część E. Sprzęganie.
Do roztworu z części D dodano 2,5 mg cyklicznego związku pośredniego cyklo-(D-LysNMeArg-Gly-Asp-Mamb), rozpuszczonego w 0,5 ml 0,5 M buforu fosforanowego pH 9, po
czym pH doprowadzono do wartości 9,5-10. Po ogrzewaniu w temperaturze 50°C
w ciągu 30 minut, roztwór poddano analizie metodą HPLC, z zastosowaniem metody 1.
P r z y k ł a d 30. Cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb([99mTcO(MA-MAMA)]-5-Aca))
Syntezę związku tytułowego przeprowadzono zgodnie ze sposobem postępowania
opisanym w przykładzie 29, z tą różnicą, że zamiast cyklicznego związku pośredniego cyklo(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) użyto w części E modyfikowanego grupą mostkową
związku cyklicznego cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5Aca).
Tabela 4
Dane analityczne i dotyczące wydajności odnoszące się do odczynników znakowanych 99mT c
Przykład nr
H P LC Czas retencji (min)
W ydajność (% )
1
2
3
16
15 ,0
60
17
16 ,2
45
18
15 ,3
35
19
15 ,5
55
20
14 ,3
44
21
15 ,5
34
22
14 ,5
70
23
13 ,2
50
24
13,0
55
25
14 ,3
40
26
18 ,2
27
19 ,1
28
19 ,3
10
22
22
29
14,8
23
30
16 ,2
34
64
178 252
Metody analityczne
HPLC metoda 1
Kolumna: Vydac C18, 250 mm x 4,6 mm, wielkość porów 300 A
Rozpuszczalnik A: 10 mM fosforan sodu, pH 6,0
Rozpuszczalnik B: 100% acetonitryl
Gradient:
0% B 30% B 75% B
0' 15' 25'
Szybkość przepływu: 1,0 ml/min.
Detekcja: sonda Nal
TLC metoda 2
Pasek ITLC-SG, 1 cm z 7,5 cm, rozwijany w układzie aceton/woda 1:1
HPLC metoda 3
Kolumna: Vydac C18, 250 mm x 4,6 mm, wielkość porów 300 A
Rozpuszczalnik A: 10 mM fosforan sodu, pH 6,0
Rozpuszczalnik B: 75% acetonitryl w rozpuszczalniku A
Gradient:
5% B 5% B 100% B
0' 5' 40'
Szybkość przepływu: 1,0 ml/min
Detekcja: sonda Nal.
P r z y k ł a d 31. Kwas Boc-D-2-aminomasłowy (Boc-D-Abu) wytworzono sposobem
stanowiącym modyfikację sposobu postępowania poprzednio opisanego w literaturze [Itoh,
Hagiwara i Kamiya, Tett. Lett., 4393 (1975)], jak to przedstawiono na schemacie 26.
Schemat 26
W 20 ml H2O rozpuszczono 1,0 g (9,70 mmola) kwasu D-2-aminomasłowego, po czym
dodano roztworu 2,62 g (10,6 mmola) Boc-ON w 20 ml acetonu. Utworzył się osad o barwie
białej, który rozpuścił się po dodaniu 3,37 ml (24,2 mmola) trietyloaminy, w wyniku czego
utworzył się roztwór o barwie bladożółtej, o pH 9 (wilgotny papierek wskaźnikowy). Roztwór
ten mieszano w temperaturze pokojowej przez noc, po czym usunięto aceton pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałą warstwę wodną poddano ekstrakcji trzykrotnie eterem, zakwaszono do pH 2 stężonym kwasem solnym i poddano trzykrotnie ekstrakcji octanem etylu. Połączone warstwy organiczne osuszono bezwodnym siarczanem magnezu i odparowano pod
zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego utrzymano 2,05 g (powyżej wydajności ilościowej, z zawartością rozpuszczalnika kwasu tert-butoksykarbonylo-D-2-aminomasłowego w
postaci oleju, który stosowano następnie bez dalszego oczyszczania. 1H NMR (CDCl3): 0,98
(t, 3H), 1,45 (s, 9H), 1,73 (m, 1H), 1,90 (m, 1H), 4,29 (m, 1H), 5,05 (m, 1H).
P r z y k ł a d 32. Kwas 3-aminometylobenzoesowy. HCl
W 200 ml etanolu rozpuszczono 10,0 g (68 mmoli) kwasu 3-cyjanobenzoesowego przy
ogrzewaniu w łaźni wodnej o temperaturze 35-50°C, następnie dodano 6,12 ml (73 mmola)
stężonego HCl i utworzony roztwór przeniesiono do 500 ml przedmuchanej azotem kolby
178 252
65
okrągłodennej zawierającej katalizator palladowy na węglu (1,05 g, 10% Pd/C). Otrzymaną
zawiesinę mieszano w atmosferze wodoru w ciągu 38 godzin, po czym przesączono przez
lejek z filtrem ze spiekanego szkła i dokładnie przemyto H2O. Etanol usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałą warstwę wodną, zawierającą osad o barwie białej, rozcieńczono
do objętości 250 ml dodatkową ilością wody. Następnie dodano 50 ml eteru i utworzoną zawiesinę przeniesiono do rozdzielacza. Po energicznym wymieszaniu wszystkie substancje
stałe rozpuściły się. Następnie warstwę wodną przemyto dwukrotnie eterem, odparowano do
objętości 150 ml pod zmniejszonym ciśnieniem i zliofilizowano, w wyniku czego otrzymano
8,10 g (64%) związku tytułowego (kwas 3-aminometylobenzoesowy. HCl) w postaci substancji stałej o barwie beżowej.
1H NMR (D2O): 4,27 (s, 2H), 7,60 (t, 1H), 7,72 (d, 1H), 8,06 (d, 2H).
P r z y k ł a d 33.Kwastert-butoksykarbonylo-3-aminometylobenzoesowy(Boc-Mamb).
Związek tytułowy wytworzono zgodnie z modyfikacją typowych sposobów postępowania poprzednio opisanych w literaturze [(Itoh, Hagiwara i Kamiya, Tett. Lett., 4393 (1975)].
W 60 ml H2O rozpuszczono 3,0 g (16,0 mmola) chlorowodorku kwasu 3aminometylobenzoesowego. Do utworzonego roztworu dodano roztworu 4,33 g (17,6 mmola)
Boc-ON w 60 ml acetonu, a następnie 5,56 ml (39,9 mmola) trietyloaminy. Roztwór zmienił
barwę na żółtą, po czym pH doprowadzono do 9 (wilgotny papierek wskaźnikowy) przez dodanie jeszcze 1,0 ml (7,2 mmola) trietyloaminy. Następnie roztwór mieszano przez noc w
temperaturze pokojowej, po czym aceton usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałą
warstwę wodną przemyto trzykrotnie eterem. Następnie warstwę wodną zakwaszono do pH 2
przy użyciu 2N HCl, po czym poddano trzykrotnie ekstrakcji octanem etylu. Połączone warstwy organiczne przemyto trzykrotnie H2O, osuszono bezwodnym siarczanem magnezu i odparowano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymany produkt poddano rekrystalizacji z mieszaniny octanu etylu i heksanu, w wyniku czego otrzymano dwa rzuty związku tytułowego, w ilości 2,58 g (64%) w postaci substancji stałej o barwie białawej. Temperatura topnienia 123-125°C.
1H NMR (CDCl3): 1,47 (s, 9H), 4,38 (br s, 2H), 4,95 (br s, 1H), 7,45 (t, 1H), 7,55 (d,
1H), 8,02 (d, 2H).
P r z y k ł a d 34. Kwastert-butoksykarbonylo-3-aminofenylooctowy
Roztwór 10 g (66 mmoli) kwasu 3-aminofenylooctowego (Aldrich), 15,8 g (72 mmoli)
diwęglanu di-tert-butylu i 8,6 g (66 mmoli) DIEA w 50 ml dichlorometanu mieszano przez
noc w temperaturze pokojowej. Otrzymaną mieszaninę reakcyjną zatężono i poddano ekstrakcji mieszaniną dichlorometanu i wody, po czym warstwę wodną oddzielono, zakwaszono do
pH 3 przy użyciu 1 N HCl i poddano ekstrakcji dichlorometanem. Otrzymane ekstrakty przemyto H2O i wodnym roztworem chlorku sodu, po czym osuszono bezwodnym siarczanem
sodu i odparowano do sucha pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymany produkt oczyszczano
na drodze rekrystalizacji z heptanu, w wyniku czego otrzymano 3,7 g (22%) związku tytułowego w postaci substancji stałej o barwie białej. Temperatura topnienia: 105°C.
1H NMR (CDCl3): 7,35 (s, 1H), 7,25 (m, 3H), 6,95 (m, 1H), 6,60 (br s, 1H), 3,65 (s, 2H),
1,50 (s, 9H).
P r z y k ł a d 35. 5-Laktam kwasu 2-aminometylo fenylooctowego
Związek tytułowy wytworzono zgodnie z modyfikacją sposobów postępowania poprzednio podanych w literaturze [Naito i in., J. Antibiotics, 30, 698 (1977)]. Do oziębianej
lodem zawiesiny 10,8 g (82 mmoli) 2-indanonu i 9,4 g (82 mmoli) azydotrimetylosilanu w
115 ml chloroformu wprowadzono 25 ml stężonego kwasu siarkowego z taką szybkością aby
utrzymać temperaturę w zakresie 30-40°C. Po upływie dodatkowych 3 godzin, mieszaninę
reakcyjną wylano na lód, po czym warstwę wodną zalkalizowano stężonym wodorotlenku
amonu. Warstwę chloroformową oddzielono, przemyto wodą i wodnym roztworem chlorku
66
178 252
sodu, po czym osuszono bezwodnym siarczanem magnezu i odparowano do sucha pod
zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymany produkt poddano oczyszczaniu za pomocą przesublimowania (145°C, <1 mm), a następnie rekrystalizacji z benzenu, w wyniku czego otrzymano
5,4 g 945%) związku tytułowego w postaci kryształów o barwie bladożółtej. Temperatura
topnienia: 149-150°C.
1H NMR (CDCl3): 7,20 (m, 5H), 4,50 )s, 2H), 3,60 (s, 2H).
P r z y k ł a d 36. Kwas 2-aminometylofenylooctowy. HCl
Związek tytułowy wytworzono zgodnie z modyfikacją sposobów postępowania poprzednio podanych w literaturze [Naito i in., J. Antibiotics, 30, 698 (1977)].
Mieszaninę 6,4 g (44 mmoli) 8 laktamu kwasu 2-aminometylofenylooctowego i 21 ml 6
N HCl ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin w ciągu 4 godzin.
Następnie mieszaninę reakcyjną zadano węglem aktywnym (Norit A) i po przesączeniu odparowano do sucha. Pozostałość o konsystencji oleju ucierano z acetonem. Po przesączeniu
otrzymano 5,5 g związku tytułowego (62%) w postaci bezbarwnych kryształów. Temperatura
topnienia: 168°C (rozkład).
1H NMR (D6-DMSO): 12,65 (br s, 1H), 8,35 (br s, 3H), 7,50 (m, 1H), 7,35 (m, 3H),
4,05 (ABq, 2H), 3,80 (s, 2H).
P r z y k ł a d 37.y-Laktamkwasu2-aminometylobenzoesowego
Związek tytułowy wytworzono zgodnie z modyfikacją sposobów postępowania poprzednio opisanych w literaturze [Danishefsky i in., J. Org. Chem. 40, 796 (1975)].
Mieszaninę 45 g (33 moli) estru metylowego kwasu o-metylobenzoesowego, 57 g
(32 moli) N-bromosukcynoimidu i 0,64 nadtlenku dibenzoilu w 175 ml tetrachlorku węgla
ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin w ciągu 4 godzin. Następnie ochłodzoną mieszaninę reakcyjną przesączono, odparowano do sucha pod zmniejszonym
ciśnieniem i rozpuszczono w 250 ml metanolu, po czym dodano do niej 75 ml (1,11 mola)
stężonego wodorotlenku amonu. Otrzymaną mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze
wrzenia w warunkach powrotu skroplin w ciągu 5 godzin, po czym zatężono i przesączono.
Osad przemyto wodą a następnie eterem. Otrzymany produkt poddano oczyszczaniu na drodze krystalizacji z wody, w wyniku czego otrzymano 11,0 g (26%) związku tytułowego w
postaci substancji stałej o barwie białej. Temperatura topnienia: 150°C.
1H NMR (CDCl3): 7,90 (d, 1H), 7,60 (t, 1H), 7,50 (t, 2H), 7,00 (br s, 1H), 4,50 (s, 2H).
P r z y k ł a d 38. Kwas 2-aminometylobenzoesowy.HCl
Związek tytułowy wytworzono z zastosowaniem ogólnego sposobu postępowania opisanego powyżej w odniesieniu do chlorowodorku kwasu 2-aminometylofenylooctowego.
3,5 g 26 mmoli) laktamu przekształcono w 2,4 g (50%) związku tytułowego w postaci bezbarwnych kryształów. Temperatura topnienia: 233°C (rozkład)
1H NMR (D6-DMSO): 13,40 (br s, 1H), 8,35 (br s, 3H), 8,05 (d, 1H), 7,60 (m, 3H), 4,35
(br s, 2H).
