close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

PL189424B1

код для вставкиСкачать
RZECZPOSPOLITA
POLSKA
(12) OPIS PATENTOWY (19)PL (11) 189424
(21) Numer zgłoszenia:
(22) Data zgłoszenia:
331464
21.08.1997
(86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
Urząd Patentowy
Rzeczypospolitej Polskiej
21.08.1997, PCT/GB97/02242
(87) Data i numer publikacji zgłoszenia
międzynarodowego:
(51) IntCl7
C12R 1/01
C12N 9/14
C12Q 1/34
C02F 3/34
26.02.1998, W098/07839,
PCT Gazette nr 08/98
Nowy szczep bakteryjny Rhodococcus rhodochrous, ekstrakt komórkowy,
sposob wytwarzania ekstraktu komórkowego, sposób wykrywania w próbce
heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny (RDX), czujnik biologiczny do wykrywania
w próbce RDX oraz sposób oczyszczania środowiska zanieczyszczonego przez RDX
(73) Uprawniony z patentu:
(30)
Pierwszeństwo:
21.08.1996,GB,9617537.7
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
19.07.1999 BUP 15/99
(45) o udzieleniu patentu ogłoszono:
31.08.2005 WUP 08/05
THE SECRETARY OF STATE FOR
DEFENCE IN HER BRITANNIC MAJESTY'S
GOVERNMENT OF THE UNITED KINGDOM
OF GREAT BRITAIN AND NORTHERN
IRELAND, Farnborough, GB
(72) Twórcy wynalazku:
Stephen Nicklin, Farnborough, GB
Neil Charles Bruce, Cambridge, GB
Christopher Edward French, Cambridge, GB
Emma Rachel Travis, Cambridge, GB
Amrik Basran, Cambridge, GB
(74) Pełnomocnik:
Kulikowski Jarosław,
KULIKOWSKA & KULIKOWSKI
PL 189424 B1
(57)
1. Nowy szczep bakteryjny Rhodococcus rhodochrous określony jako „11Y”
i zdeponowany jako NCIMB 40820 oraz jego mutanty posiadające aktywność enzymatyczną degradującą heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5 -triazynę (RDX).
2
189 424
Nowy szczep bakteryjny Rhodococcus rhodchrous, ekstrakt komórkowy,
sposób wytwarzania ekstraktu komórkowego, sposób wykrywania w próbce
heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny (RDX), czujnik biologiczny
do wykrywania w próbce RDX oraz sposób oczyszczania środowiska
zanieczyszczonego przez RDX
Zastrzeżenia
patentowe
1. Nowy szczep bakteryjny Rhodococcus rhodochrous określony jako „11Y” i zdeponowany jako NCIMB 40820 oraz jego mutanty posiadające aktywność enzymatyczną degradującą heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazynę (RDX).
2. Ekstrakt komórkowy posiadający aktywność enzymatyczną znamienny tym, że katalizuje uwalnianie azotynu z heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny (RDX) i pochodzi
z komórek szczepu Rhodococcus rhodochrous 11Y NCIMB 40820. określonego w zastrz. 1
albo jego mutanta.
3. Sposób wytwarzania ekstraktu komórkowego posiadającego enzymatyczną aktywność degradującą RDX określonego w zastrz. 2, znamienny tym, że hoduje się szczep Rhodococcus rhodochrous 11Y NCIMB 40820 określony w zastrz. 1 albo jego mutanty, a następnie rozrywa się komórki i wydziela ekstrakt komórkowy.
4. Sposób wykrywania w próbce heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny (RDX), znamienny tym, że próbkę poddaje się działaniu ekstraktu komórkowego posiadającego aktywność enzymatyczną degradującą RDX określonego w zastrz. 2 i wykrywa się azotyn wytworzony w tej próbce.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że azotyn wykrywa się kolorymetrycznie.
6. Sposób według zastrz. 4 albo 5, znamienny tym, że ekstrakt komórkowy posiadający enzymatyczną aktywność degradującą RDX wytwarza się sposobem określonym w zastrz. 3,
przy czym dodatkowo do próbki dodaje się ditiotreitol.
7. Sposób wykrywania w próbce heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny (RDX), znamienny tym, że próbkę poddaje się działaniu ekstraktu komórkowego posiadającego aktywność enzymatyczną degradującą RDX określonego w zastrz. 2 i wykrywa się formaldehyd
wytworzony w tej próbce.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że formaldehyd wykrywa się kolorymetrycznie.
9. Sposób według zastrz. 7 albo 8, znamienny tym, że ekstrakt komórkowy posiadający enzymatyczną aktywność degradującą RDX wytwarza się sposobem określonym w zastrz. 3,
przy czym dodatkowo do próbki dodaje się ditiotreitol.
10. Czujnik biologiczny do wykrywania w próbce heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5triazyny (RDX), znamienny tym, że zawiera środki do kontaktowania próbki z ekstraktem
komórkowym posiadającym enzymatyczną aktywność degradującą RDX opisanym w zastrz. 2
i do utrzymywania próbki w warunkach odpowiednich dla enzymatycznej degradacji zanieczyszczenia oraz środki do wykrywania występowania reakcji heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5triazyny (RDX) katalizowanej przez ekstrakt komórkowy posiadający aktywność enzymatyczną w przypadku obecności heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny (RDX) w próbce.
