ardp.19642971002

Archiv der Pharmazie
und Berlchte der Deutschen PharmazeutischenGesellschaft
Oktober 1964
297. Band
Heft 10
2379. C. H. Brieskorn und H. Hofmannl)
Beitrag zum Chemismus der Farbreaktion
nach Liebermann-Burchard")
Ana dem Institut fiir Pharmazie und Lebensmittelchemie der Univereitlrt WIirzbnrg
.
(Eingegangen am 8. April 1964)
Zum Nachweis VOR Sterinen wird hiiufig die Liebermsnn-Burchard-Reaktion(im
folgenden ale L. B. R. abgekiirzt) herangezogen. Sie ist durch den Farbenverlauf
rot-violett-blau-blaugriingekennzeichnet.Wir empfehlen von einer positiven L. B. R.
nur dann zu sprechen, wenn die blaugriine Endfarbe eine Absorptionsbande bei
mindeatens 605 mp aufweist.
Der Chemismus der L. B. R. ist bereits Gegenstand zahlreicher Arbeitena-6) gewesen. Die Aubren werten das Auftreten der Farben iibereinstimmend ale ,,Halochromie", die durch Anlagerung von Schwefelsaure an ein System konjugierter
Doppelbindungen be&@ ist.
Untemchiedliche Auffassungen bestehen hinsichtlich der Beschaffenheit des konjugierten Systems. Wutmade*) macht hierfiir ein von ihm isoliertes Tetraen (I)
verantwortlich. Andere Autoren2-6) betrachten ein Dien oder Trien bereite als ausreichend. Nach den derzeitigen Kenntnissen vom Zuaammenhang misohen Konstitution und Farbe7) ist es jedoch unwahrscheinlich, daD ein Dien oder Trien mit
einer Siinre derart tief gefarbte (& 610-700 mp) Farbsalze auszubilden vermag,wie sie fiir die L.B. R. charakteristisch sind.
*) H e m F'rof. Dr. Dr. h. c. H. P. Kautmann eum 20. 10. 1964 gewidmet.
I) Teil der Dissertation Eeinz Hofmunn, WIirzburg 1962.
a) 0. Rmnheirn, Biochem. J. 23,47 (1929).
*) W . h n q e , R. U.Fol~nlogenund D. a. KO&,J. h e r . chem. 800.71,1733 (1949).
') 0.H . B h h und L. Capuano, Chem. Ber. 86,866 (1953).
s, 0.H . Brieakmn und H . Herrig, Arch. Phermse. 292,485 (1959).
*) T. W & d e , ref.: C . A. 66, 10603 (1981); Orig.: Eiaei 8hikenjo H8koku 77, 87 (1959).
') H. A . 8taab, Einftihrung in die theoret. organ. Chemie, Verhg Chemie, Weinheim/Berg&r.
1960.
Amhiv 297. Band, Heft 10
37
678
Archiv der
B r i e e k o r n und E o f m a n n
Pharmpljt
Watanabes6 ) Tetraen, daa 3,3'-Bkcholesta-A3,5-dien(
I) kann nicht daa die
blaugriine Farbe vemachende Endprodukt sein. Wir mochten dies mit folgenden
Beobachtungen begriinden :
3,3'-Bischolesta-A3,5-&en liefert mit €LJ304-Acetmhydrid zunachst eine rotviolette Farbe mit einer Hauptabsorptionsbande bei 540
Nach 30 Min. stellt
sich das Maximum der blaugriinen Farbe ein, deren Absorptionsbanden bei 600
und 650mp liegen. Beim Cholesterin wird das Maximum der blaugriinen Farbe
bereits nach 26 Min. erreicht. Ihre Absorptionsbande liegt bei 620 mp. A5-Sterine
mit unterschiedlicher Seitenkette reagieren verschieden schnell und intensiv. Beim
Vergleich der Lage der Absorptionsbanden konnten wir Unterschiede von maximal
80 mp featatellen. Die untersuchten A5-8terine sind in den Ringen A und B vollig
gleich. Der von Watanabe'J)angenommene Chromophor mu13 daher bei diesen
Sterinen stet^ identisch sein.
Die beobachteten Unterschiede.konnen unseres Erachtens n u am einem anderen
Reaktionsverlauf innerhalb der Gesamtmolekel des betreffenden Sterins resultieren.
Es m d im Verlauf der L. B. R. eine sich uber die Einzelmolekel des Sterins erstreckendeResonanzkette aufgebaut werden und der Vorgang der oxydativen Kupplung zweier Molekeln Cholesta-AS,B-dien, der zu dem von Watanabes) isolierten
Produkt fiihrt, lediglich eine Nebenreaktion damtellen.
Der Aufbau einer Reihe von vier und mehr Doppelbindungen ist nach folgendem
Schema denkbar: nach Dehydratisierung in A 3 hegt bei A5-sterinen (im folgenden ah A5-SLnole abgekiirzt) ein A3,5-Dien vor. Die Verliingernng des Systems
miiDte durch wiederholte Oxydationenin Allylstellung zu einer bereits vorhandenen
oder gebildeten Doppelbindung oder an sonstigen, oxydativen Angriffen zugiinglichen Stellen und anschliefiende ,,Dehydratisierungen" erfolgen. Ahnliche Vorgange beschreibt Bwckardt*),der z. B. beim Behandeln eines Alkans mit rauchender
Schwefelsiiure zum Alkylsulfonsauresulfat gelangt, wobei als Zwischenstufe ein
A 2 - f i e n auftritt (11).
w.
...............
*)
a. N. Burckardi, J. chem. 8oc. (London)1930,2387.
Das L. B. R.-Gemisch Schwefelsiiure/Acetanhy~dweist oleumartige Eigenschaften auf. Durch das Acetsnhydrid ist ea praktiach waaaerfrei, so dal3 in vermehrtem MaDe Dischwefdsiiure und Schwefeltrioxid vorliegen. Letzteres ist von
una nach Baumgarten und Krurnmu~7rer~)
im Reagenzgemkh nachgewiesen worden.
Wie die Reaktion zu I1 zeigt, wird beim Entstehen des Alkena Schwefeldioxid
frei. Das Entweichen von SO, beim Ablauf der L. B. R. ist bereits von Aaderson und
Nabenhuwlo) beobachtet worden. Wir bestimmten die Menge dea auftretenden
SO,. Danach werden bei der L. B. R. mindeatens 3 Mol SO, pro Mol Sterin entwickelt. Die SO,-Freisetzung steht in Zusammenhang mit der Farbentwicklung, da
bei Steroiden, welche unter den Bedingungen der L. B. R. die typische blaugriine
Farbe nicht liefern, nur eine sehr geringe bzw. kei ne SO,-Entwicklung festetellbar
ist (vgl. Tab. 1).
Tabelle 1
Schwefeldioxidentdcklungbei Steroiden im Verhufe der L. B. R.
Konz.
Steroid
Choleaterin
99
,,
,,
,,
9)
Choleaterylecetat
99
-
Ergoeterin
Verbr. ml
0,001 n J
3
3
1
2
2
'4
47,4
61,6
16,s
32,O
28,4
66,l
3
3
43,6
Mol80,/
(MolSteroid1
Formel
44,l
I
II 3
49,l
1
Androetendion
9)
10)
3
P. Bawngarten und A . El. Krummaclrer, h g e w . Chem. 55, 116 (1942).
R. J . Anderaon und F. P.Xabenhawr, J. h e r . chem. 800.46,1963(1924).
37*
B r i e e k o r n und H o f m a n n
580
. Mvder
Pharmazie
P'artsebung von Tebelle 1
Konz
Steroid
Imglmi
I
Verbr. ml
0,001 n J
Mol SO,!
IMolStemdl
Formel
Epiandrosteron
11
0
3
116
3
3
Dehydroepiendrosteron
1,
Dehydroepiendrosteronacetai
9,
23,4
14,3
22,8
22,6
I
Daneben erfolgt mit Sicherheit auch Sulfonierung, wie die vermehrte Wasserloslichkeit des Reaktioasansatzes im Verlaufe der L. B. R. z u erkennen gibt. Aus
diesem Grunde war es uns bis jetzt nicht moglich; das vermutete Polyen zu
faasen*). Zum Verstiindnis dieser Reaktion gelangt man einstweilen nur, wenn man
ihren Ablauf schrittweise uberdenkt und aus dem Reaktionsverhalten verschieden
gebauter Sterine Schldfolgerungen zieht.
Unser Augenmerk richtete sich zuniichst auf denEinfluD der Hydroxylgruppe am
C-3 sowie der Doppelbindung am C-6. Brieskorn und Mitarb.") s), W&wbe6) und
-im Zusammenhang mit der ahnlich verlaufenden 8dkow8ka1l)-Reaktion-Raooll,
Chopin und DouZOU~~)
haben bereita die Abspaltung dea C-3-Hydroxyls mammen
mit einem Wasserstoff am C-4 angenommen bzw. bewiesen.
Bei einer derartigen ionischen 1,2-Eliminierung miissen die reagierenden Gruppen
nach C. W. Shoppee und G. H. R. Summers'3) in trans-diaxialer Anordnung vorliegen. Damit deckt sich auch der Befund von A. Windaus und J. Naggatzl4),wonach nur aus 7-Keto-e pi cholesterylacetat leicht Essigsiiure abgespalten werden
kann. Die Epimerisierung des iiquatorialen C-3-Hydroxylsvor der Dehydratisierung
m d folglich als Zwischenschritt angenommen werden. Wir konnten aus dem Reaktionsansatz Cholesterylsulfat und -acetat isolieren. Watunabe6)hat daa nach der
Dehydratisierung entstehende Cholesta-A 3,5-dien bereita friiher nachgewiesen.
Die L. B. R. miil3te demnach durch die Reaktionsfolge Sterin (111)--+ Sterylsul*) vber ein bei der L. B. R. der Hydroxytriterpencarhm&ureOleenolsllnre leicht isolierbares.
gelb geftkbtes Polyen werden wir in Kliree berichten.
Z. physiol. Chem. 57,523 (1908).
11)
8dkmu&, Hoppe-Seylera
la) R. Doulocc, J . CrCOpin und
13) J. &em. Boo. (London) 1953,
1.
P. Raoul, Bull. SOC. chim. 18, 616 (1951).
640.
Liebigs Ann. Chem. 542, 204 (1939).
fat (IV) -+ Sterylacetat (V)
geleitet werden.
--f
Epishrylacetat (VI) -+ Sta-A3,5-dien (VII) ein-
Die uns zur Verfugung stehenden Verbindungen Cholesterin, Choleaterylacetat
und Epicholesterylacetat stimmen in ihrem Reaktionsverhalten mit d ie m Forderung iiberein.
Tebelle 2
Vergleioh der Reaktionsgeaohwindigkeiten von Choleaterin, 3,9-Acetylcholeaterin
und 3 a-Acetylcholeeterin (Epioholeeteryhcetat)
Sterin
Choleeterin
3 fi-A&ylCholmteIiIl
3 a-Acetylcholeeterin
I
1
&lax
620 mp
620mp
Mdmd-Extinktion
eFiei&t&:
26 Min.
18 Min.
10 Min.
.
620 m p
Eine weitere Konjugation ist durch daa Auftreten einer Doppelbindung am C-7
denkbar. Die Position 7 der Sterinmolekel ist oxydativen Angriffen mgiinglioh,
wie zahlreiche Autoren16-1s) in anderem Znsammenhang bewiemn haben. Wir
verglichen deshalb die Reaktionsgeschwindigkeiten von Cholesterin, 7a-Hydroqi
cholesterin und 7-Dehydrooholesterin sowie die Intensitiitenihrer blaugriinen Farbprodukte.
Tebelle 3
Verlauf der L. B. R. mit Choleaterin, 7 a - H y d r o x y o h o l ~und 7-Dehydrochole8tarin
Sterin
IKonz.mg/mll &(my)
1 E,I arreichtneoh:
1,13
0,23
0,28
20 Min.
6Min.
3,5 Min.
Das Egebnis dieser Untersuchung stimmt ebenfalls mit unserer Amicht groJ3tenteils tiberein. Wichtig ist dabei die Feststellung, da13 die bhugrfinen Farbprodukte
von 7a-Hydroxycholwterinund 7-Dehydrocholesterinebenfalls Ma&
bei 620 mp
15)
S. B e v a t r h und 0.Wirintereteiner,C. 1946, II,8394340.
16) 8.A. D. H a a W , Biochem. J. 36,389 (1942).
1 7 ) L. Sta~krr,
COILCzech. ohem. Comman. 26,2452 (1961),
18)
8turAxa, Pharmazie 17, 126 (1962).
L.
ref.: C. A. 66,27420 (1961).
582
B r i e a k o r n und H o f m a n n
AKhtv der
Pharmazie
aufweisen. Wie schon Brieskorn und Herrig6) beobachteten, gibt 7-Ketocholesterh
keine L. B. R.: hier ist das Auabilden der Doppelbindung am C-7 nicht mehr moglich. Tab. 3 lalit erkennen, daB der Oxydationsvorgang am C-7 geschwindigkeitabestimmend ist. Unerwartet ist die kurze Reaktionszeit des 7-Dehydrocholeste~.
Die von u118 geforderten zusiitzlichen Doppelbindungen A16 und A17 (20)
m a t e n demnach, geht man vom 7-Dehydrocholesterin am, neben den Reaktionsvorgiingen am C-3 in den noch verbleibenden 3,5 Min. bis zum Erreichen des Abeorptionsmaximums gebildet werden. Eine derart leichte Zugiinglichkeit der Positionen 16 und 17 gegeniiber oxydativen Angriffen ist bisher in der Literatur noch
nicht beschrieben worden.
Weiter hatten schon [email protected] und K. Mie~cherl~)
sowie Brieskorn und H e s )
eine starke Abhiingigkeit der Farbentwicklung vom Bau der Seibnkette beobachtet, jedoch diese nicht systematisch iiberpriift. Dies veranlaBte uns, eine Reihe
von A5-Stenolen zu untersuchen, welche sich lediglich in der Seitenkette (VIII)
unterscheiden. Nach unserer Definition der L. B. R. beriicksichtigten wir dabei
nur jene Verbindungen, die echte Blaugriinfiirbungen mit Maxima langwelliger
als 606 mp lieferten (vgl. Tab. 4).
28
I
97
VIII
Der Tabelle 4 sind folgende Einzelheiten zu entnehmen (die angegebenen Nummern beziehen sich auf Tab. 4) :
1. Ftir den Ablauf der L. B. R. sind insbesondere die Liganden der C-Atome 17
und 20 wichtig.
a) Beim Fehlen der C-17-Seitenkette tritt die blaugriine Farbe nicht auf
(9, 12-14).
b) 1st die Seitenkette vorhanden, dann entscheiden die Substitutionsverhaltnisse an C-20. Befindet sich dort eine Hydroxyl- oder Carbonylgruppe, so
verliiuft die Ii. B. R. negativ (10,11, 15-18). Auch eine C-20 (22)-Doppelbindung verhindert die Reaktion (5).
Daraus folgt: eine positive Reaktion erhalten wir nur dann, wenn an C-17
eine Seitenkette vorhanden ist und sich an C-20 ein Waaserstoff befindet:
2. Eine Verliingerung der Kette sowie eine Vermeigung derselben an C-24 verursacht eine bathochrome Verschiebung des Absorptionsmaximums (1 --t 2
+3; 4+6+7).
3. Auch eine Doppelbindung in der Seitenkette (mit Ausnahme A20 (22))
bewirkt Farbvertiefung (2 + 4; 3 + 7).
-18) Helv.
chim. Acta 22, 683 (1039).
Tebelle 4
Abhhgigkdt der L. B. R. von der Struktur der Seitenkette
Steroid
,itenkette (Nnmeriernq
er C-Atome &he V I I I )
1. 20-Methyl-A [email protected]
0,680
2. A 6-Cholegten-3p-01 (Choleeteh)
1,133
0,626
4.
A 6,24-Chole&adien-3p-01
6.
A 6,20(22)[email protected]
0,967
-
6. M-Methylenoholmb~
0,976
7. A 6,[email protected]
(Stigmesterin)
0,917
-
10. A [email protected]
-
12. 17a-Methyl-AS-endroeten-38,[email protected]
0
13. A [email protected],[email protected]
14. A [email protected]
-
-
584
A l T a l V dec
B r i e e k o r n und H o f m o r a n
Pharmaae
Fortsetmng von Tabbelle 4
Steroid
I
1
Seitenkette (Numerierung
der C-Atome siehe VIII)
Amax
I
Emax
Folgende Verbindungen wurden untersucht, obwohl sie nioht die erforderliohe Winheit
aufwieaen:
16. 22-Methyl-A 6-oholeatan-38,20 B-diol
620
0,227
16. 21-(3',3'-Dhethyl)-b~t~lA 6pregnen-3~-01-20-on
620
0,084
17. 21-Methyl-21-(3'-methyl)-butylA 6-pregnen-38-01-20-0n
620
0,077
18. 21-(2',3'-Dimethyl)-b~t~lA 6pregnen-3/3-01-20-0n
620
O,OQ4
Die beiden folgenden Verbindungen sind keine 38-Hydroxy-A 6-stenole:
\/..A/
I
20. A 7,22-stiigmestedien-38-01
(,,a"-Spin&erin)
'
670
680
2,2
-
3.6
Unsere Vorstellung uber den Ablauf der L. B. R. mu13 an Hand dieser Ergebnisse
folgendermaaen formuliert werden :
Bei einem Absorptionsmaximum von 610-620 mp, wie es bei der L. B. R. von
Methylpregnenol und Cholesterin erhalten wird, stellen Wjr das Pentaen IX zur
Diskuseion :
'
I
.Ix
Zu seinem Entstehen sind auDer den bereits beachriebenen Reaktionen in den
Ringen A und B zunachst die schon erwahnte Oxydation an 0-1'7sowie eine De-
191. Bd.
1964, Nr. 10
Beitrag zum C h e m h w der Farbreaktion raach Liebermann-Burchard
585
hydratisierung in A17 (20) notwendig. Nach A. Windaus und C. ReSau20) greifen
z. B. auch Chromsaure und Ozon die Sterinmolekel bevorzugt an C-17 an. Naoh
erfolgter Oxydation kann die Dehydratisierung nur dann erfolgen, wenn sich an
C-20 ein Wasserstoffatom befindet. Die unter 1b) im Anschld an Tab. 4 getroffenen
Festatellungen sind damit begriindet.
Absorptionen im Bereich oberhalb von 620 mp sind durch die Annahme weiterer
Doppelbindungen in der Seitenkette erkllirbar. Eine Farbvertiefung erhalten wir
folglich dann, wenn die Seitenkette schon eine Doppelbindung enthiilt. Sie kann aber
auch wiihrend der Reaktion gebildet werden, wenn durch eine Verzweigung an C-24
ein weiteres ,,tertiiirea Wasserstoffatom" vorliegt. Dadurch konnte sowohl die
Oxydation als auch die Dehydratation an C-24 bzw. C-25 erleichtert werden. Bei
der L. B. R. des Stigmashrine, dessen blaugriines Barbprodukt bei 700 mp absorbiert, miil3te somit neben der C-17 (20)- und der C-22 (23)-Doppelbindungnoch
eine weitere am C-24 (25) gebildet werden. ,,a"-Spinasterin, das A7-ungesiittigte
Isomer dea Stigmasterins, zeigt bei der L. B. R. ein Maximum bei 680 mp. Wir
nehmen an, da13 hier die Resonanzkette urn eine Doppelbindung kiirzer ist, da die
in A3 entatandene sofort in Konjugation zur A7-Doppelbindung wandern wird.
Die aus Formel IX ersichtliche Lage des konjugierten Systems miiI3te nach Wanderung der A7-Doppelbindung in die A 8 (14)-Position und ansohliel3endes Nachrticken der Doppelbindungen A 3 und A 5 nac h A 4 und A 6 zustandekommen. Die
Neigung der A7-Doppelbindung, rich in die A 8 (14)-Stellung zu begeben, wurde
bereita von I. M.Heilbron, F. Jokpbstone und F. S. Sptilagal)beobachtet.
Das Farbsab entateht wahrsoheinlich in der gleichen Weise wie bei den Carotinoiden, deren Reaktion mit Mineral- oder Lewis-Siiuren von Wmsermm und
Mitarb.22-25) sowie von Kmuss und Grud26) 2 7 ) eingehend studiert worden ist.
Analog ist anzunehmen, da13 die Polyenkette in ihren polaren Glrenzzustiinden
Saurekationenund -anionen,in userem FaUe [email protected] OHe bzw. HSOd0,reversibel anlagert. Die grol3te Farbvertiefung wird erreicht, wenn die angelagertenIonen
bei einer langen Kette von Doppelbindungen moglichst weit voneinander entfernt
aind, was im F d e einer geringen Saurekonzentration am besten moglioh ist.
Bei der L. B. R. bewirkt diese Verdriingung der &SO, das Acetanhydrid. Erhohen dea Sohwefelsaureanteils hat eine hypsochrome Verschiebung der Absorptionsbande zur Folge, weil durchvermehrte Adagerung der Siure eine Aufspaltung
.der Doppelbindungskettein kleinere, unabbhlingig voneinander absorbierende chromophore erfolgt. Dieser Vorgang ist erkennbar an dem riickliiufigen Farbenspiel
no) Ber. dteoh. ohem. Gee. 46, 1248 (1913).
chem. SOC.(London) 1929,2248.
22) A . W a a e m n , J. ohem. SOC.(London) 1954,4329.
88) A . Waasemann, ebenda 1969,986,
24) A . Waaaemnn, K . Bange und J . W.&milk, ebenda 1962,864.
m6) A . Wasaermunn, L. Roubinek and R. V. French, ebenda 1961,1953.
36) W . Krawa and H . ( h u n d , Z. Elektroohem. 68,142 (1954).
8 7 ) W. K r a w and H.Urud,ebenda 69,872 (1955).
*I) J.
686
.
B r i e s k o r n und H o f m a n n
AmUv der
phermazie
blaugrtin-blau-violett-rot.Die b a t h o o h r o m e Farbenfolge imVerlauf der L. B. R.
ist durch den schrittweisen Aufbau der Resonanzkette bedingt.
Dem F o n h der Chemischen Industrie sind wir fiir die Unterstutzung der Arbeit zu
grohm Dank verpflichtet.
Bedmeiiuag der Versuche
Qualitative Ausfuhrung der Liebermann-Burohard-Reaktion
6 mg Sterin werden nacheinander mit 1 ml Chloroform, 2 ml Aaetanhydrid und 2 Tropfen
Schwefd&ure versetzt. An Stelle dea S c h w e f e l e i i u r e / a d - G e keM
~ ~ ~auoh
reuchende SohwefelsGure verwendet werden. Es tritt zuniichst Rotfiirbung euf. Vom
Rende her erfolgt nach 6-10 Min. Farbwechsel nach bhu und blaugriin.
Q u a n t i t a t i v e Ausfuhrung der Liebermenn-Burchard-Reektion
Bereiten des Reegenzgemisches :
2 ml Schwefelsiiure 20 ml Acetmhydrid. Man lint die Schwefelsiiure untk Waeeerkiihlung und Umschwenken in das Acetanhydrid h e m einflieDen. Vorher werden die
Rsegenzien auf gemu 20" temperiert.
+
Messung:
Vor Ausfiihren der Bestimmung sind Liisungsmittel und Reagemien auf'genau 20" zu
bringen. 1 ml Lhung (Konzentration bei A6-Stenolen 1 mg/ml Chloroform, bei A7Stenolen und A 6,7-Stenadienolen 0,l mg/ml Chloroform) wird mit 3 ml Chloroform verdiinnt. Bus einer Pipette l i D t man der Liieung dam innerhalb von 30 Sek. 1 ml Reagenzgemisch unter Waeeerkiihlung und Umschwenken zufliehn. Im Laufe von weiteren
30 Sek. wird daa Reaktionsgemisch in eine 1 cm-Kiivette ubergefiihrt und diese danach
in den auf 20" temperierten Kiivettenschlitten eingesetzt. Im Spektrelphotometer
(Unicam Spektralphotometer, Modell SP 600)verfolgt man sodann gegen eine Blindlosung
die zeitliche Entwicklung der Farbe im Maximum.
Bestimmen des Schwefeldioxids
1 ml [email protected]; des Sterins in Chloroform (3mg/ml) wird in der nebenstahenden Appamtur
mit 1 ml R e e n s (2 ml konz. Schwefeleiiure
10 ml Acetcmhydrid) zwmmengegeben
und der Aneata 7 Std. im Thermoataten bei 20" von Stickstoff durchperlt. Das entweichende N,/SOs-Gemiach treibt men in einen MeBkolben, der 100 ml 0,601 n J enthiilt.
Nach Beendignng den Einleitens wird die Jodl6sung in ein Beoherglaa ubergefiihrt, der
MeDkolben 3-1 mit je 6 ml Wtlsser geapiilt und die Jodlosung mch Aneliuern mit 1 ml
Schwefelstiure mittela 0,001 n NasSsO, titriert ( I n d h t o r : Stiirke). Vor jeder Ehuptbeatimmung wird ein Blindversuch durchgefiihrt.
+
Isolieren u n d Identifizieren des Cholesterylsulfets u n d Cholesterylecetats
1. 1g Choleeterin wird in 60 ml Chloroform gelost und im Kryosteten bei - 16" unk
Umriihren innerhalb von 6 Min. mit einem Gemisch von 6 ml Schwefeleiiure und 60 ml
Acetanhydrid versetzt. Danach beliiDt man den h t a 6 Min. bei der angegebenen Temperatur. AnschlieBend wird in Anteilen euf 5" abgekiihltes Wasser solange hinzugegeben,
bis eme Emulsion entsteht. Der h t z
mit einer geaiittigten NaHCO,-LaeUng neutralisiert. Beim Ausschutteln mit Petroliither ( 3 d 100 ml) reiohert aich an der Grenzfliche eine farbloee Substanz an, die abgesaugt und mit Petmliither gewaschen wird. Der
Ruckstand hat im IR-Spektrum eine eterke Bande bei 1274 om-, welche a d eine SO,Gruppierung echlieBen liil3t.
+
n
Abb. 1
Eigemchaften dee Natriumcholeatarylulfats: Ferblose, mikrokristalline Subatanz.
schmp. 176-180" (Zera.). In Wasser z. T. kolloid loalich.
2. Bei der alkalischen Hydrolyee bleibt die Substam unveriindert.
3. Saure Hydrolyse dea Natriumcholeaterylsulfate :
600mg Substanz werden mit 100 ml 16proz. Salzsiiure 2 Std. untar RUckfluB erhitzt.
Den Reaktionmnsatz extrahiert man mit Petrolather und dampft dae Usungsmittel ab.
Ber. : 0,3626 g. Gef. : 0,3966g.
Der MiachNach dreimdigem Umkrietdhieren aua abs. Athanol, Schmp. 146-147'.
schmp. mit authent.ischem Choleatarin zeigt keine Depression.
Aus der ealzeeuren Phase fiillten wir mit Bariumcblorid daa Sulfat: Ber.: 0,2218 g.
Gef. : 0,2389g.
4. DC%) dea Petroliitherauazugs von 1. uber Kieaelgel G ,,Merck" mitt& Petroliitherl
Benzol/Chloroform/Awton (40:40 :17 :3) liefert nach Bespriihen mit SbC1, einen mit
Choleaterylacetat identiachen Fleck. Nach Verseifen dea Petroliitherauazuga eracheint ein
Fleck mit gleicher Laufatrecke wie die authentiachen Choleeterins. Der dem Cholesterylamtat zugeordnete Fleck tritt nicht mehr auf.
Bezugsquellen und Heratellung der f u r die F a r b r e a k t i o n e n benotigten
Sterine
Die nechatehend 8ufgdihrt.m Substanzen d e n . aoweit die zur Verfiigung stahenden
Mengen ee erlaubten, durch Umkriatdiaieren aua abaolutem Methanol gereinigt.
ns) E. StuhZ,
Chemiker-Ztg. 82,323 (1958).
688
B r i e s k o r n und H o f m a n n
.
ArchiV der
pharmazls
1. Choleaterin ( E . Merck, Dannstadt), Schmp. 149"*).
2. ,,fl"-Sitosterin (C. Both, Karlaruhe), Schmp. 139,&140".
3. Stigmastah (L.BucL, Basel), Schmp. 169,6-170".
4.**) 21-Methyl-21-(3'-methyl)-butylA S-pregnen-20-on-3P-yl-acetat,.
Schmp. 79-81'.
6. 20fl-Hydroxy-22-methyl-A
6-cholesten-38-yl-agatat, Schmp. 181,6-183" (Zers.).
6. A 6,20(22)-Ergostm+m-3fl-yl-ecetat, Schmp. 81-83".
7. 21-(3',3'-Dimethyl)-butyl-A6-pregnen-20-on-3fl-yl-soetat, Schmp. 146-166".
8. Ergoeterin (Zehtoff-Fabrik Wddhof, Mannheim), Schmp. 166".
9. 24-Methylencholeshrin(Prof.Dr. Barbkr, Uif-eur-Yvette,Frankreich), Schmp. 141
-142".
10. 20-Methyl-A6-pregnen-3/l-ol (Prof. Dr. BZkkemfuff, Indianapolis, Indiana, USA),
Schmp. 135-136'.
11. A6,24-Choleatedien (Prof. Dr. Bergmann und Dr. Stoke, Rhode bland, USA),
schmp. 11Q1
-20".
12. 7-Dehydrocholesterin,Schmp. 139-141" (E. Merck A. G.,Darmhdt).
13. 7a-Eydroxycholeeterin, Schmp. 166-167" ( E . Merck A. ff., D a m s a t ) .
14.***) A 6-Androsten-38-17b-diol, Schmp. 183".
16. 6-Epiandrosten-3fl-ol-20-0n,Schmp. 162,6--163".
16. Androsten-3,17-dion, Schmp. 132-133".
17. Epiandrosteron, Schmp. 172-174'.
18. Pregnendiol, Schmp. 209-211".
19. Pregnenolon, Schmp. 188".
20. 16-Dehydropregnenolon, Schmp. 214-216".
21. 7-Ketocholesterylacetat, Schmp. 163-165".
22. Athinylandrostendiol, Schmp. 240-241".
23. ,,a"-SpineStapin (Prof. Dr.Uraf, Tiibingen), Schmp. 166---1Bs0****).
Folgende Priiperete wurdem selbst hergestellt :
24. Epicholeaterin qach Fieaerm). Bus 20 g Cholestarin erhielten wir 1,l g des Komplexes BUE Epicholestern und A 4-CholeSten-6B-ol-3-on. Daa Aufspdhn des Komplexea
erfolgte abweichend von den Angaben iiber eine mit Hieeelgel 0,2-0,6 mm ,,Merck" beBohickte Siiule (Liinge 48 cm, lichter Durchmeaser 1,6 om) mitteh Benzol/Petrolither/
Chloroform/Aceton (40 : 40 : 17 : 3). Wir erhielten 6 Frektionen mit folgenden Schmp. :
I: 130-134";
,II:130-134";
III: 138-137";
IV: 136137";
V: 128-132";
VI: 129-131".
Die Ausbeute betrug 0,46 g Rohepicholesterin. Nach 2mtlligem Umkriatallieieren &us
J e . Methanol Schmp. 140".
26.-26. Aoetate von Cholesterin und Epicholeatarin: Die Sterine d e n in iiblicher
W e b zusernmen mit Acetanhydrid und wasserfreiem W d i n verestert. Cholesteryhcetat
Schmp. l14-116°; Epicholeshrylmtat Schmp. 84-86".
27. 7-Ketocholesterin, Schmp. 161-163", durch Vereeifen von 7-Ketocholesterylacetat.
*) Das Bestimmen der Schmp. erfolgte im Apparat nach Linstrdm.
**) 4.-7. (Prof. Dr.Bergmunn, The Hebrew University, Jernmlem, Israel).
***) 14-22. (~SchringA. ff., Berlin).
****) FIir das vberlaasen der Prbparate Nr. 4-23, die zum Gelingen dieser Arbeit erheblich
beigetragen haben, sei an dieser Stelle allen Spendern nochmals henlichst gedankt.
88)
L.F. Fieaer, J. Amer. chem. Soc. 75,4377 (1953).
AnnchrUt: Prof, Dr. C. H. Brleukorn, 87 Wllrzburg, EoellikmtraBe 2.
[Ph 0111