close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

PL180372B1

код для вставкиСкачать
(11)180372
(12) OPIS PATENTOWY (19)PL
RZECZPO SPO LITA
PO LSKA
(21) Numer zgłoszenia:
(22 ) Data zgłoszenia:
(13)B1
306209
07.03.1994
(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
(51) IntCl7:
07.03.1994, PCT/US94/02511
(87) Data i numer publikacji zgłoszenia
międzynarodowego:
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej Polskiej
(
5
4
(30)
Pierwszeństwo:
29.09.1994, W094/21674,
PCT Gazette nr 22/94
)
Peptyd będący antagonistą bombezyny
oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca ten peptyd
(73)
Zgłoszenie ogłoszono:
(72)
06.03.1995 BUP 05/95
(45)
O udzieleniu patentu ogłoszono:
31.01.2001 WUP 01/01
PL 180372 B1
(57 )
Uprawniony z patentu:
The Administrators of the Tulane Educational Fund, New O rleans, US
15.03.1993,US,08/031325
(43)
C07K 7/02
A61K 38/08
A61P 35/00
Twórcy wynalazku:
Andrev V. Schally, Metairie, U S
Ren Zhi Cai, Metairie, US
(74)
Pełnomocnik:
Wojtowicz Ew a, M ARKPAT Sp . z o .o., Biuro
Ochrony W łasności Intelektualnej
1 Peptyd, będący antagonistą bombezyny o wzorze. X -A 1-A 2-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-A9-Q w którym X oznacza wodór, pojedyncze wiązanie łączące grupę alfa-aminowąz A 1z ugrupowaniem gamma-karboksylowym z ugrupowania 3 -propionylowego z A 2, gdy A 2
jest Glu, lub grupę o wzorze R 1 CO-, w którym R 1oznacza wodór, C 1-10-alkil lub fenylo-C 1-10-alkil; A 1 oznacza resztę D- lub L-aminokwasu
wybranego z grupy, składającej się z Cpa, Phe, pGlu, Nal, Pal, Tpi, Trp niepodstawionego lub Trp podstawionego w pierścieniu benzenowym przezjeden lub więcej element wybrany z grupy, składającej się z F, Cl, Br, NH2 lub alkilu C1-3 lub peptydowe wiązanie łączące ugrupowanie acylowe R 1 -CO- z ugrupowaniem alfa-aminowym z A 2; A 2 oznacza G ln, Glu [-], Glu (Y) lub His, gdzie [-] oznacza wiązanie
pojedyńcze gdy X jest wiązaniem pojedyńczym i A 2 oznacza Glu, łączące ugrupowanie gamma-karboksylowe ugrupowania 3 -propionylowego z Glu z grupą alfa-ammowąz A 1 , zaś Y oznacza resztę -OR2, gdzie R oznacza C 1-3-alkil, Leu-psi- oznacza zredukowaną formę Leu,
w której zamiast ugrupowania C =O występuje -CH2, tak że wiązanie tego ugrupowania -CH2- z gtupą alfa-am inową sąsiedniej reszty A 9jest
wiązaniem pseudopeptydowym, A 9 oznacza Tac, MTac, DMTac, Cys lub Pen, Q oznacza NH2 lub -OQ1, gdzie Q 1 oznacza wodór, alkil
C 1-10 , alkil C 1-10, fenyl lub fenylo-C1-10-alkil, oraz jego dopuszczalne farmaceutycznie sole
13 Kompozycja farmaceutyczna, zawierająca substancję biologicznie czynną oraz dopuszczalny farmaceutycznie nośnik ciekły lub
stały, znam ienna tym, że jako substancję biologicznie czynną zawiera peptyd, będący antagonistą bombezyny o wzorze- X -A 1-A 2-Trp-Ala-Va1-Gly-His-Leu-psi-A9-Q, w którym X oznacza wodór, pojedyńcze wiązanie łączące grupę alfa-am inową z A 1 z ugrupowaniem gamma-karboksylowym z ugrupowania 3 -propionylowego z A 2, gdy A 2 jest Glu, lub grupę o wzorze R 1CO-, w którym R 1 oznacza wodór,
C1-10-alkil lu b fenylo-C1-10-a lk il.A 1 oznacza resztę D- ub L-am inokwasu wybranego z grupy, składającej się z Cpa, Phe, pGlu, Nal, Pal, Tpi,
Trp niepodstawionego lub Trp podstawionego w pierścieniu benzenowym przezjeden lub więcej element w y brany z grupy, składającej się z
F , Cl, Br,N H 2 lub alkilu C1-3 lub peptydowe wiązanie łączące ugrupowanie acylowe R 1-C O -z ugrupowaniem alfa-aminowym z A 2, A 2 oznacza Gln, Glu [-J, Glu (Y) lub His, gdzie [-] oznacza wiązanie pojedyńcze, gdy X jest wiązaniem pojedynczym i A 2 oznacza Glu, łączące
ugrupowanie gamma-karboksylowe ugrupowania 3 -propionylowego zG lu 2 z grupą alfa-aminowąz A , zaś Y oznacza resztę -OR2, gdzie R 2
oznacza C 1-3-alkil, Leu-psi- oznacza zredukowaną formę Leu, w której zamiast ugrupowania C =O występuje -CH2, tak że wiązanie tego
ugrupowania-CH2-z grupą alfa-aminową sąsiedniej reszty A 9jest wiązaniem pseudopeptydowym; A 9 oznacza Tac, MTac, DMTac, Cys lub
Pen, 1 Q oznacza NH2 lub -OQ1, gdzie Q 1 oznacza wodór, alkil C1-10, fenyl lub fenylo-C1-10-alkil,lub jego dopuszczalne farmaceutycznie
sole
Peptyd, będący antagonistą bombezyny
oraz kompozycja farmaceutyczna zawierająca ten peptyd
Zastrzeżenia
patentowe
1. Peptyd, będący antagonistą bombezyny o wzorze:
X-A1-A2-Trp-Ala-Va1-Gly-His-Leu-psi-A9-Q
w którym
X
oznacza wodór, pojedyńcze wiązanie łączące grupę alfa-am inową z A 1z ugrupowaniem
gamma-karboksylowym z ugrupowania 3-propionylowego z A2, gdy A2 jest Glu, lub
grupę o wzorze R 1CO-, w którym R 1oznacza wodór, C 1-10-alkil lub fenylo-C1-10-alkil;
A1
oznacza resztę D- lub L-aminokwasu wybranego z grupy, składającej się z Cpa, Phe,
pGlu, Nal, Pal, Tpi, Trp niepodstawionego lub Trp podstawionego w pierścieniu benzenowym przez jeden lub więcej element wybrany z grupy, składającej się z F, Cl, Br, NH2
lub alkilu C 1-3lub peptydowe wiązanie łączące ugrupowanie acylowe R1-CO- z ugrupowaniem alfa-aminowym z A2;
A2
oznacza Gln, Glu [-], Glu (Y) lub His, gdzie
[-] oznacza wiązanie pojedyńcze, gdy X jest wiązaniem pojedynczym i A2 oznacza
Glu, łączące ugrupowanie gamma-karboksylowe ugrupowania 3-propionylowego
z Glu2 z grupą alfa-aminową z A 1, zaś
Y oznacza resztę -OR2, gdzie R2 oznacza C1-3-alkil;
Leu-psi- oznacza zredukowaną formę Leu, w której zamiast ugrupowania C=O występuje -CH2,
tak ze wiązanie tego ugrupowania -CH2- z grupą alfa-aminową sąsiedniej reszty A9jest
wiązaniem pseudopeptydowym;
A9
oznacza Tac, MTac, DMTac, Cys lub Pen;
Q
oznacza NH2 lub -OQ1, gdzie Q 1 oznacza wodór, alkil C 1-10, alkil C 1-10, fenyl lub feny
lo-C1-10-alkil,
oraz jego dopuszczalne farmaceutycznie sole.
2. Peptyd według zastrz. 1,w którym X oznacza wodór lub R 1CO, gdzie R 1oznacza H lub
alkil C 1-10; A 1oznacza D-Cpa, D-Nal, L- lub D-Pal, D-Phe, D- lub L-Tpi, lub D-Trp; A2 oznacza
Gln lub His; i Q oznacza NH2.
3. Peptyd według zastrz 2, w którym A9 oznacza Tac.
4. Peptyd według zastrz. 2, w którym A9 oznacza DMTac.
5. Peptyd według zastrz. 3, w którym X oznacza H lub Ac,A 1 oznacza D-Phe, L- lub D-Tpi i A2 oznacza Gln.
6. Peptyd według zastrz 4, w którym X oznacza H lub Ac, A 1 oznacza D-Phe, L- lub
D-Tpi i A2 oznacza G ln.
7. Peptyd według zastrz. 3 o wzorze
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Va1-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2.
8. Peptyd według zastrz. 3 o wzorze
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Va1-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2 .
9. Peptyd według zastrz. 4 o wzorze
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-DMTac-NH 2 .
10.
Peptyd według zastrz. 1, w którym X oznacza R1CO-, A 1oznacza wiązanie peptydowe
łączące ugrupowanie acylowe z R 1CO- z ugrupowaniem alfa-aminowym z A2; A2 oznacza Gln
lub His; i Q oznacza NH2.
180 372
3
11. Peptyd według zastrz. 10, w którym X oznacza Hca, A2 oznacza Gln, a A9 oznacza Tac.
12. Peptyd według zastrz. 11 o wzorze
Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2 13. Kompozycja farmaceutyczna, zawierająca substancję biologicznie czynną oraz
dopuszczalny farmaceutycznie nośnik ciekły lub stały, znamienna tym, że jako substancję biologicznie czynną zawiera peptyd, będący antagonistą bombezyny o wzorze:
X -A 1-A2-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-A9-Q,
w którym
X
oznacza wodór, pojedyńcze wiązanie łączące grupę alfa-am inową z A 1z ugrupowaniem
gamma-karboksylowym z ugrupowania 3-propionylowego z A2, gdy A2 jest Glu, lub
grupę o wzorze R1CO-, w którym R 1oznacza wodór, C1-10-alkil lub fenylo-C1-10-alkil;
A1
oznacza resztę D- lub L-aminokwasu wybranego z grupy, składającej się z Cpa, Phe,
pGlu, Nal, Pal, Tpi, Trp niepodstawionego lub Trp podstawionego w pierścieniu benzenowym przez jeden lub więcej element wybrany z grupy, składającej się z F, Cl, Br, NH2
lub alkilu C 1-3lub peptydowe wiązanie łączące ugrupowanie acylowe R 1-CO- z ugrupowaniem alfa-aminowym z A2;
A2
oznacza Gln, Glu [-], Glu (Y) lub His, gdzie
[-] oznacza wiązanie pojedyńcze, gdy X jest wiązaniem pojedynczym i A2 oznacza
Glu, łączące ugrupowanie gamma-karboksylowe ugrupowania 3-propionylowego
z Glu2 z grupą alfa-aminową z A 1, zaś
Y oznacza resztę -OR2, gdzie R2 oznacza C1-3-alkil;
Leu-psi- oznacza zredukowaną formę Leu, w której zamiast ugrupowania C=O występuje -CH2,
tak że wiązanie tego ugrupowania -CH2- z grupą alfa-aminową sąsiedniej reszty A9jest
wiązaniem pseudopeptydowym;
A9
oznacza Tac, MTac, DMTac, Cys lub Pen; i
Q
oznacza NH2 lub -OQ1, gdzie Q1oznacza wodór, alkil C 1-10, fenyl lub fenylo-C1-10-alkil,
lub jego dopuszczalne farmaceutycznie sole.
* * *
Przedmiotem wynalazku jest nowy peptyd, wywierający wpływ na wzrost guzów rakowych u ludzi. W szczególności wynalazek dotyczy antagonisty bombezyny, który jest Ψ 8-9
pseudopeptydem, zawierającym w pozycji C-końcowej resztę Tac, MTac lub DMTac, jego soli i
kompozycji farmaceutycznej. Peptyd ten posiada właściwości antagonistyczne w stosunku do
bombezyny lub peptydów bombezyno-pochodnych.
Wynalazek dotyczy związków polipeptydowych, posiadających właściwości antagonistyczne w stosunku do bombezyny lub peptydów bombezyno-pochodnych (takich jak peptyd
uwalniający gastrynę (GRP), neuromedyna C i podobne), określanych w dalszej części opisu
jako właściwości bombezyno-antagonistyczne i posiadających znaczenie na przykład w leczeniu
chorób złośliwych organizmów ciepłokrwistych, takich jak człowiek. Wynalazek dotyczy
nowych związków polipeptydowych i nowych kompozycji farmaceutycznych, zawierających
wspomniane związki polipeptydowe do wytwarzania efektu bombezyno-antagoni stycznego w
organizmach ciepłokrwistych, takich jak człowiek.
Bombezyna jest tetradekapeptydoamidem, który został po raz pierwszy wyizolowany ze
skóry żaby Bombina bombina (Anastasi, Erspamer i Bucci, Experientia, 1971, 27, 166). Wiadomo jest, że bombezyna jest silnym mitogenem dla mysich komórek fibroblastów 3T3 Swiss
(Rozengurt i Sinnett-Smith, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983, 80, 2936) i że stymuluje ona
wydzielanie amylazy z trzustki świnki morskiej (Jensen Jones, Folkers i Gradner, Naturę, 1984,
309,61). Wiadomo jest również, że peptydy bombezyno-podobne są wytwarzane i wydzielane
4
180 372
przez komórki ludzkiego raka małokomórkowego płuc (SCLC) (Moody, Pert, Gazdar, Carn ey i
Minna, Science, 1981, 214, 1246), że dodane egzogenne peptydy bombezyno-podobne mogą
stymulować wzrost ludzkich komórek SCLC in vitro (Carney, Cuttita, M oody i Minna, Cancer
Research, 1987,47, 821) i że przeciwciało monoklonalne specyficzne dla regionu C-końcowego
bombezyny i GRP może blokować wiązanie GRP do jego receptorów i zapobiegać wzrostowi
ludzkich komórek SCLC zarówno in vitro jak i in vivo (Cuttita, Carney, Mulshine, Moody, Fedorko, Fischler i Minna, Nature, 1985, 316, 823).
GRP, który posiada właściwości bombezyno-podobne, jest szeroko rozpowszechnionym
peptydem, zawierającym 27 aminokwasów, wyizolowanym z jelita świńskiego (McDonald,
Jomvall, Nilsson, Vagne, Ghatei, Bloom i Mutt, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1979, 90,
227), w którym C-końcowa sekwencja aminokwasów jest prawe identyczna jak w bombezynie.
Meuromedyna C jest dekapeptydoamidem, którego struktura jest identyczna jak dziesięć ostatnich aminokwasów w C-końcowym regionie GRP, wyizolowanego z jelita cienkiego psa (Reeve,
Walsh, Chew, Clark, Hawke i Shively, J. Biol. Chem., 1983,258,5582). GRP stymuluje wiele odpowiedzi biologicznych, w tym uwalnianie gastryny w krążeniu układowym. Funkcjonuje on
również jak czynnik wzrostu w mysich fibroblastach 3T3 oraz komórce małokomórkowego raka
płuc (SCLC). Zaproponowano zatem, że GRP odgrywa bezpośrednią rolę patofizjologiczną w
rozwoju SCLC poprzez mechanizm wzrostu autokrynnego.
Struktury bombezyny, neuromedyny C i karboksylo-zakończonego nonapeptydu GRP
przedstawiono poniżej:
Bombezyna:
pGlu-Gln-Arg-Leu-Gly-Asn-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH 2
Neuromedyna C:
H-Gly-Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2
C-końcowy nonapeptyd GRP:
Asn-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH 2
Poszukiwania u zwierząt ziemnowodnych innych peptydów bombezyno-podobnych doprowadziły do wyizolowania ze skóry żaby z Papui Nowa Gwinea litorinu, nonapeptydu (pGluGLn-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-Met-NH2), który okazał się wyjątkowo silnym analogiem bombezyny (Yasukara i wpółpr., Chem. Pharm. Bull., 1979, 27, 492). Badania nad analogami bombezyny wykazały, że minimalny segment 9 reszt aminokwasowych w pozycjach od 6 do 14
bombezyny posiadał pełne spektrum aktywności bombezyny.
Scharakteryzowano dotąd kilka rodzajów antagonistów bombezyny. Substancja P (ArgPro-Lys-Pro-Gln-Gln-Phe-Phe-Gly-Leu-Met-NH2), która posiada niewielką homologię sekwencji aminokwasów z bombezyną, nie hamuje wiązania bombezyny i peptydów bombezyno-podobnych, ale stwierdzono, że analogi substancji P, zmodyfikowane przez zastąpienie kilku
L-aminokwasów D-aminokwasami, takie jak (D-Arg1, D-Pro2, D-Trp7,9, Leu11) substancja P i
(D-Arg1, D-Phe3, D-Trp7’9, Leu11) substancja P (Moody i współpr., Fed. Proceedings, 1987, 46,
2201), blokują wydzielanie bombezyny w komórkach trzustkowych i antagonizują sprzyjające
wzrostowi efekty bombezyny w komórkach Swiss 3T3 . Wykazano, że dwa typy antagonistów
bombezyny, pochodzących od bombezyny, na przykład (D-Phe6, D -Phe12) bombezyna i
[Leu13-psi-Leu14]bombezyna (Coy i współpr., J. Biol. Chem., 1988, 263, 5056 i peptydy, 1989,
10, 587) są silnymi inhibitorami odpowiedzi bombezyny in vitro i in vivo.
Z europejskich opisów patentowych nr 339193 oraz 402852 znane są związki o właściwościach antagonistów bombezyny, pozbawione wiązania pseudopeptydowego Ψ 8-9.
Innym rodzajem antagonisty bombezyny ujawnionym prze Heimbrooka i współpr. (Bio.
Chem., 1989, 264, 11258) jest N-acetylo-GRP(20-26) i jego analogi, w których C-końcowa
reszta metioniny jest usunięta z analogów GRP(20-27). Coy [J. Biol. Chem., 264, 1989, 25,
180 372
5
14691] podał, że niektórzy antagoniści bombezyny o krótkich łańcuchach na bazie sekwencji
litorinu, tak jak [D-Phe6, Leu13-psi-Phe14]bombezyna(6-14) i [D-Phe 13-Leu13- psi-Leu14] bombezyna(6-14) wykazują znacznie silniejszą moc działania niż odpowiadający peptyd macierzysty [Leu 13-psi-Leu14] bombezyna.
Liniowe (niecykliczne) bombezynowe analogi GRP i bombezyny ze zwierząt zimnokrwistych, ewentualnie posiadające niepeptydowe wiązanie CH2-NH są opisane w zgłoszeniu patentowym PCT WO 90/039980 (i pokrewne analogi w WO 91/02746). Analogi te, działające jak
stwierdzono jako inhibitory naturalnych peptydów bombezyny, mają wzór
w którym R 1i R 2 = H; A° może być usunięte; spośród wielu możliwych aminokwasów w każdej z
pozycji A 1 może oznaczać D-Phe, D-Trp lub D-Nal; A 2 może oznaczać G ln; A 4 może oznaczać
Ala; A 5 może oznaczać Val; A 6 może oznaczać Gly; A 7 może oznaczać His, a W może oznaczać
gdzie R4 = CH 2-NH; w niektórych przypadkach Z 1może oznaczać identyfikujący łańcuch boczny Leu, to jest -CH 2CH(CH 3) 2 ; Z 2 może oznaczać identyfikujący łańcuch boczny Cys lub Met, to
jest -CH 2-SH lub (CH 2) 2S-CH 3; V = N(R6)R7; gdzie R6, R 7 i R8 m ogą oznaczać H; R 1 i R 2 mogą
oznaczać H lub COE1, gdzie E 1może oznaczać alkil C1-20.
Pseudopolipeptydy Ψ8-9 znane z patentu USA nr 5,244,883 udzielonego na podstawie
zgłoszenia dokonanego w listopadzie 1990 r s ą także szeroko omówione w publikacji Cai i wsp.
„Pseudononapeptide Bombesin Antagonists Containing C-termina Trp or Tpi” w Peptides tom
13, 1992, str. 267-271. Z publikacji tej wiadomo, że reszta Tpi w położeniu A9 pseudononapeptydów znanych ze wskazanego patentu USA może nie mieć wpływu na zdolność wiązania peptydu tak zakończonego z określonymi receptorami. Ustalenie to nie uprawnia jednak do
postawienia tezy o braku wpływu tego ugrupowania na właściwości analogów bombezyny, które
zależą od wielu różnych aspektów budowy tych związków.
W cytowanej publikacji wskazano, że analog Tpi9jest korzystny, gdyż może być mniej podatny na trawienie proteazą z uwagi na podwyższoną hydrofobowość tej reszty. W świetle
takiego ujawnienia oczywistym mogłoby być wprowadzenie jako A9 grup bardziej hydrofobowych.
W stanie techniki (publikacja WO 90/03980) znany jest peptyd, w których A9 oznacza Cys,
jednakże reszta A1 w tym związku oznacza D-Phe. Chociaż z cytowanej wyżej publikacji dotyczącej znanych pseudononapeptydowych antagonistów bombezyny znany jest peptyd z resztą
Tpi w pozycji A 1, to brak jest w niej jakichkolwiek sugestii, co do zastąpienia końcowej reszty
Tpi lub Trp w pozycji A9 resztą Cys lub Pen w tej pozycji.
Liniowe peptydowe analogi bombezyny s ą również opisane w opisie EP 309297. Peptydy
te mogą mieć C-końcową resztę Met i wiązanie pseudopeptydowe [CH2-NH] między resztą Ckońcową i resztą z nią sąsiadującą.
Nieoczekiwanie okazało się, że modyfikując charakter grup A 1 i A9 w znanych antagonistach bombezyny z grupy Pseudopolipeptydów Ψ 8-9między innymi przez wprowadzenie reszt
Tac, MTac i DMTac w miejsce reszty Tpi9jest korzystne, choć sprzeczne z wiedzą wynikającą z
patentu USA nr 5,244,883 - bowiem grupy te - ze względu na obecność ugrupowania -S- w ich
6
180 372
strukturze, są bardziej hydrofilowe niźli Tpi, a zgodnie zatem z przywołanym stanem techniki
fachowiec unikałby wprowadzenia grup bardziej hydrofitowych niż Tpi jako A9.
Zgodnie z wynalazkiem polipeptyd będący antagonistą bombezyny ma budowę określoną
wzorem:
X -A 1-A2-Trp-Ala-Val-Gly-HiS'Leu-psi-A9-Q
w którym
X
oznacza wodór, pojedyńcze wiązanie łączące grupę alfa-aminow ą z A 1z ugrupowaniem
gamma-karboksylowym z ugrupowania 3-propionylowego z A2, gdy A2 jest Glu, lub
grupę o wzorze R1CO-, w którym R 1oznacza wodór, C1-10-alkil lub fenylo-C 1-10-alkil;
A1
oznacza resztę D- lub L-aminokwasu wybranego z grupy, składającej się z Cpa, Phe,
pGlu, Nal, Pal, Tpi, Trp niepodstawionego lub Trp podstawionego w pierścieniu benzenowym przez jeden lub więcej element wybrany z grupy, składającej się z F, Cl, Br, NH2
lub alkilu C 1-3 lub peptydowe wiązame łączące ugrupowanie acylowe R 1-CO- z ugrupowaniem alfa-aminowym z A2;
A2
oznacza Gln, Glu [-], Glu (Y) lub His, gdzie
[-] oznacza wiązanie pojedyńcze, gdy X jest wiązaniem pojedynczym i A2 oznacza
Glu, łączące ugrupowanie gamma-karboksylowe ugrupowania 3-propionylowego
z Glu2 z grupą alfa-aminową z A 1, zaś
Y oznacza resztę -OR2, gdzie R2 oznacza C1-3-alkil;
Leu-psi- oznacza zredukowaną formę Leu, w której zamiast ugrupowania C=O występuje -CH2,
tak że wiązanie tego ugrupowania -CH2- z grupą alfa-aminową sąsiedniej reszty A9jest
wiązaniem pseudopeptydowym;
A9
oznacza Tac, MTac, DMTac, Cys lub Pen; i
Q
oznacza NH2 lub -O Q 1, gdzie Q 1oznacza wodór, alkil C 1-10, fenyl lub fenylo-C1-10-alkil,
oraz jego dopuszczalne farmaceutycznie sole.
Korzystną grupę związków zdefiniowanych powyżej, stanowią te określone powyższym
wzorem, w którym X oznacza wodór lub resztę R1CO, gdzie R 1 oznacza H lub alkil C 1-10; A 1
oznacza D-Cpa, D-Nal, L- lub D-Pal, D-Phe, D- lub L-Tpi, lub D-Trp; A2 oznacza Gln lub His; i Q
oznacza NH2.
Wyodrębnić można wśród tych związków korzystną podgrupę, w której A9 oznacza Tac.
Dodatkowo, korzystnie wów
c zas X oznacza H lub Ac, A 1 oznacza D-Phe, L- lub D-Tpi, zaś A2
oznacza Gln.
Szczególnie korzystnymi peptydami z tej grupy są związki o wzorze:
oraz
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2 -
Inną korzystną podgrupę wskazanych korzystnych związków stanowią te, w których A9
oznacza DMTac. Dodatkowo, korzystnie wówczas X oznacza H lub Ac, A 1 oznacza D-Phe, Llub D-Tpi, zaś A2 oznacza G ln.
Szczególnie korzystnym peptydem z tej podgrupy jest związek o wzorze:
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-DMTac-NH 2 .
Korzystnie, wynalazek obejmuje także peptyd będący antagonistą bombezyny o wzorze'
X -A1-A2-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-A9-Q
w którym
X
oznacza wodór, pojedyńcze wiązanie łączące grupę alfa-aminową z A 1z grupą gamma-karboksylową z ugrupowania 3-propionylowego z A2, gdy A2 jest Glu, lub grupę o
wzorze R 1CO-, w którym R 1oznacza wodór, C 1-10-alkil, lub fenylo-C1-10-alkil;
180 372
7
A1
oznacza niewystępujący naturalnie aminokwas wybrany z grupy, składającej się z Llub D-Pal, lub L- lub D-Tpi;
A2
oznacza Gln, Glu [-], Glu (Y) lub His, gdzie
[-] oznacza wiązanie pojedyńcze, gdy X jest wiązaniem pojedynczym i A2 oznacza
Glu, łączące ugrupowanie gamma-karboksylowe ugrupowania 3-propionylowego
z A2 z grupą alfa-aminową z A 1, zaś
Y oznacza resztę -OR2, gdzie R2 oznacza alkil C 1-3;
Leu-psi- oznacza zredukowaną formę Leu, w której zamiast ugrupowania C=O występuje -CH2-,
tak że wiązanie tego ugrupowania -CH2- z grupą alfa-aminową sąsiedniej reszty A9jest
wiązaniem pseudopeptydowym;
A9
oznacza Cys lub Pen;
Qoznacza NH2 lub -OQ1, gdzie Q 1oznacza wodór, alkil C 1-10 fenyl lub fenylo-C1-10-alkil,
oraz jego dopuszczalne farmaceutycznie sole.
Korzystnie, peptyd będący antagonistą bombezyny według wynalazku ma budowę określoną wzorem
X -A 1-A2-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-A9-Q,
w którym
X oznacza R1CO-,
A 1 oznacza wiązanie peptydowe łączące ugrupowanie acylowe z R1CO- z ugrupowaniem
alfa-aminowym z A2;
A2 oznacza Gln lub His; i Q oznacza NH2.
Korzystnie, X oznacza Hca; A2 oznacza Gln, zaś A9 oznacza Tac.
Korzystnym takim peptydem jest związek o wzorze:
Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2 .
Kompozycja farmaceutyczna, zawierająca substancję biologicznie czynną oraz dopuszczalny
farmaceutycznie nośnik ciekły lub stały, według wynalazku cechuje się tym, że jako substancję
biologicznie czynną zawiera ona peptyd, będący antagonistą bombezyny o wzorze:
X -A1-A2-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-A9-Q
I
w którym
X
oznacza wodór, pojedyńcze wiązanie łączące grupę alfa-aminową z A 1z ugrupowaniem
gamma-karboksylowym z ugrupowania 3-propionylowego z A 2, gdy A2 jest Glu, lub
grupę o wzorze R1CO-, w którym R 1oznacza wodór, C ^o-alkil lub fenylo-C].10-alkil;
A1
oznacza resztę D- lub L-aminokwasu wybranego z grupy, składającej się z Ćpa, Phe,
pGlu, Nal, Pal, Tpi, Trp niepodstawionego lub Trp podstawionego w pierścieniu benzenowym przez j eden lub więcej element wybrany z grupy, składaj ącej się z F, Cl, Br, NH2
lub alkilu C1_3lub peptydowe wiązanie łączące ugrupowanie acylowe R 1-CO- z ugrupowaniem alfa-aminowym z A2;
A2
oznacza Gln, Glu [-], Glu (Y) lub His, gdzie
[-] oznacza wiązanie pojedyńcze, gdy X jest wiązaniem pojedynczym i A2 oznacza
Glu, łączące ugrupowanie gamma-karboksylowe ugrupowania 3-propionylowego
z Glu2 z grupą alfa-aminową z A 1, zaś
Y oznacza resztę -OR2, gdzie R2 oznacza C1-3-alkil;
Leu-psi- oznacza zredukowaną formę Leu, w której zamiast ugrupowania C = 0 występuje -CH2,
także wiązanie tego ugrupowania -CH2- z grupą alfa-aminową sąsiedniej reszty A9jest
wiązaniem pseudopeptydowym;
A9
oznacza Tac, MTac, DMTac, Cys lub Pen; i
Q
oznacza NH2 lub -O Q 1, gdzie Q 1oznacza wodór, alkil C 1-10, fenyl lub fenylo-C1-10-alkil,
lub jego dopuszczalne farmaceutycznie sole.
8
180 372
W związkach według wynalazku grupa A9 oznacza Tac, MTac, DMTac, Cys lub Pen.
Wyjaśnić należy, że człon Tac stanowi utlenioną formę reszty Cys, zaś MTac i DMTac
stanowią dalsze modyfikacje grupy Tac. Podkreślić należy, że skoro grupy Tac, MTac oraz
DMTac stanowią utlenione i dodatkowo zmodyfikowane reszty Cys to związki z tymi grupami są
jednoznacznie mniej podatne na utlenianie, są więc trwalsze od znanych antagonistów bombezyny.