P r z y k ł a d 39. cyklo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)
Związek o wzorze (I), w którym J oznacza D-Abu.
Związek tytułowy wytworzono z zastosowaniem ogólnego sposobu postępowania opisanego poniżej w odniesieniu do cyklicznego związku pośredniego 4. Peptyd wytwarzany był
w skali 0,101 mmola, co prowadziło do otrzymania 51 mg (63%) zabezpieczonego peptydu
cyklicznego. 43 mg peptydu i 50 µl 1m-krezolu poddano działaniu bezwodnego fluorowodoru
w temperaturze 0°C w ciągu 30 minut. Produkt surowy wytrącono eterem i po rozpuszczeniu
w wodnym roztworze HOAc zliofilizowano, w wyniku czego otrzymano 23 mg (68,7%)
związku tytułowego w postaci substancji stałej o barwie bladożółtej (wydajność w przeliczeniu na octan). Oczyszczenia dokonano metodą HPLC z odwróconymi fazami na kolumnie
preparatywnej Yydac C 18 (2,5 cm), przy 0,23%/min gradiencie 7-14% acetonitrylu zawiera-
178 252
67
jącego 0,1% kwasu trifluorooctowego. Po liofilizacji otrzymano sól związku tytułowego z
TFA w postaci puszystej substancji stałej o barwie białej (odzysk 31%, wydajność ogólna
12,4%).
Widmo masowe: [M+H] = 561,46.
P r z y k ł a d 40. cyklo-(Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)
Związek o wzorze (I), w którym J oznacza Abu.
Związek tytułowy wytworzono z zastosowaniem ogólnego sposobu postępowania opisanego w odniesieniu do cyklo-(D-Val-NMeARG-Gly-Asp-Mamb) (cykliczny związek pośredni 4). W celu przyłączenia Boc-Mamb do żywicy oksymowej użyto metody DCC/DMAP.
Jako odczynnika sprzęgającego użyto TBTU. Peptyd wytwarzany był w skali 0,596 mmola,
co prowadziło do otrzymania 182 mg (38,4%) zabezpieczonego peptydu cyklicznego. 176 mg
peptydu i 0,176 ml anizolu poddano działaniu bezwodnego fluorowodoru w temperaturze 0°C
w ciągu 20 minut. Produkt surowy wytrącono eterem i po rozpuszczeniu w wodnym roztworze acetonitrylu zliofilizowano, w wyniku czego otrzymano 116 mg (90,4% w przeliczeniu na
fluorek) związku tytułowego. Oczyszczenia dokonano metodą HPLC z odwróconymi fazami
na kolumnie preparatywnej Vydac C18 (2,5 cm) przy gradiencie 0,45%/min 9-27% acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA. Po liofilizacji otrzymano sól związku tytułowego z TFA
w postaci puszystej substancji stałej o barwie białej (odzysk 1,92%, wydajność ogólna
0,574%). FAB-MS: [M+H] = 561,39.
P r z y k ł a d 41. cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)
Związek o wzorze (I), w którym J oznacza D-Val.
Do 25 ml probówki polipropylenowej wyposażonej w spiek wprowadzono 0,126 g (0,5
mmola) Boc-Mamb i 6 ml DMF. Następnie dodano 0,194 g (0,5 mmola) HBTU, 0,52 g żywicy oksymowej (poziom podstawienia = 0,96 mmola/g) i 0,165 ml (1,50 mmola) Nmetylomorfoliny. Utworzoną zawiesinę mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu 24 godzin. Następnie żywicę przemyto dokładnie (10-12 ml objętościami) 3 razy DMF, 1 raz MeOH, 3 razy DCM, 2 razy MeOH i 3 razy DCM. Ilościową metodą ninhydrynową oznaczono
poziom podstawienia wynoszący 0,389 mmola/g. Nieprzereagowane grupy oksymowe zostały
zablokowane przez podziałanie 0,5 M chlorkiem trimetyloacetylu/0,5 M DIEA w DMF w
ciągu 2 godzin. Następnie przeprowadzono następujące etapy:
(Etap 1): żywicę przemyto 3 razy DMF, 1 raz MeOH, 3 razy DCM, 2 razy MeOH i 3
razy DCM.
(Etap 2): odblokowano grupę Boc przy użyciu 25% TFA w DCM w ciągu 30 minut.
(Etap 3): żywicę przemyto 3 razy DCM, 1 raz MeOH, 2 razy DCM, 3 razy MeOH i 3
razy DMF.
(Etap 4): do żywicy dodano 0,613 g (1,94 mmola) Boc-Asp(OcHex), 0,753 g (1,99 mmola)
HBTU, 8 ml DMF i 0,642 ml (5,84 mmola) N-metylomorfoliny, po czym prowadzono reakcję
w ciągu 2,5 godziny.
(Etap 5): jakościową metodą ninhydrynową stwierdzono całkowite zajście reakcji
sprzęgania.
Etapy 1-5 powtarzano tyle razy, ile było trzeba do uzyskania pożądanej sekwencji.
Sprzęganie Boc-D-Val z NMeArg kontrolowano z zastosowaniem testu z użyciem kwasu pikrynowego. Po złożeniu peptydu liniowego usunięto N-końcową grupę tert-Boc przez podziałanie 25% TFA w DCM w ciągu 30 minut. Następnie żywicę przemyto dokładnie 3 razy
DCM, 2 razy MeOH i 3 razy DCM, po czym zobojętniono przez podziałanie 10% DIEA w
DCM 2 razy po 1 minucie. Żywicę przemyto dokładnie 3 razy DCM i 3 razy MeOH, po czym
wysuszono. Połowę żywicy (0,101 mmola) poddano cyklizacji przez podziałanie 6 ml DMF
zawierającego HOAc 5,8 ml (0,101 mmola) i ogrzewanie w temperaturze 50°C w ciągu 72
godzin. Następnie żywicę odsączono na lejku z filtrem ze spiekanego szkła ze starannym
68
178 252
przemyciem przy użyciu DMF. Przesącz DMF odparowano do konsystencji oleju, rozpuszczono w mieszaninie acetonitrylu i wody 1:1 i zliofilizowano, w wyniku czego otrzymano 49
mg (60%) zabezpieczonego peptydu cyklicznego. 42 mg peptydu poddano działaniu bezwodnego fluorowodoru w temperaturze 0°C, w obecności 50 ml m-krezolu jako zmiatacza, w ciągu 30 minut, w celu usunięcia grup zabezpieczających łańcuch boczny. Produkt surowy wytrącono eterem i po rozpuszczeniu w wodnym roztworze HOAc zliofilizowano, w wyniku
czego otrzymano 23 mg (70% w przeliczeniu na octan). Oczyszczenia dokonano metodą
HPLC z odwróconymi fazami na preparatywnej kolumnie Vydac C18 (2,5 cm) przy
0,23%/minutę gradiencie 7-18% acetonitrylu zawierającego 0,1% kwasu trifluorooctowego, w
wyniku czego otrzymano sól związku tytułowego z TFA w postaci puszystej substancji stałej
o barwie białej (odzysk 24%, wydajność ogólna 9,4%).
FAB-[MS: [M+H] = 575,45.
P r z y k ł a d 42. Synteza cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) w fazie ciekłej
Poniżej użyto następujących oznaczeń skrótowych, odnoszących się do układów rozpuszczalników w chromatografii cienkowarstwowej (TLC):
Chloroform/metanol
95:5 = CM
Chloroform/kwas octowy
95:5 = CA
Chloroform/metanol/kwas octowy 95:5 = CMA.
A. Boc-NMeArg(Tos)-Gly-OBzl
W 25 ml CH2Cl2 rozpuszczono 11,07 g (25 mmoli) BocNMeArg(Tos) (Bachem),
10,10 g (30 mmoli)Gly-OBzl-p-toluenosulfonianu (Bachem), 9,48 g (25 mmoli) HBTU (heksafluorofosforanu O-benzotriazolo-N,N,N'N' tetrametylouroniowego (Advanced Chemtech) i
75 mmoli DEEA (diizopropyloetyloaminy) (Aldrich). Reakcję prowadzono w ciągu godziny,
po czym rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 50°C do
konsystencji syropu i rozpuszczono tę pozostałość w 400 ml octanu etylu. Otrzymany roztwór
poddano ekstrakcji (za każdym razem po 150 ml) 2 razy 5% kwasem cytrynowym, 1 raz wodą, 2 razy nasyconym roztworem NaHCO3, 1 raz nasyconym roztworem NaCl. Następnie
warstwę organiczną osuszono MgSO4 i rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Oleistą pozostałość ucierano z eterem naftowym i wysuszono w warunkach wysokiej próżni w ciągu przynajmniej jednej godziny, w wyniku czego otrzymano 14,7 g (99,5%)
produktu.
TLC. RfcM) = 0,18; Rf(CA) = 0,10.
NMR: widmo zgodne z budową.
FABMS: M+H+ = 590,43 (oczekiwano 590,26).
B. NMeArg(Tos)-Gly-OBzl
W 30 ml TFA rozpuszczono 14,5 g (24,5 mmola) BocNMeArg(Tos)-Gly-OBzl i
prowadzono reakcję w ciągu 5 minut, po czym rozpuszczalnik odparowano w temperaturze pokojowej pod ciśnieniem 1 mm Hg. Pozostałość o konsystencji syropu rozpuszczono
w 400 ml octanu etylu schłodzonego w lodzie i poddano ekstrakcji 100 ml nasyconego
roztworu NaHCO3 schłodzonego w lodzie. Fazę wodną poddano 2 razy ekstrakcji po 200 ml
octanu etylu i połączone warstwy organiczne poddano ekstrakcji 1 raz (25 ml) nasyconym
roztworem NaCl. Następnie rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, w
wyniku czego otrzymano pozostałość o konsystencji lepkiego oleju, którą ucierano z 300 ml
eteru. Utworzoną substancję stałą odsączono i przemyto eterem, w wyniku czego otrzymano
związek higroskopijny, który wysuszono w eksykatorze próżniowym.
Wydajność: 10,33 g (86,2%).
TLC: Rf(CM>—0,03; Rf cma ) = 0,20.
NMR: widmo zgodne z budową.
FABMS: M+H+= 490,21 (oczekiwano 490,20)
178 252
69
C. Boc-D-Val-NMeArg(Tos)-Gly-OBzl
W 10 ml chlorku metylenu rozpuszczono 4,80 g (9,80 mmola) NMeArg(Tos)-Gly-OBzl,
2,13 g (9,82 mmola) Boc-D-Val i 3,79 g (10,0 mmola) HBTU. Kolbę umieszczono w łaźni z
lodem i wprowadzono 3,45 ml (20 mmoli) DIEA. Reakcję prowadzono w temperaturze 0°C
w ciągu 15 minut i w temperaturze pokojowej w ciągu 2 dni. Następnie mieszaninę reakcyjną
rozcieńczono 400 ml octanu etylu i poddano ekstrakcji (za każdym razem po 200 ml), 2 razy
5% kwasem cytrynowym i 1 raz nasyconym roztworem chlorku sodu. Po osuszeniu MgSO4i
odparowaniu pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano pozostałość o konsystencji oleju,
którą ucierano z 50 ml, a następnie 30 ml eteru w ciągu 30 minut ze skutecznym mieszaniem.
Wydajność: 4,58 g (69%).
TLC: Rf(cm) = 0,27; (widoczna jest także plamka blisko startu, którą stanowi zanieczyszczenie aromatyczne, usuwane z produktu w następnym etapie).
NMR: widmo zgodne z budową.
FABMS: M+H+ = 689,59 (oczekiwano 689,43).
D. Boc-D-Val-NMeArg(Tos)-Gly
W 80 ml metanolu rozpuszczono 4,50 g (4,44 mmola) Boc-D-Val-NMeArg(Tos)-Gly-OBzl
i przez otrzymany roztwór przepuszczano N 2w ciągu 10 minut. Następnie dodano 1,30 g
katalizatora palladowego na węglu (10%, Fluka, nr serii produkcyjnej 273890) i wprost nad
powierzchnią mieszaniny reakcyjnej przepuszczano H2. Metodą TLC wykazano, że reakcja
zaszła do końca w ciągu około 0,5 godziny. Po upływie godziny usnięto katalizator przez
przesączenie przez warstwę Celite, po czym usunięto rozpuszczalnik w temperaturze 40°C
pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymaną w ten sposób substancję stałą ucierano dobrze
z 50 ml eteru w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin, po czym odsączono i
przemyto eterem naftowym.
Wydajność: 3,05 g (78%).
TLC: Rf(cM) = 0,03; Rf cma ) = 0,37;
NMR: widmo zgodne z budową.
FABMS: M+H+ = 599,45 (oczekiwano 599,29).
E. Oksym 4-nitrobenzofenonu (Ox)
50 g (220 mmoli) nitrobenzofenonu (Aldrich) i 30,6 g (440 mmoli) chlorowodorku hydroksyloaminy (Aldrich) ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin
w 0,5 litra mieszaniny metanolu i pirydyny 9:1 w ciągu 1 godziny. Mieszaninę reakcyjną odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem, rozpuszczono w 500 ml eteru i poddano ekstrakcji
(za każdym razem pod 200 ml) 2 razy 5% kwasem cytrynowym i raz nasyconym roztworem
NaCl, po czym osuszono MgSO4i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Po utarciu z
eterem otrzymano 44,35 g (83%) oksymu w postaci mieszaniny izomerów cis i trans.
