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ardp.19683011002

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Archiv de.r Pharrnazie
und Berlchte der Deutschen Pharmazeutischen Gesellschaft
301. Band
Oktober 1968
Heft
10
5. Johne, D. Qroger und Q. R i c h t e r
Zur Biosynthese von Peganin in Adhatoda vasica Nees *)
Bus dem Institut fiir Biochemie der Wanzen der Deutschen Akademie der Wissenschaften
Halle /hale
(Eingegangenam 2. Februar 1968)
Die nach Applikation von Bernstein&~ue-2,3-~%
und Apfeleiiure-3-14C an Adhatoda vasica Neee erhaltenen Einbauergebnieee in Peganin (I)und die W e r mit
AsparaginSiiure-14C erhaltenen Re~ultate
machen ea wahraoheinlich, daS Aspertat
oder eine nahe verwandte Verbmdung die
unmittelbare Vorstufe der C-Atome 1 und 2
von I ist. Erste Experimenta iiber den
Einbeu von Acetat werden mitgetailt. Hohe
spezifieche Embauraten l i e h sioh nach
Fiitterung von A n t h r a f i ~ r e - ~ ~und
N
Glutamin-(COBNH,) emielen. Dieae Verbindungen liefern offenbar das N-Atom B
dea Alkaloids.
Labelled compounds were adminiitered
to young planta of Adhatoda vasica Neea in
order to clarify the origin of the "non-anthranilic-portion" and the nitrogene of
peganine (I). Feeding experiments with
B U C C ~ ~ ~acid-2,3-W
C
and malio acid-3-1%
are in agreement with earlier obtained resulta with aspcrrtic acid and indicate that
either aspartate or a closely related intermediate is the direct preonraor of the cerborn 1 and 2 of peganine. Probably acetate
providee. carbon atom 3 and 10 of I. Anthranilic acid-16N and glutamine-(CO'6NHI)
am incorporated with high efficiency providing nitrogen atom 9 of the alkaloid.
Das Hauptalkaloid der indischen Acanthacee Adhatoda vasica Nees ist das
Peganin (=Vasicin =I),welches in chemischer Hinaicht besonders von Spcith und
seiner Schule') bearbeitet worden ist. Der groI3te Teil der bisher bekannten Chinazolinalkaloide konnte in hoheren Pflanzen nachgewieeen werden. Untersuchungen
der jiingaten Zeit haben ergeben, daB Chinazoline auch bei Tieren und Bakterien
vorkommen. Der von Schildknecht und Wenneis2) isolierte Arthropoden-Abwehretoff a m Glomeris marginata erwies sich ala 1,2-Dirnethylchinazolon-(4).
Ah Stoffwechselprodukte von Pseudomonas aeruginosa sind von Mann3) 4) 4-Methylchinazoline gefunden worden.
*) H e m Professor Dr. Drs. h. c. K. Motheu danken wir henlich fiir die go0ziigiie Unterstiitzung
dieser Arbeit.
E. Spilth, Mh. Chemie 72, 116 (1939).
2 ) H . Schildkndt und W . 8. W e n d , Z . Naturforschg. 21b. 552 (1966).
8 ) S. Mann, Arch. Mikrobiol. 56, 324 (1967).
4 ) S. Mann, Arch. Hygiene u. Baktariol. 151, 474 (1967).
1)
AmMv 801. Band. Heft 10
4F
722
J o h n e , Q r o g e r und R i c h t e r
Archlv der
Pharmazie
Im allgemeinen wird angenommen, daD als e i n Baustein der Chinazoline Anthranilsiiure (11)in Frage k ~ m m t ~ -Die
~ ) . Beteiligung von I1 an der Biosynthese der
Chinazoline konnte bisher fiir folgende Alkaloide gesichert werden : [email protected])lo),
Glomerin und Homoglomerinll), Arborin12). Die 4-Methyl-chinazoline entatehen
sehr wahrscheinlich im Zuge des Tryptophanabbaues, wobei o-Aminoacetophenon
als Zwischenstufe durchlaufen wird (), Quinazoline pathway L L des Tryptophans bei
Pseudom~nas)~).