Wskazane wyżej różnice pomiędzy Cys i Tac oraz Trp i Tpi sprawiają, iż nowe związki
według wynalazku są nowe i nieoczywiste w świetle znanego stanu techniki.
Peptydy zdefiniowane powyżej stanowią związki syntetyczne.
Gdy A 1oznacza wiązanie pojedyńcze, pseudopeptyd o wzorze I jest oktapeptydem, ale gdy
A 1jest aminokwasem lub jego analogiem, pseudopeptyd jest nonapeptydem.
Gdy A9 = Tac, MTac lub DMTac, to w A9 obecny jest 5-członowy pierścień heterocykliczny. Pierścień ten generalnie tworzy się przez utlenianie łańcucha bocznego reszty A9 w
pewnym punkcie syntezy nonapeptydu o wzorze I, korzystnie za pomocą formaldehydu lub aldehydu octowego, przebiegające z cyklizacją łańcucha bocznego z grupą alfa-aminową z A9.
Tożsamość uzyskanej scyklizowanej reszty A9 zależy od tożsamości pierwotnej, nieutlenionej
reszty A9 oraz użytego reagenta utleniającego.
Zatem, gdy grupa -CH2-SH z Cys9 ulega cyklizacji z grupą alfa-aminową Cys9 sąsiadującą
z wiązaniem pseudopeptydowym Leu-psi w reakcji z formaldehydem, uzyskany pierścień ma
strukturę o wzorze IIA (pokazaną tu jako fragment -Leu8-psi-Tac9-NH2nonapeptydu o wzorze I):
/
S
\
H2C CH2
NH - CH - CH2 - N - CH - CO - NH2
IIA
I
CH2-CH(CH3)2
Pseudopeptydy te m ają większą czynność biologiczną i dłuższą trwałość niż peptydy nie
zawierające pierścienia, w których A9 oznacza Cys lub Pen. Pomimo to, w niektórych korzystnych postaciach peptydów o wzorze I, w którym A9 nie jest scyklizowane, X, A2 i Q m ają
znaczenie takie jak podano powyżej, A9 oznacza Cys lub Pen, a A 1jest nie wy stępującym naturalnie aminokwasem wybranym z grupy, składającej się z L- lub D-Pal, L- lub D-Tpi.
W niektórych korzystnych postaciach X oznacza R1CO, R 1 oznacza wodór lub alkil C 1-10
(korzystnie metyl); A 1= D-Cap, D-Nal, D-Phe, D- lub L-Tpi, lub D-Trp; A2 - Gln; A9 = Tac lub
DMTac, a Q = NH2.
Jednakże, gdy w innych korzystnych postaciach A 1 oznacza wiązanie peptydowe łączące
ugrupowanie acylowe R1CO- z grupą alfa-aminową A2, to wtedy
A2 oznacza Gln lub His;
A9 oznacza Tac, M-Tac, DM-Tac, a Q oznacza NH2. W korzystnej postaci tych peptydów X
oznacza Hca; A2 oznacza Gln, a A9 oznacza Tac.
Antagoniści bombezyny o wzorze I mogą być zsyntetyzowani na drodze syntezy w fazie
stałej. Według pierwszego protokołu wszystkie aminokwasy kolejno łączy się ze sobą po
przyłączeniu reszty C-końcowej do fazy nośnika w postaci żywicy. Po przyłączeniu wszystkich
reszt aminoacylowych do żywicy, tworzy się 5-członowy pierścień heterocykliczny pseudopeptydu poprzez reakcję łańcucha bocznego reszty C-końcowej z reagentem utleniającym.
Następnie pseudopeptyd poddaje się działaniu HF w celu usunięcia go z fazy żywicy-nośnika. W
wyniku tej reakcji następuje również usunięcie grup zabezpieczających łańcuch boczny.
180 372
9
Według drugiego protokołu pseudopeptydu o wzorze I syntetyzuje się w postaci dwóch
fragmentów, które buduje się w fazie stałej lub w fazie ciekłej. Tripeptyd zawierający C-koniec
łączy się z oligopeptydem, otrzymując całkowitego antagonistę bombezyny o wzorze I.
5 -Członowy pierścień heterocykliczny tworzy się przez reakcję łańcucha bocznego A9 z
reagentem utleniającym. Peptyd poddaje się następnie działaniu HF, w wyniku czego następuje
usunięcie wszystkich grup zabezpieczających z łańcuchów bocznych reszt aminoacylowych i
odszczepienie peptydu z żywicy.
Pseudopeptydy o wzorze I mogą być stosowane w kompozycjach farmaceutycznych do
leczenia niektórych nowotworów ssaków, jak również i innych stanów, przez podawanie efektywnej dawki pseudopeptydu lub dopuszczalnego terapeutycznie kwasu lub jego soli w nośniku
farmaceutycznym. M ogą być one podawane razem z dopuszczalnym farmaceutycznie
nośnikiem w dawkach od około 1 do 1000 mikrogramów na kg wagi ciała dziennie. Taka kompozycja może być podawana pozajelitowo, dożylnie, podskórnie, domięśniowo, donosowo, za pomocą aerozolu płucnego lub w formie depot.
Opis rysunków
Figura 1 jest wykresem obrazującym wpływ podawania niektórych antagonistów bombezyny na raka sutka M XT u myszy na podstawie danych z tabeli 2 w przykładzie VII.
Figura 2 jest wykresem obrazującym wpływ podawania niektórych antagonistów bom bezyny na objętość guza SCLC u nagich myszy w oparciu o dane z tabeli 4 w przykładzie VIIL
Figura 3 jest wykresem obrazującym wpływ podawania niektórych antagonistów bombezyny na objętość guza trzustki MIA PACA-2 u nagich myszy w oparciu o dane z tabeli 5 w
przykładzie IX.
Figura 4 jest wykresem obrazującym wpływ podawania niektórych antagonistów bom bezyny na objętość guza trzustki CAPAN-2 u nagich myszy w oparciu o dane z tabeli 6 w
przykładzie X.
Opis korzystnych postaci
A. Peptydy syntetyczne
1. Nomenklatura
Dla celów wygody opisu mniejszego wynalazku użyto typowych skrótów dla aminokwasów,
peptydów i ich pochodnych, generalnie stosowanych w nauce o peptydach i zalecanych przez
Komisję Nomenklatury Biochemicznej IUPAC-IUB [European J. Biochem. 1984, 138, 9-37],
Skróty dla poszczególnych reszt aminokwasowych są oparte na nazwie pospolitej am inokwasu, na przykład Ala oznacza alaninę, Cys oznacza Cysteinę, Gln oznacza glutaminę, Glu
oznacz kawas glutaminowy, pGlu oznacza kwas piroglutaminowy, Gly oznacza glicynę, His
oznacza histydynę, Leu oznacza leucynę, Phe oznacza fenyloalaninę, Trp oznacza tryptofan, a
Val oznacza walinę. Glu może mieć grupy funkcyjne połączone z gamma-karboksylowym
łańcuchem bocznym: [-] lub Y, zdefiniowane powyżej. Dpa oznacza kwas 2,3-diaminopropionowy.
Gdy reszta aminokwasu posiada formy izomeryczne, to jeśli wskazano inaczej za pom ocą symbolu D- lub DL- występującego przed symbolem aminokwasu, to występuje on w formie L.
Skróty nietypowych aminokwasów stosowane w niniejszym wynalazku są następujące:
oznacza para-chlorofenyloalaninę
Cpa
oznacza kwas 2,3-diaminopropionowy
Dpa
oznacza kwas piroglutaminowy
pGlu
oznacza 3-(2-naftylo)alaninę
Nal
oznacza 3-(3-pirydylo)alaninę
Pal
oznacza penicyloaminę
Pen
oznacza kwas 2,3,4,9-tetrahydro-1H-pirydo[3,4-b]indolo-3-karboksylowy
Tpi
oznacza kwas tiazolidyno-4-karboksylowy
Tac
oznacza 2-metylotiazolidyno-4-karboksylowy
Mtac
DMTac oznacza kwas 5,5-dimetylotiazolidyno-4-karboksylowy
10
180 372
Analog aminokwasu obejmuje:
Hca
oznacza kwas hydrocynamonowy lub des-amino-fenyloalaninę
Zastosowano następujące skróty:
AC
acyl
Ac
acetyl
AcOH kwas octowy
BHA
benzhydryloamina
Boc
tert-butoksykarbonyl
(BOC)2O diwęglan di-tert-butylu
Bom
benzyloksymetyl
But
butyl
Bzl
benzyl
BSA
bydlęca albumina osocza
DIC
1,3-diizoprpylokarbodiimid
DMEM pożywka Eagle'a zmodyfikowana przez Dulbecco
DMF dimetyloformamid
Et
etyl
EDTA kwas etylenodiaminotetraoctowy
FCBS cielęca surowica płodowa
Fmoc 9-fluorenylometyloksykarbonyl
For
formyl
HITES pożywka R P M I 16 4D plus 10-8M hydrokortyzonu, 5 μ/ml insuliny
bydlęcej, 10 ¡μg/ml ludzkiej transferyny, 10-8M (3-estradiolu i 3 x 10-8M
Na2SeO3
HOBt
1-hydroksybenzotriazol
HPLC
wysokosprawna chromatografia cieczowa
Leu-psi jest zredukowaną formą Leu, w której zamiast wiązania C=O jest
wiązanie -CH2-, tak że wiązanie tego ugrupowania -CH2- z ugrupowaniem
aminokwasowym A9 jest wiązaniem pseudopeptydowym
Me
metyl
MeCN acetonitryl
MeOH alkohol metylowy
PBS
solanka buforowana fosforanem
TEA
trietyloamina
TFA
kwas trifluorooctowy
Sekwencje peptydów sąpisane zgodnie z konwencją według której aminokwas N-końcowy
jest po lewej stronie, a aminokwas C-końcowy jest po prawej stronie. Należy jednakże zwrócić
uwagę, że jeśli nie wskazano inaczej, to nie jest stosowana konwencja numerowania reszt aminokwasów we fragmentarycznym peptydzie zgodnie z odpowiadającą pozycją w kompletnym
tetradekapeptydowym antagoniście bombezyny. Jeśli konwencja ta byłaby stosowana, to reszty
w opisanym tu nonapeptydzie o wzorze I byłyby numerowane od 6 do 14, a rdzeń antagonistów
bombezyny Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu byłby numerowany A 8-A9-A 10-A 11-A 12-A 13. W celu uniknięcia pomyłki, antagoniści bombezyny są zamiast tego numerowani w sposób następujący:
A 1 oznacza aminokwas N-końcowy; A9 oznacza C-końcową resztę aminokwasu (lub analogu
aminokwasu): a reszty leżące między nimi są numerowane kolejno od A2 (sąsiadująca z N-końcową
resztą A 1) wzrastającymi liczbami do A8 (sąsiadująca z resztą C-końcową A9).
2. Korzystne postacie
Pseudopeptydy, będące antagonistami bombezyny według wynalazku scharakteryzowane
s ą przez sekwencje aminokwasów, w szczególności przy resztach A 1, A2 i A9, jak również przez
obecność wiązania pseudopeptydowego między A 8 i A9 oraz przez obecność 5-cżłonowego
pierścienia heterocyklicznego przy A9. Struktura pierścienia jest zdeterminowana przez tożsa-
180 372
11
mość reszty A9 oraz związku użytego do jej utlenienia. Zatem, gdy użyje się formaldehydu i A9
oznacza Cys, powstały pierścień ma strukturę Tac o wzorze IIA (pokazaną tu jako fragment
Leu8-psi-Tac9-Q peptydu o wzorze I, w którym Q = NH2):
CH2-CH(CH3)2
Gdy Cys zamiast formaldehydem utleni się aldehydem octowym, to powstały 5-członowy
pierścień heterocykliczny ma strukturę MTac o wzorze IIB (pokazaną tu jako fragment Leu8-psi-MTac 9-Q peptydu o wzorze I, w którym Q = NH2):
Gdy A9 zamiast Cys oznacza Pen i jest utleniane formaldehydem, uzyskany pierścień ma
strukturę DMTac o wzorze IIC (pokazaną tu jako fragment Leu8-psi-DMTac9-Q nonapeptydu o
wzorze I, w którym Q = NH2):
W tych korzystnych postaciach korzystne jest, gdy X = H lub Ac, A 1= D-Phe, A2 = G ln, a
Q = NH2.
12
180 372
Najbardziej korzystne pseudopeptydy będące antagonistami bombezyny według wynalazku przedstawiono poniżej.
Numer
Struktura
peptydu
1.
D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2
2.
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2
3.
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-MTac-NH 2
4.
Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2
5.
D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2
6.
D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-MTac-NH 2
7.
D-Na1-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2
8.
Pa1-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2
9.
D-Pa1-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2
10.
D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2
11.
Ac-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2
12.
Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2
13.
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-T ac-NH 2
14.
Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2
15.
D-Phe-His-T rp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2
16.
D-Phe-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2
17.
D-Phe-Glu[-]-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2
18.
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-DMTac-NH 2
19.
Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-DMTac-NH 2
20.
D-Cpa-Gln-Trp-Al a-Val-Gly-His-Leu-psi-DMTac-NH 2
21.
Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-HiS'Leu-psi-DMTac-NH 2
22.
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-DMTac-NH 2
Do szczególnie korzystnych postaci pseudopeptydów należą następujące:
2.
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2
13.
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-T ac-NTb
18.
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-DMTac-NH2
180 372
13
Pełną charakterystykę związków według wynalazku, określa 27 sekwencji scharakteryzowanych w dalszej części opisu wynalazku
B. Metody syntetyczne
1. Przegląd
Pseudopeptydy o wzorze I m ogą być otrzymywane dowolną z technik znanych specjalistom z dziedziny peptydów. Podsumowanie takich dostępnych technik można znaleźć w książce
M. Bodanszky, Principles o f Peptide Synthesis, Springer-Verlag, Heidelberg, 1984.
Wszystkie pseudopeptydy o wzorze I mogą być syntetyzowane zgodnie z procedurami
syntezy w fazie stałej. Synteza w fazie stałej jest szczególnie korzystną metodą otrzymywania
peptydów według wynalazku i peptydów pośrednich. Techniki syntezy prowadzonej całkowicie
w fazie stałej są przedstawione w podręczniku J. M. Stewart i J. D. Young, Solid Phase Peptide
Synthesis, Pierce Chem. Co., Rockford, IL, 1984 (wyd. 2) oraz w przeglądzie G. Barany i
w spółpr., Int. J. Peptide P rotein R es., 30, 705: 7739, 1987. (D odatkow y etap utleniania
C-końcowej reszty A9 w celu scyklizowania charakterystycznego łańcucha bocznego reszty z jej
grupą alfa-aminową może być przeprowadzony w jednym z kilku punktów syntezy peptydów o
wzorze I).
Dla wytworzenia pseudopeptydów, będących antagonistami bombezyny o wzorze I można
stosować co najmniej dwa protokoły syntetyczne. Zgodnie z pierwszym protokołem po
przyłączeniu reszty C-końcowej A9 do fazy żywicy-nośnika, wszystkie aminokwasy łączy się
kolejno ze sobą. Zgodnie z drugim protokołem na żywicy buduje się tripeptyd. Jest on następnie
łączony z oligopeptydem przenoszącym pozostałe aminokwasy z utworzeniem antagonisty
bombezyny. W obu protokołach synteza rozpoczyna się przy reszcie C-końcowej A9i dołącza się
kolejno reszty aminokwasów, a wzrost przebiega w kierunku reszty N-końcowej.