TLC: Rf(cm) = 0,50; R f(cma ) = 0,82;
NMR: widmo zgodne z budową.
FABMS: M+H+= 242,07 (oczekiwano 242,07).
F. BocMamb-Ox
W 40 ml CH2Cl2 rozpuszczono 5,522 g (22 mmole) BocMamb, 4,84 g (20 mmoli)
oksymu nitrobenzenofenonu i 20 mmoli DMAP (4-dimetyloaminopirydyny) (Aldrich). Kolbę
umieszczono w łaźni z lodem i dodano 4,33 g (21 mmoli) DCC (dicykloheksylokarbodiimidu). Reakcję prowadzono przy oziębianiu lodem w ciągu 30 minut i w temperaturze pokojowej przez noc. Utworzony dicykloheksylomocznik odsączono i przemyto 40 ml chlorku metylenu. Przesącz odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze pokojowej do
konsystencji syropu i rozpuszczono w 400 ml octanu etylu. Roztwór ten poddano ekstrakcji
(za każdym razem po 150 ml) 2 razy 5% kwasem cytrynowym, 1 raz wodą 2 razy nasyconym
roztworem NaHCO3 i 1 raz nasyconym roztworem NaCl. Warstwę organiczną osuszono
70
178 252
MgSO4, po czym rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Oleistą pozostałość ucierano z eterem naftowym i wysuszono w warunkach wysokiej próżni w ciągu co
najmniej 1 godziny.
Wydajność: 7,51 g (79%).
TLC: Rf(CM)= 0,41; Rf(cma ) = 0,66.
NMR: widmo zgodne z budową.
FABMS: M+H+= 476,30 (oczekiwano 476,18).
G. TFA.MAMB-Ox
W 30 ml chlorku metylenu z zawartością 10 ml TFA (25% TFA) rozpuszczono 7,4 g
(15,5 mmola) BocMamb-Ox. Reakcję prowadzono w temperaturze pokojowej w ciągu godziny, po czym rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze pokojowej w ciągu 10 minut, a następnie w temperaturze 40°C w ciągu 15 minut. Pozostałość
o konsystencji syropu ucierano z 200 ml eteru, w temperaturze -5°C. Utworzone kryształy
odsączono po upływie 1 godziny i dobrze przemyto eterem
Wydajność: 7,22 g (95%);
Rf(CMA) = 0,25.
NMR: widmo zgodne z budową.
FABMS: M+IT = 376,22 (oczekiwano 376,12).
H. Boc-Asp(OcHex)-Mamb-Ox
W 20 ml DMF rozpuszczono 6,308 g (20 mmoli) Boc-Asp(OcHex) (Bachem) i 7,66 ml
(44 mmoli) DIEA. Następnie dodano 7,58 g (20 mmoli) HBTU (Advanced Chemtech) i prowadzono reakcję w ciągu 2 minut przy energicznym mieszaniu. Następnie dodano 7,13 g
(15 mmoli) TFA.Mamb-Ox i reakcję prowadzono przez noc w temperaturze pokojowej.
Następnie usunięto rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymano oleistą pozostałość, którą rozpuszczono w 500 ml octanu etylu. Otrzymany roztwór poddano ekstrakcji (za każdym razem po 150 ml), 2 razy 5% kwasem cytrynowym, 1 raz wodą
2 razy nasyconym roztworem NaHCO3 i 1 raz nasyconym roztworem NaCl. Następnie warstwę organiczną osuszono MgSO4 i rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Oleistą pozostałość ucierano z eterem naftowym i wysuszono w warunkach wysokiej
próżni.
Wydajność: 9,76 g (97%).
TLC: Rf(cM)= 0,55.
NMR: widmo zgodne z budową.
FABMS: M+H+= 673,45 (oczekiwano 673,23).
I. TFA Asp(OcHex)-MAMB-Ox
W 50 ml 35% TFA w CH2Cl2rozpuszczono 15 mmoli Boc-Asp(OcHex)-MAMB-Ox i
prowadzono reakcję w ciągu 90 minut. Następnie rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze pokojowej w ciągu 10 minut, a następnie w temperaturze
40°C w ciągu 15 minut. W celu usunięcia śladów TFA, dodano 25 ml DMF i rozpuszczalnik
odparowano w temperaturze 50°C. Pozostałość o konsystencji syropu ucierano z 200 ml eteru,
po czym wysuszono w warunkach wysokiej próżni. Wydajność: 9,61 g (93%).
Rf(CMA) = 0,45.
NMR: widmo zgodne z budową.
FABMS: M+H+= 573,56 (oczekiwano 573,23).
J. Boc-D-Val-NMeArg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-MAMB-Ox
W 20 ml DMF rozpuszczono 10,0 mmoli TFA Asp(OcHex)-MAMB-Ox, 10,0 mmoli
Boc-D-Val-NMeArg(Tos)-Gly i 10,0 mmoli HBTU oraz 30 mmoli DIEA. Po upływie 4 godzin
usunięto rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość rozpuszczono w 600 ml
octanu etylu. Otrzymany roztwór poddano ekstrakcji (za każdym razem po 300 ml) 5% kwa-
178 252
71
sem cytrynowym, wodą i nasyconym roztworem NaCl. Warstwę organiczną osuszono MgSO4
i odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość ucierano z eterem i wysuszono pod
zmniejszonym ciśnieniem.
Wydajność: 9,90 g (86%).
Rf(CM) = 0, 10.
NMR: widmo zgodne z budową.
FABMS: M+H+ = 1153,22 (oczekiwano 1153,47).
K. TFA. D-Val-NMeArg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-MAMB-Ox
Związek ten wytworzono z 9,8 g (8,5 mmola) Boc-D-Val-NMeArg-(Tos)-GlyAsp(OcHex)-MAMB-Ox na drodze reakcji z mieszaniną TFA i CH2Cl2 1:1 w ciągu 45 minut.
Rozpuszczalnik odparowano i pozostały produkt ucierano z eterem.
Wydajność: 9,73 g (98%).
Rf(CM) = 0, 10.
NMR: widmo zgodne z budową.
FABMS: M+H+ = 1053,22 (oczekiwano 1053,4).
L. Cyklo(D-Val-NMeArg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-MAMB)
W 200 ml DMF rozpuszczono 1,80 g (1,54 mmola) TFA. D-Val-NMeArg(Tos)-GlyAsp(OcHex)-MAMB-Ox i po 2 mmole DIEA i kwasu octowego. Otrzymaną mieszaninę
ogrzewano w temperaturze 50°C w ciągu 2 dni, po czym odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość o konsystencji syropu rozpuszczono w 400 ml mieszaniny octanu etylu
i n-butanolu 1:1 i poddano ekstrakcji (po 200 ml) 3 razy 5% kwasem cytrynowym i raz nasyconym roztworem NaCl. Warstwę organiczną osuszono MgSO4 i dwukrotnie ucierano z
200ml eteru.
Wydajność: 1,07 g (86%).
Rf(CM) = 0,10.
NMR: widmo zgodne z budową.
FABMS: M+H+= 811,25 (oczekiwano 811,38).
M. Cyklo(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-MAMB)
0,50 g cyklo(D-Val-NMeArg(Tos)-Gly-Asp(OcHex)-MAMB) poddano działaniu 5 ml
HF w temperaturze 0°C, w obecności 0,5 ml anizolu, w ciągu 30 minut. HF usunięto pod
zmniejszonym ciśnieniem i surowy peptyd ucierano z eterem, octanem etylu i eterem. Otrzymaną substancję stałą rozpuszczono w 10% kwasie octowym i zliofilizowano.
Wydajność: 0,321 g (82%, w przeliczeniu na octan).
Otrzymany produkt poddano oczyszczaniu z odzyskiem w przybliżeniu 40%, z zastosowaniem takiej samej metody, jaką opisano w odniesieniu do produktu zsyntetyzowanego
metodą syntezy w fazie stałej.
P r z y k ł a d 43. Krystalizacja cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)
Otrzymywanie soli
Stwierdzono, że związki według wynalazku można wyodrębniać przez wykrystalizowanie danego związku z rozpuszczalników organicznych lub wodnych.
Jon dwubiegunowy cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) przekształcono w jego
metanosulfonian za pomocą ogrzewania jonu dwubiegunowego w temperaturze wrzenia w
warunkach powrotu skroplin, przy mieszaniu, w środowisku izopropanolu, w stężeniu
25 mg/m l i przy powolnym dodawaniu roztworu 1,0 molowego równoważnika kwasu metanosulfonowego (z korektą na zawartość wody wprowadzanej z jonem obojnaczym) w izopropanolu. Po przerwaniu ogrzewania roztwór oziębiono do temperatury 5°C w łaźni z lodem.
Po mieszaniu w ciągu godziny roztwór ten przesączono i osad przemyto 3 razy zimnym izopropanolem, a następnie wysuszono do stałej wagi.
72
178 252
Według tego samego sposobu postępowania wytworzono następujące sole cyklo-(DVal-NMeArg-Gly-Asp-Mamb), przez dodanie 1,0 równoważnika odpowiedniego kwasu:
- cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (bifenylosulfonian): jon dwubiegunowy + 1,0
równoważnika kwasu bifenylosulfonowego;
- cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (a-naftalenosulfonian): jon dwubiegunowy
+ 1,0 równoważnik kwasu a-naftalenosulfonowego;
- cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (b-naftalenosulfonian): jon dwubiegunowy
+ 1,0 równoważnika kwasu β-naftalenosulfonowego;
- cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (benzenosulfonian): jon dwubiegunowy + 1,0
równoważnika kwasu benzenosulfonowego;
- cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (p-toluenosulfonian): jon dwubiegunowy
+ 1,0 równoważnika kwasu p-toluenosulfonowego.
Wytworzono następujące sole cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) na drodze krystalizacji związku z układów wodnych.
cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (siarczan):
10 mg bezpostaciowego cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (wytworzonego na
drodze liofilizacji jonu obojnaczego, z roztworu 2 molowych równoważników kwasu octowego w wodzie) rozpuszczono/ml 1 N H2SO4 i pH doprowadzono do 2,5. Po odstawieniu
w temperaturze pokojowej utworzył się osad. Osad ten odsączono przez lejek z filtrem ze
spiekanego szkła i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem do stałej wagi.
cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (metanosulfonian) (mesylan):
100 mg bezpostaciowego cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-MAMB) rozpuszczono/ml
wody +1, 2 molowego równoważnika kwasu metanosulfonowego (otrzymanego jako 4 M
roztwór wodny). Po odstawieniu w temperaturze pokojowej utworzyły się duże, płaskie
kryształy.
cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (benzenosulfonian):
Jon dwubiegunowy rozpuszczono w ilości 100 mg/ml wody z dodatkiem 1,2 równoważnika kwasu benzenosulfonowego. Po odstawieniu w temperaturze pokojowej utworzył się
osad. Osad ten odsączono na lejku z filtrem ze spiekanego szkła, przemyto niewielką objętością izopropanol i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem do stałej wagi.
cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) (p-toluenosulfonian).
100 mg jonu dwubiegunowego rozpuszczono/ml wody + 1,2 molowego równoważnika
dodanego kwasu toluenosulfonowego. Po odstawieniu w temperaturze pokojowej utworzył się
osad. Osad ten odsączono na lejku z filtrem ze spiekanego szkła i wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem do stałej wagi.
P r z y k ł a d 44. cyklo-(D-Val-D-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)
Związek o wzorze (I), w którym J oznacza D-Val.
Związek tytułowy wytworzono z zastosowaniem ogólnego sposobu postępowania opisanego w odniesieniu do cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). Użyto metody DCC/DMAP
do przyłączenia Boc-Mamb do żywicy oksymowej. Peptyd był wytwarzany w skali 0,596 mmola,
co prowadziło do otrzymania 186 mg (38,6%) zabezpieczonego peptydu cyklicznego. 183 g
peptydu i 0,183 ml anizolu poddano działaniu bezwodnego fluorowodoru w temperaturze 0°C w
ciągu 30 minut. Produkt surowy wytrącono eterem i rozpuszczono w wodnym roztworze acetonitrylu. Po zliofilizowaniu otrzymano 145 mg (powyżej wydajności ilościowej, w przeliczeniu
na fluorek) związku tytułowego. Oczyszczenia dokonano metodą HPLC z odwróconymi fazami
na kolumnie preparatywnej Vydac C18 (2,5 cm) przy 0,23%/min gradiencie 9-22,5% acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA. Po liofilizacji otrzymano sól związku tytułowego z TFA w postaci puszystej substancji stałej o barwie białej (odzysk 14,8%, wydajność ogólna 5,3%).
FAB-MS; [M+H] = 575,31.
178 252
73
P r z y k ł a d 45. Synteza cyklo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) w fazie stałej
Związek o wzorze (I), w którym J oznacza D-Lys.