11. Czujnik biologiczny według zastrz. 10, znamienny tym, że środki do wykrywania
wystąpienia reakcji stanowią środki do wykrywania zmiany kolorymetrycznej.
12. Czujnik biologiczny do wykrywania w próbce heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5triazyny (RDX), znamienny tym, że zawiera środki do szczepienia próbki hodowlą izolatu
bakteryjnego Rhodococcus rhodochrous opisanego w zastrz. 1 i do utrzymywania próbki
w warunkach odpowiednich do degradacji zanieczyszczenia przez izolat oraz środki do wykrywania wystąpienia reakcji heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny (RDX) katalizowanej
przez izolat w przypadku obecności heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny (RDX) w próbce.
189 424
3
13. Czujnik biologiczny według zastrz. 12, znamienny tym, że środki do wykrywania
wystąpienia reakcji stanowią środki do wykrywania zmiany kolorymetrycznej.
14. Sposób oczyszczania środowiska zanieczyszczonego przez heksahydro-1,3,5trinitro-1,3,5-triazynę (RDX), znamienny tym, że dodaje się do środowiska ekstrakt komórkowy posiadający aktywność enzymatyczną degradującą RDX opisany w zastrz. 2 i utrzymuje
się mieszaninę w warunkach odpowiednich do enzymatycznego degradowania zanieczyszczenia do momentu degradacji obecnej w materiale heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny.
15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że podczas utrzymywania mieszaniny
w warunkach odpowiednich do enzymatycznego degradowania zanieczyszczenia dodaje się
do mieszaniny ditiotreitol.
*
* *
Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakteryjny Rhodococcus rhodochrous, ekstrakt komórkowy, sposób wytwarzania ekstraktu komórkowego, sposób wykrywania w próbce
heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny (RDX), czujnik biologiczny do wykrywania w próbce
RDX oraz sposób oczyszczania środowiska zanieczyszczonego przez RDX.
Wynalazek znajduje zastosowanie w dziedzinie wykrywania i biodegradacji materiałów
wybuchowych. Wynalazek dotyczy w szczególności aerobowej biodegradacji heksogenu, czyli
heksahydro-1,3,5~trinitro-1,3,5-triazyny (dalej określanej powszechnie stosowanym skrótem
RDX) oraz sposobów i czujników do wykrywania RDX, wykorzystując ekstrakt komórkowy
posiadający enzymatyczną aktywność degradowania RDX.
Nowy ekstrakt komórkowy wykazujący aktywność enzymatyczną uwalniania azotyny
z heterocyklicznej nitroaminy-RDX.
Nitroaminy, występujące wprawdzie w naturze wyjątkowo rzadko, produkowane są
w znacznych ilościach przez przemysł chemiczny i stanowią ważną klasę materiałów energetycznych, mających zastosowanie jako materiały wybuchowe i pędne, a RDX w Stanach Zjednoczonych obecnie stanowi najważniejszy wojskowy materiał wybuchowy. Wytwarzanie,
użytkowanie i dysponowanie RDX może prowadzić do zanieczyszczenia środowiska heksogenem. Istnieją obawy dotyczące zatruwania środowiska nitroaminami ze względu na ich stosunkowo dużą odporność, istnieje zatem zapotrzebowanie na środki do usuwania takich zanieczyszczeń ze środowiska bez wytwarzania innych niepożądanych zanieczyszczeń. Jest też
pilne zapotrzebowanie na lepszą metodę wykrywania RDX, ponieważ obecnie proponowane
układy analityczne najczęściej zawierają wielkie i wyrafinowane elementy wyposażenia, takie
jak wysokowydajna chromatografia cieczowa (High Performance Liquid Chromatography)
i/lub wymagają specjalnie wyuczonych techników laboratoryjnych do ich stosowania.
Celem wynalazku jest dostarczenie enzymu, który byłby zdolny katalizować biodegradację RDX i który mógłby być stosowany w biologicznym układzie zapobiegania zanieczyszczeniom środowiska przez odpady RDX. Ponadto, celem niniejszego projektu jest dostarczenie enzymu, przydatnego w układach wykrywania RDX.
Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakteryjny Rhodococcus rhodochrous określony jako „11 Y”i zdeponowany jako NCIMB 40820 oraz jego mutanty posiadające aktywność enzymatyczną degradującą heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazynę (RDX).
Przedmiotem wynalazku jest również ekstrakt komórkowy posiadający aktywność enzymatyczną, charakteryzujący się tym, że katalizuje uwalnianie azotynu z heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny (RDX) i pochodzi z komórek szczepu Rhodococcus rhodochrous 11Y
NCIMB 40820 albo jego mutanta.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania ekstraktu komórkowego
posiadającego enzymatyczną aktywność degradującą RDX, charakteryzujący się tym, że hoduje się szczep Rhodococcus rhodochrous 11Y NCIMB 40820 albo jego mutanty, a następnie
rozrywa się komórki i wydziela ekstrakt komórkowy.
Następnym przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania w próbce heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny (RDX), charakteryzujący się tym, że próbkę poddaje się działa-
4
189 424
niu ekstraktu komórkowego posiadającego aktywność enzymatyczną degradującą RDX i wykrywa się azotyn wytworzony w tej próbce.
Korzystnie, azotyn wykrywa się kolorymetrycznie.