Noch nicht vollig geklart ist die Biogenese des ,,Nicht-Anthranilsaureteiles"von I,
also die Herkunft der C-Atome 1, 2, 3, 10 und der beiden N-Atome. Bei unseren
Versuchen zeigte es sich, daD ~-Hydro~yglutarninsaure-a-1~Cund 4-Hydroxyprolin-2-14C unspezifisch eingebaut werden. Auch Putrescin-l,4-14C sowie Ornithin-214C, die zur ,,Glutaminsiiure-FamilieL'
zahlen, sind keine Vorstufen des PyrrolidinRinges von I.
Weiterhin konnten wir nachweisen, daD Adhatoda-Pflanzen nicht in der Lage
sind, Desoxyvasicin in 3-Stellnng zu hydr~xylierenl~)
14). Offenbar wird nicht zuerst das Ringgeriist aufgebaut und nachtraglich hydroxyliert, sondern die Vorstufe
mu0 schon die OH-Gruppe enthalten. Andere Verhaltnisse beobachteten wir nach
Applikation von Asparaginsaure-3-l4C. Der iiberwiegende Teil(- 80 %) der Radioaktivitiit war hier im beim Abbau erhaltenen Glycin, also in den C-Atomen 1 und 2
des Peganins lokalisiert. Ein geringer Teil der Radioaktivitiit erscheint auch in der
Anthranilsaure und denC-Atomen 3 und 10,jedoch ist dieser Befund bei der groDen
Stoffwechselaktivitat der Asparaginsaure leicht zu erklaren16). Die Radioaktivitat
der Asparaginsaure-4-14Cwurde dagegen nur unspezifisch inkorporiert und liefert
also nicht das C-3 von I. Weiterhin fanden wir, dal3 N-Methyl-(14C)-anthranilsame
sowie N-Formyl-(14C)-anthranilsaurenicht in Peganin eingebaut werdenl4). Nach
dem bisherigen Stand der Untersuchungen ergibt sich folgendes Bild: Neben I1 ist
Asparaginsaure (111) oder eine aquivalente Verbindung an der Biosynthese von I
beteiligt. Im Zuge der Synthese werden beide Carboxylgruppen von I11 eliminiert.
Bei dem noch fehlenden C,-Korper handelt es sich vermutlich urn Acetat (Schema 1).
R. Robinaon, The Structural Relations of Natural Products. Oxford University Prees 1955.
E . Lede in: P. Bern/&, Biogenesis of Natural Products, Pergamon Press, Oxford 1963.
') E . Wenkert, Experientia (Basel) 15, 165 (1959).
K . Mothea, W c h . Apotheker Ztg. 106, 1409 (1960).
O) D . [email protected] und K . M o t h , Arch. Pharmaz. 293, 1049 (1960).
l o ) D . &@eyer,5. Johne und K . Mothea, Experientia (Basel) 21, 13 (1965).
11) H . SchildknecU und W . F . Wenmie, Tetrahedron Letters (London) 1967, 1815.
lz) ,
?
&@er
I
.nnd S . Johne, 2. Naturforschg., im Druck.
la)D. &@er, S . Johne und K . M d h , Abh. dtsch. Akad. Wiss. Berlin, KI. Chem. Geol. Biol.,
Jg. 1966, Nr. 3, Akademie-Verlag, Berlin.
14) S . Johne und D . [email protected], Phytochernistry 7 , 429 (1968).
l 5 ) D. Qrcjger, S. Johne und K . Moth,Experientia (Basel) 23.812 (1967).
5,
6,
Sol. Bd.