Związek tytułowy wytworzono z zastosowaniem ogólnego sposobu postępowania opisanego powyżej w odniesieniu do cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). Użyto metody
DCC/DMAP do przyłączenia Boc-Mamb do żywicy oksymowej. Peptyd wytwarzany był w
skali 0,586 mmola, co prowadziło do otrzymania 349 mg (58,9%) zabezpieczonego peptydu
cyklicznego. 334 mg peptydu i 334 ml anizolu poddano działaniu bezwodnego fluorowodoru
w temperaturze 0°C w ciągu 30 minut. Produkt surowy wytrącono eterem i rozpuszczono w
wodnym roztworze acetonitrylu. Po zliofilizowaniu otrzymano 168 mg (79,1%, w przeliczeniu na difluorek) związku tytułowego w postaci substancji stałej o barwie bladożółtej.
Oczyszczania dokonano metodą HPLC z odwróconymi fazami na preparatywnej kolumnie
Vydac C18 (2,5 cm) przy 0,23%/min gradiencie 5,4-14,4% acetonitrylu zawierającego 0,1
TFA. Po liofilizacji otrzymano sól związku tytułowego z TFA w postaci puszystej substancji
stałej o barwie białej (odzysk 33,6%, wydajność ogólna 12,1%).
FABM-MS: [M+H] = 604,32.
P r z y k ł a d 46. Synteza cyklo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) w fazie ciekłej.
Związek o wzorze (I), w którym J oznacza D-Lys. Syntezę tę ilustruje schemat 27.
Schemat 27
74
178 252
Część A - Boc-Asp(OBzl)
Do roztworu 45,80 g (140 mmoli) Boc-Asp(OBzl) i 16,10 g (140 mmoli) HOSu (Nhydroksysukcynoimid) w 300 ml p-dioksanu dodano w temperaturze 5-10°C 30,20 g (140
mmoli) DCC. Powstały roztwór mieszano w ciągu 30 minut w temperaturze 5-10°C, po czym
substancje stałe odsączono i przemyto 3 razy po 50 ml dioksanu. Połączone ekstrakty organiczne zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymano oleistą, klarowną
pozostałość, która po ucieraniu (3 razy po 100 ml eteru) wykrystalizowała z utworzeniem
bezbarwnej substancji stałej. Otrzymano 42,98 g (73%) związku tytułowego.
NMR: widmo zgodne z budową.
Temperatura topnienia: 98-99°C.
DCI-MS: [M+NH] = 438.
Część B - Boc-Asp(OBzl)-Mamb
W 120 ml DMF rozpuszczono 13,08 g (70,0 mmoli) chlorowodorku kwasu 3aminometylobenzoesowego, po czym dodano 24,32 ml (140 mmoli) DIEA, przy czym pH
zmieniło wartość z 4 do 7,5. Utworzoną zawiesinę o barwie białej mieszano w ciągu 30 minut
w temperaturze pokojowej, po czym dodano roztwór, 40 g (70,0 mmola) Boc-Asp(OBzl)-OSu
w 50 ml DMF. Otrzymaną mieszaninę mieszano w ciągu 24 godzin i w tym czasie zmieniła
się ona w roztwór o barwie złotej. Roztwór ten wprowadzono do 2000 ml 5% kwasu cytrynowego i oziębiano do temperatury 5°C na 3 godziny. Następnie wydzielono utworzony osad
przez odsączenie i po przemyciu 200 ml wody schłodzonej w lodzie i 100 ml eteru schłodzonego w lodzie wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymano 29,62 g
(92%) związku tytułowego w postaci bezbarwnej substancji stałej. Temperatura topnienia:
149-151°C.
DCI-MS: [M+NH4] - 474.
Część C - HCl. H-Asp(OBzl)-Mamb
W 50 ml 4 N roztworu HCl w dioksanie rozpuszczono 7,92 g (17,4 mmola) BocAsp(OBzl)-Mamb i po mieszaniu w ciągu 2 godzin otrzymany roztwór zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymano 6,80 g (99%) związku tytułowego w postaci
bezbarwnej substancji stałej.
DCI-MS: [M+NH4] = 374.
Część D - Boc-D-Lys(Tfa)-NMeArg(Tos)-Gly-OBzl
W 40 ml chlorku metylenu rozpuszczono 14,40 g (29,4 mmola) NMeArg(Tos)-Gly-OBzl,
10,00 g (29,4 mmola) Boc-D-Lys(Tfa) i 11,37 g (62,0 mmola) HBTU. Po oziębieniu roztworu
do temperatury 0°C dodano 10,44 g (62,0 mmola) DIEA i prowadzono reakcję w ciągu
20 minut w temperaturze 0°C i w ciągu 2 dni w temperaturze pokojowej. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńczono 800 ml octanu etylu i poddano ekstrakcji 200 ml porcjami:
(1 raz) 0,2 N HCl, (1 raz) nasyconego roztworu NaHCO3 i (2 razy) nasyconego roztworu NaCl.
Po osuszeniu MgSO4 i odparowaniu pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano substancję
178 252
75
stałą o barwie żółtej. Po oczyszczeniu metodą chromatografii rzutowej (żel krzemionkowy,
EtOAc:acetonitryl 5:1) otrzymano 20,34 g (85%) bezbarwnej substancji stałej. Temperatura
topnienia: 78-85°C.
DCI-MS: [M+NH4] = 831.
Część E - Boc-D-Lys(Tfa)-NMeArg(Tos)-Gly
Roztwór 11,00 g (13,5 mmola) Boc-D-Lys(Tfa)-NMeArg(Tos)-Gly-OBzl w 200 ml
metanolu umieszczono w butelce aparatu do wytrząsania Parra i po przepuszczeniu w ciągu
10 minut N 2 dodano 3,6 g 10% katalizatora palladowego na węglu (10% Pd/C). Następnie
butelkę do wytrząsania w dalszym ciągu przedmuchiwano w 7 cyklach: zwiększanie ciśnienia-usuwanie gazu, po czym ponownie zwiększono w niej ciśnienie i wstrząsano w ciągu
90 minut, w trakcie czego pochłonięta została wyliczona ilość wodoru. Następnie usunięto
katalizator przez przesączenie przy użyciu warstwy Celite i otrzymany przesącz zatężono pod
zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymano pozostałość w stanie stałym, którą
ucierano z 75 ml eteru przy ogrzewaniu w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin, w wyniku czego otrzymano 9,18 g (94%) czystego związku w postaci bezbarwnej substancji stałej.
DCI-MS: [M+H] = 724.
Część F - Boc-D-Lys(Tfa)-NMeArg(Tos)-Gly-OSu
W 75 ml DMF rozpuszczono 8,00 g (11,0 mmola) Boc-D-Lys(Tfa)-NMeArg(Tos)-Gly,
1,25 g (10,8 mmola) HOSu i 2,22 g (10,8 mmola) DCC i otrzymany roztwór mieszano w
temperaturze pokojowej w ciągu 2 dni. Następnie substancje stałe usunięto przez przesączenie
i przemyto 2 razy po 15 ml DMF. Przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i pozostałość o konsystencji syropu wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40°C,
w wyniku czego otrzymano 6,50 g (72%) substancji stałej o barwie brunatnej. Temperatura
topnienia: 66-69°C.
FAB-MS: [M+H] = 821.
Część G - Boc-D-Lys(Tfa)-N-MArg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Mamb
Do zawiesiny 8,85 g (10,8 mmola) Boc-D-Lys(Tfa)-N-MeArg(Tos)-Gly-OSu i 4,24 g
(10,8 mmola) HCl.Asp(OBzl)-Mamb w 100 ml mieszaniny dioksanu i DMF 4:1 dodano 1,39 g
(10,8 mmola) DIEA w ciągu 10 minut. Utworzoną mieszaninę mieszano w ciągu 2 dni
w temperaturze pokojowej, po czym zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem do konsystencji
syropu. Pozostałość tę rozpuszczono w 300 ml octanu etylu i przemyto 75 ml porcjami:
(3 razy) 0,2 N HCl, (2 razy) nasyconego roztworu NaHCO3, (1 raz) H2O i (1 raz) nasyconego
roztworu NaCl. Warstwę organiczną osuszono MgSO4i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40°C, w wyniku czego otrzymano 9,13 g (78%) lepkiej substancji stałej
o barwie bursztynowej. Temperatura topnienia: 90-93°C.
FAB-MS: [M+H] = 1062.
Część H - HCl.D-Lys(Tfa)-N-MeArg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Mamb
W 50 ml 4 N roztworu HCl w dioksanie rozpuszczono (częściowo) 8,30 g (7,8 mmola)
Boc-D-Lys(Tfa)-N-MArg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)Mamb i otrzymaną mieszaninę mieszano w
temperaturze pokojowej w ciągu 30 minut, po czym zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem,
w wyniku czego otrzymano substancję stałą o barwie żółtej. Po ucieraniu z 60 ml ciepłego octanu
etylu otrzymano 7,65 g (98%) związku tytułowego w postaci substancji stałej o barwie żółtej.
FAB-MS: [M+H] = 962.
Część I - Cyklo-(D-Lys(Tfa)-N-MeArg(Tos)-Gly-Asp(OBzl)-Mamb)
W 100 ml DMF rozpuszczono 3,00 g (3,0 mmola) HCl.D-Lys(Tfa)-N-MeArg(Tos)-GlyAsp(OBzl)-Mamb, 0,77 g (6,0 mmola) DIEA i 0,98 g (3,0 mmola) TBTU. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu 22 godzin, przy czym pH utrzymywano na
poziomie 7-8 za pomocą dodawania, w miarę potrzeby, DIEA. Następnie mieszaninę reakcyj-
76
178 252
ną zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem i otrzymaną oleistą pozostałość rozpuszczono
w 110 ml mieszaniny octanu etylu i 1-butanolu 3,75:1. Roztwór organiczny przemyto 50 ml
porcjami: 0,2 N HCl (2 razy), nasyconego roztworu NaHCO3(1 raz), H2O (1 raz) i nasyconego roztworu NaCl (1 raz). Po osuszeniu (MgSO4) roztwór zatężono, w wyniku czego otrzymano oleistą pozostałość o barwie brązowej. Po ucieraniu ze 100 ml eteru dietylowego
otrzymano substancję stałą o barwie brązowej, które poddano oczyszczaniu metodą chromatografii rzutowej (żel krzemionkowy, EtOAc EtOH 5:1), w wyniku czego otrzymano 1,62 g
(57%) związku tytułowego w postaci bezbarwnej substancji stałej. Temperatura topnienia:
128-130°C.
FAB-MS: [M+H] = 944.
Część J - Cyklo-(D-Lys(Tfa)-N-MeArg-Gly-Asp-Mamb)
W 10 ml TFA rozpuszczono 0,85 g (0,9 mmola) cyklo-(D-Lys(Tfa)-N-MeArg(Tos)Gly-Asp(OBzl)-Mamb) i otrzymany roztwór oziębiono do temperatury -10°C. Do mieszaniny
reakcyjnej, przy mieszaniu i utrzymywaniu temperatury -5°C, powoli dodano 10 ml kwasu
trifluorametanosulfonowego. Następnie dodano 2 ml anizolu i mieszanie kontynuowano w
ciągu 3 godzin w temperaturze -5°C. Następnie temperaturę mieszaniny reakcyjnej obniżono
do -78°C, po czym dodano 200 ml eteru dietylowego i mieszaninę tę mieszano jeszcze w ciągu godziny. Utworzoną lepką substancję o barwie białej usunięto przez przesączenie i przemyto 50 ml eteru schłodzonego w lodzie. Następnie otrzymaną substancję stałą rozpuszczono
w 10 ml mieszaniny acetonu i wody 1:1 i poddano liofilizacji, w wyniku czego otrzymano
0,63 g ( 100%) produktu w postaci puszystej, bezbarwnej substancji stałej.
FAB-MS: [M+H] = 700.
Część K - Cyklo-(D-Lys-N-MeArg-Gly-Asp-Mamb)
W 10 ml 1,0 M wodnego roztworu piperydyny rozpuszczono w temperaturze 0°C 0,63 g
(0,9 mmola) cyklo-(D-Lys(Tfa)-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) i mieszaninie reakcyjnej pozwolono ogrzać się powoli, w ciągu 3 godzin, do temperatury pokojowej. Następnie powstały roztwór poddano liofilizacji, w wyniku której otrzymano substancję stałą o barwie żółtej.
Oczyszczenia dokonano metodą preparatywnej HPLC przy użyciu białkowo-peptydowej kolumny Vydac C-18 (2,1 cm) przy 0,36%/min gradiencie 9-18% acetonitrylu zawierającego
0,1% TFA. Po liofilizacji otrzymano 0,20 g (90%) związku tytułowego w postaci bezbarwnego, puszystej substancji stałej. Temperatura topnienia: 138-142°C.
FAB-MS: [M+H] = 604.
P r z y k ł a d 47. cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-D-Asp-Mamb)
Związek o wzorze (I), w którym J oznacza D-Val.