Korzystnie, ekstrakt komórkowy posiadający enzymatyczną aktywność degradującą
RDX wytwarza się sposobem wymienionym powyżej, przy czym dodatkowo do próbki dodaje
się ditiotreitol.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania w próbce heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny (RDX), charakteryzujący się tym, że próbkę poddaje się działaniu ekstraktu komórkowego posiadającego aktywność enzymatyczną degradującą RDX i wykrywa
się formaldehyd wytworzony w tej próbce.
Korzystnie, formaldehyd wykrywa się kolorymetrycznie.
Korzystnie, ekstrakt komórkowy posiadający enzymatyczną aktywność degradującą
RDX wytwarza się sposobem określonym powyżej, przy czym dodatkowo do próbki dodaje
się ditiotreitol.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest czujnik biologiczny do wykrywania w próbce
heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny (RJDX), charakteryzujący się tym, że zawiera środki
do kontaktowania próbki z ekstraktem komórkowym posiadającym enzymatyczną aktywność
degradującą RDX i do utrzymywania próbki w warunkach odpowiednich dla enzymatycznej
degradacji zanieczyszczenia oraz środki do wykrywania występowania reakcji heksahydro- 1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny (RDX) katalizowanej przez ekstrakt komórkowy posiadający
aktywność enzymatyczną w przypadku obecności heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny
(RDX) w próbce.
Korzystnie, środki do wykrywania wystąpienia reakcji stanowią środki do wykrywania
zmiany kolorymetrycznej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest czujnik biologiczny do wykrywania w próbce
heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny (RDX), charakteryzujący się tym, że zawiera środki
do szczepienia próbki hodowlą izolatu bakteryjnego Rhodococcus rhodochrous określonego
jako „11Y” i zdeponowanego jako NCIMB 40820 lub jego mutanta i do utrzymywania próbki
w warunkach odpowiednich do degradacji zanieczyszczenia przez izolat oraz środki do wykrywania wystąpienia reakcji heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny (RDX) katalizowanej
przez izolat w przypadku obecności heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny (RDX) w próbce.
Korzystnie, środki do wykrywania wystąpienia reakcji stanowią środki do wykrywania
zmiany kolorymetrycznej.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób oczyszczania środowiska zanieczyszczonego przez heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazynę (RDX), charakteryzujący się tym, że
dodaje się do środowiska ekstrakt komórkowy posiadający aktywność enzymatyczną degradującą RDX i utrzymuje się mieszaninę w warunkach odpowiednich do enzymatycznego degradowania zanieczyszczenia do momentu degradacji obecnej w materiale heksahydro-1,3,5-trinitro-1,3,5-triazyny.
Korzystnie, podczas utrzymywania mieszaniny w warunkach odpowiednich do enzymatycznego degradowania zanieczyszczenia dodaje się do mieszaniny ditiotreitol.
Jak to już wspomniano, wynalazek wykorzystuje aktywny enzym, który katalizuje usuwanie
azotynu z RDX. Ten aktywny enzym wykazuje mniejszą aktywność wobec podobnej heterocyklicznej nitroaminy, oktogenu - oktahydro-1,3,5,7-tetranitro-1,3,5,7-tetrazocyny (HMX), jak również mniejszą aktywność wobec azotanowego estru - tetraazotanu pentaerytrytu - pentrytu
(PENT). Stwierdzono, że enzym ten jest związany z membraną i może być wymyty z niej 5%
trytonem (środek powierzchniowo czynny Rhohm & Haas).
Kofaktor taki jak NADrH, NADH, FES czy FAD me jest konieczny do uzyskania aktywności enzymatycznej, przy czym aktywność jest stabilna w obecności stosunkowo wysokich stężeń denaturantów i wzrasta w obecności mocznika. Enzym ten wykazuje też trwałą
aktywność przy denaturacji cieplnej. Ponadto duża część enzymu pozostaje rozpuszczalna gdy
zmniejsza się wartość pH do 3,5 lodowatym kwasem octowym.
Ekstrakt komórkowy wykazujący aktywność enzymatyczną według wynalazku uzyskuje
się z wyizolowanego z natury szczepu bakteryjnego. Ten szczep bakteryjny to szczep Rhodococcus rhodochrous, określony tu jako 11Y. Ten nowo wyizolowany organizm bakteryjny sta-
189 424
5
nowi dalszy aspekt przedstawionego wynalazku. Próbkę nowo wyizolowanego organizmu, na
podstawie Porozumienia Budapeszteńskiego o Międzynarodowym Uznawaniu Depozytów
Mikroorganizmów do celów postępowań patentowych, zdeponowano 7 sierpnia 1996 pod
numerem depozytowym NCIMB 40820 w UK National Collection o f Industrial and Marine
Bacteria, 23 St. Machał Drive, Aberdeen, AB2 1RY, Scotland.
Dalsze charakterystyki zdeponowanej bakterii 11Y są przedstawione niżej:
barwienie Gramma
+
zarodniki
ruchliwość
wzrost
37°C
+
41°C
+
45°C
katalaza
+
oksydaza
fermentacyjna
bez zmian w teście oksydacyjno-fermentacyjnym z glukozą.
Analiza ściany komórkowej i kwasów tłuszczowych dostarczyła następujących informacji:
Obecne są kwasy mykolowe (a-rozgałęzione, |3-hydroksy kwasy tłuszczowe);
Diaminokwasem ścianek komórek jest mezoDAP.