1.
(a) Protokół pierwszy. Jako fazę żywicy-nośnika w syntezie pseudopeptydów w fazie
stałej można stosować dostępne w handlu, żywicę benzhydryloaminową (BHA) lub 1% chlorometylowaną żywicę polistyrenową, usieciowaną diwinylobenzenem. Reszta C-końcowa A9
jest przyłączona do tej żywicy poprzez swoją grupę karboksylową. Reakcji między dwoma
takimi resztami zapobiega się przez przyłączenie chemicznej grupy zabezpieczającej do grupy
alfa-aminowej każdej reszty A9 przed jej przyłączeniem do żywicy. Grupą zabezpieczającą dla
grupy alfa-aminowej reszty A9 i każdej następnie przyłączanej reszty aminokwasu może być
grupa 9-fluorenylometyloksykarbonylowa (Fmoc) albo grupa tert-butoksykarbonylowa (Boc).
Fmoc jest preferowana przy sprzęganiu od C-końcowej reszty A9 aż do A2, ponieważ w reakcji
usuwania Boc, usuwa się również grupę zabezpieczającą łańcuch boczny z C-końcowej reszty
A9. Podczas tych reakcji łączenia, charakterystyczne grupy funkcyjne łańcuchów bocznych niektórych aminokwasów m ogą być również zabezpieczone przed niepożądaną reakcją chemiczną
przez przyłączenie do nich przed reakcją łączenia chemicznych grup zabezpieczających (dla A9
odpowiednia jest But).
Po przyłączeniu reszty C-końcowej Fmoc- A9(But) do fazy nośnika, odbezpiecza się jej
grupy alfa-aminowe i sprzęga z n ią Fmoc-Leu-CHO, tworząc w ten sposób wiązanie pseudopeptydowe.
Pozostałe reszty A5, A4, A3 i A2, odpowiednio zabezpieczone przez Fmoc, oraz A 1, odpowiednio zabezpieczoną przez Boc, dodaje się etapowo w odwrotnym porządku numerowym (A7, A6, etc.),
konstruując żądany pseudopeptyd.
Gdy w pseudopeptydzie obecny jest His lub Glu, to ich łańcuchy boczne mogą być podczas
reakcji ich przyłączenia lub reakcji przyłączenia innych reszt, narażone na niepożądane reakcje
chemiczne. W związku z tym do takich łańcuchów bocznych m ogą być przed połączeniem tych
aminokwasów w reakcji łączenia, przyłączone chemiczne grupy zabezpieczające.
Po przyłączeniu wszsytkich reszt aminokwasów do żywicy BHA, grupa Boc pseudopeptydu na N-końcu może być usunięta. 5-Członowy pierścień heterocykliczny Tac, MTac lub
DMTac tworzy się przez reakcję odsłoniętego ugrupowania -CH2-SH Cys (lub -C(CH3)2SH Pen)
oraz drugorzędowej grupy aminowej ze zredukowanego wiązania łączącego reszty A8i A9 (to jest
14
180 372
grupy alfa-aminowej A9) z reagentem utleniającym, takim jak formaldehyd lub aldehyd octowy.
Przejściowy pseudopeptyd, nadal obarczony grupami zabezpieczającymi łańcuchy boczne, poddaje się działaniu HF w celu odszczepienia go od fazy żywicy-nośnika oraz w celu usunięcia grup
zabezpieczających łańcuchy boczne.
1.
(b) Protokół drugi. W drugim protokole metodami syntezy w fazie stałej buduje się
tnpeptyd na żywicy BHA, otrzymując zabezpieczoną tripeptydo-żywicę:
Boc-His(Bom)7-Leu8-psi-Cys(But)9-żywica BHA
Grupę Boc1 oraz grupę But usuwa się, a ugrupowanie -CH2-SH z Cys cyklizuje się z
drugorzędową grupą aminową ze zredukowanego wiązania łączącego reszty A8 i A9, otrzymując
His(Bom)7-Leu8-psi-Tac9-żywica BHA. Po obróbce HF otrzymuje się wolny tripeptyd
His7-Leu8-psi-Tac-NH2.
Boc-A1-A2-Trp-Ala-Val-Gly-OCH2-żywica buduje się etapowo na Gly-CH2-żywica zgodnie ze standardowymi metodami syntezy w fazie stałej, a następnie działa przez 12 godzin 95%
metanolem, zawierającym 1% KCN w celu odszczepienia Boc-oligopeptydu. Po skonstruowaniu
dwóch fragmentów Boc-oligopeptyd dołącza się do wolnego tripeptydu His7-Leu8-psi-Tac9-NH2
za pomocą reagenta BOP. Grupę Boc następnie usuwa się, otrzymując żądany peptyd.
Przed szczegółowym opisaniem syntezy antagonistów bombezyny o wzorze I, opisanych
zostanie kilka operacji syntetycznych wspólnych dla jednego lub obu powyższych protokołów.
2. Ogólne operacje syntezy polipeptydów.
Operacja 1: tworzenie niektórych syntetycznych reszt lub reagentów.
a) L- i D-Tpi: 2,04 g ( 10 mM) L-Trp rozpuszcza się w 25 ml wrzącej wody, zawierającej 2,1 g
kwasu cytrynowego. Dodaje się0,5 ml 40% wodnego roztworu formaldehydu, po czym rozpoczyna
się natychmiastowe powstawanie osadu. Mieszaninę chłodzi się w łaźni lodowej i osady zbiera
się oraz przemywa zimną wodą i powietrzem, po czym suszy w temperaturze pokojowej, otrzymując 2,14 g lub 99% osadu o t.t. (z rozkładem) ok. 310°. Izomer D tworzy się w ten sam sposób z
D-Trp i ma on również t.t. (z rozkładem) ok. 310°.
b) L- i D-Boc-Tpi: Do mieszanej zawieśmy 10,8 g (50 mM) D-Tpi w 250 ml 0,2N NaOH i
7,5 ml trietyloaminy dodaje się 10 g diwęglanu di-tert-butylu, mieszaninę miesza się przez 4
godziny, po czym dodaj e się następne 10 g diwęglanu, oraz kolejne 10 g po następnych 3 godzinach
mieszania. Mieszaninę miesza się przez noc i ekstrahuje eterem (2 x 100 ml), który odrzuca się.
Do warstwy wodnej dodaje się kwas cytrynowy w celu uzyskania pH 3-5. Osad zbiera się, przemywa wodą i suszy na powietrzu przez noc.
Osad zawiesza się w 100 ml tetrahydrofuranu. Prawie cały osad ulega rozpuszczeniu. Substancje nierozpuszczalne usuwa się przez odsączenie i usuwa się THF pod próżnią. Pozostałość
rozciera się z eterem, otrzymując 9,20 g lub 58%. Materiał ten ma taką samąt t. jak materiał wyjściowy,
ale różni się rozpuszczalnością oraz TLC na żelu krzemionkowym przy użyciu układu rozwijającego CHCl3 : MeOH : HOAc 85 : 15 • 0,5.
2,55 g L-Tp1przy użyciu tej samej metody daje 2,22 g lub 59% Boc-Tpi.
c) Fmoc-Leu-CHO. Ester metylowy Fmoc-1eucyny (35 g, 134 mmole) w suchym toluenie
(250 ml) pod N2 ochładza się w łaźni suchy lód/aceton i dodaje w ciągu 30 minut 150 ml 25% wodorku di-izobutyloglinowego. Po dodaniu wodorku di-izobutyloglinowego mieszaninę miesza
się w łaźni suchy lód/aceton przez 20 m inut, po czym ostrożnie dodaje m etanol (15 ml).
Mieszaninę wylewa się do 1000 ml lodowato-zimnej wody, wytrząsa się i sączy. Toluen oddziela
się, a warstwę w odną re-ekstrahuje eterem (3 x 300 ml). Ekstrakty toluenowe i eterowe łączy się i
suszy nad Na2SO4. Uzyskany olej przepuszcza się szybko przez kolumnę z żelem krzemionkowym (3 x 50 cm) w 1500 ml 15% EtOAc/nafta. Otrzymuje się w postaci osadu Fmoc-Leu-CHO (27,6 g).
d) Syntetyczne aminokwasy lub analogi aminokwasów do włączania do pseudopeptydów,
będących antagonistam i bom bezyny według w ynalazku są ogólnie dostępne ze źródeł
handlowych. Zatem Hca jest dostępny w handlu z Aldrich Co., 1001 St. Paul Avenue, M ilwaukee, WI53233. Aminokwasy zabezpieczone Boc lub Fmoc są dostępne w handlu z Advanced
180 372
15
ChemTech, 5609 Fern Valley Road, Louisville, KY 40228; lub Bachem California, 3132 Kashiwa Street, Torrance, CA 90505.
Operacja 2: Otrzymywanie żywicy i dołączanie reszty A9
Żywicę BHA przygotowuje się przez działanie 10% TEA w CH2Cl2 (zobojętnianie) dwa
razy po trzy minuty i przemywanie sześć razy CH2Cl2. Resztę Fmoc-A9(But) wiąże się z żywicą
przez dodanie 1,35 mmola Fmoc-A9(But) i 1,50 mmola 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt) w
DMF i mieszanie przez trzy minuty. Dodaje się 20% 1,3-diizopropylokarbodiimid (DIC) z 1,3
mmola CH2Cl2. Mieszaninę wytrząsa się w temperaturze pokojowej przez 60 minut. Uzyskany
Fmoc-A9(But)-żywica BHA przemywa się po dwa razy CH2Cl2 i metanolem oraz trzy razy
CH2Cl2, po czym poddaje się testowi Kaisera (Anal. Biochem. 34,595 (1970). W przypadku niekompletnego sprzężenia procedurę powtarza się.
Operacja 3: Tworzenie wiązania pseudopeptydowego
Odbezpieczenie grupy Fmoc z A9 przeprowadza się przez dodanie 50% piperydyny w
DMF i mieszanie przez 30 minut, przemycie DMF ( 6 x 1 minuta), a następnie i) dodanie FmocLeu-CH O (3 rów now ażniki) w DMF, zaw ierającym 1% A cO H i ii) dodanie N aB H 3CN
(3,5 równoważnika) w DMF i wytrząsanie przez 60 minut. Następnie przemywa się 50% MeOH
(3 x 1 minuta), 100% M eOH ( 3 x 1 minuta) i DMF ( 3 x 1 minuta).
Operacja 4: Sprzęganie aminokwasów i tworzenie wiązania peptydowego
Grupą zabezpieczającą dla grupy alfa-aminowej reszty A9 i każdej kolejno dołączanej
reszty aminokwasu może być grupa 9-fluorenylometyloksykarbonylowa (Fmoc) albo grupa
tert-butoksykarbonylowa (Boc). Fmoc jest preferowana przy sprzęganiu A9 z resztami aż do
reszty sąsiadującej z N-końcową resztą aminokwasu, ponieważ w reakcji usuwania Boc
następuje również usunięcie grupy zabezpieczającej łańcuch boczny A9.
A) Stosowanie Fmoc-aminokwasu
W celu wprowadzenia Fmoc-aminokwasu do pośredniego Fmoc-peptydu przeprowadza
się następujące procedury.
(1) Pośredni Fmoc-peptyd odbezpiecza się i zobojętnia, po czym przemywa CH2Cl2 (3 x 1
minuta) i DMF ( 3 x 1 minuta).
(2) Fmoc-aminokwas sprzęga się z odbezpieczonym peptydem pośrednim przez: i) dodanie Fmoc-aminokwasu (3 równoważniki) i HOBt (3,3 równoważnika) w DMF (3 minuty) do
peptydu pośredniego; ii) dodanie 3 równoważników DIC (jako 20% roztworu w CH2Cl2) i
wytrząsanie mieszaniny przez 90 m inut..
(3) Następnie mieszaninę przemywa się etanolem ( 3 x 1 minuta) i DMF (3 x 1 minuta).
W celu sprzężenia dalszych reszt nowo sprzężony Fmoc-aminokwas odbezpiecza się za
pomocą 50% piperydyny w DMF przez 30 minut oraz przemywa DMF (6 x 1 minuta). Pozostałe
sprzęgania przebiegają w sposób opisany w etapie (2).
Za każdym razem, gdy nowy aminokwas jest sprzęgany z żywicą lub peptydem, przeprowadza się test Kaisera; w przypadku, gdy sprzężenie nie było kompletne, reakcję powtarza się.
Do sprzęgania Fmoc-Gly i Fmoc-Gln etap (2) tej Operacji modyfikuje się następująco: do
roztworu mieszaniny Fmoc-aminokwasu (3,0 równoważnika) i HOBt (3,3 równoważnika) w
DMF dodaje się 3 równoważniki DIC (jako 20%CH2Cl2) w ciągu 15 minut i w temperaturze
pokojowej. Mieszaninę reakcyjną dodaje się do peptydo-żywicy, wytrząsa przez 1 godzinę w
przypadku Fmoc-Gly i przez 2 godziny w przypadku Fmoc-Gln.
B) Stosowanie Boc-aminokwasu
W celu wprowadzenia Boc-aminokwasu do pośredniego Fmoc-peptydu przeprowadza się
następujące procedury.
(1) Grupę Boc usuwa się przez dodanie 50% TFA w CH2Cl2;
(2) dodaje się 50% TFA w CH2Cl2, zawierającym 5% merkaptoetanolu i 5% anizolu przez
25 minut; i
(3) przemywa się CH2Cl2 (2 razy po 1 minucie), MeOH (2 razy po 1 minucie) i DMF (3 razy
po 1 minucie).
16
180 372
(4) Sprzęganie reszty Boc-aminokwasu przeprowadza się przez dodanie 3 równoważników
Boc-aminokwasu i 3,3 równoważników HOBt w DMF i mieszanie przez 3 minuty. Następnie dodaje się 3 równoważniki 20% diizopropylokarbodiimidu w CH2Cl2 i wytrząsa przez 90 minut.
Mieszaninę reakcyjną następnie przemywa się MeOH (3 razy przez 1 minutę) i CH2Cl2 (3 razy po
1 minucie).
(5) Grupę Boc usuwa się (odbezpieczenie) przez przemycie produktu etapu (5) 50% TFA w
CH2Cl2, zawierającym 5% merkaptoetanol (5 minut) i 5% anizol (25 minut). Następnie dodatkowo przemywa się CH2Cl2 (2 razy po 1 minucie), MeOH (2 razy po 1 minucie) i DMF (3 razy po
1 minucie).
Należy pamiętać o tym, że usuwanie grupy Boc powoduje również usunięcie grupy zabezpieczającej But, odpowiednio sprzężonej z łańcuchem bocznym A9. Zatem usuwanie Boc przeprowadza się zwykle dopiero bezpośrednio przed cyklizacją reszty A9.
Operacja 5: Tworzenie 5-członowego pierścienia heterocyklicznego
Strukturę pierścieniową o wzorze IIA tworzy się przez wytrząsanie peptydu pośredniego,
mającego odbezpieczoną Cys9 w mieszaninie 50% AcOH, 3,7% HCHO i DMF (1:1:8) w temperaturze pokojowej przez 10 minut i odsączenie. Produkt przemywa się po trzy razy DMF,
MeOH i CH2Cl2.