Związek tytułowy wytworzono z zastosowaniem ogólnego sposobu postępowania opisanego powyżej w odniesieniu do cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). Użyto metody
DCC/DMAP do przyłączenia Boc-Mamb do żywicy oksymowej. Peptyd wytwarzany był
w skali 0,611 mmola, co prowadziło do otrzymania 257 mg (51,9%) zabezpieczonego peptydu cyklicznego. 250 mg peptydu i 0,250 ml anizolu poddano działaniu bezwodnego fluorowodoru w temperaturze 0°C w ciągu 30 minut. Produkt surowy wytrącono eterem i rozpuszczono w wodnym roztworze acetonitrylu. Po zliofilizowaniu otrzymano 192 mg (powyżej
wydajności ilościowej, w przeliczeniu na fluorek) związku tytułowego. Oczyszczenia dokonano metodą HPLC z odwróconymi fazami na preparatywnej kolumnie Vydac C18 (2,5 cm),
przy 0,23%/min gradiencie 9-18% acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA. Po liofilizacji
otrzymano sól związku tytułowego z TFA w postaci puszystej substancji stałej o barwie białej
(odzysk 44,4%, wydajność ogólna 20,7%).
FAB-MS: [M+H] = 575,42.
178 252
77
P r z y k ł a d 48. cyklo-(D-Abu-NMeArg-Gly-D-Asp-Mamb)
Związek o wzorze (I), w którym J oznacza D-Abu.
Związek tytułowy wytworzono z zastosowaniem ogólnego sposobu postępowania opisanego w odniesieniu do cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb) w przykładzie 41. Użyto
metody DCC/DMAP do przyłączenia Boc-Mamb do żywicy oksymowej. Jako odczynnika
cyklizującego użyto TBTU. Peptyd wytwarzany był w skali 0,596 mmola, co prowadziło do
otrzymania 273 mg (57,6%) zabezpieczonego peptydu cyklicznego. 263 mg peptydu i
0,263 ml anizolu poddano działaniu bezwodnego fluorowodoru w temperaturze 0°C, w ciągu
20 minut. Produkt surowy wytrącono eterem i rozpuszczono w wodnym roztworze acetonitrylu. Po zliofilizowaniu otrzymano 218 mg (powyżej wydajności ilościowej, w przeliczeniu
na fluorek) związku tytułowego. Oczyszczenia dokonano metodą HPLC z odwróconymi fazami na preparatywnej kolumnie Vydac C18 (2,5 cm) przy 0,23%/min gradiencie 10,8-19,8%
acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA. Po liofilizacji otrzymano sól związku tytułowego z
TFA w postaci puszystego związku o barwie białej (odzysk 40,4%, wydajność ogólna 21,9%).
FAB-MS: [M+H] = 561,37.
P r z y k ł a d 49. cyklo-(D-Abu-D-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)
Związek o wzorze (I), w którym J oznacza D-Abu.
Związek tytułowy wytworzono z zastosowaniem ogólnego sposobu postępowania opisanego w odniesieniu do cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb). Użyto metody
DCC/DMAP do przyłączenia Boc-Mamb do żywicy oksymowej. Jako odczynnika cyklizującego użyto TBTU. Peptyd wytwarzany był w skali 0,596 mmola, co prowadziło do otrzymania 241 mg (50,8%) zabezpieczonego peptydu cyklicznego. 235 mg peptydu i 0,235 ml anizolu poddano działaniu bezwodnego fluorowodoru w temperaturze 0°C, w ciągu 20 minut.
Produkt surowy wytrącono eterem i rozpuszczono w wodnym roztworze acetonitrylu. Po zliofilizowaniu otrzymano 168 mg (98,3 w przeliczeniu na fluorek) związku tytułowego. Oczyszczenia dokonano metodą HPLC z odwróconymi fazami na kolumnie preparatywnej Vydac
C18 (2,5 cm) przy 0,23%/min gradiencie 12,6-21,6% acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA.
Po liofilizacji otrzymano sól związku tytułowego z TFA, w postaci puszystej substancji stałej
o barwie białej (odzysk 2,3%, wydajność ogólna 0,99%).
FAB-MS: [M+H] = 561,36.
P r z y k ł a d 50. Synteza Boc-Mamb(Z-5-Aca)
Syntezę tę przedstawiono na poniższym schemacie 28.
Schemat 28
78
178 252
Część A. Ester metylowy kwasu 3-nitro-5-hydroksymetylobenzoesowego.
Do roztworu 396,0 g (1,76 mola) estru monometylowego kwasu 3-nitroizoftalowego w
1000 ml bezwodnego THF wkroplono, w ciągu godziny, 2,0 M BMS (kompleks sulfid dimetylowyborowodór) 1,76 mola) w 880 ml THF. Utworzony roztwór ogrzewano w temperaturze
wrzenia w warunkach powrotu skroplin w ciągu 12 godzin, po czym powoli dodano 750 ml
MeOH w celu zatrzymania reakcji. Następnie otrzymany roztwór zatężono, w wyniku czego
otrzymano substancję stałą o barwie żółtej, które poddano krystalizacji z toluenu i otrzymano
297,5 g (80%) związku tytułowego.
1H NMR (CDC13): 8,71-8,70 (m, 1H), 8,41-8,40 (m, 1H), 8,31-8,30 (m, 1H), 4,86 (s, 2H),
3,96 (s, 3H), 2,47 (s, 1H).
Temperatura topnienia: 76.5-77,5°C.
DCI-MS. [M+H] = 212.
Część B. Metanosulfonian 3-metoksykarbonylo-5-nitrobenzylu.
W 150 ml dichlorku etylenu rozpuszczono 296,0 g (1,40 mola) estru metylowego kwasu
3-nitro-5-hydroksymetylobenzoesowego i 360,8 g (1,68 mola) gąbki protonowej. Do zawiesiny wkroplono w ciągu 90 minut 292,3 g (1,68 mola) bezwodnika trifluorometanosulfonowego, po czym otrzymaną mieszaninę mieszano w ciągu 18 godzin w atmosferze azotu. Następnie reakcję zatrzymano przez dodanie 2000 ml H2O i utworzone dwie warstwy rozdzielono,
po czym warstwę organiczną przemyto 1000 ml porcjami 1 N HCl, H2O, nasyconym roztworem NaHCO3, H2O i nasyconym roztworem NaCl. Następnie warstwę organiczną osuszono
(MgSO4) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymaną substancję stałą o barwie żółtej poddano rekrystalizacji z toluenu, w wyniku czego otrzymano 366,8 g (91%) związku tytułowego w postaci substancji stałej o barwie brunatnej.
1H NMR (CDCl3) 8,84-8,85 (m, 1H), 8,45-8,46 (m, 1H), 8,40-8,39 (m, 1H), 5,35 (s, 2H),
3,98 (s, 3H), 3,10 (s, 3H).
Temperatura topnienia: 96-97°C.
DCI-MS: [M+NH4] = 307.
Część C. Ester metylowy kwasu 3-azydometylo-5-nitrobenzoesowego.
W 1700 ml DMF zawieszono 300,0 g (1,04 mola) metanosulfonianu 3-metoksykarbonylo5-nitrobenzylu i 81,0 g (1,25 mola) azydku sodu, po czym otrzymaną zawiesinę mieszano
w temperaturze pokojowej w ciągu 5 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńczono
2000 ml octanu etylu, przemyto 1000 ml porcjami H2O (2 razy) i nasyconym roztworem NaCl
178 252
79
(1 raz), po czym osuszono (MgSO4) i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Utworzony
produkt o konsystencji syropu i barwie bursztynowej wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40°C, w wyniku czego otrzymano 226,5 g (92%) związku tytułowego
w postaci substancji stałej o barwie brunatnej.
1H NMR (CDCl3): 8,60 (s, 1H), 8,26 (s, 1H), 8,20 (s, 1H), 4,52 (s, 2H), 3,88 (s, 3H).
Temperatura topnienia: 44-46°C.
Część D. Ester metylowy kwasu 3-amino-5-aminometylobenzoesowego.
W butelce aparatu do wytrząsania Parra umieszczono roztwór 15,50 g (65,7 mmola)
estru metylowego kwasu 3-azydometylo-5-nitrobenzoesowego i 22,14 g (140 mmoli) kwasu
benzenosulfonowego w 320 ml ciepłego metanolu i przepuszczano przez 15 minut azot.
Nastenosulfonowego w 320 ml ciepłego metanolu i przepuszczano przez 15 minut azot.
Następnie wprowadzono 4,0 g katalizatora palladowego na węglu (10% Pd/C) i butelkę aparatu do wytrząsania w dalszym ciągu przedmuchiwano w 7 cyklach zwiększania ciśnieniausuwania gazu, po czym ponownie zwiększono w niej ciśnienie i wstrząsano w ciągu 18 godzin,
w trakcie czego pochłonięta została żądana ilość wodoru. Następnie usunięto katalizator przez
przesączenie przy użyciu warstwy Celite, a przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem,
w wyniku czego otrzymano produkt o konsystencji oleju, o barwie brunatnej. Po ucieraniu z
octanem etylu (dwa razy po 150 ml) przy ogrzewaniu w temperaturze wrzenia w warunkach
powrotu skroplin, a następnie oziębianiu w temperaturze -5°C w ciągu 12 godzin, otrzymano
substancję stałą o barwie brunatnej, którą zebrano przez przesączenie i po przemyciu 2 razy
po 50 ml octanu etylu wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano 25,82 g (80%)
związku tytułowego.
1H NMR (CD3OD): 8,25-8,23 (m, 1H), 8,07-8,06 (m, 1H), 7,86-7,80 (m, 5H), 7,49-7,42
(m, 6H), 4,29 (s, 2H), 3,97 (s, 3H).
Część E. Ester metylowy kwasu 3-amino-5-(tert-butoksykarbonyloamino)metylobenzoesowego.
Roztwór 19,32 g (39,0 mmola) estru metylowego kwasu 3-amino-5-aminometylobenzoesowego, 7,89 g (78,0 mmola) TEA i 8,51 g (39,0 mmola) diwęglanu di-tert-butylu
w 350 ml NaOH poddano reakcji w ciągu 24 godzin w temperaturze pokojowej, w wyniku
czego otrzymano bezbarwną substancję stałą, które poddano oczyszczaniu metodą chromatografii rzutowej (żel krzemionkowy, układ heksan/octan etylu 1:1), w wyniku czego otrzymano
9,21 g (84%) związku tytułowego w postaci bezbarwnej substancji stałej.
1H NMR (CD3OD): 7,26-7,25 (m, 2H), 6,86-6,85 (m, 1H), 4,16 (s, 2H), 3,88 (s, 3H),
1,48 (s, 9H).
Temperatura topnienia: 57-65°C.
ESI-MS: [M+H] = 281.
Część F. Boc-mamb(Z-5-Aca)-OMe.
W 250 ml bezwodnego THF rozpuszczono 7,77 g (29,3 mmola) kwasu N-CBZ-ε-aminoheksanowego i 2,97 g (29,3 mmola) TEA. Otrzymany roztwór oziębiono do temperatury -20°C,
po czym wkroplono do niego 4,00 g (29,3 mmola) chloromrówczanu izobutylu i otrzymaną mieszaninę pozostawiono do przereagowania w ciągu 5 minut w temperaturze -20°C. Do mieszaniny
reakcyjnej dodano oziębiony do temperatury -20°C roztwór 8,20 g (29,3 mmola) estru metylowego kwasu 3-amino-5-(tert-butoksykarbonyloamino)metylobenzoesowego w 50 ml bezwodnego
THF. Następnie mieszaninę reakcyjną pozostawiono w celu powolnego ogrzania się do temperatury pokojowej i mieszano jeszcze w ciągu 2 dni. Następnie substancje stałe odsączono, a przesącz
zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymaną pozostałość rozpuszczono w 125 ml
octanu etylu i przemyto (za każdym razem dwoma 50 ml porcjami) 0,2 N kwasu solnego,
nasyconego roztworu wodorowęglanu sodu i nasyconego roztworu chlorku sodu. Warstwę
organiczną osuszono siarczanem magnezu i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt
80
178 252
surowy poddano oczyszczaniu metodą chromatografii rzutowej (żel krzemionkowy, układ
heksan/octan etylu 1:2) i po rekrystalizacji z CCl4 otrzymano 10,09 g (65%) związku tytułowego w postaci bezbarwnej substancji stałej.
1H NMR (CDCl3): 8,03-7,63 (m, 3H), 7,32-7,28 (m, 5H), 5,12-4,92 (m, 4H), 4,27-4,25
(m, 2H), 3,85 (s, 3H), 3,17-3,12 (m, 2H), 2,34-2,28 (m, 2H), 1,72-1,66 (m, 2H), 1,48-1,53 (m, 2H),
1,43 (s, 9H), 1,36-1,34 (m, 2H).
Temperatura topnienia: 52-54°C.
ESI-MS: [M+H] - 528.
Część G. Boc-Mamb (Z-5-Aca).
W 500 ml mieszaniny 1 N NaOH i MeOH 1:1 rozpuszczono 22,58 g (43,0 mmola) BocMamb(Z-5-Aca)-OMe i otrzymany roztwór mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu
18 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną poddano ekstrakcji mieszaniną 300 ml octanu
etylu i 200 ml H2O, po czym utworzone dwie warstwy rozdzielono. pH warstwy wodnej obniżono do 4,5, po czym wytrącony oleisty osad poddano ekstrakcji 2 razy po 300 ml octanu etylu.
Ekstrakt organiczny osuszono (MgSO4) i zatężono, w wyniku czego otrzymano pozostałość w postaci substancji stałej o barwie żółtej, którą ucierano z CCL4 (3 razy po 100 ml)
przy ogrzewaniu w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin, w wyniku czego
otrzymano 14,17 g (64%) produktu w postaci bezbarwnej substancji stałej.