ZIlr Bw&a
1868/10
Anthranils l u r e (11)
001)
Pwnin in Adhahia 00sica
EssigsBure (IV)
Asparaginstiure (111)
Nea
733
Peganin (I)
Schema 1: MBglicher Weg d e r Biosynthese von Peganin
(Die Bezifferung von I erfolgt nach 1 ) )
Im folgenden wird ilber weitereVersuchezur Klarung der Bioeyntheee dea ,,NichtAnthranilsaure-Tei" von Peganin berichtet.
Nach Flltternng von Bemsteinaiinre-2,3-l4Cfanden wir 53 % der Radioaktivitiit
in den C-Atomen 1 und 2 dee isolierten Peganins (Tab. 1). Die Markierung war Tabelle 1
Einbau v01l Berneteineiinre-2,3-l'C= A;AP~~MUB-W'C
=B
a d Gl~&-l-"C C in Peganin
Spezifische AktivitILt der Abbaupdukte (RdioalrtivitetevMung)
Imp/min/mMol
RadioAt. d. Peg&BpeZ.
Allthrenil-
ninS
8&W0
A2
i,i3.105
10%
2 ~ 1 104
.
18,7 Yo
B2
2,4a. 105
100Y O
3,9. 10'
i , i . 105
9,8 * 10'
89 O/O
c2
100%
Qlycin
(C.1
+ (2.2)
1.3 + c-10
nicht
3estimmt
1597YO
wie zu erwarten - gleic-ig
&hen
&Men beiden Kohlemtoff-Atomen verteilt. Der Einbau konnte iiber Aspartat verlaufen, da Bemsteineiiure durch den
Zitroneneiiurecyclus leicht in OxaleseigSiinre ubergeht, welche durch Aminierung
eu I11 umgeaetzt wird. Ein etiirkerer Einbau (- 72 %) in die C-Atome 1und 2 von I
lielJ aich nach Applikation von Apfelsiinre-3-14C beobachten. Hier war keine Gleiohverteilung der Rsdioaktivitiit eingetreten. Im C-1 waren 26 % und im C-2 46 % der
Radioaktivitiit lokaliaiert. Diesee Ergebnia und die frtiheren Befande der Beparaginsiinre-Experimente 1 4 ) 9 weieen darauf hin, daS offenbar eine umymmetriaohe
Verbindung ale nnmittelbare Vorstufe von I in Frage kommt. Da eine m p m e t r i ache Vorstufe angenommen werden m d , iet noch der Befund eu erkliiren, warum
46.
Arhiv der
J o h n e , G r o g e r und R i c h t e r
734
Pharmazie
nach Aspartat-3-1fC- bzw. Apfehaure-3-14C-Futterungim Peganin die C-Atome 1
und 2 markiert werden. Theoretisch ware nur eine Markierung des C-2 des Alkaloids
zu erwarten. Die Randomisierung (= Verschmierung) der Radioaktivitiit zwischen
den C-Atomen 2 und 3 der Asparaginsiiure bzw. Apfehaure laat sich durch folgende
Reaktionen erklaren : Einmal kann die Asparaginsiiure durch die Aspartase zu
Fumarsiiure und Ammoniak umgesetzt werden. Aus Aspartat kann ferner Oxalessigsiiure entstehen, die via Apfelsaure in Fumarsiiure ubergehen kann. Diese Prozesse
sind reversibel. Das heifit, da13 die bei einer Resynthese aus Fumarsiiure entatehende
Apfehaure bzw. Asparaginsa~rel~C
zu gleichen Teilen im C-2 und C-3 enthalten.
Werden nun diese Verbindungen zusammen mit der urspriinglich gefutterten Vorstufe (Apfelsaure-3-14C bzw. Asparaginsiiure-3-W) in I eingebaut, so sollte man
im C-1 und C-2 des Alkaloids Radioaktivitiit finden, und zwar sollte daa C-2-Atom
stiirker markiert sein als C-1. Dies ist in der Tat der Fall, wie die Ergebnisse der
Abbauversuche zeigen (Tab. 1). Eine ahnliche Radioaktivitiitsverteilung nach
Applikation der oben genannten Verbindungen ist erstmalig von Jmkanicz und
Byerrurn'") bei der Biosynthese des Pyridin-Ringes des Nicotins beobachtet wordeii.