Strukturę pierścieniową o wzorze IIB tworzy się przez wytrząsanie peptydu pośredniego,
mającego odbezpieczoną Cys9 w mieszaninie 50% AcOH, 10% CH3CHO i DMF (1,5:0,5:8) w
temperaturze pokojowej przez 10 minut i odsączenie. Produkt przemywa się po trzy razy DMF,
MeOH i CH2Cl2.
Strukturę pierścieniową o wzorze IIC tworzy się przez wytrząsanie peptydu pośredniego,
mającego odbezpieczoną Pen9 w mieszaninie 50% AcOH, 3,7% HCHO i DMF (1:1:8) w temperaturze pokojowej przez 3 minuty i odsączenie. Produkt przemywa się po trzy razy DMF,
MeOH i CH2Cl2.
Operacja 6: Odłączenie peptydu od żywicy
Po dołączeniu wszystkich żądanych reszt aminokwasów na pośrednią peptydo-żywicę
działa się ciekłym HF w obecności anizolu w celu odszczepienia polipeptydu od fazy nośnika. W
wyniku tej reakcji usuwa się również grupy zabezpieczające łańcuch boczny. Gdy stosuje się
żywicę BHA, uzyskany peptyd pośredni ma Q = NH2.
Jeśli X jest inne niż H, to grupę X umieszcza się przy N-końcu albo przez wprowadzenie
aminokwasu już obarczonego grupąX (na przykład Ac-D-Phe) lub przez reakcję odbezpieczonej
grupy alfa-aminowej przy N-końcowym A 1pośrdniego pseudopeptydu z odpowiednim reagentem. Zatem kompletny peptyd po usunięciu z fazy nośnika-żywicy można odpowiednio poddać
reakcji z KOCN, uzyskując X = NH2CO-.
Operacja 7: Oczyszczanie peptydów.
Pseudopeptydy o wzorze I oczyszcza się generalnie za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) na kolumnie z odwróconymi fazami, przeprowadzanej na układzie
Rainin HPLC (Rainin Inc., Co., Wobum, MA), składającym się z trzech pomp do HPLC typu
Rabbit HP, kontrolowanych przez komputer Apple Macintosh Plus, wstrzykiwacza typu Rheodyne oraz monitora UV zmiennej długości fali typu Knauer Model 87. Surowe peptydy (10-40 mg)
załadowuje się na kolumnę Dynamax Macro (21,2 x 250 mm) wypełnioną sferycznym żelem
krzemionkowym C 18(wielkość porów: 300 A; wielkość cząstek: 12 μm) (Rainin Inc. C o .)i eluuje
w gradiencie liniowym, stosując układ rozpuszczalników składający się z (A) 0,1% TFA i (B)
0,1 % TFA w 70% wodnym acetonitrylu przy prędkości przepływu 2,0 ml/min. Wszystkie frakcje
ocenia się pod względem czystości i czasu retencji za pomocą analitycznego HPLC opisanego
poniżej.
Jakość oraz charakterystykę elucji surowego i oczyszczonego peptydu ocenia się za pom ocą analitycznego HPLC na chromatografie cieczowym model Hewlett-Packard 1090, wyposażonym w detektor z diodą szeregową nastawioną na 220 i 280 nm oraz kolumnę z odwróconymi
fazami 4,6 x 250 mm W-porex C 18 (wielkość porów: 300A, wielkość cząstek: 5 μm). Utrzymuje
180 372
17
się prędkość p rzepływ u układu rozpuszczalników (A) i (B) o p isan eg o pow yżej ró w n ą
1,2 ml/min, a rozdziały przeprowadza się w temperaturze pokojowej.
W większości przyp adków pseudopeptydy, będące antagonistami bombezyny są dodatkowo oczyszczane przez ponowną chromatografię na tej samej kolumnie przy niewielkiej modyfikacji warunków gradientu. Jednorodność oczyszczonych peptydów zgodnie z wynikami
analitycznej HPLC wynosi powyżej 97%.
W razie potrzeby analizę aminokwasów w pseudopeptydach o wzorze I można przeprowadzić za pom ocą analizatora aminokwasów typu Beckmann 6300 na próbkach hydrolizowanych przez 20 godzin w 110°C w zamkniętych, ewakuowanych probówkach za pomocą4M
kwasu metanosulfonowego, zawierającego 0,2% 3-(2-aminoetylo)indolu.
C. Syntetyczne związki poślednie
1. Grupy zabezpieczające łańcuchy boczne
W syntezie, w fazie stałej powszechnie stosuje się zabezpieczanie reaktywnych grup funkcyjnych w łańcuchach bocznych różnych ugrupowań aminokwasów lub fragmentów peptydów.
Grupy funkcyjne w łańcuchach bocznych mogą być zabezpieczone w celu zapobiegania przebiegu niepożądanej reakcji chemicznej na wspomnianych łańcuchach. W związku z tym powszechne
jest otrzymywanie peptydu pośredniego, który zawiera wszystkie reszty aminoacylowe umiejscowione w żądanej sekwencji w łańcuchu peptydowym z grupami zabezpieczającymi łańcuch
boczny, przyłączonymi do odpowiednich reszt.
Przy doborze konkretnych grup zabezpieczających łańcuch boczny w syntezie peptydów,
postępuje się na ogół według następujących zasad:
(a) grupa zabezpieczająca zachowuje z reguły swoje właściwości zabezpieczające w warunkach sprzęgania,
(b) grupa zabezpieczająca powinna być stabilna w stosunku do reagentów sprzęgających,
korzystnie jest stabilna w warunkach sprzęgania dobranych tak, aby usuwać grupy zabezpieczające grupy alfa-aminowe w każdym etapie syntezy i
(c) grupa zabezpieczająca łańcuch boczny musi być usuwalna po zakończeniu syntezy
żądanej sekwencji aminokwasów w warunkach reakcji nie zmieniających w sposób niepożądany
łańcucha peptydowego.
Grupy zabezpieczające łańcuchy boczne przyłącza się do reszt aminokwasów metodami
znanymi ze stanu techniki. Do odpowiednich grup zabezpieczających łańcuch boczny dla His
należy Bom, a dla Glu i Cys But.
2. Syntetyczne związki pośrednie
Zakresem wynalazku objęte s ą również pośrednie peptydy z kolejnych etapów syntezy. Zilustrowano tu peptydy pośrednie dla peptydu 2 na trzech etapach.
Etap A: po połączeniu wszystkich aminokwasów i żywicy:
Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica-BHA („ 1/02/A”);
Etap B: po usunięciu N-końcowej grupy Boc:
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys-żywica-BHA („1/02/B”);
Etap C: po cyklizacji A9:
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica-BHA („1/02/C”).
Jest jeden dalszy etap, Etap D, zilustrowany w syntezie peptydu nr 17 w poniżej przedstawionym przykładzie II. Związek pośredni z etapu D usuwa się z żywicy, ale nie ma jeszcze pojedynczego wiązania X, łączącego A 1 z A2.
Zastosowania medyczne
Antagoniści bombezyny są użyteczni w leczeniu stanów hipergastrynemii, na przykład
anemii złośliwej, chronicznego zanikowego nieżytu żołądka, zespołu Zollingera-Ellisona i bielactwa nabytego, z towarzyszącą hiperplazją komórek gastrycznych typu komórek
srebrnochłonnych, a także ze zwiększonym ryzykiem rozwinięcia się wieloogniskowych guzów
rakowatych żołądka. Ponadto, hiperplazja komórek typu srebn ochłonnego powstaje zwykle u
zwierząt hipergastrynemicznych.
18
180 372
Leczenie takie ma pewne zalety w stosunku do obecnie stosowanych leków, ponieważ antagoniści H2, jak cimetydyna, powodują hipergastrynemię i m ogą prowadzić u ludzi do guzów rakowatych. Ponadto, przerwanie terapii antagonistami H2 powoduje natychmiastowy nawrót
wrzodów z powodu istniejącej hipergastrynemii.
Ponieważ związki według wynalazku są antagonistami receptorów bombezyny/GRP,
mogą być stosowane w leczeniu raka płuc, raka okrężnicy i raka żołądka.
Antagoniści bombezyny o wzorze I mogą być podawani w postaci dopuszczalnych farmaceutycznie, nietoksycznych soli, takich jak sole addycyjne z kwasami. Przykładowymi takimi
solami addycyjnymi z kwasami są chlorowodorek, bromowodorek, siarczan, fosforan, fumaran,
glukonian, taninian, maleinian, octan, cytrynian, benzoesan, bursztynian, alginian, pamoesan,
jabłczan, askorbinian, winian i podobne.
Te kompozycje farmaceutyczne będą zawierać pseudopeptydy o wzorze I w połączeniu z
typowym, dopuszczalnym farmaceutycznie nośnikiem, na przykład dopuszczalną jest solanka
fizjologiczna, chociaż m ogą być stosowane inne nośniki znane ze stanu techniki.
Leczenie osób za pom ocą tych kompozycji farmaceutycznych może być prowadzone w ten
sam sposób jak leczenie kliniczne przy użyciu innych agonistów i antagonistów LHRH lub analogów somatostatyny. Zatem antagoniści bombezyny o wzorze I mogą być podawani dożylnie,
podskórnie, domięśniowo, donosowo lub za pomocą aerozolu płucnego albo w formie depot (na
przykład mikrokapsułek, mikrogranulek lub cylindrycznych implantów typu pałeczki), w ytworzonych z odpowiedniego biodegradowalnego polimeru (takiego jak DL-laktydokoglikolid). W zakres wynalazku wchodzą również inne równoważne sposoby podawania, na
przykład wlewy ciągłe, pompa infuzyjna i sposoby uwalniania rozłożonego w czasie, takie jak
mikrokapsułki i podobne.
Efektywne dawki peptydów o wzorze I zależeć będą od postaci podawania i konkretnego
leczonego gatunku ssaka. Dawka będzie wynosić około od 1 do 1000 mikrogramów peptydu na
kilogram wagi ciała gospodarza na dzień przy podawaniu pozajelitowym. Te zakresy s ą jedynie
zakresami preferowanymi i w odpowiednich okolicznościach m ogą być wybrane wyższe dawki.
Może być podawany roztwór soli fizjologicznej zawierający peptyd, zapewniając dawkę w zakresie od około 0,01 do 0,20 mg/kg wagi ciała dziennie, z wyjątkiem form depot, dla których
wstrzykiwana ilość jest wyliczana tak, aby działanie trwało od około 15 do około 30 dni lub
dłużej.
W poniższych przykładach zastosowano trzyliterowy kod, identyfikujący peptydy pośrednie na niektórych etapach syntezy. Peptyd zakodowany „1/01/A” jest peptydem pośrednim dla
peptydu „01”, wytworzonego w przykładzie I, który zakończył etap A syntezy. Podobnie
„2/08/B” i „4/19/C” są peptydami pośrednimi dla peptydów odpowiednio „08” i „19” w
przykładach II i VI, które zakończyły syntezę etapów odpowiednio B i C.
Przykład I
N r peptydu
1. D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2
2. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2
4. Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2
5. D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2
7. D-Na1-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2
8. Pa1-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2
9. D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2
10. D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2
180 372
19
11. Ac-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2
12. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2
13. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2
14. Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2
Peptydy te m ogą być odpowiednio syntetyzowane ze wspólnego związku pośredniego 1-1,
Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica-BHA w sposób opisany poniżej.
Fmoc-Leu-psi-Cys(But)-żywica-BHA otrzymuje się następująco: 2,0 g żywicy BHA
(0,55 mmola NH2/g) otrzymuje się przez działanie 20 ml 10% TEA w CH2Cl2 (zobojętnianie)
dwa razy po 3 minuty i przemycie sześć razy 20 ml CH2Cl2; następnie miesza się z 3,3 mmola
Fmoc-Cys(But) i 3,6 mmola HOBt w DMF przez trzy minuty. Dodaje się 3 równoważniki DIC
(jako 20% roztwór w CH2Cl2), Mieszaninę wytrząsa się w temperaturze pokojowej przez 90 m inut. Uzyskany związek Fmoc-Cys(But)-żywica-BHA przemywa się po dwa razy CH2Cl2 i m etanolem oraz trzy razy CH2Cl2, a następnie poddaje testowi Kaisera.
Sprzęganie Fmoc-Leu-CHO z utworzeniem wiązania pseudopeptydowego przeprowadza
się następująco. Odbezpieczenie grupy Fmoc z A9 przeprowadza się przez dodanie 15 ml 50%
piperydyny w DMF i mieszanie przez 30 minut i przemycie 15 ml DMF (6 x 1 minuta). Następnie
dodaje się 3.3 mmola Fmoc-CHO (3 równoważniki) w DMF, zawierającym 1% AcOH, a następnie
NaBH3CN (3,5 równoważnika) w DMF i wytrząsa przez 1 godzinę. Następnie przemywa się 15 ml
50% MeOH (3 x 1 minuta); 15 ml 100% MeOH (3 x 1 minuta); i 15 ml DMF ( 3 x 1 minuta).
Usuwanie grupy Fmoc (odbezpieczanie) z Fmoc-Leu-psi-Cys(But)-żywica-BHA przeprowadza się jak w operacji 4A.
Po usunięciu grupy Fmoc z Fmoc-Leu-psi-Cys(But)-żywica-BHA i zobojętnieniu, przeprowadza się sprzęganie Fmoc-His(Bom) tak jak opisano dla operacji 4A.
Sprzęganie Fmoc-Gly przeprowadza się jak w operacji 4. Do roztworu 3,3 mmola Fmoc-Gly i 3,6 mmola HOBt dodaje się w 0°C 20% roztwór 1,3-diizopropylokarbodiimidu (3,3
mmola) w CH2Cl2, miesza się chłodząc przez 15 minut oraz przez 15 minut w temperaturze pokojowej, odsącza precypitat i dodaje do żywicy oraz wytrząsa przez 60 minut. Następnie przez
sprzęganie w ten sam sposób wprowadza się kolejno dalsze reszty aminokwasowe Fmoc-Val,
Fmoc-Ala i Fmoc-Trp, uzyskując 3,80 g związku pośredniego 1-1, zabezpieczonej peptydo-żywicy o strukturze Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA.
W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Gln i Boc-D-pGlu z pośrednim peptydem I-1 otrzymuje się:
Boc-D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („1/01 /A”) .
W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Gln i Boc-D-Phe z pośrednim peptydem I-1 otrzymuje się:
Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („1/02/A”).
W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Gln i Ac-D-Phe z pośrednim peptydem I - 1 otrzymuje się:
Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („1/04/A”).
W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Gln i Boc-D-Cpa z pośrednim peptydem I-1 otrzymuje się:
Boc-D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („1/05/A”)W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Gln i Boc-D-Nal z pośrednim peptydem I-1 otrzymuje się:
Boc-D-Na1-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („1/07/A”).
W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Gln i Boc-Pal z pośrednim peptydem 1-1 otrzymuje się:
Boc-Pa1-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („1/08/A”).
W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Gln i Boc-D-Pal z pośrednim peptydem I-1 otrzymuje się:
Boc-D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („1/09/A”)W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Gln i Boc-D-Trp z pośrednim peptydem I-1 otrzymuje się:
Boc-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („1/10/A”).
W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Gln i Ac-D-Trp z pośrednim peptydem 1-1 otrzymuje się:
Ac-D-trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („1/11/A”).
20
180 372
W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Gln i Boc-Tpi z pośrednim peptydem 1-1 otrzymuje się:
Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („1/12/A”).
W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Gln i Boc-D-Tpi z pośrednim peptydem 1-1 otrzymuje się:
Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („1/13/A”).
W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Gln i Hca z pośrednim peptydem 1-1 otrzymuje się:
Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („1/14/A”).
Następnie N-końcową grupę Boc peptydu pośredniego 1/01/A usuwa się przez dwukrotne
działąnie 50% TFA w CH2Cl2, zawierającym 5% merkaptoetanolu i 5% anizolu, po raz pierwszy
przez 5 minut i następnie przez 25 m inut. Peptyd pośredni przem yw a się następnie CH2Cl2
(2 razy po 1 minucie), MeOH (2 razy 1 minuta) i DMF (3 razy 1 minuta). W ten sposób usuwa się
również grupy zabezpieczające But z Cys, otrzymując peptyd pośredni D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys-żywica BHA („1/01/B”), który następnie przemywa się
CH2Cl2, MeOH i DMF, po trzy razy przez 1 minutę każdy.
W tym punkcie łańcuch boczny Cys peptydu pośredniego 1/01/B cyklizuje się przez utlenianie
z wytworzeniem 5-członowego pierścienia heterocyklicznego pokazanego we wzorze IIA, stosując Operację 5. Dodaje się 10 ml mieszaniny AcOH, 3,7% HCHO i DMF (1:1:8). Mieszaninę
reakcyjną wytrząsa się w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, przemywa się po trzy razy
wodą, DMF i Ch2Cl2, otrzymując peptyd pośredni 1/01/C, D-pGlu-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica BHA.
Następnie na peptyd pośredni 1/01/C działa się HF i anizolem za pomocą Operacji 6 w celu usunięcia
grupy zabezpieczającej Bom z His i jednocześnie odszczepienia nonapeptydu z fazy nośnika-żywicy,
uzyskując C-końcową grupę Q, którą jest NH2. Peptyd oczyszcza się za pom ocą HPLC jak w
Operacji 7. W ten sposób otrzymuje się będący antagonistą bombezyny peptyd numer 1.
Te same etapy usuwania grupy Boc i grupy But oraz cyklizacji grupy -CH2-SH w Cys z
drugorzędową aminą ze zredukowanego wiązania przeprowadza się na peptydach pośrednich
1/02/A, 1/05/A, 1/07/A, 1/08/A, 1/09/A, 1/10/A i 1/12/A, otrzymując następujace peptydy
pośrednie:
1/02/B
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica BHA
1/04/B
Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica BHA
1/05/B
D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica BHA
1/07/B
D-Nal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica BHA
1/08/B
Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica BHA
1/09/B
D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica BHA
1/10/B
D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica BHA
1/11/B
Ac-D-Trp-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica BHA
1/12/B
Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica BHA
1/13/B
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica BHA
1/14/B
Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica BHA
180 372
21
Surowe peptydy odszczepia się z żywicy BHA, a następnie oczyszcza za pomocą Operacji
6 i 7, otrzymując czyste peptydy 2,4,5 i 7-14.
Czasy retencji dla tych peptydów są następujące.
Nr peptydu
1
2
3
5
7
8
9
10
11
12
13
14
Dane z analitycznej HPLC
Gradient %B/min
Czas retencji na kolumnie D
25-65
14,40
25-65
14,20
25-75
15,17
25-65
16,11
20-60
23,75
20-60
13,19
25-65
12,00
25-65
16,98
25-65
24,50
25-65
19,91
25-65
16,99
40-80
13,68
Alternatywnie, 5-członowy pierścień heterocykliczny może być utworzony w roztworze
za pomocą następującej procedury:
25 mg pośredniego peptydu, zawierającego strukturę Leu-psi-Cys-NH2, otrzymanego
przez syntezę w fazie stałej w 0,8 ml lodowatego kwasu octowego miesza się ze 100 (μl 1% formaldehydu (% wagowy roztworu wodnego) w temperaturze pokojowej przez 30 sekund, a następnie
dodaje się 20 μl 50% roztworu octanu amonu. Mieszaninę reakcyjną poddaje się oczyszczaniu,
otrzymując żądany peptyd, który zawiera strukturę -Leu-psi-Tac-NH2.
P r z y k ł a d II
Nr peptydu
15. D-Phe-His-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2
16. D-Phe-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH2
17. D-Phe-Glu[-]-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2
Peptydy w tym przykładzie mogą być zsyntetyzowane ze wspólnego związku pośredniego
1-2, Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA, budowanego etap po
etapie na 0,5 g żywicy BHA (0,55 mmola NH2/g). Pośredni peptyd 1-2 otrzymuje się według
Operacji i procedur przedstawionych w przykładzie I. Porcję 150 mg związku pośredniego 1-2
dzieli się następnie na 3 jednakowe części i poddaje dwóm kolejnym sprzęganiom zgodnie z procedurą opisaną w Operacji 4, otrzymując końcowe żywice nonapeptydowe.
W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-His(Bom) i Boc-D-Phe z pośrednim peptydem 1-2
otrzymuje się:
Boc-D-Phe-His(Bom)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („2/15/A”).
W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Glu(OMe) i Boc-D-Phe z pośrednim peptydem 1-2
otrzymuje się:
Boc-D-Phe-Glu(OMe)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („2/16/A”)W wyniku kolejnego sprzęgania Fmoc-Glu(But) i Boc-D-Phe z pośrednim peptydem 1-2
otrzymuje się:
Boc-D-Phe-Glu(But)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („2/17/A”).
22
180 372
Usunięcie grupy Boc z pośredniego peptydu 2/15/A przeprowadza się stosując 50% TFA w
CH2Cl2, zawierający 5% merkaptoetanolu i 5% anizolu w Operacji 4. W reakcji tej następuje
również usunięcie grupy But z reszty A9, w wyniku czego otrzymuje się pośredni peptyd 2/15/B:
D-Phe-His(Bom)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys-żywica BHA
W tym punkcie łańcuch boczny Cys peptydu pośredniego 2/15/B cyklizuje się przez utlenianie
z wytworzeniem 5-członowego pierścienia heterocyklicznego pokazanego we wzorze IIA za pom ocą Operacji 5. Dodaje się 10 ml mieszaniny AcOH, 3,7% HCHO i DMF (1:1:8). Mieszaninę
reakcyjną wytrząsa się w temperaturze pokojowej przez 3 minuty, przemywa po 3 razy wodą,
DMF i CH2Cl2, otrzymując peptyd pośredni 2/15/C:
D~Phe-Glu(Bom)-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Tac-żywica BHA.
Następnie na peptyd pośredni 2/15/C działa się świeżo destylowanym HF (5 ml) i anizolem
(0,25 ml) w 0°C przez 1 godzinę, usuwając w ten sposób również grupę zabezpieczającą Bom z
His. Rozpuszczalnik odparowuje się pod próżnią i przemywa octanem etylu, ekstrahuje 70-80%
wodnym roztworem kwasu octowego i liofilizuje. Po oczyszczeniu otrzymuje się będący antagonistą bombezyny peptyd nr 15.
Te same etapy usuwania N-końcowego Boc, cyklizacji Cys9, usuwania peptydu pośredniego z żywicy BHA i oczyszczania za pom ocą HPLC przeprowadza się na peptydach pośrednich 2/16/A i 2/17/A, otrzymując peptyd numer 16 i peptyd pośredni 2/17/D:
D-Phe-Glu-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Tac-NH 2 .
Mieszaninę 15 mg 2/17/D i 15 mg HOBt w 0,8 ml DMF w 0°C dodaje się do 50 mikrolitrów
25% roztworu diizopropylokarbodiimidu w CH2Cl2 i miesza w 0°C przez 2 godziny. Powstaje
wiązanie pojedyńcze peptydu 17, łączące grupę alfa-aminową D-Phe1z ugrupowaniem gammakarboksylowym grupy 3-propionylowej w Glu2:
D-Phe-Glu[-] -Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-T ac-NH 2 .
Mieszaninę reakcyjną oczyszcza się za pomocą HPLC według Operacji 7.
Czasy retencji dla tych peptydów są następujące.
Nr peptydu
15
16
17
Przykład
Dane analitycznej HPLC
Gradient %B/min
Czas retencji na kolumnie D
20-60
17,23
25-65
19,13
20-60
20,34
III
Nr peptydu
3. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-MTac-NH 2
6. D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-MTac-NH2
Powyższych antagonistów bombezyny można zsyntetyzować ze wspólnego związku
pośredniego 1-3, to jest Fmoc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA.
Ten związek pośredni buduje się na 1,0 g żywicy BHA (0,55 mmoli N H 2/g) poprzez kolejne
sprzęganie w warunkach syntezy w fazie stałej, takich jak opisano w przykładzie I, rozpoczynając o d Fmoc-Cys(But), następnie Fmoc-Leu-CHO z (NaBH3CN) i Fmoc-His(Bom), etc., dalej
zgodnie z przykładem I. Fmoc-Gln łączy się z N-końcowym zgodnie z O peracją 4, otrzymując
związek pośredni 1-3. Końcowe sprzęganie Boc-D-Phe lub Boc-D-Cpa do związku pośredniego
180 372
23
1-3 przeprowadza się zgodnie z procedurą z Operacji 4, otrzymując peptydy pośrednie odpowiednio „3/3/A” lub „3/6/A”.
Usuwanie grupy Boc przeprowadza się za pomocą 50% TFA w CH2Cl2, zawierającym 5%
merkaptoetanolu i 5% anizolu za pomocą Operacji 4.
W tym punkcie łańcuch boczny Cys w peptydzie pośrednim 3/3/B cyklizuje się przez utlenianie z utworzeniem 5-członowego pierścienia heterocyklicznego pokazanego we wzorze IIB
za pomocą Operacji 5. Dodaje się 10 ml mieszaniny 50% AcOH, 10% CH3CHO i DMF
(1,5:0,5:8). Mieszaninę reakcyjną wytrząsa się w temperaturze pokojowej przez 10 minut, przemywa po 3 razy wodą, DMF i CH2Cl2, otrzymując peptyd pośredni 3/3/C: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-MTac-żywica BHA.
Peptydy pośrednie 3/3/C i 3/6/C usuwa się z żywicy za pomocą Operacji 6, poprzez
działanie HF (5 ml) i anizolem (0,25 ml) w 0°C przez 1 godzinę. W procesie tym następuje
również usunięcie grupy zabezpieczającej Bom z His, w wyniku czego otrzymuje się końcowe
nonapeptydy 3 i 6.
Peptydy oczyszcza się za pomocą HPLC, jak w Operacji 7; ich czasy retencji podano
poniżej.
N r peptydu
3
6
Dane analitycznej HPLC
Gradient %B/min
Czas retencji na kolumnie D
25-65
15,71
25-65
17,37
Alternatywnie, 5-członowy pierścień heterocykliczny może być utworzony w roztworze
przez dodanie do 25 mg peptydu pośredniego, zawierającego strukturę Leu-psi-Cys-NH2 w temperaturze pokojowej 0,8 ml lodowatego kwasu octowego zmieszanego ze 100 mikrolitrami 10%
aldehydu octowego. Miesza się to przez 5 minut, następnie dodaje się 100 mikrolitrów octanu
amonu. Mieszaninę reakcyjną poddaje się oczyszczaniu, otrzymując żądany peptyd, zawierający
strukturę Leu-psi-MTac-NH2.
P r z y k ł a d IV
Nr peptydu
18. D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-DMTac-NH2
19. Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-DMTac
20. D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-DMTac-NH2
21. Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-DMTac-NH 2
22. D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-DMTac-NH 2
Polipeptydy te m ogą być zsyntetyzowane odpowiednio ze wspólnego związku pośredniego 1-4, Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-żywica BHA. Ten związek
pośredni buduje się etapowo na żywicy benzhydryloaminowej (BHA) zgodnie ze standardowymi metodami syntezy w fazie stałej, jak o p is ano w przykła dach I i II.
Zatem na 1,0 g żywicy BHA (0,55 mmola NH2/g) przygotowanej zgodnie z Operacją 3,
działa się dwa razy po trzy minuty 10 ml 10% TEA w CH2Cl2 (zobojętnianie) i przemywa sześć
razy 10 ml CH2Cl2; następnie miesza się przez trzy minuty z 1,6 mmola Fmoc-Pen(But) i 1,8
mmola 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt) w DMF. Dodaje się 1,6 mmola 20% roztworu 1,3-diizopropylokarbodiimidu (DIC) w CH2Cl2. Mieszaninę wytrząsa się w temperaturze pokojowej przez 90 minut. Uzyskany związek Fmoc-Pen(But)-BHA przemywa się po dwa razy
CH2Cl2 i metanolem oraz trzy razy CH2Cl2, po czym poddaje testowi Kaisera.
24
180 372
Usuwanie grupy Fmoc (odbezpieczanie) z Fmoc-Pen(But)-żywica BHA przeprowadza się
za pomocą operacji 4A.
Sprzęganie Fmoc-Leu-CHO przeprowadza się zgodnie z Operacją 3. Związek
A9(But)-żywica BHA przemywa się 2 razy DMF. Następnie dodaje się 1,6 mmola Fmoc-Leu-CHO w DMF, zawierającym 1% AcOH, po czym 1,8 mmola NaBH3CN w DMF. Mieszaninę
reakcyjną wytrząsa się przez 60 minut, następnie przemywa 2 razy 50% metanolem w H2O, 2
razy 100% MeOH i 3 razy CH2Cl2, za każdym razem przez 1 minutę.
Po usunięciu z Fmoc-Leu-psi-Pen(But)-żywica BHA grupy Fmoc i zobojętnieniu przeprowadza się sprzęganie Fmoc-His(Bom) w sposób opisany w Operacji 4.
Sprzęganie Fmoc-Gly przeprowadza się jak w Operacji 4, przez dodanie w 0°C do
roztworu 1,5 mmoli Fmoc-Gly i 1,65 mmoli HOBt w DMF 20% roztworu 1,3-diizopropylokarbodiimidu (1,5 mmola) w CH2Cl2, mieszanie z chłodzeniem przez 15 minut i w
temperaturze pokojowej przez 15 minut, odsączenie wytrąconego osadu i dodanie do żywicy
oraz wytrząsanie przez 60 minut. Następnie przez sprzęganie w ten sam sposób kolejno
wprowadza się następne reszty aminokwasów Fmoc-Val, Fmoc-Ala i Fmoc-Trp, otrzymując 1,9 g
związku pośredniego 1-4, zabezpieczonej peptydo-żywicy o strukturze Fmoc-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-żywica BHA.
0,91 g związku pośredniego 1-4 dzieli się na pięć równych części (około 200 mg każda),
które używa się do syntezy zabezpieczonych żywic polipeptydowych zgodnie z procedurami
opisanymi w Operacji 4:
Kolejne sprzęganie Fmoc-Gln i Boc-D-Phe do peptydu pośredniego 1-4 daje:
Boc-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-żywica BHA („4/18/A”).