1H NMR (CD3OD): 8,04 (s, 1H), 7,71-7,66 (m, 2H), 7,30-7,23 (m, 5H), 5,02 (s, 2H),
4,24 (s, 2H), 3,32 (s, 3H), 3,11 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 2,34 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 1,74-1,35 (m, 15H).
Temperatura topnienia: 168-169°C.
DCI-MS: [M+NH4] = 531.
P r z y k ł a d 51. Cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-Aca))
Syntezę związku tytułowego przedstawiono poniżej na schemacie 29.
Schemat 29
178 252
81
Do 60 ml kolby do syntezy peptydów wprowadzono 1,61 g żywicy oksymowej (poziom
podstawienia = 0,62 mmola). Żywicę spęczniono za pomocą jednorazowego przemycia 30 ml
DMF. Do kolby wprowadzono 513 mg 91,0 mmola) Boc-Mamb (Z-5-Aca), 379 mg (1,0
mmola) HBTU i 0,52 ml (3 mmole) DIEA. Otrzymaną zawiesinę mieszano w temperaturze
pokojowej w ciągu 96 godzin. Żywicę przemyto dokładnie 30 ml porcjami DMF (3 razy),
MeOH (1 raz), DMF (3 razy), MeOH (2 razy) i DCM (3 razy). Metodą z użyciem kwasu pikrynowego oznaczono poziom podstawienia, który wynosił 0,381 mmola/g. Nieprzereagowane grupy oksymowe zablokowano przez podziałanie 30 ml mieszaniny 0,5 M chlorku trimetyloacetylu/0,5 M DIEA w ciągu 2 godzin.
W dalszym ciągu przeprowadzono następujące etapy.
(Etap 1). Żywicę przemyto 30 ml porcjami DMF (3 razy), MeOH (1 raz), DCM (3 razy),
MeOH (2 razy) i DCM (3 razy).
(Etap 2). Żywicę przemyto 30 ml 50% TFA w DCM i odblokowano grupę Boc przy
użyciu 30 ml 50% TFA w DCM w ciągu 30 minut.
(Etap 3). Żywicę przemyto dokładnie DOM (3 razy), MeOH (1 raz), DCM (2 razy),
MeOH (3 razy) i DMF (3 razy).
(Etap 4). Do żywicy dodano 0,092 g (3,04 mmola) Boc-Asp(OBzl), 1,153 g
(3,04 mmola) HBTU, 1,59 ml (9,14 mmola) DIEA i 14 ml DMF; po czym prowadzono reakcję w ciągu 22 godzin.
(Etap 5). Zajście reakcji sprzęgania do końca kontrolowano z zastosowaniem metody z
użyciem kwasu pikrynowego. Etapy 1-5 powtarzano, aż do uzyskania pożądanej sekwencji.
Po złożeniu liniowego peptydu usuwa się N-końcową grupę Boc za pomocą, najpierw,
przemycia 50% TFA w DCM, a następnie podziałania 30 ml 50% TFA w DCM w ciągu
30 minut. Żywicę przemyto dokładnie DCM (3 razy), MeOH (2 razy), DCM (3 razy), po
czym zobojętniono 2 razy po 1 minucie 30 ml porcjami 10 DIEA w DCM. Żywicę przemyto
następnie DCM (3 razy) i MeOH (3 razy), po czym wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymano 1,965 g żywicy o barwie brązowej.
Żywicę poddano cyklizacji przez zawieszenie w 20 ml DMF zawierającego 35 µl
(0,609 mmola) HOAc i ogrzewania w temperaturze 50°C w ciągu 72 godzin. Żywicę odsączono na lejku z filtrem ze spiekanego szkła i przemyto dokładnie trzema 10 ml porcjami
DMF. Przesącz DMF odparowano i otrzymaną pozostałość o konsystencji oleju rozpuszczono
w 20 ml mieszaniny acetonitrylu i wody 1:1. Po zliofilizowaniu otrzymano 342 mg zabezpieczonego peptydu cyklicznego. Oczyszczenia dokonano metodą HPLC z odwróconymi fazami
na preparatywnej kolumnie Vydac C18 (2,1 cm), używając izokratycznej fazy ruchomej w
postaci układu acetonitryl/H2o 1:1, zawierającego 0,1% TFA. Po liofilizacji frakcji zawierającej żądany związek otrzymano 127 mg oczyszczonego zabezpieczonego peptydu.
120 mg (0,11 mmola) peptydu odblokowano przez podziałanie 1 ml TFA i 1 ml kwasu
trifluorometanosulfonowego zawierającego 0,2 ml anizolu, w ciągu 3 godzin, w temperaturze
82
178 252
-10°C. Peptyd wytrącono przez dodanie eteru i oziębiania do temperatury -35°C w ciągu
1,5 godziny. Peptyd odsączono, przemyto eterem i wysuszono. Utworzoną substancję stałą
rozpuszczono w 12 ml mieszaniny acetonu i wody 1:1, po czym pH doprowadzono do 4-6 za
pomocą obróbki z udziałem żywicy jonowymiennej AG1-8X w postaci octanowej (Bio-Rad).
Żywicę odsączono i przemyto wodą. Przesącz zliofilizowano, w wyniku czego otrzymano
75 mg (wydajność ogólna 13,5%) czystego (według HPLC) peptydu.
FAB-MS: [M+H] = 703,3951.
P r z y k ł a d 52. Cyklo-(D-Abu-NMeArg-Gly-Asp-Mamb(5-Aca))
Związek tytułowy wytworzono z zastosowaniem ogólnego sposobu postępowania opisanego w odniesieniu do cyklo-(D-Val-NMeArg-Gly-Asp-Mamb (5-Aca). Peptyd wytwarzany był w skali 1,35 mmola, co prowadziło do otrzymania 1,05 g (73%) surowego cyklicznego
zabezpieczonego peptydu. 500 mg peptydu odblokowano przez podziałanie 4 ml TFA i 4 ml
kwasu trifluorometanosulfonowego zawierającego 0,8 ml anizolu, w ciągu 3 godzin w temperaturze -10°C. Peptyd wytrącono przez dodanie eteru i oziębiania w temperaturze-35°C
w ciągu 1,5 godziny. Następnie peptyd odsączono, przemyto wodą i wysuszono. Otrzymaną
substancję stałą rozpuszczono w 50 ml mieszaniny acetonu i wody 1:1 i zliofilizowano.
Oczyszczenia dokonano metodą HPLC z odwróconymi fazami na preparatywnej kolumnie
Vydac C18 (2,1 cm) przy 0,36%/min gradiencie 9-18% acetonitrylu zawierającego 0,1 TFA.
Po liofilizacji otrzymano 218 mg (69% odzysku, wydajność ogólna 37%) soli związku tytułowego z TFA w postaci puszystej, bezbarwnej substancji stałej.
FAB-MS: [M+H] = 689,3735.
P r z y k ł a d 53. Cyklo-(D-Lys(5-Aca)-NMeArg-Gly-Asp-Mamb)
Wytwarzanie związku tytułowego przedstawiono na schemacie 30 poniżej.
Schemat 30
Sporządzono roztwór 100 mg (0,12 mmola) cyklo-(D-Lys-NMeArg-Gly-Asp-Mamb),
47 mg (0,144 mmola) estru hydroksysukcynoimidowego kwasu Boc-5-aminoheksanowego i
50 µl (0,36 mmola) Et3N w 1,50 ml DMF i prowadzono reakcję w temperaturze pokojowej w
178 252
83
ciągu 60 minut. Postęp reakcji śledzono i kontrolowano metodą TLC z normalnymi fazami
(CHCl3:MeOH:HOAc 90:8:2) z zastosowaniem metody ninhydrynowej i Sakaguchi. Następnie usunięto DMF pod zmniejszonym ciśnieniem. Surowy koniugat poddano działaniu 3 ml
TFA w temperaturze pokojowej w ciągu 45 minut, w celu usunięcia grupy zabezpieczającej
tert-Boc. Następnie usunięto TFA pod zmniejszonym ciśnieniem i koniugat poddano oczyszczaniu metodą HPLC z odwróconymi fazami na preparatywnej kolumnie Vydac C 18
(2,1 cm), przy użyciu 6% acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA, w ciągu 20 minut, z następującym po tym 3,0%/minutę gradientem 6-36% acetonitrylu zawierającego 0,1% TFA.
Po zliofilizowaniu otrzymano 80 mg (70%) soli związku tytułowego z TFA w postaci
puszystej, bezbarwnej substancji stałej.
P r z y k ł a d 54. Cyklo-([3-(4-hydroksyfenylo)propylo-D-Lys]-NMeArg-Gly-AspMamb)
Do roztworu 0,026 g (0,04 mmola) cyklo D-Lys-NMeArg-Gly-Asn-MAMB) w 5 ml buforu fosforanowego, pH 9, dodano roztworu 0,022 g (0,08 mola) 3-(4-hydroksyfenylo)propionianu n-sukcynoimidylu (odczynnika Boltona-Huntera) i 0,02 ml (0,10 mmola) DIEA
w 5 ml dioksanu. Otrzymaną mieszaninę reakcyjną mieszano w ciągu 2 dni w temperaturze
pokojowej. Następnie utworzony roztwór zliofilizowano i otrzymany produkt w postaci substancji stałej o barwie białej poddano oczyszczaniu metodą HPLC z odwróconymi fazami na
preparatywnej kolumnie Vydac C18 (2,1 cm) przy 0,36%/min gradiencie 9-18% acetonitrylu
zawierającego 0,1% TFA, w wyniku czego otrzymano 0,018 g (60%) produktu w postaci bezbarwnej substancji stałej.
Temperatura topnienia: 146-155°C.
ESI-MS: [M] = 751.
P r z y k ł a d 55. Synteza estru N-hydroksysukcynoimidowego N-[4-(karboksy)benzylo-N,N'-bis[(2-trifenylometylotio)etylo]glicynoamidu.
Syntezę związku tytułowego przedstawiono na poniższym schemacie 31.
Schemat 31
84
178 252
Część A. S-Trifenylometylo-2-aminoetanotiol
Do roztworu 79,5 g (0,7 mola) chlorowodorku cysteaminy w 500 ml TFA dodano 182 g
(0,7 mola) trifenylometanolu i całość mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu godziny.
Następnie usunięto TFA pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 45°C i utworzony
produkt o konsystencji oleju, o barwie ciemnopomarańczowej rozpuszczono w 700 ml octanu
etylu. Roztwór octanowy przemyto 3 razy po 350 ml 2 N NaOH, 2 razy po 350 ml H2O, 350
ml nasyconego roztworu NaHCO3 i 350 ml nasyconego roztworu NaCl. Połączone przemywki
wodne poddano ekstrakcji 350 ml octanu etylu. Połączone warstwy organiczne osuszono
(MgSO4) i zatężono, w wyniku czego otrzymano pozostałość w postaci substancji stałej o
barwie żółtej. Po ucieraniu z 500 ml eteru otrzymano 97,2 g (43%) produktu w postaci bezbarwnej substancji stałej.
Temperatura topnienia: 90-92°C. Według D. Brennera i in., [J. Inorg. Chem., 23, 37933797 (1984)], temperatura topnienia wynosi 93-94°C.
Po zatężeniu eterowego roztworu po ucieraniu do objętości 100 ml, a następnie oziębieniu, otrzymano dodatkowo 40,9 g produktu. Temperatura topnienia: 89-91°C.
Wydajność grupy mostkowej: 62%.
Część B. N-2-Bromoacetylo-S-trifenylometylo-2-aminoetanotiol
Roztwór 48 g (0,15 mola) S-trifenylometylo-2-aminoetanotiolu i 20,9 ml (0,15 mola)
Et3N w 180 ml DCM dodano powoli, przy mieszaniu, w temperaturze -20°C do roztworu 13,9
ml (0,15 mola) bromku bromoacetylu w 100 ml DCM. Mieszaninę pozostawiono na godzinę
w celu ogrzania się do temperatury pokojowej, po czym przemyto ją 500 ml porcjami H2O,
0,2 N HCl, nasyconego roztworu NaHCO3 i nasyconego roztworu NaCl. Roztwór organiczny
osuszono (MgSO4) i zatężono do konsystencji oleju. Olej ten poddano krystalizacji z mieszaniny DCM i heksanu, w wyniku czego otrzymano 54,9 g (83%) produktu w postaci bezbarwnej substancji stałej.
Temperatura topnienia: 137-139,5°C. Według J. A. W olffa [Ph.D. Thesis, Mssachusetts Institute of Technology, (luty 1992)], temperatura topnienia wynosi 130-135°C.
Część C. N,N'3-Bis[(2-trifenylometylotio)etylo]glicynoamid.
Roztwór 35,2 g (0,08 mola) N-2-bromoacetylo-S-trifenylometylo-2-aminoetanotiolu,
25,5 g (0,08 mola) S-trifenylometylo-2-aminoetanotiolu 1 16,7 ml (0,12 mola) Et3N w 375 ml
DCM przetrzymano w temperaturze pokojowej w ciągu 24 godzin. Otrzymany roztwór przemyto 200 ml porcjami H2O (1 raz), nasyconym roztworem NaHCO3 (2 razy), H2O (1 raz) i
nasyconym roztworem NaCl (1 raz), po czym osuszono (MgSO4) i zatężono, w wyniku czego
otrzymano produkt o konsystencji lepkiego oleju. Olej ten rozpuszczono w 150 ml mieszaniny DCM i octanu etylu 70:30, po czym oziębiona w łaźni z lodem. Utworzony osad usunięto
178 252
85
przez odsączenie, a przesącz zatężono do konsystencji lepkiego oleju. Olej ten poddano
oczyszczaniu metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym 60 A (20-400 mesh),
przy użyciu fazy ruchomej w postaci układu DCM/octan etylu 70:30, w wyniku czego
otrzymano 34,4 g (63%) produktu w postaci bezbarwnego i bezpostaciowej substancji
stałej jako piany.
1H NMR (CDCl3): 7,42-7,18 (m, 30H), 3,12-3,01 (m, 4H), 2,48-2,27 (m, 6H).
Część D. Ester metylowy kwasu 4-(metanosulfonylometylo)benzoesowego.
Do roztworu 10,8 g (0,065 mola) estru metylowego kwasu 4-(hydroksymetylo)benzoesowego i 19,5 g (0,091 mola) gąbki protonowej w 200 ml DCM dodano 13,94 g
(0,08 mola) bezwodnika metanosulfonowego i całość mieszano w temperaturze pokojowej w
ciągu 20 godzin. Mieszaninę reakcyjną przemyto 100 ml porcjami H2O (1 raz), 1 N HCl
(2 razy), H2O (1 raz), nasyconym roztworem NaHCO3(1 raz) i H2/O( 1 raz). Fazę organiczną
osuszono (MgSO4) i zatężono, w wyniku czego otrzymano 15,5 g substancji stałej o barwie
bladożółtej. Po rekrystalizacji ze 150 ml CCl4z użyciem węgla odbarwiającego otrzymano
14,2 g (90%) produktu w postaci bezbarwnych igieł. Temperatura topnienia: 91-94°C.
Część E. N-[4-(metoksykarbonylo)benzylo]-N,N'-bis[(2-trife-nylometylotio)ety-lo]glicynoamid.
Roztwór 16,27 g (0,024 mola) N,N'-bis[(2-trifenylometylotio)etylo]glicynoamidu
i 4,88 g (0,02 mola) estru metylowego kwasu 4-(metanosulfonylometylo)benzoesowego w
200 ml dichlorku etylenu ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin
w ciągu 28 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną przemyto 200 ml porcjami nasyconego
roztworu NaHCO3i H2O, po czym osuszono (MgSO4) i zatężono, w wyniku czego otrzymano
30 g produktu o konsystencji oleju o barwie jasnobrązowej. Olej ten poddano oczyszczaniu
metodą chromatografii rzutowej na żelu krzemionkowym 60 A (200-400 mesh), przy użyciu
fazy ruchomej w postaci układu DCM/octan etylu, w wyniku czego otrzymano 9,9 g (60%)
produktu jako bezbarwną, bezpostaciową i spienioną substancję stałą.
1H NMR (CDCl3): 7,90 (d, 2H, J = 6,5 Hz), 7,49-7,18 (m, 32H), 3,91 (s, 3H), 3,47 (s,
2H), 3,01 (q, 2H, J = 6,2 Hz), 2,88 (s, 2H), 2,43 (t, 2H, J = 6,2 Hz), 2,39-2,27 (m, 4H).
Część F. N-[4-(karboksy)benzylo]-N,N'-bis[(2-trifenylometylotio)etylo]gli-cynoamid.
Mieszaninę 6,00 g (7,26 mmola) N-[4-(karbometoksy)benzylo]-N,N'-bis[(2-trifenylometylotio)etylo]glicynoamidu w 65 ml dioksanu i 65 ml 1 N NaOH mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu 24 godzin. Mieszaninę tę zakwaszono następnie przy użyciu 100 ml
2,5 M kwasu cytrynowego. Wytrącił się gumowaty osad, który poddano ekstrakcji 400 ml
octanu etylu. Roztwór octanowy przemyto H2O (3 razy po 200 ml) i 100 ml nasyconego roztworu NaCl, po czym osuszono (MgSO4) i zatężono, w wyniku czego otrzymano 5,90 g
( 100%) produktu jako bezbarwną, bezpostaciową, spienioną substancję stałą.
1H NMR (CDCl3): 7,96 (d, 2H, J = 8,1 Hz), 7,40-7,16 (m, 30H), 3,71 (s, 3H), 3,49 (s, 2H),
3,00 (q, 2H, J = 5,4 Hz), 2,91 (s, 2H), 2,44 (t, 2H, J = 5,4 Hz), 2,38-2,30 (m, 4H).
Część G. Ester N-hydroksysukcynoimidowy N-[4-(karboksy)benzylo]-N,N'-bis[(2-trifenylometylotio)etylo]glicynoamidu.
Do roztworu 450 mg (0,55 mmola) N-[4-(karboksy)benzylo]-N,N'-bis[(2-trifenylometylotio)etylo]glicynoamidu i 76 mg (0,66 mmola) N-hydroksysukcynoimidu w 10 ml
DCM dodano roztworu 122 mg (0,66 mmola) WSCD.HCl w 7 ml DCM i całość mieszano w
temperaturze pokojowej w ciągu 22 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną zatężono i substancje stałe rozpuszczono w 60 ml octanu etylu. Roztwór octanowy przemyto 2 razy po
25 ml H2O, 1 raz 35 ml 0,1 N NaOH, 2 razy po 25 ml H2O i 1 raz 35 ml nasyconego roztworu
NaCl, po czym osuszono NaS O4 i zatężono, w wyniku czego otrzymano 469 mg (93%) produktu w postaci bezbarwnej substancji stałej.
86
178 252
P r z y k ł a d 56. Synteza kwasu N-[2-(benzoilotio)propionylo]glicyloglicylo-gaminomasłowego (Bz-Me-MAG2-gaba)
Związek tytułowy wytworzono zgodnie ze schematem 32 z N-(2-merkaptopropionylo)glicyny (1), dostępnej handlowo z firmy Aldrich. Zabezpieczenia grupy tiolowej
w związku 1 dokonano za pomocą reakcji z chlorkiem benzoilu w warunkach zasadowych,
w wyniku której otrzymano związek 2. Grupę karboksylową można zaktywować przez utworzenie estru sukcynoimidowego (3), który reaguje z kwasem glicyloaminomasłowym w środowisku 90% roztworu metanolu, w wyniku czego otrzymuje się zabezpieczony grupą benzoilową związek Me-MAG2-gaba (4). Dane widmowe (IR, 1H NMR i FAB-MS) są całkowicie
zgodne z proponowanym wzorem.
Schemat 32
Synteza zabezpieczonego grupą benzoilową Me-MAG2-gaba.
Etap 1. N-[2-(benzoilotiolo)propionylo]glicyna (2).
W mieszaninie 40 ml wody i 30 ml toluenu rozpuszczono 4,5 g (0,109 mola) wodorotlenku sodu i 8,20 g (0,05 mola) N-(2-merkaptopropionylo)glicyny. Przy użyciu łaźni z lodem
obniżono temperaturę do 5-15°C. Następnie wkroplono, przy energicznym mieszaniu, 4,6 ml
(0,051 mola) chlorku benzoilu w 10 ml toluenu. Po zakończeniu wkraplania utworzoną mieszaninę mieszano w temperaturze 5-15°C w ciągu dalszych 30 minut, a następnie w ciągu
2 godzin w temperaturze pokojowej. Warstwę organiczną oddzielono, przemyto 2 razy po 20 ml
H2O i odrzucono. Frakcje wodne połączono izakwaszono do pH około 1,5stężonym HCl
przy czym utworzył się osad o barwie białej. Osad ten odsączono,przemytoH2O i niewielką
ilością etanolu, a następnie wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego
otrzymano 13,0 g (97%) produktu.
Analiza elementarna dla CI2H13NO4S
Obliczono:
C 53,90;
H 4,90; N 5,24
Stwierdzono: C 53,89;
H4,81; N 5,22.
178 252
87
IR (tabletka KBr, w cm-1): 3375 (s, nN.H), 3200-2500 (szeroki, no_H), 1745 (vs, tioester
nc=0), 1663, 1625 (vs, amid i karboksyl nc=o).
1H NMR (DMSO-d6, δ w ppm): 1,47 (d, 3H, CH3, J = 7,0 Hz), 3,79 (d, 2H, CH2, J = 5,9
Hz), 4,40 (q, 1H, CH, J = 7,0 Hz), 7,53 (m, 2H, =CH), 7,69 (m, 1H, -CH), 7,90 (dd, 2H,
=CH, J = 7,0 Hz), 8,59 (t, 1H, NH, J = 5,8 Hz), 12,6 (br s, 1H, COOH).
DCI-MS: m/z = 268 ([M+H]+).
Etap 2. Ester sukcynoimidowy N-[2-(benzoilotio)propionylo]glicyny (3).
Do zawiesiny 5,80 g (0,05 mola) N-hydroksysukcynoimidu i 13,35 g (0,05 mola) N-[2-(benzoilotiolo)propionylo]glicyny w 400 ml suchego THF dodano w temperaturze 5-10°C
12,0 g (0,052 mola) DCC w 100 ml takiego samego rozpuszczalnika, a mianowicie THF.
Otrzymaną mieszaninę mieszano w temperaturze 5-10°C w ciągu 2 godzin, a następnie w
temperaturze pokojowej w ciągu 2 dni. Do mieszaniny reakcyjnej dodano 2-3 ml kwasu
octowego i całość mieszano jeszcze w ciągu 2 godzin. Następnie substancje stałe odsączono i
przemyto 2 razy po 150 ml THF. Frakcje organiczne połączono i rozpuszczalnik usunięto pod
zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymano produkt w postaci substancji stałej o
barwie białej, którą zebrano, przemyto eterem dietylowym i wysuszono na powietrzu, w wyniku czego otrzymano 14,5 g (80%) produktu.
Analiza elementarna dla C 16H 16N2O6S
Obliczono:
C 52,72;
H4,43;
N7,69
Stwierdzono: C 52,70;
H 4 ,21;
N7,69.
IR (tabletka KBr, w cm -1): 3290 (s, nN-H), 1820 (m, sukcynoimid n= o), 1785 (m, ester
n= o), 1735 (vs, tioester n=o), 1600 (vs, amid n=o).
1H NMR (CDCl3, δ w ppm): 1,57 (d, 3H, CH3, J = 7,0 Hz), 2,79 (s, 4H, CH2), 4,33 (q,
1H, CH, J = 7,0 Hz), 4,39 (m, 2H, CH2), 7,00 (t, 1H, NH, J = 5,8 Hz), 7,44 (m, 2H, =CH),
7,59 (m, 1H, =CH), 7,93 (dd, 2H, =CH, J = 7,0 Hz).
DCI-MS: m/z = 365 ([M+H]+)
Etap 3. Kwas N-[2-(benzoilotio)propionylo]glicyloglicylo-g-aminomasłowy (Bz-MeMAG2-gaba, 4).
1,82 g (5 mmoli) estru sukcynoimidowego N-[2-(benzoilotio)propionylo]glicyny i 0,80 g
(5 mmoli) kwasu glicylo-g-aminomasłowego zawieszono w mieszaninie 150 ml metanolu i 30 ml
wody. Następnie mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach
powrotu skroplin w ciągu 5 godzin, w trakcie czego mętna z początku mieszanina przemieniła
się w klarowny roztwór. Roztwór ten ochłodzono do temperatury pokojowej i mieszano przez
noc. Po odparowaniu rozpuszczalników pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano produkt
w postaci substancji stałej o barwie białej, który poddano oczyszczaniu polegającemu na przemyciu wodą. Po wysuszeniu pod zmniejszonym ciśnieniem otrzymano 1,85 g (93%) produktu.
Analiza elementarna dla C 18H23N3O6S
Obliczono:
C 52,78;
H 5,66;
N 10,27
Stwierdzono: C 52,69;
H 5,70;
N 10,17.
IR (tabletka KBr, w cm-1): 3380, 3320 (s, nN_H), 3100-2500 (szeroki, no-H), 1725 (vs, tioester nc=o), 1680, 1640, 0,1624 (vs, nc=o).
1H NMR (DMSO-d6, δ w ppm): 1,49 (d, 3H, CH3, J = 7,0 Hz), 1,62 (kwintet, 2H, CH2,
J - 7,rH z), 2,21 (t, 2H, CH2COOH, J = 7,5 Hz), 3,05 (q, 2H, NH-CH2, J = 7,0 Hz), 3,67 (d,
2H, NH-CH2, J = 5,7 Hz), 3,75 (d, 2H, NH-CH2, J = 7,0 Hz), 4,42 (q, 1H, CH, J - 7,0 Hz),
7,57 (m, 2H, =CH), 7,70 (m, 1H, =CH), 7,80 (t, 1H, NH, J = 3,0 Hz), 7,90 (dd, 2H, =CH,
J = 7,0 Hz), 8,14 (t, 1H, NH, J = 5,70 Hz), 8,75 (t, 1H, NH, J = 5,90 Hz), 12,0 (br s, 1H,
COOH).
DCI-MS: m/z = 410 ([M+H]+).
88
178 252
P r z y k ł a d 57. Synteza N-[2-(benzoilotio)propionylo]glicyloglicyloglicyny (Bz-Me-MAG3)
Związek tytułowy wytworzono sposobem opisanym w odniesieniu do Bz-Me- MAG2gaba przez zastąpienie kwasu glicylo-g-aminomasłowego glicyloglicyną. Wydajność wynosiła 83%.
Analiza elementarna dla C16H19N3O6S
Obliczono:
C 50,39;
H 5,02;
N 11,02
Stwierdzono: C 50,59;
H 5,78;
N 10,70.
LR (tabletka KBr, w cm-1): 3380, 3300 (s, nN-H), 3100-2500 (szeroki, no-H), 1738 (vs, tioester nc=o), 1680, 1660 (vs, amid nc=o)0
1H NMR (DMSO-d6, δ w ppm): 1,48 (d, 3H, CH3, J = 7,05 Hz), 3,78 (m, 4H, CH2), 3,85
(d, 2H, CH2, J = 6,00 Hz), 4,41 (m, 1H, 7,52 (m, 2H, =CH), 7,70 (m, 1H, =CH), 7,90 (m, 2H,
-CH), 8,15 (t, 1H, NH, J = 3,00 Hz), 8,51 (t, 1H, NH, J = 3,00 Hz), 8,80 (t, 1H, NH, J = 3,00
Hz).
FAB-MS: m/z = 382 ([M+H]+).
ESI-MS: m /z-381,9.
P r z y k ł a d 58. Synteza kwasu N-2-(benzoilotio)propionyloglicyloglicylo-4-aminometylocykloheksanokarboksylowego (Bz-Me-MAG2-ACA)
Synteza Bz-Me-MAG2ACA obejmuje przeprowadzenie kilku etapów (schemat 33).
Związek 1 można w łatwy sposób przekształcić w jego chlorek 2, który poddaje się reakcji z
kwasem 4-trans-aminometylocykloheksanokarboksylowym, w wyniku czego otrzymuje się
związek 3. W rezultacie odblokowania związku 3 przy użyciu hydrazyny w etanolu, z następującym potem wprowadzeniem HC1, otrzymuje się związek 4. Związek 4 poddaje się reakcji
z Bz-Me-MAG-Succ (gdzie Succ oznacza sukcynimid) w metanolu w obecności Et3N, w wyniku czego otrzymuje się Bz-Me-MAG2ACA (5).
Schemat 33
178 252
89
Etap 1. Chlorek ftaloiloglicylu.
W 400 ml chloroformu zawieszono 40 g ftaloiloglicyny, po czym dodano 60 ml chlorku
tionylu. Otrzymaną mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu
skroplin w ciągu 2 godzin i w tym okresie mieszanina przemieniła się w jednorodny, klarowny roztwór. Rozpuszczalnik i nadmiar chlorku tionylu usunięto pod zmniejszonym
ciśnieniem, w wyniku czego otrzymano substancję stałą o barwie białawej, które wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem i stosowano w dalszym ciągu z pominięciem dalszego oczyszczania.
1H NMR: widmo zgodne z budową.
Etap 2. Kwas 4-trans-[(ftaloiloglicylo)aminometylo]cykloheksanokarboksylowy.
W 150 ml DMF zawieszono 7,85 g (50 mmoli) kwasu 4-trans-aminometylocykloheksanokarboksylowego i 5 g (50 mmoli) K2CO3. Do otrzymanej zawiesiny dodano 11,85 g
(50 mmoli) chlorku ftaloiloglicylu w 150 ml acetonitrylu. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano
w ciągu 3 godzin w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin, po czym przesączono na gorąco. Rozpuszczalniki usunięto pod zmniejszonym ciśnieniem i do oleistej pozostałości dodano 50 ml eteru dietylowego, w wyniku czego utworzył się osad o barwie białej.
Osad ten odsączono, przemyto eterem dietylowym i wysuszono na powietrzu, w wyniku
czego otrzymano 10,32 g (60%) produktu.
1H NMR (w DMSO-d6, δ w ppm względem TMS): 0,87-2,00 (m, 9H, CH2 i CH
z pierścienia cykloheksanu), 2,10 (m, 1H, CHCOOH), 2,92 (t, 2H, CH2, J = 4,6 Hz),
4,19 (s, 2H, CH2), 7,85 (m, 4H, -CH=), 8,21 (t, 1H, NH, J = 4,1 Hz).
Etap 3. Chlorowodorek kwasu glicylo-4-trans-(aminometylo)cykloheksanokarboksylowego (Gly.ACA.HCl).
Do zawiesiny 10,32 g (30 mmoli) kwasu [(ftaloiloglicylo)aminometylocykloheksanokarboksylowego w 300 ml etanolu dodano 100 ml 85% hydratu hydrazyny. Otrzymaną mieszaninę
ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin w ciągu 12 godzin i w
tym czasie wytrącił się osad o barwie białej. Po usunięciu rozpuszczalnika, do pozostałości
dodano 200 ml 2 N HC1. Następnie mieszaninę ogrzewano w temperaturze 60-70°C w ciągu
20 minut, po czym substancje stałe odsączono i odrzucono. Przesącz zatężono do 1/3 pierwotnej objętości, po czym mieszaninę oziębiano w łaźni z lodem w ciągu 2 godzin. Utworzony osad
zebrano przez przesączenie i przemyto niewielką ilością wody i etanolu, po czym wysuszono
pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymano 3,45 g (45%) produktu.
1H NMR (w D2O, (5 w ppm względem TMS): 1,04 (m, 2H, CH2), 1,45 (m, 2H, CH2),
1,57 (m, 1H, CH), 1,81-2,05 (m, 4H, CH2), 2,35 (m, 1H, CHCOOH), 3,15 (d, 2H, CH2, J = 4,9
Hz), 3,84 (s, 2H, CH2).
Etap 4. Kwas N-[2-(benzoilotio)propionylo]glicyloglicylo-4-aminometylocykloheksanokarboksylowy (Bz-Me-MAG2-ACA).
W mieszaninie złożonej z 200 ml metanolu i 100 ml acetonitrylu zawieszono 1,25 g
(5 mmoli) Gly-ACA.HCl, 1,0 g (10 mmoli) Et3N i 1,82 g (5 mmoli) Bz-Me-MAG-Succ.
Otrzymaną mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin
przez noc. Następnie usunięto rozpuszczalniki pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymano pozostałość w postaci substancji stałej o barwie białej, do której dodano 10 ml
6 N HCl. Uzyskaną substancję stałą wydzielono przez przesączenie i po przemyciu wodą i
niewielką ilością etanolu wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymano 1,35 g (58%) produktu.
Analiza elementarna dla C22H29N3O6S
Obliczono:
C 57,00;
H6,31;
N 9,06;
Stwierdzono: C 58,41;
H 6,70;
N9,72.
90
178 252
IR (tabletka KBr) w cm-1): 3600-2000 (szeroki, OH-N), 3270 (s,nN-H), 1720, 1655, 1625
i 1565 (vs, nc=o).
FAB-MS: m/z - 464 (M+1).
1H NMR (w DMSO-d6, δ w ppm względem TMS): 0,81-1,90 (m, 9H, CH2 i CH z pierścienia cykloheksanu), 1,48 (d, 3H, CH3, J = 5,2 Hz), 2,10 (t, 1H, CHCOOH, J = 9,0 Hz), 2,91
(t, 2H, CH2, J = 4,6 Hz), 3,68 (d, 2H, CH2, 4,2 Hz), 3,75 (d, 2H, CH2, J = 4,1 Hz), 4,42 (q, 1H,
CH, J = 5,2 Hz), 7,50 (t, 2H, -CH=, J = 5,8 Hz), 7,71 (t, 2H, -CH=, J = 5,4 Hz), 7,91 (d, 1H, CH=, J = 6,4 Hz), 8,14 (t, 1H, NH, J - 4,2 Hz), 8,60 (t, 1H, NH, J = 4,1 Hz), 12,00 (br s, 1H,
COOH).
P r z y k ł a d 59. Synteza kwasu 3,4-bis[3-(benzoilotioacetylo)amido]benzoesowego
(Bz-MABA)
Do roztworu 8,69 g (40 mmoli) chlorku S-benzoilotioacetylu (świeżo otrzymanego na
drodze reakcji kwasu S-benzoilotiooctowego z użytym w nadmiarze chlorkiem tionylu w środowisku chloroformu) w 300 ml suchego THF, wprowadzono 3,04 g (20 mmoli) kwasu 3,4diaminobenzoesowego. Roztwór przybrał barwę brązową. Roztwór ogrzewano w temperaturze wrzenia w warunkach powrotu skroplin przez noc i w tym czasie utworzył się osad.
Mieszaninę oziębiono i osad wydzielono przez odsączenie, po czym przemyto THF, etanolem
i eterem dietylowym, a następnie wysuszono pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego
otrzymano 5,8 g (54%) produktu w postaci substancji stałej o barwie bladoszarej.
Analiza elementarna dla C25H20N2O6S2
Obliczono:
C 59,04;
H 3,96;
N 5,51
Stwierdzono: C 58,82;
H 4,04;
N 5,46.
IR (tabletka KBr, w cm-1): 3600-2000 (szeroki, OH-N), 3340 (s, nN-H), 1690,1670, 1655,
1610 i 1595 (s lub m, n=o).
FAB-MS: m/z = 509 (M+1).
1H NMR (w CDC13, δ w ppm względem TMS): 4,12 i 4,14 (s, 4H, CH2), 7,50-8,30
(m, 13H, aromatyczne H), 9,85 i 9,89 (s, 2H, NH), 12,99 (br s, 1H, COOH).
P r z y k ł a d 60. Synteza estru etylowego 2-(S-trifenylometylomerkapto)etyloaminoacetylo-S-trifenylometylo-L-cysteiny (Tr2-MA-MAMA)
Schemat 34
178 252
91
a: trifenylometanol, TFA; b: bromek bromoacetylu, TEA, THF; c: S-trifenylometylo-2aminoetanotiol, TEA, chlorek metylenu.
Ester etylowy S-trifenylometylo-L-cysteiny (2)
Do roztworu 18,6 g (0,1 mola) chlorowodorku estru etylowego L-cysteiny w 200 ml
TFA dodano 52 g (0,2 mola) trifenylometanolu. Powstały roztwór o barwie ciemnobązowej
mieszano w ciągu 2 godzin w temperaturze pokojowej w atmosferze azotu. Następnie usunięto rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem i do pozostałości dodano 100 ml etanolu.
Do tak utworzonego roztworu etanolowego dodano 50 ml 1 M roztworu etanolanu sodu i całość mieszano w ciągu 90 minut. W tym czasie roztwór zmętniał. Mieszaninę przesączono i
przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku czego otrzymano oleistą pozostałość. Po przeprowadzeniu szybkiej chromatografii kolumnowej przy użyciu układu octan
etylu/heksan 1:3 oraz octanu etylu otrzymano pożądany produkt (zawierający pewną ilość
trudnego do usunięcia octanu etylu), który przechowywano pod zmniejszonym ciśnieniem.
Ester etylowy N-bromoacetylo-S-trifenylometylo-L-cysteiny (3)
Roztwór 18 g (46 mmola) estru etylowego S-trifenylometylo-L-cysteiny i 6,4 ml (46
mmoli) trietyloaminy w 250 ml suchego THF oziębiono, w atmosferze azotu, do temperatury
0°C. Następnie wkroplono roztwór 9,28 g (46 mmoli) bromku bromoacetylu w 60 ml suchego
THF i w tym czasie roztwór zmętniał. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze 0°C w
ciągu godziny, a następnie w temperaturze pokojowej także w ciągu godziny. Następnie mieszaninę reakcyjną przesączono i przesącz zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem, w wyniku
czego otrzymano oleistą pozostałość, którą poddano ekstrakcji mieszaniną złożoną z 60 ml
chlorku metylenu i 60 ml wody. Warstwę organiczną przemyto 5% HCl i NaHCO3, po czym
osuszono siarczanem magnezu. Po przesączeniu i usunięciu substancji lotnych otrzymano
pożądany produkt (69%).
Ester etylowy 2-(S-trifenylometylomerkapto)etyloaminoacetylo-S-trifenylemetylo-L-cysteiny (4)
Do roztworu 3,0 g (1,98 mmola) estru etylowego N-bromoacetylo-S-trifenylometylo-L-cysteiny i 0,4 ml (2,9 mmola) trietyloaminy w 10 ml chlorku metylenu dodano 0,64 g
(2,0 mmola) S-trifenylometylo-2-aminoetanotiolu. Mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej w ciągu 7 dni. Następnie dodano 10 ml wody i warstwę organiczną przemyto 2 razy p 10 ml NaHCO3, 2 razy po 10 ml wody i 1 raz 10 ml wodnego roztworu chlorku
sodu, po czym osuszono siarczanem magnezu i zatężono pod zmniejszonym ciśnieniem,
w wyniku czego otrzymano produkt w postaci piany. Po chromatografii rzutowej przy użyciu
układu octan etylu/heksan 3:1 otrzymano pożądany związek z wydajnością22%.
MS (M+H) = 751 (obliczono 751,3).
178 252
F ig
. a
F ig . 1 b
Departament W ydawnictw U P RP. Nakład 70 egz.
Cena 6,00 zł.