Die restlichen am Aufbau des Pyrrolidin-Ringes beteiligten C-Atome sowie N-11
konnten dem Glycin entstammen. Dies ist jedoch nicht der Fall, wie Futterungsexperimente mit G1ycin-l-14Cergaben (Tab. 1). Uberraschend war hier der auDerordentlich hohe Einbau der Vorstufe in 11.
Die Ergebnisse der Fiitterung von Acetat-l-14C und Acetat-2-14C sind in der
Tab. 2 zusammengestellt. Das nach Acetat-l-l"C-Applikationerhaltene I wurde
Tabelle 2
Einbau von Natri~rnacetat-l-~~C
= A und n'atri~macetat-2-~~C
= B in Peganin
A = spez. Radioaktivitiit dea Peganins 2,6. 106 = lOOyo
B = ~pez.Radioaktivitlit des Peganins 4,51- los Imp/min/mMol
=
100(!,
Spezifische Aktivitiit der Abbauprodukte (Radioaktivitatsverteilung)
Imp/min/mMol
Versuchs.
C-1 ah
2-3 + c-10
dauer 4-Chinazolon- AnthranilOlycin
HCHOnicht
allure
Dimedon
(C-1 + C-2)
beatinini t
(Tage) 3-essigstiure
I
6,6. lo4
1496%
i
1,490 10s
3396
7,06* 103
15.7 0 ;
52,4'/"
unter Verlust von C-3 zur 4-Chinazolon-3-essigsiiureabgebaut. Durch Differeiiz ergibt sich, daS 33% der Radioaktivitiit im C-3 lokalisiert sind (Theorie 100yo).
Beim
la)T.
Y. Jackunicz und R. U. Byerrurn, J. biol. Chemistry 241, 1290 (1960).
301. Bd.
leSS/lO
Zur B & y n t b von Peganin in Adhato&a vaeica Nees
mi
Acetat-214C-Versuchist die gesamte Radiaoktivitiit im C-10 zu erwarten. Durch
Differenz lie0 sich ermitteln, daS im C-3 C-10 etwa die Hiilfte der Radioaktivitiit
lokalisiertist. Ein geringer Teil(14 %) ist in I1 nachweisbar. 33% der Radioaktivitiit
konnten im C-1 und C-2 wiedergefunden werden, wobei eine Gleichverteilung der
Markierung zwischen beiden C-Atomen eingetreten ist. Dies ist auch zu erwarten,
wenn Acetat-2-14C in den Zitronensaurecyclus eingeschleust, in Apfelsaure b m .
Oxalacetat und Aspartat iibergeht und dann in Peganin inkorporiert wird. Ob C-3
und C-10 von I Acetat oder einer aquivalenten Vorstufe entstammen, laDt sich auf
Grund der bisherigen Fiitterungsexperimente noch nicht mit Sicherheit sagen. Die
erhaltenen Resultate sprechen zumindest nicht dagegen. Um die beobachtete Verschmierung der Radioaktivitiit zuruckzudrangen, miissen Eurzzeit-Experimente
durchgefiihrt werden. Weiterhin sei bemerkt, daS bis jetzt noch kein definierter
Alkaloidabbau bekannt ist, um die Radioaktivitiit von C-3 und C-10 selektiv zu
erfassen. Wir sind bisher auf Differenzmessungen angewiesen.
+
Durch Versuehe mit 16N-markiertenVerbindungen sollte die Herkunft der beiden
Stickstoff-Atome von I gekliirt werden (Tab. 3). Nach Applikation von Anthranileiiure-16N wurde eine spezifische Einbaurate von 5,4% erzielt. Diese Einbaurate
liegt in derselben GroDenordnung wie bei den friiheren Versuchen mit Anthranilsaure-(14COOH) (17). Somit erscheint gesichert, daD das N-9-Atom der Verbindung
Tabelle 3
Der Einbau vm.hiedmer 1bN-markimter Verbmdungen in Peganin. Der 15N-VbereohrrS
in den applizierten Verbindungen betrug 62%. Fiittenqsdauer 3 Tage
Appliziert
~~
~~
-
Spezifische Einbaurate (yoI6N)
bemgen a d 1 N-Atom
Peganin isoliert
~
Anthranilsiiure-16N
6 mg
6,4 mg
5.4
Glutamin-(CO1~NH,)
7 mg
3,s mg
3,s
Anthranilsiiureamid-(CO1bNH,)
7 mg
2,8 mg
0,19
I1 entstammt. Eine weitere Stiitze dieser Annahme ist das Ergebnis der [email protected]&Ftitterung. Die Einbaurate liegt hier bei 3,8%. Nun ist bekannt, das
bei der Anthranilsaurebiosynthese der Stickstoff vom Amid-N des ~lutaminegeliefert mird. Noch nicht gekliirt ist die Herkunft von N-11 von I. Anthranilsaureamid-(C016NH2)scheint offenbar nicht in Rage zu kommen, da die Einbaurete
nur 0,19% betmg. Die 3 genannten Verbindungen -den
gleichzeitig an gleichaltrige Pflaeen verfiittert, 80 daB ein direkter Vergleich der Einbauraten gerechtfertigt ist. Endgiiltige Beweise, daD das N-11 von I von der Asparaginsaure geliefert
J o h n e , arogerund R i c h t e r
726
Archiv der
Pharmazle
wird, liegen noch nicht vor. Bei einem orientierenden Versuch an 4 Monate alten
Pflanzen (hier ist schon der groI3te Teil des Alkaloids gebildet) wurde bei Aspartat15N-Fiitterung eine spezifische Einbaurate von 0,84 yo gefunden.
Anmerkung bei der Korrektur :Durch Decarboxylierung von V, Reduktion des 3-Methylund dessen Spaltung mit Snlzchinazolon-(4) zum 3-9fethyl-1,2,3,4-tetrahydrochinazolin
saure gelang es unR, dus (2-10 des Peganins srlektiv als Formaldehyd zu erfassen.
Beschreibung der Vereuche
Applikation d e r markierten Vorstufen
Samen von Adhatoda vasica (Acanthacea) erhielten wir vom Regional Research Laboratory Jammu/Tawi (Indien). Die Aufzucht der Versuchspflanzen erfolgte im Gewiichshaus.
Fiir die Versuche wurden 6-7 Wochen alte Pflanzen eingesetzt. Die markierten Verbindungen haben wir in H,O gelost und pro Pflanze etwa 2 ml Liisung iiber die Wunel
appliziert. Pro Versuch verwendeten wir 6-10 Pflanzen.
= 9,62. 10'
Folgende Verbindungen wurden verfiittert: 1.10 mg Bern~teinSiiure-2,3-~%
Ipm; 2. l00p C DL-Apfelsiiure-3-14C 19.8 mg L(-)Apfeleiiure; 3. 7,Q mg Glycin-l-"C
= 3,26 10' Ipm; 4. 20,6 mg Natriumacetat-1-W = 8,7 lo7 Ipm; 6. 12,2 mg Natrium7.7 mg Gl~tamin-(CO~~NH,);
a ~ t a t - 2 - ~=
% 1,57 1W Ipm; 6.6 mg Anthranilsii~re-~~N;
8. 7 mg Anthranilsiiureamid-(C016NH,).
-
+
.
.
I s o l i e r u n g d e s Alkaloids
Daa getrocknete und gemahlene Pflanzenmaterial haben wir nach Anfenchten mit
10proz. Ammoniak im Soxhlet emchopfend mit Chloroform : Ieopropanol(3 :1)extrahiert.
Die Reinigung des Alkaloids erfolgte durch DC (Kieselgel G ,,Merck") Liisungemittelsyeteme: 1. CHCl, : Methanol : Eisessig (75 : 20 : 6); 2. CHCl, :Methanol (3 : 1). Die quantitative Bestimmung wurde mit Tropiiolin 00 durchgefiihrtl?).
A b b a u d e s P e g a n i n s (Schema 2)
Radioaktives Alkaloid haben wir mit inaktivem I verdiinnt und bis zur konstanten
spezifiichen Radioaktivitiit umkristalliiiert (bei den 1%-Versuchen). Zum Abbau (in Anlehnung an la)) wurden etwa 150-200 mg I eingeaetzt. I haben wir in Aceton gel6et nnd
(V) lieD
rnit KMnO, oxydiert. Die entatandene 4-0~0-3,4-dihydrochinazolyl-3-essigsiiure
sich bei pH 2 mit Ather extrahieren. Die kristalliie Substanz wurde rnit kaltam CHCI,
gewaschen und im Hochvak. sublimiert. Schmp. 237". Die Reinheitekontrolle erfolgte
durch DC. Mobile Phase: CHCl, :Methanol : Eieesaig (86 :16 :3); Detektion rnit Joddampf. Durch Vereaterung mit Dammethan erhielten w i ~den Methylester (VI) der Chinazoloneasigsiiure (V). Die Spaltung des Esters (VI) erfolgte durch Erhitzen (30 %.) rnit
20proz. Kalilauge unter Stickstoff. Die entatandene I1 haben wir bei p H 3 rnit Ather
extrahiert und mehrfach durch DC gereinigt : Kieselgel Q ,,Merck", ,,tLlkaliiche" Platten.
Liisungsmittelsysteme: 1. CHCl, :Methanol :Eieeseig (86: 13:2); 2. Athylacetat :konz.
Ammoniak :Jsopropanol (40: 20 :36). Zur weiteren Reinigung kann im Hochvak. subli-
Gr6gcr und 8. Johne, Beitrkge zur Biochemie und Phyeiologie yon Xaturstoffen. b'estschrift K. M o t h , VEB Gustav Fischer Verhg, Jene 1966.
la) E. 8pcith und E. Nikoroils, Ber. dtsch. chem. Ges. 67.45 (1934).
17) D.
301.
Bd.
Zur Bioeynthe von Peganin in Adhatoda vaeica Nea
lea8ilO
737
miert werden. Die quantitative Bestimmung wurde nach l9) durchgefiihrt. Die glycinhaltige Usung wurde zur Entselzung iiber Dowex 50 (H') gegeben und die Aminosiiure
mit n NH, eluiert. Die weitere Reinigung erfolgte durch DC: Kieaelgel G. Liisungsmittelsysteme: 1. Athanol (70%) ; 2. n-Butanol : Waseer : Eisessig (4 : 1 : 1). Zur Elution
diente jeweils daa erete Laufmittel. Die quantitative Bestimmung dea Glycins (VII) erfolgte
in Anlehnung an
Einen aliquoten Teil dea Glycins haben wir mit Ninhydrin umgesetzt
und den entstandenen Formaldehyd (= C-2 der Aminosiiure) ale Dimedon-Derivat kristallin
crhalten. Die Umkristallisation erfolgte aus verd. Athanol, Schmp. 189".
0
V : R = COOH
VI: R = COOCHs
I
1
0
..
Nlnhydrin
I
HCHO-Dimedon
4
VII Glycin
I1
Schema 2: Abbau von Peganin
Menmethoden: Zur W-Bestimmung diente der MethandurchfluDziihler der Firma
Frieaecke und H6pfn.m. Die 16N-Baetimmungenerfolgten nach 81).
D. Qrwer, K . M o t h , H.Simon, H.Q. F'loea und I . Weygand, 2.Naturforsch. 16b, 432 (1961).
R. Krriger, Helv. chim. Acta 32, 250 (1949).
81) D. blunache, Kernenergie 8.32 (1965).
19)
*O)
-
. ...
Ansohrift: Dor. Dr. D. Oager, Halle/Saale. Weinbergweg.
[Ph 6681
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