Kolejne sprzęganie Fmoc-Gln i następnie Ac-D-Phe do peptydu pośredniego 1-4 daje:
Ac-D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-żywica BHA („4/19/A”).
Kolejne sprzęganie Fmoc-Gln i Boc-D-Cpa do peptydu pośredniego 1-4 daje:
Boc-D-Cpa-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-żywica BHA („4/20/A”).
Kolejne sprzęganie Fmoc-Gln i Boc-Tpi do peptydu pośredniego 1-4 daje:
Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-żywica BHA („4/21/A”).
Kolejne sprzęganie Fmoc-Gln i Boc-Tpi do peptydu pośredniego 1-4 daje:
Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen(But)-żywica BHA („4/22/A”).
Następnie grupę Boc usuwa się z peptydu pośredniego 4/18/A za pom ocą 50% TFA w
CH2Cl2, zawierającego 5% merkaptoetanolu i 5% anizolu, otrzymując peptyd pośredni 4/18/B:
D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Pen-żywica BHA.
W tym punkcie łańcuch boczny Pen w peptydzie pośrednim 4/18/B cyklizuje się przez utlenianie za pomocą Operacji 5 z utworzeniem 5-członowego pierścienia heterocyklicznego pokazanego we wzorze IIC. Dodaje się 10 ml mieszaniny AcOH, 3,7% HCHO i DMF (1:1:8),
otrzymując mieszaninę reakcyjną, którą wytrząsa się w temperaturze pokojowej przez 3 minuty,
przemywa po 3 razy wodą, DMF i CH2Cl2, otrzymując peptyd pośredni 4/18/C: D-Phe-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-DMTac-żywica BHA.
Następnie peptyd pośredni 4/18/C przemywa się CH2Cl2, metanolem i CH2Cl2 po trzy razy
każdy i działa w 0°C przez 1 godzinę świeżo destylowanym HF (5 ml) i anizolem (0,25 ml). Rozpuszczalnik odparowuje się pod próżnią, przemywa eterem lub octanem etylu, po czym ekstrahuje 70-80% kwasem octowym i liofilizuje, otrzymując surow ą nonapeptydożywicę. Mieszaninę
reakcyjną oczyszcza się, otrzymując będący antagonistą bombezyny peptyd nr 18.
Te same etapy usuwania grup zabezpieczających, cyklizacji odbezpieczonego A9 i odłączenia
peptydu pośredniego od żywicy BHA przeprowadza się dla pośrednich peptydów 4/19/A,
4/20/A, 4/21/A i 4/22/A, otrzymując peptydy o numerach 19, 20, 21 i 22.
Oczyszczanie przeprowadza się za pom ocą HPLC układem rozpuszczalników składającym
się z (A) 0,1% TFA i (B) 1% TFA w 70% acetonitrylu, zgodnie z O peracją 7. Za pom ocą analitycznej HPLC wykazano, że oczyszczone peptydy mają czystość powyżej 97%. Czasy retencji
tych peptydów podano poniżej.
180372
25
Dane analitycznej HPLC
N r peptydu
Gradient %/min.
Czas retencji na kolumnie D
18
25-65
14,01
19
25-65
22,96
20
25-65
15,97
21
25-65
19,19
22
25-65
16,53
Alternatywnie, reszta A9 może być cyklizowana w roztworze przez dodanie 25 mg wolnego peptydu zawierającego strukturę -Leu-psi-Pen-NH2 do 25 mg HOBt w 0,8 ml lodowatego
kwasu octowego zmieszanego ze 100 mikro litrami 10% formaldehydu i mieszanie w 0°C przez
30 minut z wytworzeniem peptydu mającego strukturę 5-członowego pierścienia -Leu-psi-DMTac-NH2.
P r z y k ł a d V.
Pal-Gln-Trp-Ala-Val -Gly-His-Leu-psi -Cys-NH 2
D-Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Cys-NH2
Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Cys-NH 2
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Cys-NH 2
Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Cys-NH 2
Peptydy te można syntetyzować ze wspólnego związku pośredniego 1-5 Fmoc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA.
Fmoc-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA otrzymuje się następująco: 1,0 g żywicy BHA
(0,55 m m ola NH2/g) sprzęga się kolejno z Fmoc-Cys(But) i Fmoc-Leu-CHO m etodą wskazaną
w Operacjach 2 i 3.
Kolejne sprzęganie Fmoc-His(Bom), Fmoc-Gly, Fmoc-Val, Fmoc-Ala, Fmoc-Trp i FmocGln daje Fmoc-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywicę BHA, pośredni peptyd 1-5.
150 mg podwielokrotność tego związku pośredniego 1-5, wspólnego dla wszystkich peptydów z tego przykładu, poddaje się jednemu dalszemu sprzęganiu za pomocą procedur opisanych w Operacji 4, otrzymując końcowe peptydo-żywice.
Kolejne sprzęganie Boc-Pal z pośrednim peptydem 1-5- daje:
Boc-Pa1-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („5/08/A”)Kolejne sprzęganie Boc-D-Pal z pośrednim peptydem 1-5- daje:
Boc-D-Pa1-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („5/09/A”).
Kolejne sprzęganie Boc-Tpi z pośrednim peptydem 1-5- daje:
Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („5/12/A ”).
Kolejne sprzęganie Boc-D-Tpi z pośrednim peptydem 1-5 daje:
Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („5/13/A”).
Kolejne sprzęganie Hca z pośrednim peptydem 1-5 daje:
Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(But)-żywica BHA („5/14/A”).
N -końcową grupę Boc usuwa się z pośredniego peptydu 5/01/A przez działanie dwa razy
50% TFA w CH2Cl2, zawierającym 5% merkaptoetanolu i 5% anizolu, za pierwszym razem
przez 5 minut, a za drugim razem przez 25 minut. W wyniku tego działania usuwa się grupę zabezpieczającą z Cys. Następnie peptyd przemywa się CH2Cl2, MeOH i DMF jak w Operacji 4,
otrzymując pośredni peptyd 5/08/B:
Pal-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys-żywica BHA.
26
180 372
Następnie na pośredni peptyd 5/08/B działa się świeżo destylowanym HF (5 ml) i anizolem
(0,25 ml) w 0°C przez 1 godzinę, usuwając również grupę zabezpieczającą Bom z His. Rozpuszczalnik odparowuje się pod próżnią i przemywa octanem etylu, ekstrahuje 70-80% kwasem
octowym i liofilizuje, otrzymując następujący peptyd:
Pa1-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His-Leu-psi-Cys-NH 2 .
Grupę zabezpieczającą i żywicę BHA usuwa się z pośrednich peptydów 5/08/A, 5/09/A,
5/11/A, 5/12/A, 5/13/A i 5/14/A, otrzymując peptydy wymienione na początku tego przykładu.
Peptydy te poddaje się testowi czystości zgodnie z Operacją 7.
N r peptydu
5/08
5/09
5/12
5/13
5/14
Dane analitycznej HPLC
Gradient %B/min.
Czas retencji na kolumnie D
20-60
5,56
25-65
4,60
25-6.5
12,78
25-65
9.62
40-80
7,39
Alternatywnie, peptydy te mogą być odpowiednio zbudowane etapowo na żywicy BHA z
Boc-zabezpieczonymi aminokwasami, przy użyciu Bz w celu zabezpieczenia grupy -SH z Cys9
zgodnie ze standardowymi metodami syntezy w fazie stałej, z uzyskaniem następujących peptydów pośrednich:
BocPa1-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(Bz)-żywica BHA („5/08/A”).
Boc-D-Pa1-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(Bz)-żywica BHA („5/09/A”).
Boc-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(Bz)-żywica BHA („5/12/A”).
Boc-D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(Bz)-żywica BHA („5/13/A”).
Hca-Gln-Trp-Ala-Val-Gly-His(Bom)-Leu-psi-Cys(Bz)-żywica BHA („5/14/A”).
Grupę Boc usuwa się przez działanie 50% TFA w CH2Cl2 zawierającym 5% merkaptoetanolu i 5% anizolu, i następnie działanie HF i anizolem w celu odszczepienia peptydu od żywicy,
w wyniku czego usuwa się również grupę zabezpieczającą Bom z His i Bz z Cys, otrzymując peptydy wymienione na początku tego przykładu.
P r z y k ł a d VI. Procedury testowe.
(A) Test wiązania receptora
Wiązanie 125I-Tyr4-bombezyny i jej wypieranie przez pseudopeptydy będące antagonistami bombezyny testuje się na 24-studzienkowych płytkach do hodowli tkankowych
(GIBCO) przy użyciu komórek Swiss 3T3. Mysie fibroblasty Swiss 3T3 utrzymuje się przez cotygodniowe pasażowanie w DMEM zawierającym 10% FCBS i środki przeciwgrzybicze. Hodowle inkubuje się w powietrzu zawierającym 5% CO2 w 37°C. Studzienki posiewa się 103
komórek/studzienkę (żywotność > 95%), namnaża do podpłynięcia i uspokojenia. Procedurę
wiązania prowadzi się w 7 dni po posianiu. Komórki przemywa się 2 razy po 0,5 ml buforu
w iążącego (pożyw ka Eagle'a zm odyfikow ana przez D ulbecco, zaw ierająca 20 nM
HEPES-NaOH (pH 7,4), 0,2% BSA i 100 mcg/ml bacytracyny). N astępnie komórki
inkubuje się z 0,2 nM 125I-Tyr4-bom bezyny w obecności lub w nieobecności różnych stężeń
antagonistów (6 x 10-11 - 6 x 10-6M, objętość całkowita 0,4 ml).
Komórki inkubowano przez 30 minut w 37°C, ponieważ według Zachary i Rozengurta
(1985) oraz Laytona i współpr. (1988) wiązanie 125I-GRP w 37°C osiąga maksym alną wartość po
30 minutach i następnie maleje. Następnie komórki przemywa się 2 razy lodowato-zimnym
(4°C) buforem wiążącym i 2 razy lodowato-zimną solanką buforowaną fosforanem (PBS, mM):
NaCl 138, KC1 2 ,8 ,N a 2HPO4 8, KH2PO4 1,45, CaCl2 0,91, MgCl2 0,49. Przemyte hodowle ekstrahuje się 0,5 ml 0,5 M NaOH i przenosi do probówek do zliczeń. Studzienki przemywa się raz 0,5
ml wody destylowanej (jałowej), a przemywki dodaje do odpowiednich probówek. Następnie ra-
180 372
27
dioaktywność próbek zlicza się w automatycznym liczniku gamma (Micromedic System, Inc.,
Huntsville, Ala).
Do ustalenia typów wiązania receptora, stałych dysocjacji (Kd), stałej asocjacji (Ka) i
maksymalnej pojemności wiążącej receptorów (Bmax) użyto programu komputerowego PC
Munsona i Rodbarda Ligand, służącego do dopasowywania krzywej.
Dane wiązania polipeptydów według wynalazku są zestawione poniżej w tabeli I. Do
oznaczenia zdolności do wypierania specyficznego wiązania 125I-Tyr4-bombezyny stosowano
zmieniające się dawki nieznakowanych polipeptydów. Pokazano średnią wartość z 2-3
niezależnych testów dla każdego peptydu (każdy przeprowadzony trzykrotnie).
Hamowanie wiązania
125
4
Tabel a
1
I-Tyr -bombezyny w komórkach Swiss 3T3 przez antagonistów bombezyny
Nr peptydu
K, [nM]
01
5,0
02
0,078
03
13
04
13
05
0,007
06
4,3
07
0,009
08
4,5
09
8,8
10
0,11
11
5,4
12
<0,001
13
<0,001
14
<0,001
15
0,26
16
12
17
213
18
0,93
19
20
20
13
21
0,07
22
0,074
D-Tpi-Gln-Trp-Ala-Val-Gly'His-Leu-psi-Leu-NH 2
0,20
Bombezynab
a: Wartość średnia z 6 testów;
b: wartość średnia z 11 testów
0,28
P r z y k ł a d VII.
Wpływ antagonistów bombezyny na objętość guza w niezależnych od estrogenu mysich
rakach sutka MXT testowano w spoób następujący: 40 myszy samic B 6D 2F1; otrzymanych z Na-
28
180 372
tional Cancer Institute, Frederick Cancer Research Facility (Frederick, Maryland) trzymano w
temperaturze 211°C i wilgotności 555%. Zwierzęta trzymano w automatycznie regulowanym
harmonogramie 12 godzin św iatła/12 godzin cimności i podawano karmę dla gryzoni laboratoryjnych 50001 i wodę wodociągową do woli. Dojrzałym myszom samicom zaszczepiano podskórnie jeden mm3 tkanki estrogeno-niezależnego raka sutka MXT (3,2)/Ovex, otrzymanej od dr A.E.
Bogdena (Biomeasure Inc., Hopkinton, MA) i przechowywanej w stanie zamrożonym.
Dwa dni po transplantacji guzów, myszy podzielono przypadkowo na cztery grupy i rozpoczęto terapię za pomocą systemów o przedłużonym uwalnianiu (mikrokapsułki). Stworzono
następujące cztery grupy:
1) Kontrola, tylko wehikulum do iniekcji;
2) [D-Tpi6, Leu13-psi-Leu14]Bn(6-14),
3) [D-Phe6, Leu13-psi-Tac14]Bn(6-14),
4) Chirurgiczna dwustronna owariektomia
W skrótach dla antagonistów bombezyny zastosowano typową numerację dla reszt fragmentu peptydowego; każda reszta jest numerowana zgodnie z pozycją, którą zajmuje w pełnym
fragmencie. Jednakże antagonistów bombezyny jest dużo łatwiej porównywać z innymi peptydami, jeśli numeracja rozpoczyna się od ,jeden” na N-końcu. Zatem ,,[D-Tpi6-Leu13-psi-Leu14]Bn(6-14) jest D-Tpi1-Gln2-Trp3-Ala4-Val5-Gly6-His7-Leu8-psi-Leu9-NH2 (w dalszym
ciągu „B 1”), natomiast [D-Phe6-Leu13-psi-Tac14]Bn(6-14) jest tym samym peptydem co
powyższy peptyd nr 2.
Dwóch antagonistów bombezyny zsyntetyzowano metodami syntezy w fazie stałej. Grupa
myszy nr 2 otrzymywała preparat o przedłużonym działaniu „B 1”, natomiast grupa nr 3
otrzymywała preparat powyższego peptydu nr 2. Ten preparat o przedłużonym uwalnianiu
utrzymywał ciągłe uwalnianie B 1 lub peptydu nr 2 w ilości 25 mikrogramów/dzień przez 15 dni.
Do przedłużonego dostarczania zastosowano pompy osmotyczne Alzet (Alzo Co., Pało
Alto, CA). Pompę model Alzet 2002 uwalniającą 0,48 μl/h implantowano podskórnie w dolnej
tylnej części grzbietu. Peptydy przed napełnieniem minipomp osmotycznych rozpuszczano w
50% (v/v) roztworze glikolu propylenowego w wodzie.
Eksperymenty kończono w eksponencjalnej fazie wzrostu guza. Pierwszy pomiar objętości guza przeprowadzano po 10 dniach. Różnice w objętości guza między kontrolą a grupami
leczonymi antagonistami bombezyny ja k również między obiema grupami leczonymi antagonistami bombezyny były istotne statystycznie. Rezultaty pomiarów objętości guza podano w tabeli 2 i zilustrowano na figurze 1.
Tabel a 2
Wpływ antagonistów bombezyny na objętość guza w estrogeno-niezależnych rakach sutka MXT u myszy
Peptyd
Objętość guza w czasie (dni)
10
14
17
Kontrola
729
2565
5000
[D-Tpi6-Leu13-psi-Leu14]-Bn(6-14) („B1”)
363*
2437
3742*
[D-Phe-Leu13-psi-Tacl4]-Bn(6-14), to jest peptyd nr 2
360*
1477*
3323**
Obustronna owariektomia chirurgiczna
* p <0,05
** p<0,01
Po zakończeniu eksperymentów myszy skrwawiono pod znieczuleniem metofanowym, po
czym zmierzono ciężary guzów i poddano analizie statystycznej za pom ocą testu Duncana i testu
Studenta. Rezultaty przedstawiono w tabeli 3.
180 372
Tabela
29
3
Związek podawany myszom obarczonym estrogeno-niezależnym guzem sutka MXT
Ciężar guza (g)
Kontrola
8,450,23
[D-Tpi6-Leu13-psi-Leu 14]Bn(6-14)
7,360,46
Peptyd nr 2
Wartości są średnimi ± S.E.
5,481,00**
* * p 0,01
P r z y k ł a d VIII.
Wpływ jednego analogu somatostatyny i trzech antagonistów bombezyny na ludzkiego
raka małokomórkowego płuc u nagich myszy testowano w sposób następujący. Bezgrasicze
nagie myszy samce w wieku, w chwili przybycia około 6 tygodni, otrzymane z National Cancer
Institute (Belthesda, MD) przetrzymywano w warunkach ograniczonego dostępu patogenów.
Komórki ludzkiego raka małokomórkowego płuc (SCLC, linia H69) namnażano w postaci
monowarstwy w medium rpmi 1640 (Gipco, Grand Island, NY) suplementowanym 10% albuminy
surowicy bydlęcej, antybiotykami i środkami przeciwgrzybiczymi w temperaturze3 7°C i w wilgotnej
atmosferze, zawierającej 5% CO2. Wzrost przeszczepów inicjowano przez iniekcję podskórną 1 x
107 komórek z hodowli tkankowej komórek w fazie wzrostu eksponencjalnego do prawego boku
pięciu nagich myszy. Wytworzone guzy po trzech tygodniach aseptycznie wycięto i rozdrobniono
mechanicznie. Następnie kawałki tkanki guza objętości 3 mm3 transplantowano podskórnie za pomocą trokaru 60 zwierzętom. Dwa tygodnie po traknsplantacji guzy urosły do objętości około 10
mm3, a zwierzęta podzielono w sposób przypadkowy na 5 grup eksperymentalnych, leczonych 5
różnymi związkami, począwszy od dnia następnego po dwóch tygodniach od transplantacji. Przez
następne 5 tygodni guzy mierzono co tydzień. Obliczono objętości guza jako (długość x szerokość x
wysokość x pi)/6. W każdej grupie w celu pomiaru ciężaru guza zabito 8 myszy.
Pierwszym z leków podawanych nagim myszom w celu terapii jest analog somatostatyny
D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Trp-NH2, oznaczony tu jako „S1” .
Pierwszym z trzech antagonistów bombezyny jest D-Tpi1-Gln2-Trp3-Ala4-Val5-Gly6-His7-Leu8-psi-Leu9-NH2, to jest B 1. Drugim antagonistą bombezyny jest [Tpi6-Leu13-psi-Tpi14]Bn-(6-14), to je s t D -Tpi1-Gln2-Trp3-Ala4-Val5-Gly6-His8-Leu8-psi-Tpi9-NH2 , oznaczony
„B2”, a trzecim antagonistą peptyd nr 2.
Mikrogranulki soli pamoesanowej SI w poli(DL-1aktydo-koglikolidzie) przygotowano w
Cytotech SA i zaprojektowano tak, aby z podwielokrotności 16 mg wydzielały około 100 mikrogramów/dzień przez 2 tygodnie. Mikrogranulki te wstrzykiwano podskórnie co 15 dni na stronie
przeciwnej do guza. Każdy z antagonistów bombezyny rozpuszczano w 0,1% dim etylosulfotlenku w roztworze solanki i wstrzykiwano podskórnie dwa razy dziennie w dawce 20 mikrogramów/dzień.
Wpływ tej terapii lekowej na objętość guza widoczny jest w tabeli 4 i jest zilustrowany na
figurze 2.
Tabela 4
Wpływ antagonistów bombezyny na objętość guza SCLC
Peptyd
Objętość guza w czasie (dni)
0
7
14
21
28
35
142,8 ±37,5
249,7 ± 74,3
10,5 ±0,5
19,3 ± 1,4
31,6 ± 5,6
63,8 ± 10,6
SI
9,8 ± 0,8
14,4 ± 1,5
15,8 ± 1,3
18,4 ± 2,9
33,2 ± 9,0
66,0 ± 12,1
BI
11,2 ±0,8
13,3 ± 1,2
17 ± 3,4
24,7 ± 8,2
55 ± 24,5
80,2 ± 27,2
B2
10 rt 1,1
11,7 ± 1,2
14,7 ± 2,4
24,5 ± 7,9
45 ± 15
74,1 ±31,8
7,4 ± 1,8
8,9 ±2,3
14,3 ± 6,3
19,2 ± 9,4
49,0 ±21,0
Kontrola
Peptyd nr 2
11,6 ± 1,7
30
180 372
P r z y k ł a d IX.
W pływ antagonistów bombezyny na guzy raka trzustki MIA PACA-2 mierzono w sposób
następujący.
Nagim myszom podobnie jak w przykładzie VIII wstrzyknięto podskórnie komórki ludzkiego raka trzustki M IA PACA-2, pochodzące z hodowli tkankowej komórek,- namnażanych tak
jak SCLC w przykładzie VIII. Objętość guza mierzono dla dwóch grup eksperymentalnych tak
jak w przykładzie VIII.
Dwie grupy eksperymentalne były następujące: grupa myszy otrzymujących antagonistę
bombezyny peptyd 2 oraz grupa kontrolna, otrzymująca tylko iniekcję roztworu wehikulum.
Każdej myszy podawano dwa razy dziennie za pomocą iniekcji poskómej 50 μg roztworu wehikulum lub peptydu 2.
Rezultaty pomiarów objętości guza podano w tabeli 5 i zilustrowano je na figurze 3.
Tabela 5
3
Wpływ antagonistów bombezyny na objętość (mm ) guza trzustki MIA PACA-2
Objętość guza po czasie (dni)
Peptyd
0
7
11
15
Kontrola
45,6 ± 7,9
254,2 ± 59,8
645,1 ± 128,6
855,9 ± 145,4
Peptyd nr 2
29,8 ± 4,3
252,3 ± 98,9
427,9 ± 122,6
634,1 ± 174,0
P r z y k ł a d X.
Wpływ leczenia antagonistą bombezyny na nagie myszy obarczone ludzkim rakiem
trzustki CAPAN-2 jest następujący.
Nagim myszom podobnym jak w przykładzie VII podano heteroprzeszczepy ludzkiego
guza trzustki CAPAN-2, otrzymane z hodowli komórkowej namnażanej jak w przykładzie VII.
Myszy podzielono na dwie grupy, z których grupa kontrolna otrzymywała tylko roztwór wehikulum do iniekcji, a druga otrzymywała antagonistę bombezyny, peptyd nr 2, w ilości 50 mg dwa
razy dziennie w postaci iniekcji podskórnej.
Objętość guza mierzono jak w przykładzie VIII, a rezultaty pomiarów objętości guza
przedstawiono w tabeli 6 oraz zilustrowano na figurze 4.
T abela 6
Wpływ antagonistów bombezyny na objętość (mm ) guza trzustki CAPAN-2
Peptyd
Objętość guza po czasie (dni)
0
7
14
21
28
Kontrola
21,2 ± 1,7
28,3 ±2,3
43,0 ±3,6
51,4 ±8,9
78,8 ± 16,7
Peptyd nr 2
19,7 ± 1,7
27,8 ±3,3
32,2 ±3,5
46,4 ± 3,0
50,5 ± 17,8
Chociaż wynalazek został opisany w odniesieniu do jego korzystnych postaci, należy rozumieć, że bez odchodzenia poza zakres wynalazku przedstawiony w zastrzeżeniach m ogą być
dokonane zmiany i modyfikacje oczywiste dla specjalisty, mającego zwykłe umiejętności w tej
dziedzinie. W wynalazku można zastosować substytuty znane ze stanu techniki, które nie
wpływają w sposób istotny na efektywność wynalazku.
180 372
WYKAZ SEKWENCJI
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 1:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = D-pGlu”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 9
(C) INNE INFORMACJE: /uw aga- „Reszta 9 = Tac-NH2”
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 1:
Xaa Gln Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
5
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
31
180 372
32
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = D-Phe”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 9
(C) INNE INFORMACJE: /uw aga- „Reszta 9 = Tac-NH2”
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 2:
Xaa Gln Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
5
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 3:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = D-Phe”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 9
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = MTac-NH2”
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 3:
180 372
Xaa Gln Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
5
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = Ac-D-Phe”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 9
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 - Tac-NH2”
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 4:
Xaa Gln Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
5
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(ix) CECHA:
33
34
180 372
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = D-Cpa”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= "Reszta 8 = zredukowany izoster Leu”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 9
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = Tac-NH2”
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 5:
Xaa Gln Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
5
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 6:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
(C) INNE INFORMACJE: /'uwaga= „Reszta 1 = D-Cpa”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 8 = zredukowany izoster Leur
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 9
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = M Tac-NH2”
180 372
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 6:
Xaa Gln Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
5
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 7:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = D-Nal”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 9
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = Tac-NH2”
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 7:
Xaa Gln Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
5
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 8:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(ix) CECHA:
35
180 372
36
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = Pal”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 9
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = Tac-NH2”
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 8:
Xaa Gln Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
(2)
5
INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 9:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyńcza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = D-Pal”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 9
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 - Tac-NH2”
180 372
37
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 9:
Xaa Gln Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
5
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 10:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = D-Trp”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 9
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 - Tac-NH2”
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 10:
Xaa Gln Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
5
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 11:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
180 372
38
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = Ac-D-Trp”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 9
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = Tac-NH2”
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 11:
Xaa Gln Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
5
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 12:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = Tpi”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 9
180 372
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = Tac-NH2”
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 12:
Xaa Gln Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
5
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 13:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = D-Tpi”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 9
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 9 = Tac-NH2”
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 13:
Xaa Gln Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
5
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 14:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 8 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
39
40
180 372
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = Hca-Gln”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 7
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= Reszta 7 = zredukowany izoster Leu”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
(C) INNE INFORMACJE: /uw aga- „Reszta 8 = Tac-NH2”
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 14:
Xaa Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
5
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 15:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = D-Phe”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 8 = zredukowany izoster Leur
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 9
180 372
41
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = Tac-NH2”
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 15:
Xaa His Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
5
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 16:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyńcza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = D-Phe”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 2
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 2 = Glu(OMe)”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 9
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = Tac-NH2”
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 16:
Xaa Xaa Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
5
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 17:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
180 372
42
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = D-Phe”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 2
(C) INNE INFORMACJE: /uw aga- „Reszta 2 = Glu[-]”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 9
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = Tac-NH2”
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 17:
Xaa Xaa Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
5
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 18:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
180 372
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = D-Phe”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 9
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 9 = DMTac-NH2”
(xi) OPIS SEKWENCJE SEKW. NR: 18:
Xaa Gln Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
5
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 19:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = Ac-D-Phe”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 9
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = DMTac-NH2”
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 19:
43
180 372
44
Xaa Gln Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
5
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 20:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = D-Cpa”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga11 „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 9
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 - DMTac-NH2”
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 20:
Xaa Gln Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
5
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 21:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(ix) CECHA:
180 372
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = Tpi”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 8 - zredukowany izoster Leu”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 9
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = DMTac-NH2”
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 21:
Xaa Gln Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
5
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 22:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyńcza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = D-Tpi”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu5'
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 9
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = DMTac-NH2”
45
180 372
46
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 22:
Xaa Gln Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
5
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 23:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
(C)
INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 - X-A1, gdzie X=H, wiązanie
pojedyńcze łączące grupę alfa-aminową A l z grupą gamma-karboksylową na grupie 3propionylowej Glu gdy Res 2 =Glu; lub RIC O , gdzie R1=H, alkil C 1-10, fenylo- C 1-10
-alkil; a A l = reszta D-, L- lub DL-aminokwasu wybranego z Cpa, Phe, pGlu, Nal, Pal,
Tpi, niepodstawiony Trp lub Trp podstawiony w pierścieniu benzenowym przez jeden
lub więcej F, Cl, Br, NH2 lub alkil C 1-3; lub wiązanie peptydowe łączące ugrupowanie
acylowe R IC O z ugrupowaniem alfa-aminowym Reszty 2"
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 2
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 2 = Gln, G lu[-|, Glu(Y) lub His”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 9
180 372
(C)
INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = A9-Q, gdzie A9 = Tac,
MTac lub DMTac; a Q = NH2 lub OQ1, gdzie Q1 = H, fenyl lub fenylo-C1-10-alkil”
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 23:
Xaa Xaa Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
5
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 24:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyńcza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = D-Phe”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 9
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = Tac-NH2”
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 24:
Xaa Glu Tip Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
47
5
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 25:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza
48
180 372
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = X-A1, gdzie X = H lub Ac;
A l = D-Phe, L- lub D-Tpi”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 9
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = Tac-NH2”
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 25:
Xaa Gln Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
5
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 26:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = X-A1, gdzie X = H lub Ac;
A l = D-Phe, L- lub D-Tpi”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
180 372
49
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 9
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga- „Reszta 9 = DMTac-NH2”
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 26:
Xaa Gln Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
5
(2) INFORMACJA O SEKWENCJI NR: 27:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 9 aminokwasów
(B) RODZAJ: aminokwas
(C) ILOŚĆ NICI: pojedyncza
(D) TOPOLOGIA: liniowa
(ii) RODZAJ CZĄSTECZKI: peptyd
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 1
(C)
INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 1 = X-A1, gdzie X = H, wiązanie
pojedyńcze łączące grupę alfa-aminową A l z grupą gamma-karboksylową ugrupowania
3-propionylowego Glu gdy Res 2 = Glu; lub RICO, gdzie RI = H, alkil C 1-10, a A l =
L- lub D-Pal lub L- lub D-Tpi”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 2
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 2 - Gln, Glu[-], Glu)Y) lub His”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 8
(C) INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 8 = zredukowany izoster Leu”
(ix) CECHA:
(A) NAZWA/KLUCZ: cecha mieszana
(B) UMIEJSCOWIENIE: 9
180 372
50
(C)
INNE INFORMACJE: /uwaga= „Reszta 9 = A9-Q, gdzie A9 = Cys lub
Pen; a Q = NH2 lub OQ 1, gdzie Q 1 = H, alkil C 1-10, fenyl lub fenylo-C1-10-alkil”
(xi) OPIS SEKWENCJI: SEKW. NR: 27:
Xaa Xaa Trp Ala Val Gly His Xaa Xaa
1
5
180 372
FIG.
2
180 372
180 372
FIG. 3
FIG. 4
FIG.
1
180 372
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz.
Cena 6,00 zł.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
2 210 Кб
Теги
pl180372b1
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа