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300. Ed.
1!367/4
N-Meth yl-pyridinium-2-aldozim-Salze v. Phosphoreuureestern
363
G. K u h n , G. W. F i s c h e r und Kh. L o h s
Synthese, Toxizitat und Cholinesterase-Hemmwirkungvon
N-Methyl-pyridinium-2-aldoximSalzen insektizider
Phosphorsaureester
Aus dem Institut fur Pharmakologie und Pharmazie der T’eterinitrmedizinischen Fekultat der
Humboldt-UniversitBt zu Berlin und dem Institut fur Biophysik der Deutschen Akademie der
Wissenschaften zu Berlin, Berlin-Buch
(Eingegangen am 9. September 1966)
Phosphorsaureester rnit ausgepragtern Alkylierungsvermogen werden durch
2-Pyridin-aldoxim-methojodid
(2-PAM)zu N-Methyl-pyridinium-2-aldoximphosphaten (11)entalkyliert. Die Toxizitit der BUS den Insektiziden Trichlorphon, DDVP und Methyl-Parathion erhaltenen Phosphate IV, VI und VIII
wurde an Albinomausen, die Cholinesterase-Hernmwirlrung an Rindererythrozyten bestimmt.
Insektizide Phosphorsaureester mit niedriger Warmbliitertoxizitat haben in der
Veterinarmediziii zur Bekampfung von Ekto- und Endoparasiten zunehmend an
Bedeutung gewonnenl). Als besonders geeignet erwiesen sich vor allem Praparate
auf Basis des O,O-Dimethyl-(l-hydroxp-2,2,2-trichlorathyl)-phosphates
(Trichlorphon, Dipterex), die auf Grund der geringen Toxizitat des Wirkstoffs (LD,, Ratte:
225 mg/kg intraperitoneal, etwa 600 mg/kg oral, 2000 mg/kg kutan;.LD5, Maus:
650 mg/kg intraperitoneal, 660 mg/kg oral) im groBen Umfang zur DasselfliegenIarvenbekampfung2) sowie zur Bekampfung von Magen- und Darm~viirmern~)
eingesetzt merden.
Mogliche Intoxikationen bei der Trichlorphon-Therapie lassen sich durch Cholinesterase-Reaktivatoren wie Pyridin-2-aldoxim-methojodid(2-PAM) beheben, wobei die Antidotwirkung durch zusatzliche Atropingabe noch erhoht werden kann4).
Zur Verbesserung der allgemeinen Vertraglichkeit wird auch die kombinierte Anwendung von Wirkstoff und Antidot empfohlen5). So enthalt das Injektionspraparat
, , B u b u l i n “ neben Trichlorphon 0,5% 2-PAM und 0,15y0Atropinsulfat6).
Da andererseits bekannt ist, daB verschiedene Phosphorsaureester (z. B. Sarin)
mit Pyridinium-aldoximen zu hochtoxischen Verbindungen mit starker Cholin-
>
l)
G. Schruder, Die Entwicklung neuer insektizider Phosphorsaureester, Terlag Chemie, Wein-
heim/BergstraBe 19ti3.
tier%rztl.Wschr. 63, 64, 429 (19%); 66, 549 (1969); 67, 558 (19GO);
Vet.-med. Nachr. 1961, 41.
3, E . Endrejut, Vet.-med. Nachr. 1962, 73; L. Sehrag, ebenda 1964, 97; K . Neubrund, ebenda
1964, 239.
4, I . B. Wilson und 3’. Sondheimer, Arch. Biochem. Biophysics 69, 465 (1957); I. 12. Wilson,
Biochem. biophysica Acta 27, 196 (1955); H . Kewitz, Klin. Wschr. 35, 521 (1957).
5, E.-A. Miekel, W . Haupt und H . Richter, Mh. TeterinBrmcd. 16, 569 (1961); J . A . Schulz
und W . Priboth, ebenda 18, 172 (1963).
6, Tierarzneimittelverzeichnis, TER Gustav Fischer \*erlag, Jena 1964.
*) 6 . Rosenherger, Dtsch.
Archiv der
R u h n , F i s c h e r und L o h s
364
Pharmazie
esterase-Hernmwirkuiig reagieren7), interessierten uns inogliche Reaktionen von
2-PAM mit Trichlorphon und einigen anderen insektiziden Phosphorsaureestern
sowie die Toxizitit und Enzymwirkung der entstehenden Reaktionsprodukte.
A) Uins e t z uiig i n se k t i z i d e r P h o s p h o r s 1u r e e s t e r mi t 2 - P y r i d i n a ldo xi min e t h o j o d i d
Die bislang bekannten Reaktionen von Pyridiiiium-aldoximen (%YAM, 4-PAM,
TMB-4) und anderen Oximen mit Phosphorsaureestern verlaufen meist unter
Phosphorylierurig der Oximgruppe7) s). Wir fanden, daB 2-PAM (I)mit geeigneten
Phosphorsiureestern auch in1 Sinne einer anionischen Entalkylierung zu salz(11)mit intakter Oximgruppe
m-tigen ~-~~etliyl-pyridiniuin-2-aldoxim-phosphaten
z u reagieren verniag :
I
I1
Die skizzierte Reaktioii reiht sich somit in die fur Ester des fiinfwertigen Phosphors typische dlkylieruiig nucleophiler Reagenzien ein, uber die bereits zahlreiches
Ma,t,erialvorliegtg).ErwartungsgemaW werden auch hier die Methylester erheblich
leiahter entalkyliert als die kthyl- und hiiheren Alkylester. Fur die Struktur I1 der
auf diesem Wege dnrgestellten Verbindungen spricht neben der Elemeiitaranalyse
und speziellen Reaktioiieii insbesondere auch die leichte Loslichkeit in Wasser und
Alkohol somie die Unliislichkeit in unpolaren orgaiiischen Solventieii.
Vorerst seien die Umsetzungen folgender insektizider Phosphorsaureester mit,
%PAM niitgeteilt :
0 , O - 1)i me t h y l - ( 1-1) y d r o x y - 2 , 2 , 2 - t r ic h lo r t h y l ) -p h o s p 11at, ( T r i c hlo r phoii, Dipte re x)
Auf die methylierende Wirkung von Trichlorphon wird schon von Schraderl)
veru-iesen: z. B. fuhrt Trichlorphon Kaliumjodid mit guter Ausbeute in Methyljodid uber. In imaloger Weise reagiert Trichlorphon (111)mit 2-PAM (I)beim Erliitzeii in acetoriiseher oder atliaiiolischer Losung uiiter Met,hyljodid-Bildung zu IV,
H,CO,::
I +
P-CH-CC1,
H3CO’
AH
I11
-+
CH3J
+
[
cH=NoHl[ 1
H ~ C O \ ~
P- C H- CC13
@
y
AH
CH3
IV
b,
H. E . l f a c k l e y , C. J I . Stekberg und C’. J . Lamb, Arch. Biocherri. Biophysics 80, 211 (1659);
J . C’. Lamb, G‘. N . Steinberg uiid B. E . Ilnckley, Biochim. Biophys. Acta 89, 174 (19154).
R. E . Hockley uiid 0.0.Ozoei.w, J . org. Chemistry 24, 1120 (19.59); N . Eto und Y . Oshimn,
9,
Agr. Biol. Chem. 2G, 834 (1062).
C. Ndqetng und H . Teichmann, Angew. Chem. 77, 1001 (lYfi5).
?j
300. Bd.
1967,4
N -Meth yl-p yridindum-2-aldoxim-Salze
v. Phosphorsaureelstern
365
einer farblosen, in Wasser und Alkohol leicht, in Aceton, ;ither urid Chloroform
unloslichen Verbindung vom Schmp. 129-130".
Das bei der Reaktion gasformig entweichende Methyljodid kann in Pyridin absorbiert und als Methyl-pyridinium-jodid (Schmp. 118")identifiziert werden.
Fur das unveranderte Vorliegen des Strukturelementes -CHOH-CC1,
in IV
spricht u. a. die Teatsache, daB mit wahiger Silbernitratlosung nach langerem
Stehen oder beim Erhitzen infolge Chlorwasserstoffabspaltung Silberchlorid gebildet wird.
0 , O -Dime t h y 1 - 0 - ( 2 , 2 - d i e hlor - v i n y l ) - p ho s p h a t (DDVP)
Das aus Trichlorphon leicht erhaltliche DDVP (V)l) reagiert in athanolischer
Losung nahezu vollstandig mit %PAM zu Methyljodid und VI:
VI
VI fallt nach der Isolierung zunachst als viskoses 01 an, das nach einigem Stehen
zu farblosen Kristallen voni Schmp. 77-78' erstarrt. Die unversehrte C=C-Doppelbindung der Estergruppe gibt sich, wie beim DDVP selbstlO), durch die leichte
Addition von Brom zu erkennen. Eine waBrige Losung gibt mit Silbernitrat keinen
Niederschlag.
0,O-Dimethyl-0-(p-nitropheny1)-thionophosphat(
Methyl-Parathion,
R o f a t o x)
Methyl-Paration ist als gutes Methylierungsmittel bekannt, das an viele nucleophile Agenzien wie beispielsweise Dimethylsulfid, Thioharnstoff, Triathylamin,
dthylmercaptid u. a. mit Leichtigkeit eine Methylgruppe abgibtll). Reaktionen
mit Jodiden scheinen allerdings noch nicht bekannt zu sein. Mit 2-PAM setzt sich
Methyl-Parathion (VII) beim RiickfluBerhitzen in athanolischer Losung glatt zu
Methyljodid und VIII um:
VIII
VIII erhalt man nach Reinigung in Form blaogelber, fast farbloser Kristall
vom Schmp. 143-144".
10)
J'. X e y e r , K . Hurdebeck, U . Augustiny und C . Beggerow, Arzneimittel-Forsch. 5, 109, 285,
380, 616, 747 (1935).
Archiv der
Pharmazie
K i i h n , F i s c h e r und L o h s
366
Die fur Thionophosphorsaureester bei Alkylieruiigsreaktioiien charakteristische
Umlagerung zur Thiolform lafit sich auch bei VIII durch Fallung des S-Methyl0-(p-nitropheny1)-phosphat-Anionsals Silbersalzll) sowie durch die negative Reiiktion auf Thiono-Schwefel nach Pistschimukai2) eindeutig nachweiseii.
I3) E n z y m h e m m u i i g u n d T o x i z i t a t d e r d a r g e s t e l l t e n N - M e t h y l p y r i d i 11i u ni - 2 -a 1do x i m - p h o s p h a t e
Die Cholinesterase-Hemmwirkung von IV, VI und VIII wurde an Rindererythroan
zyten mittels manometrischer Methoden ( W a r b ~ r g - B p p a r a t u r ) ~
die
~ )Toxizitat
,
Albinomausen durch intraperitoneale Gabe bestimmt. Die LD,,-Werte wurden aus
den Versuchsergebnissen durch Pr~bitanalysenl~)
berechnet.
Die aus 2-PAM uiid Trichlorphon resultierende Verbindung IV erwies sich beziiglich seiner Enzymwirkung im Verdiinnungsbereich von 1,25 x lov8bis 5 x 1 0 V
als vollkonimen inaktiv. I n hoheren Konzentrationen bis zu einer Verdiinnung von
2 x lop3, also bis zu einer 0,2proz. Losuiig, wirkte IV nur gering cholinesterasehemmend. Damit ist seine Enzymhemmung an Rindererythrozyten geringer als
die Invitro-Henimwirkung von Tri~hlorphonl~).
Die Toxizitat von IV an der Maus ist dagegen im Vergleich zu Triehlorphon nicht
geringer geworden. Fur letzteres ermittelten wir bei intraperitonealer Gabe eine
LD,, von 526 mg/kg Maus (Tab. 1).
Tabelle 1
LD,,-Bestimmungen a n der Maus. Intraperitoneale Gabe. Auswertung durchProbitanalysen
Suhstanz
Trichlorphon
Trichlorphon/PAM
(Gemisch 1 : 1)
2-PAM
I
Anzahl
d. Tiere
I
mg/kg
LD50
I
95% Vertrauensgrenze
untere
obere
50
50
526
165
463
148
598
184
32
208
187
232
Mit IV war eine komplette LD,,,-Bestimmung wegen der geringen zur Verfugung
stehenden Substanzmenge nicht moglich. Ein mit 500 mg/kg behandeltes Tier starb
nach 6 Min. (Tab. 2).
Tabelle 2
Toxizitat von I V
Verabreichte Dosis mg/kg
Tod nach Min.
250
-
300
14
350
11
500
6
G. Hilgetag, G. Lehmun7!, A . Xartini, G. Schramrn und H . Teichmann, J. prakt. Chem. 8, 207
(1059).
)
'
1
P. Pistschimuka, J. allg. Chem. 44, 1406 (1912); C. 1913, 1581.
lJ)
R.A w n o n , Pflugcrs Arch. ges. Physiol. 233,486 (1934); K. D.Friedberg und F. Sakai, Dtsch.
Z. gcrichtl. Med. 47, 580 (1958).
l 3 ) L. Cucctllt Sforzu, Grundbegriffe der Biometrie, VEB Gustav Fischer Verlag, Jena 1965.
11)
300. BCI.
1961’4
iV-Methyl-pyridinium-2-aldoxim-Salze
c. Phosphorsaureesterib
367
Die Verringerung der Dosis fiihrte zur Verlangerung der uberlebenszeit. Bei
250 mg/kg wurde die Injektion iiberlebt. Zieht man zusatzlich in Betracht, daB in
IV der Phosphorsaureester nur einen Teil des Gesamtmolekulargewichtesausmacht,
erscheint der SchluB gerechtfertigt, daB IV toxischer ist als Trichlorphon. Auch
das vergleichsweise untersuchte Gemisch aus gleichen Teilen Trichlorphon und
%PAM hat mit 165 mg/kg, bezogen auf die Einzelbestandteile, eine sehr vie1 hohere
Toxizitat als Trichlorphon (Tab. 1). Sie ist sogar groBer als die Toxizitat des 2-PAM,
dessen LD,, wir mit 208 mg/kg ermittelten. I n der LiteratuP) werden bei gleicher
Applikation 223 mg/kg angegeben. Die aus den Letalitatswerten errechneten Probitgeraden fur Trichlorphon, 2-PAM und fur das Gemisch aus beiden gibt die Abb. 1
wieder.
10
20
lag mgikg Korper Few
--
30
dbb. 1. Toxizitbtsbestimmungen an der Maus. Intraperitoneale Gabe yon Trichlorphon
), 2-PAM (- -)
und Gemisch Trichlorphon/2-P14M ((- - - - - -)
(
F
-
.
Zusammenfassend ist festzustellen, daB IV toxischer als Trichlorphon, seine
Cholinesterase-Hemmwirkung jedoch kleiner als diejenige des Trichlorphons ist.
I n analoger Weise wurden Toxizitat und Enzymhemmwirkung des aus 2-PAM
und DDVP erhaltenen Reaktionsproduktes VI gepriift. Eine 50proz. Enzymhemmung wird bei einer Verdunnung von 8,7 x
erreicht. Dies bedeutet gegeniiber
dem DDVP, das als cholinergisch gut wirksame Verbindung die gleiche Hemmwirkung bereits bei einer molaren Konzentration von 8,24 x lo-’ (Verdiinnung
1,82 x 10-7) entwickeltl), eine deutliche Verminderung der Enzymaktivitat.
Die Toxizitat von VI konnte nur groBenordnungsmaBigbestimmt werden. Nach
Tab. 3 liegt sie ungefahr im Bereich von 300 mg/kg. Die LD, des DDVP an der
Ratte betragt bei oraler Gabe 80 mg/kg bei mannlichen und 56 mg/kg bei weiblichen Tierenl).
Tabelle 3
Toxizitiit von V I
Verabreichte Dosis mg/kg
250
250
300
350
350
13
7
10
Tod nach Min.
15)
W . Eochler, Handbuch der Insektizidkunde, 1-EB Verlag Yolk und Gesundheit, Berlin 1965,
8.141.
368
Archiv der
K i i h n , F i s c h e r und L o h s
Pharmazie
VI ist also allem Anschein nach bei einer im Vergleich Zuni DDVP stark abgeschwachten Enzymaktivitiit zugleich auch etwas weniger toxisch als dieses.
Interessante Relationen ergaben sich bei der aus 2-PAM und Methyl-Parathion
gewonnenen Verbindung VIII, deren Enzymhemmwirkung gegeniiber MethylParathion nur in geringemMalje vermindert ist. Eine 50proz.Hemmung der Erythrozyten-Cholinesterase wurde mit Methyl-Parathion bei einer Verdiinnung von
3,63 x
mit VIII bei einer Tierdiinnung von 1,51 x lo-*, d. h. bei der 4,16fachen Konzentration erzielt (Abb. 2).
-5
A
-
I
-3
-L
log d. Vwddnnung der Enayminliibition -+
Abb. 2 . Hemmung der Cholinesteraseaktivitat in Rindererythrozyten durch Metliyl-ParaVIII (0-1 -0)und Gemisch Methyl-Parathion/2-PAM(-- - - -')
thioii (0-o),
Unter Beriicksichtigung des grol3eren Molekulargewichtes von VIII entspricht
dies 34,2O,, der Wirkung von Methyl-Parathion. Ein Gemisch aus gleichen Teilen
Methyl-Parathion und 2-PAM wirkt dagegen in gleicher Weise enzymhemmend \vie
das Methyl-Parathion allein (Abb. 2 ) .
!/
o
@J?Jcg
I
I
10
20
log r n g l k g Korpei-Gew
-
I
30
Abb. 3. Toxizitltsbestimmungen an der Maus. Intraperitoneale Gabe von Methyl-Parathion (--).
VIII (
-), ?-PAM(-. - . -) und Gemisoh Methyl-Parathion/
-
?-PAM (-
- - - -)
300. Bd.
1967!4
N-Methyl-pyridiuium-2-aldoxim-Salze
v. Phosphorsaureestern
369
Im Gegensate zu der nur gering verminderten Enzymwirkung besitzt VIII eine
gegeniiber Methyl-Parathion sehr stark verringerte Warmblutertoxizitat (Abb. 3).
Die LD,, des Methyl-Parathion betrug in unseren Versuchen an der Maus bei
intraperitonealer Gabe 8,2 mg/kg, die LD,, der Verbindung VIII dagegen 342 mglkg
also das 41,7fache (Tab. 4).
Tabelle 4
LD,,-Bestimmungen an der Maus. Intraperitoneale Gabe. Auswertungdurch Probitanalysen
Substanz
Methyl-Parathion
Verbindung VIII
Methyl-Parathion/PAM
(Gemisch 1: I)
I
Anzahl
d.Tiere
49
56
40
I
LD,,
mg/kg
872
342
995
I
95% Vertrauensgrenze
untere
795
327
85
obere
839
356
10,4
Bei Einbeziehung des groljeren Molekulargewichtes entspricht das 2,4% der
Wirkung. Die Toxizitat von VIII an der Maus ist gegenuber Methyl-Parathion also
lOmal starker vermindert als die Enzymhemmung an Rindererythrozyten.
Bei allen drei Verbindungen, IV, VI und VIII, erklart sich die im Vergleich zum
j eweiligen Ausgangsphosphorsaureester beobachtete Toxizitatsveranderung zwa,ng10s mit der Bildung der mindertoxischen entalkylierten Phosphat-Anionen bei
gleichbleibender Toxizitat des Pyridinium-2-aldoxim-Kations. Fur IT bedeutet
dies, ausgehend vom schwach toxischen Trichlorphon, einen Toxizitatsgewinn, fur
VIII dagegen eine drastische, durch die erfolgte Umlagerung zur S-Methyl-Form
noch gleichsinnig beeinfluBte16)Toxizitatsverminderung.
Beechreibung der versuche
(N-Methyl-pyridinium-2-aldoxim)-O-methyl-(
l-hydroxy-2,2,2-trichlorii t h y 1) - p h 0 s p h a t (IV)
1,29 g (0,005Mol) Trichlorphon und 1,32 g (0,005Mol) 2-PAM werden in 20 ml Aceton
12 Std. auf dem Wasserbade am RiickfluD gehalten. Nach dem Erkalten wird das Kristallgemisch abgesaugt und das farblose Reaktionsprodukt von der Hauptmenge des unumgesetzten 2-PAM durch Herauslosen mit Methanol abgetrennt. Fraktionierte Fallung mit
Ather scheidet aus der methanol. Losung zunachst gelbe, jodidhaltige Produkte, zuletzt
die reine, jodidfreie Verbindung ab. Farblose, glanzende Kristalle, Schmp. 129-130".
Leicht loslich in Wasser und Methanol, unloslich in Ather, Aceton und Chloroform.
Cl,Hl,Cl,N,O,P
(379,G)
Ber.: C 31,64
H 3,72
N 7,38
Gef.: C 31,70
H 3,82
N 7,48
(N-Methyl-pyridinium-2-aldoxim)
- 0 - m e t h y l - 0 - (2,2-dichlorvinyl) - p h o s p h a t (VI)
1 , l O g (0,005Mol) DDVP und 1,32 g (0,005 Mol) 2-PAM werden in 20 ml Athanol bis
zur Bildung einer fast farblosen Losung (etwa 6 Std.) am RuckfluB erhitzt. Danach wird
__16)
IV. Perkow, Die Insektizide; Chemie, Wirkungsweise und Toxizitat, Dr. Alfred Hiithig Veriag,
Heidelberg 1956.
Archiv 900. Band, Heft 4
24
370
K i i h n , P i s c h e r und L o k s
Archdv der
Ph armazie
das Losungsmittel i. Vak. abgedampft und der verbleibende olige Ruckstand mehrmals
mit Chloroform gewaschen. Nach Entfernung der letzten Losungsmittelspuren i. Vak. beginnt das viskose 0 1 beim Anreiben kristallin zu erstarren. Parblose, hygroskopische
Kristalle, Schmp. 77-78". Leicht loslich in Wasser, Methanol, Aceton, unloslich in Ather.
C,,H,,Cl,N,O,P
(357,3)
Ber.: C 33,62
H 3,67
N 7,84
H 3,95
N 8,06
Gef.: C 33,82
( N - M e t h y l - p y r i d i n i u m - 2 - a l d o x i m )- S-methyl-0-(p-nitropheng1)-phosphat
(VIII)
1,32 g (0,005 Mol) Methyl-Parathion und 1,32 g (0,005 Mol) 2-PAM werden in 20 mi
k h a n 0 1 8 Std. ruckflieflend erhitzt, wobei gegen Ende der Reaktion eine deutliche Aufhellung der anfangs intensiv gelben Losung eintritt. Danach wird das Losungsmittel i. Vak.
abgezogen, der kristalline Ruckstand rnit Chloroform gewaschen und aus wenig Methanol
mit Ather umgefallt. 1,5 g (83%d. Th.) blaflgelbe, fast farblose Kristalle, Schmp. 143-144".
Leicht loslich in Wasser, Methanol, Athanol, unloslich in Ather, Aceton, Chloroform.
C,,H,,N,O,PS
(385,3)
Ber.: C 43,64
H 4,19
N 10,95
H 4,44
N 11,06
Gef.: C 43,34
B e s t i m i n u n g d e r Cholinest.erase-Hemmwirkung u n d d e r T o x i z i t a t
Die Bestimmung der Cholinesteraseaktivitat erfolgte a n Rindererythrozyten nach der
manometrischen Methode von Ammon mittels Warburgapparatur in der Modifikation von
Friedberg und S a k a P ) , die geringfugig abgcwandelt wurde. Als Substrat befanden sich im
Hauptraum der Troge 1,5 ml einer 0,Bproz. Losung von Acetylcholinchlorid und in der
Anhangbirne 0,5 ml des Enzymprkparates, bestehend BUS 3mal gewaschenen Rindererythrozyten in einer Verdiinnung 1 : 20. Als Losungsmittel und Verdunnungsflussigkeit
wurde eine Mischung aus 10 T. 0,Sproz. NaC1-Losung und 3 T. 1,23proz. NaHC0,-Losung
verwandt. Die Ansatze wurden vor dem Einpipettieren mit einem Gasgemisch aus 5% co,
und 95% N, durchperlt. Nach dem Einpipettieren wurden die Manometer wie ublich mit
dern Gasgemisch durchstromt. Die Arbeitstemperatur betrug 37", die Temperaturausgleichsperiode 10 Min., die Schuttelfrequenz 80 Min. Nach dem Temperaturausgleich wurden Enzyin und Substrat durch Kippen vereinigt und die MeBwerte uber eine Periode von
100 Min. alle 10 Min. abgelesen.
Bei jedem Versuchsansatz wurde die Aktivitat des nicht gehemmten Enzyms in Doppelbestimmungen gemessen. Der Mittelwert aus den zwei Messungen wurde jeweils gleich
lO0yo gesetzt und diente als Ausgangswert fur die Enzymhemmwerte. Die Enzyminhibitoren wurden den Enzympraparaten beim Verdunnen, 30 Min. vor dem Kippen, zugesetzt.
Die angegebenen Inhibitor-Konzentrationen beziehen sich auf die Ansatze nach dem
Kippen. Auch hier erfolgten stets Doppelbestimmungen, die wenigstens in den Konzentrationsbereichen der 50proz. Enzymhemmung mehrfach wiederholt wurden. 2-PAM wurde
der Acetylcholinchlorid-Losung zugesetzt und durch Kippen mit dem Enzym in Kontakt
gebracht.
Die To xi z i t at s b e s t i m m u n g e n erfolgten an Albinomausen gleichen Herkunft, bei
gleicher Haltung der Tiere (Standardfutter). Die Verbindungen wurden intraperitoneal als
Emulsionen oder in Losung jeweils in einem Vol. von 0,l m1/10 g Maus injiziert. Die Ergebnisse wurden durch Probitanalysen unter Berechnung der oberen und unteren 95%Vertrauensgrenzen ausgewertetl4).
Anschrift: Prof. Dr. Kh. Lohs, Berlin-Buch, Lindenberger Weg 70.
[Ph 3601
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