Profil kwasów tłuszczowych pokazuje, że większość obecnych kwasów to nasycone
i nienasycone kwasy o łańcuchu prostym wraz z niewielką ilością 10-metylo rozgałęzionego
kwasu, to znaczy kwasu tuberkulosteaiynowego.
Ekstrakt komórkowy wykazujący enzymatyczną aktywność może być wytworzony przez
hodowlę R. rhodochrous na RDX lub NH4CI jako źródle azotu. W celu otrzymania ekstraktu
komórki mogą być rozerwane dowolnym konwencjonalnym sposobem. Dogodnie sporządza
się ekstrakt wolny od komórek. Ekstrakt może być następnie frakcjonowany drogą ultrąwirowania i części stałe zebrane, co daje w rezultacie aktywną frakcję membranową.
Alternatywnie, supernatant z ultrawirowania dostarcza rozpuszczalne aktywne białko.
Rozpuszczalne białko może być częściowo oczyszczone przez zastosowanie anionowymiennej chromatografii i wymywanie z liniowym gradientem soli 0 - 2 M chlorku sodu. Białko
eluuje się jako pojedynczy pik przy około 350 mM chlorku sodu.
Enzymatyczna aktywność otrzymana jako ekstrakt komórek wymaga obecności ditiotreitolu (DTT) (odczynnik Cleland'a) do enzymatycznej degradacji RDX.
Zamiast stosowania zdeponowanego mikroorganizmu można zastosować jego mutanty,
na przykład pochodzące z naświetlania promieniami gamma lub stosowania chemicznego
mutagenu, indukcję przez hodowlę na innym medium etc., albo jego transkoniuganty z inną
bakterią albo sztucznie wytwarzane warianty. Zdolność każdego takiego organizmu do wykazania enzymatycznej aktywności może być łatwo określona przez fachowca z tej dziedziny.
Zdolność nowego ekstraktu komórkowego wykazującego aktywność enzymatyczną do
katalizowania usuwania azotynu z RDX umożliwia stosowanie go do wykrywania RDX.
Zgodnie zatem z dalszym aspektem wynalazku, przedstawiono sposób wykrywania obecności
RDX w próbce, który polega na tym, że próbkę poddaje się działaniu enzymatycznej aktywności degradowania RDX i wykrywaniu każdego azotynu uwolnionego z tej próbki. Przydatna
do takiego wykrywania może być dobrze znana w stanie techniki metoda kolorymetryczna.
Usuwanie azotynu z RDX może dawać nietrwałe produkty pośrednie, które następnie
ulegają spontanicznej degradacji, dając szereg mniejszych cząsteczek, a w tym formaldehyd
i amoniak. W dalszym aspekcie niniejszego wynalazku przedstawiono zatem sposób wykrywania obecności RDX w próbce, który polega na wystawieniu próbki na enzymatyczną aktywność degradowania RDX i wykrywanie każdej ilości wytworzonego formaldehydu. Takie
wykrywanie może być dokonane też znaną w stanie techniki metodą kolorymetryczną.
W dalszym aspekcie prezentowany wynalazek przedstawia bioczujnik wykrywania
RDX w' próbce, który stanowi środki do kontaktowania próbki z ekstraktem komórkowym
degradującym RDX i środki do wykrywania występowania reakcji RDX katalizowanej przez
aktywność enzymatyczną, jeśli w próbce obecny jest RDX. Środki do wykrywania występowania reakcji dogodnie może stanowić przetwornik kolorymetryczny. Takie czujniki mogą
6
189 424
stanowić bazę przenośnych wykrywaczy do analizowania zakresu zanieczyszczenia środowiska odpadami RDX.
Dalszy aspekt prezentowanego wynalazku to sposób biologicznej obróbki naprawczej
środowiska zanieczyszczonego RDX, który to sposób obejmuje etapy dodawania do zanieczyszczonego środowiska ekstraktu komórkowego wykazującego aktywność enzymatyczną
i utrzymywania mieszaniny w warunkach odpowiednich do degradacji RDX przez aktywność
enzymatyczną tak, aby obecny w materiale RDX został zużyty.
Zużywanym materiałem może być, na przykład strumień ścieków materiałów zawierających RDX pochodzący z destrukcji ładunku zawierającego RDX lub próbka ziemi zanieczyszczonej RDX, albo inny materiał. W pierwszym przypadku biologiczną obróbkę naprawczą można dogodnie przeprowadzić w zbiorniku reakcyjnym, podczas gdy w tym ostatnim
przypadku ekstrakt komórkowy można wprowadzić bezpośrednio do materiału. Inne metody
obróbki nie będą stanowiły problemu dla specjalistów.
Według jeszcze dalszego aspektu prezentowanego wynalazku ekstrakt komórkowy do
degradowania RDX jest wykorzystywany do alternatywnej biologicznej obróbki naprawczej
środowiska zanieczyszczonego RDX. Sposób ten obejmuje etap zaszczepienia środowiska
próbką wyizolowanego organizmu bakteryjnego Rhodococcus rhodochrous oznaczonego jako
11Y i pozwolenie na skonsumowanie RDX obecnego w środowisku. Środowiskiem może być,
na przykład strumień odpadów materiału zawierającego RDX albo próbka ziemi zanieczyszczonej RDX lub inny materiał. W pierwszym przypadku biologiczną obróbkę naprawczą
można dogodnie przeprowadzić w zbiorniku reakcyjnym, podczas gdy w tym ostatnim przypadku izolat może być wprowadzony bezpośrednio do środowiska przez zaszczepienie nim
gleby. Inne metody obróbki nie będą stanowiły problemu dla specjalistów.
Przedmiot wynalazku w przykładach wykonania jest odtworzony na rysunku, na którym
fig. 1 przedstawia azotyn wytwarzany podczas inkubacji RDX ekstraktu komórkowego
z Rhodococcus rhodochrous 11Y, fig. 2 przedstawia azotyn i formaldehyd wytworzony z RDX
podczas inkubacji całymi komórkami Rhodococcus rhodochrous 11Y, fig. 3 przedstawia
zmiany azotynu wytwarzanego w inkubacji częściowo oczyszczonego ekstraktu z Rhodococcus rhodochrous 11Y ze stężeniem ditiotreitolu, fig. 4 przedstawia azotyn uwalniany z inkubacji RDX z częściowo oczyszczonym ekstraktem ze zmianą stężenia denaturantów, fig. 5
przedstawia uwalnianie azotynu w stosunku do czasu gotowania dla inkubacji obrabianego
cieplnie częściowo oczyszczonego ekstraktu z RDX, fig. 6 przedstawia profil wartości pH
w zależności od uwalnianego azotynu z inkubacji częściowo oczyszczonego ekstraktu z RDX
i spontanicznej hydrolizy RDXm, fig. 7 przedstawia azotyn i formaldehyd uwolniony podczas
przebiegu inkubacji częściowo oczyszczonego ekstraktu z RDXm, zaś fig. 8 przedstawia azotyn uwolniony z inkubacji częściowo oczyszczonego ekstraktu z różnymi materiałami wybuchowymi, zawierającymi azotyn.
Przykład 1
1. Wytwarzanie ekstraktu komórkowego o aktywności enzymatycznej z bakteryjnego
szczepu Rhodococcus rhodochrous 11Y
Rhodococcus rhodochrous 11Y wyizolowano stosując techniki standardowe w stanie
techniki, z próbek zebranych z naturalnego źródła przez wzbogacenie RDX jako źródłem azotu.
Rhodococcus rhodochrous 11Y hodowano w 1 litrze medium składającego się z 2,17 g/l
Na2HP04 i 1,325 g/l KH2P 0 4 o wartości pH 7,0, zawierającego 0,4% glukozy (wag/obj),
pierwiastki śladowe (jak opisano przez Pfenig'a i Lippert'a w Arch. Microbiology, 196, 55,
726-739) i bądź 1 mM RDX albo 6 mM NH4C1. Kolby inkubowano w inkubatorze wstrząsowym przy 180 obr/min i temperaturze 30°C.
Otrzymano w ten sposób wolne od komórek ekstrakty z hodowli komórek. Komórki
oddzielono przez wirowanie przy 10000 g w ciągu 15 minut w temperaturze 4°C w wirówce
Sorval RC-5C, wyposażonej w wirnik GS-3. Komórki ponownie zawieszono w 2 ml 50 mM
buforu Tricine (pH 8,0) na gram wilgotnych komórek. Komórki zniszczono działaniem ultradźwięków w MSE Soniprep (Fisons, Instruments, FSA Ltd.) stosując 6 x 12 ^m impulsów
w ciągu 15 sekund, na przemian z 30 sekundowym chłodzeniem w topniejącym lodzie.
Szczątki komórek i nieuszkodzone komórki usunięto przez wirowanie przy 13 000 g w ciągu
1 minuty w temperaturze 4°C w mikrowirówce (Sigma). Supernatant użyto jako ekstrakt wol-
189 424
7
ny od komórek. Frakcję membranową otrzymano z wolnego od komórek ekstraktu przez ultrawirowanie przy 109 000 g w ciągu 1 godziny w temperaturze 4°C (wirnik Beckman Optima
TLX Ultracentrifuge TLA 45), osad przemyto i resuspendowano w 50 mM buforu Tricine (pH 8,0)
do stężenia 2 mg/ml białka.
2. Chemikalia
RDX był najwyższej czystości, a inne o stopniu czystości „do analizy”, i jeśli nie podano inaczej, były otrzymane z BDH Ltd. (Poole, UK), Sigma Chemical Company Ltd. (Poole,
UK) lub Aldrich (Gillingham, UK).
3. Próby
Degradacja RDX
Degradację RDX określano przez monitorowanie zanikania RDX drogą HPLC w 50 mM
Tricine (pH 8,0), zawierającego RDX (50 mM, końcowe stężenie), 5 mM DTT i 40 (ii wolnego od komórek ekstraktu lub frakcji membranowej w końcowej objętości 1 ml.
Alternatywnie degradację RDX obserwowano monitorując uwalnianie azotynu przy
użyciu odczynnika Griess'a (Rosenblatt, Burrows, Mitchell and Partner, 1991; „Organie
Explosives and Related Compounds” w Handbook of Enviromental Chemisatry 3 (G), wydane przez O. Hutzinger'a Springer-Verlag). Próbę prowadzono jak opisano wyżej. Dodano kwas
sulfanilowy (0,6 mM, końcowe stężenie) i pozostawiono na 15 minut, następnie dodano N -lnafityloetyleno-diaminę (0,4 mM, końcowe stężenie) i po 5 minutach powstałe zabarwienie
mierzono spektrofotometrycznie przy 540 nm.
Białko
Białko badano rutynowo metodą Brandford'a wiązania barwnika Coomassie [Anal. Biochern. (1976), 72, 248-254], stosując dostępny w handlu odczynnik i standard albuminy surowicy bydlęcej (Pierce Ltd., otrzymane przez Life Science Labs Ltd, Luton). Próbki (20 |il),
zawierające 0,2 -1 mg białka/ml dodano do 1 ml odczynnika i pozwolono na przebieg reakcji
w ciągu 5 minut w temperaturze pokojowej przed odczytaniem absorbancji przy 595 nm wobec samego buforu (20 ul) plus odczynnik (1 ml). Porównanie ze standardową krzywą standardowych wartości (0-1 mg/ml) pozwoliło na wyliczenie stężenia białka w próbce.
4. Wyniki
Degradacja RDX
Surowy ekstrakt inkubowano w temperaturze 30°C z 50 mM Tricine, zawierającego 50 fiM
RDX i 5 mM DTT w przedziale czasów od 0 do 60 minut. Stężenie RDX określano drogą
HPLC. Stwierdzono, że stężenie RDX zmniejszało się.
Frakcję membranową inkubowano w temperaturze 30°C z 50 mM Tricine, zawierającego 50 |iM RDX i 5 mM DTT w przedziale czasów od 0 do 60 minut. Stężenia RDX określano
drogą HPLC. Stwierdzono, że stężenie RDX zmniejszało się z upływem czasu.
Wytwarzanie azotynu
Surowy ekstrakt inkubowano w temperaturze 30°C z 50 mM Tricine, zawierającego 50 fiM
RDX i 5 mM DTT w przedziałach czasu od 0 do 60 minut. Stężenia azotynu mierzono przy
użyciu odczynnika Griess'a. Zauważono, że stężenia azotynu wzrastały, jak pokazano na rysunku fig. 1.
Dodawanie któregokolwiek kofaktora NADH, NADPH, PES lub FAD nie wpływało na
ilość wytwarzanego azotynu, wskazując na aktywność enzymatyczną, niezależną od zubożającego kofaktora.
Frakcja membranowa inkubowana z 50 |j.M RDX w temperaturze 30°C też wytwarzała
azotyn. Solubilizacja tej aktywności była możliwa przy pomocy 5% trytonu.
Przykład 2
Komórki szczepu R. rhodochrous 11Y hodowano na pożywce składającej się z 2,17 g/l
Na2H P04 i 1,325 g/l KH2P 0 4, pH 7,0, z 0,4% (w/o) glukozy, 6 mM atomów azotu i pierwiastkami śladowymi (Pfennig & Lippert, jak wyżej). Hodowle inkubowano w temperaturze
30°C w obrotowej wstrząsarce przy 170 obr/min.
Całe komórki 11Y zebrano przez odwirowanie późniejszej fazy wykładniczej hodowli
przy 7000 g w ciągu 10 minut w wirówce Sorvall RC5C z użyciem wirnika GS3. Komórki
8
189 424
przemyto i zawieszono w 50 mM Tricine o pH 8 do stężenia 0,5 g/ml wilgotnego ciężaru komórek.
Degradację RDX podczas inkubacji całych komórek 11Y badano w 50 mM Tricine o pH 8,
zawierającego RDX (300 μM stężenie końcowe) i 10 μM całych komórek w końcowej objętości 1 ml. Zanikanie RDX monitorowano przy pomocy chromatografii cienkowarstwowej
(TLC) z detekcją przy użyciu odczynnika Griess'a (Rosenblatt i in. jak wyżej). Alternatywnie
wytwarzanie formaldehydu monitorowano stosując standardową próbę spektrofotometryczną;
500 μl próbkę zmieszano z 500 μl odczynnika formaldehydowego (20 mM acetyloacetonu,
2 mM octanu amonu i 50 mM kwasu octowego) (Nash, 1953, Biochemical Journal, Vol. 55,
str. 416). Następnie próbkę inkubowano w temperaturze 58°C w ciągu 10 minut i tworzenie
się żółtego zabarwienia mierzono przy 418 nm z użyciem spektrofotometru z układem diodowym. Do wykreślenia krzywej kalibracyjnej zastosowano znane stężenia formaldehydu (od 1
do 500 μm).
Próbki całych komórek inkubowano w temperaturze 30°C w ciągu 12 godzin. Stwierdzono wzrastanie stężenia azotynu jak pokazuje fig. 2. Fig. 2 pokazuje, że wzrosło też stężenie formaldehydu.
Całe komórki rozdrobniono w krzywikowej prasie komórkowej z użyciem minikomórki
przy ciśnieniu 74,3x10 5 N/m 2 (11 000 psi). Szczątki komórek i nie zniszczone komórki oddzielono przez wirowanie przy 13 000 obr/min w ciągu 1 minuty w temperaturze 4°C w mikrowirówce, stosując supernatant jako surowy ekstrakt komórek.
Aktywność degradacji RDX i wytwarzania azotynu surowego ekstraktu badano następująco: próbę przeprowadzano w 50 mM buforu Tricine o pH 8,0, zawierającego RDX (50 μM
końcowe stężenie), 5 mM DTT i 40 μl surowego ekstraktu w końcowej objętości 1 ml. Degradację RDX określano przez monitorowanie zanikania RDX drogą chromatografii cienkowarstwowej z użyciem odczynnika Griess'a do wykrywania. Do pomiaru wytworzonego azotynu strącono białka przez dodanie 2 μl lodowatego kwasu octowego i następne oddzielenia
przez wirowanie w mikrowirówce (5 minut, 13 000 obr/min). Na azotyn przeprowadzono
standardową reakcję Griess'a. Obserwowano degradację RDX i wytwarzanie zanieczyszczającego azotynu.
Subkomórkową frakcję osiągnięto przez ultrawirowanie surowego ekstraktu przy 109 000 g
w ciągu 1 godziny w temperaturze 4°C (Ultrawirówka Beckman Optima TLX z wirnikiem
TLA45), gdzie supernatant reprezentuje rozpuszczalne białka, a osad frakcję membranową.
Osad przemyto i przed badaniem aktywności ponownie zawieszono w 50 mM buforu Tricine
o pH 8,0 do stężenia 2 mg/ml białka.
Zdolność degradowania RDX obserwowano w obu frakcjach z większością we frakcji
membranowej.
Ekstrakt komórkowy wykazujący enzymatyczną aktywność degradowania RDX w rozpuszczalnym białku oczyszczono częściowo na kolumnie Q-sepharose, stosując 50 mM buforu Tris o pH 8,5 i gradient soli 0 - 2M NaCl. Eluowano białko jako pojedynczy pik przy około
350 mM chlorku sodu. Częściowo oczyszczone białko okazało się trwałe termicznie i denaturowało się w 6M mocznika, ale odbudowywało strukturę po rozcieńczeniu do 2M mocznika.
Przykład 3
1. Hodowla Rhodococcus rhodochrous i częściowe oczyszczanie enzymu
161 Rhodococcus rhodochrous 11Y hodowano w 20 mM KH2PO4, 0,4% (w/w) glukozy,
2 ml pierwiastków śladowych (Pfennig & Lippert, jak wyżej) i 1 mM RDX jako jedyne źródło
azotu w temperaturze 30°C. Komórki namnażano w 21 kolbach i zbierano przez wirowanie,
gdy tylko osiągnęły stacjonarną fazę wzrostu, w wirówce Sorvall RC5C stosując wirnik GS3
przy 10000 g w ciągu 15 minut w temperaturze 4°C. Osad komórek (57 g wilgotnego ciężaru
komórek) ponownie zawieszono w 120 ml 50 mM Tris o pH 8,0. Zawiesinę homogenizowano
w krzywikowej komorze ciśnieniowej pod ciśnieniem 241xl05 N/m 2 (35 000 psi) (trzy przejścia)
z następnym wirowaniem (wirówka Sorvall RC5C z użyciem wirnika SS-34 przy 30 000 g
w ciągu 30 minut w temperaturze 4°C), zbierając wszelkie resztki komórek. Supernatant oddzielono i wirowano powtórnie (ultrawirówka Beckman XL-90 z użyciem wirnika Ti-70 przy
25 000 g w ciągu 2 godzin w temperaturze 4°C), zbierając membrany bakteryjne. Stwierdzono, że zarówno supematanty jak i osady posiadają zdolność degradowania RDX z uwalnia-
189 424
9
niem azotynu, co potwierdzono próbą Griess'a. Supernatant z etapu wirowania z dużą szybkością użyto do dalszego oczyszczania.
Wartość pH supematantu zredukowano do 3,5 lodowatym kwasem octowym i inkubowano próbkę na lodzie w ciągu 30 minut. Stwierdzono, że około 60% białka z supemantantu
z wirowania z dużą szybkością uległa agregacji i została oddzielona przez dalsze wirowanie
(wirówka Sorvall RC5C z użyciem wirnika SS-34 przy 30 000 g w ciągu 30 minut w temperaturze 4°C). Wartość pH supematantu przesunięto do 8,0 stosując IM wodorotlenek sodu,
a ekstrakt badano na uwalnianie azotynu z RDX jak opisano w przykładzie 1. Stwierdzono, że
większość (około 75%) enzymu pozostała rozpuszczalna po poddaniu działaniu lodowatym
kwasem octowym. Tę próbkę użyto do wszystkich następnych prób.
2. Wymagania wobec substratów
Stosując częściowo oczyszczone białko badano wymagania w odniesieniu do ko faktorów. Stwierdzono, że kofaktory takie jak NADPH czy NAHD nie są potrzebne. Zależność
degradacji RDX od stężenia ditiotreitolu (DTT) badano następująco:
26 (ig częściowo oczyszczonego białka inkubowano w obecności 4M mocznika, 0,3 mM
RDX, 50 mM Tricine o pH 8,5 w temperaturze 37°C w ciągu 10 minut. Stężenie DTT zmieniano, utrzymując końcową objętość 200 |il. Uwolnioną ilość azotynu mierzono stosując badanie spektrofotometryczne opisane w przykładzie 1. Uwolnioną ilość azotynu przy stężeniu
DTT pokazuje fig. 3. Pokazano, że obecności około 3 mM DTT jest potrzebna do osiągnięcia
maksimum aktywności. DTT stosuje się do utrzymania środowiska redukcyjnego po rozbiciu
komórek
3. Rozpuszczalność i stabilność
Zatężenie roztworu częściowo oczyszczonego enzymu przy użyciu jednostki ultrafiltracyjnej Amocon [membrana 3 kDa, ciśnienie 0,5x105 N/m2 (70 psi), w temperaturze 4°C] prowadzi do agregacji białka i zmniejszenia aktywności. Stwierdzono, że zagregowane białko
może być ponownie rozpuszczone w 8M moczniku, 5 mM DTT i 50 mM Tris o pH 8,0 i zostaje przywrócona jego aktywność.
Trwałość ekstraktu wykazującego aktywność enzymatyczną w obecności silnie denaturujących środków mierzono w próbie uwalniania azotynu z RDX w obecności próbki białka
z mocznikiem czy chlorowodorkiem guanidyny. Warunki próby były następujące: 50 mM Tricine o pH 8,5, 0,3 mM RDX, 5mM DTT w temperaturze 37°C w ciągu 10 minut z 26 p.g białka; mierzono uwalnianie azotynu w próbie spektrofotometrycznej, opisanej w przykładzie 1.
Zależność aktywności wobec RDX od stężenia denaturanta pokazuje fig. 4.
Można zauważyć, że enzym wykazuje niezwykłą stabilność w obecności wysokich stężeń denaturantów. Różnica obserwowanej aktywności z mocznikiem, który działa głównie
przez rozerwanie wiązań wodorowych i hydrofobowe współdziałanie w obrębie białka, oraz
z chlorowodorkiem guanidyny, który głównie przerywa jonowe oddziaływania i w mniejszym
stopniu oddziaływania hydrofobowe, sugeruje, że oddziaływania jonowe mogą odgrywać
większą rolę w stabilizowaniu enzymatycznej aktywności.
Ponieważ aktywność degradowania RDX była zwiększona przez obecność mocznika,
wszystkie dalsze próby prowadzono w obecności 4M mocznika.
W celu określenia trwałości cieplnej enzymatycznej aktywności częściowo oczyszczonego białka, próbki ogrzewano w temperaturze 100°C, a pobierano próbki w różnych przedziałach i badano w ciągu 10 minut z 20 (j.1 gotowanej próbki, 50 mM Tricine o pH 8,5, 4 M
mocznika, 5 mM DTT i 0,3 mM RDX w temperaturze 37°C. Uwalnianie azotynu mierzono
spektrofotometrycznie, a wyniki przedstawiono na fig. 5.
Widać, że enzymatyczna aktywność jest stosunkowo trwała wobec temperatury, tracąc
jedynie około 20% aktywności po 10 minutach w temperaturze 100°C.
Profil wartości pH
Badano profil wartości pH częściowo oczyszczonego ekstraktu. Warunki prób były następujące: 50 mM odpowiedniego buforu, 4 M mocznika, 0,3 mM RDX i 5 mM DTT. Próbki
inkubowano w temperaturze 37°C w ciągu 10 minut z 26 |ig częściowo oczyszczonego białka.
Alkaliczną hydrolizę 0,3 mM RDX mierzono również w identycznych warunkach, a wyniki
10
189 424
przedstawiono na fig. 6. Jak widać enzymatyczna aktywność znacząco zwiększa uwalnianie
azotynu z RDX w porównaniu ze spontanicznym rozkładem w związku z pH.
5. Wytwarzanie azotynu i formaldehydu
Wytwarzanie azotynu i formaldehydu z enzymatycznego rozkładu RDX badano w 50 mM
Tricine o pH 8,5, 4 M mocznika, 0,15 mM RDX i 5 mM DTT w temperaturze 37°C z 26 |ig
częściowo oczyszczonego ekstraktu, a ilość uwolnionego azotynu i wytworzonego formaldehydu mierzono w czasie stosując standardową próbę spektrofotometryczną, opisaną w przykładzie 1. Wyniki przedstawiono na rysunku fig. 7. Ilości formaldehydu i azotynu uwolnionego z RDX były podobne, co sugerowało, że mechanizm enzymatycznego rozkładu RDX może
być podobny do proponowanego dla hydrolizy alkalicznej RDX (Croce and Okamoto, 1978,
Journal of Organie Chemistry, Vol. 44, strony 2100-2103; Heilmann i in., 1996, Environmental Science Technology, Vol. 30, nr 5, str. 1485-1492), gdzie usunięcie grupy azotynowej
z RDX tworzy nietrwały produkt pośredni, który spontanicznie rozkłada się, dając szereg
mniejszych cząsteczek włączając formaldehyd.
6. Specyficzność materiału wyjściowego
Badano specyficzność materiału wyjściowego poddając testowaniu aktywność enzymatyczną degradowania HMX lub PENT, obu materiałów wybuchowych zawierających azotyn.
Próby prowadzono w 50 mM Tricine, 4 M mocznika, 0,3 mM odpowiedniego materiału wybuchowego i 5 mM DTT w temperaturze 37°C w ciągu 20 minut z 26 |ig częściowo oczyszczonego ekstraktu, a wyniki porównano z RDX. Wyniki przedstawiono na rysunku fig. 8. Jak
widać enzymatyczna aktywność działała wobec wszystkich badanych materiałów wybuchowych, ale z wyraźną preferencją (to znaczy większą aktywnością) wobec RDX.
189 424
Fig.3.
Fig.4.
1
12
189 424
Fig.5.
Fig.6.
189 424
Fig.7.
Fig.8.
13
14
189 424
Fig.1.
Fig.2.
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz.
Cena 4,00 zł.
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
963 Кб
Теги
pl189424b1
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа