На правах рукописи Николаев Алексей Алексеевич КЛИНИКО - МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ У ЖИВОТ НЫХ ПОСЛЕ СПЛЕНЭКТОМИИ И АУТОЛИЕНОТРАНСПЛАНТАЦИИ 06.02.01 - Диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандида та ветеринарных наук Москва - 2017 Работа выполнена в ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии — MBA имени К.И. Скрябина» Научный руководитель: Байматов Валерий Нурмухаметович доктор ветеринарных наук, профессор, заслуженный деятель науки РБ, профессор кафедры общей патологии имени В.М. Коропова ФГБОУ ВО «Московская государственная ветеринарная академия ветеринарной медицины и биотехнологии MBA имени К.И. Скрябина» Официальные оппоненты: Жуков Алексей Петрович доктор вете ринарных наук (06.02.01), профессор кафедры внутренних незаразных бо лезней ФГОУ ВО«Оренбургский госу дарственный аграрный университет», профессор Маннапова Рамзия Тимергалиева доктор биологических наук (06.03.01), профессор кафедры микробиологии ФГБОУ ВО «Рос сийский государственный аграрный университет-ТСХА», профессор Ведущая организация: ФГБОУ ВО «Башкирский государственный аграрный университет» Защита диссертации состоится «03»октября 2017 г. в 13 часов на заседа нии диссертационного совета Д 220.042.02 при ФГБОУ ВО «Московская госу дарственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии — MBA имени К.И. Скрябина» по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23, тел.: (495)377-93-83. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии — MBA имени К.И. Скрябина» по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23 http://mgavm.ru/. Автореферат разослан « ______»____2017 г. и размещен на сайте ВАК РФ. Ученый секретарь диссертационного совета Д 220.042.02, кандидат ветеринарных наук, доцент 2 П.Н. Абрамов ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Селезенка - основной орган фагоцитарной ак тивности, бактериальный фильтр крови элиминирующий поврежденные эритро циты, лейкоциты, тромбоциты и чужеродные элементы. Она принимает уча стие в процессе свертывания крови, подавляет аутоиммунные процессы, вы полняет функцию дифференцировки лейкоцитов и образования антител, тетра пептида тафтсина. За последние годы исследователи обогатили сведения о структуре селезенки, иммунном и цитокиновом ответе в норме и патологии [Озерный Е.В., 2017; Rose А.Т., Newman M.I., Debelak J. et al., 2000; Power R.E., Kay E.W., Bouchier-Hayes D., 2002; Knezevic S., Stefanovic D., Petrovic M , Djordjevic Z., Made S., Artiko V., Milovanovic A., Popovic M.A., 2002]. Повре ждения селезенки сопровождаются кровопотерей, что способствует широкому распространению спленэктомий [Тимофеев С.В., 2006, 2008; Позябин С.В., 2006.. .2012; Кузьмичева Е.В., 2008; WhiteS.A. et.al., 2000; Ohanaca Е.С., 2001. Спленэктомия показана при гематологических и аутоиммунных заболевани ях, спленомегалии различного генеза, опухолях, инфарктах селезенки [Popo vic М. et.al., 1997]. Описано состояние организма и его иммунной системы после спленэктомии, названное послеспленэктомическим гипоспленизмом, проявляю щимся снижением общего тонуса, работоспособности, эмоциональной лабильно стью, развитием стойкого тромбоцитоза и моноцитоза, снижением фагоцитарной активности лейкоцитов [Григорьев Е.Г., Апарцин К.А. и др., 2001; Позябин С.В., 2006.. .2012]. У спленэктомированых животных имеется риск развития крипто генного сепсиса с коротким и неспецифическим продромальным периодом. Затем следуют септический шок и симптомы диссеминированного внутрисосудистого свертывания крови [Черненко Н.В., 2006, 2008]. Наблюдений по аутолиенотрасплантации невелико, не разработан алгоритм диагностических мероприя тий у разных видов животных. В последние годы начато изучение возможности пересадки эмбриональной селезеночной ткани в экспериментальных моделях. В частности, предлагается ксеногенная и аллогенная трансплантация на лабора торных мышах [Галибин О.В. и др., 2001; M ko I. et al., 2001]. Однако до настоя щего времени функционирование систем, органов и тканей после спленэкто мии остаются не конца невыясненными. Все вышеизложенное свидетельствует об актуальности изучения проблем распознавания заболеваний селезенки, ее спленэктомии, пост спленэктомического синдрома, лечения животных с помощью аутолиенотрансплантации. Цель настоящего исследования - разработать модель аутолиенотранс плантации у крыс, собак после спленэктомиии и на этом основании устано вить клинико-морфологические изменения. В соответствие с этим были поставлены следующие задачи: 3 1. Провести спленэктомию и определить клинико-биохимические измене ния в организме крыс и собак. 2. Установить структурно-функциональные изменения организма крыс и собак после резекции селезенки. 3. Воспроизвести различными методами аутолиенотрансплантацию у крыс. 4. Изучить отдаленные клинико - морфологические последствия аутолиенотрансплантации на организм животных. Научная новизна. Представлены новые данные о состоянии организма крыс и собак после спленэктомии и аутолиенотрансплантации. Проведены ис следования по оценке сравнительной эффективности методов аутотрансплан тации селезенки у крыс. Показана несостоятельность у крыс, после спленэкто мии и аутолиенотрантации, клеточного иммунитета из-за видовых особенно стей кроветворения и нарушения функции мононуклеарномакрофагальной си стемы. Выявленные клинические, гематологические, биохимические, морфоло гические изменения в организме животных позволяют рассмотреть особенно сти механизма структурно-функциональных перестроек после спленэктомии и аутотрансплантации у крыс и собак. Показано влияние спленэктомии на орга низм собак, декомпенсация защитных механизмов у крыс, что коррелирует с методами аутолиенотрансплантации и продолжительностью жизни животных. На основании гистологических, биохимических исследований выявлена вариа бельность в формировании гемомикроциркуляторных структур во внеорганных образованиях селезеночной ткани - спленоидах у крыс и собак. Теоретическая и практическая значимость. Научно обоснована и экс периментально подтверждена эффективность методов аутотрансплантации се лезенки у животных различных видов, основанная на изучении клинических, гематологических, биохимических и морфологических особенностей. На кры сах разработаны патологические модели для изучения неспецифической и спе цифической резистентности при сепсисе. На основании результатов исследова ний предложена методика для базы дальнейших исследований и совершенство ваний методов повышения резистентности организма и аутотрансплантации. Основные положения, выносимые на защиту. 1. Универсальность спленэктомии и различие ответной реакции у живот ных. 2. Клинико-морфологические особенности послеоперационного периода у крыс и собак после спленэктомии. 3. Структурно-функциональная характеристика в организме крыс с разлиными методами аутолиенотрансплантацией селезенки. 4. Сравнительная эффективность методов аутолиенотрансплантации селе зенки у крыс и патологическая модель септических процессов. Методология и методы исследования. 4 Моделирование патологических процессов у крыс проводили современ ными методами, что позволило контролировать их генез. Клинические, биохи мические, морфологические методы отражают состояние организма животных при постспленэктомическом синдроме. Доказана видовая особенность в генезе тромбоцитоза, лейкопении и эритропении после аутолиенотрансплантации. По лученные данные являются базой для возможной оценки эффективности лекар ственных средств. Апробация работы. Основные положения работы доложены, обсуждены и одобрены: на научной конференции молодых ученых ФГОУ ВПО МГАВМиБ имени К.И. Скрябина [Москва, 2012]; XX Международном ветеринарном конгрессе [Москва, 2012]; Международной научно - практической конферен ции: Современная наука: теоретический и практический взгляд, [Уфа, 2014]; Международной научной конференции: Современные аспекты сельскохозяй ственной микробиологии, М.: РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева [Москва, 2016]; расширенном заседании кафедр: МГАВМиБ- MBA имени К.И. Скряби на [Москва, 2017]. Производственные испытания проходили на базе СББЖ г. Москвы. Внедрение результатов исследований. Диссертация выполнена в рамках научно-исследовательской работы и внедрена на кафедре ветеринарной хирур гии ФГБОУ ВО МГАВМиБ - MBA имени К.И. Скрябина. Разработанные мето дики лечения используются в СББЖ г. Москвы. Публикации. По результатам исследований опубликованы 6 научных ра бот, 2 из которых в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 135 страни цах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, соб ственных исследований (результатов исследований, обсуждения результатов исследований и заключения), выводов, практических рекомендаций, списка ли тературы, включающего 200 источников, из которых 78 зарубежных изданий, иллюстрирована 69 рисунками, 22 таблицами. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материал и методы исследования Исследование проводили на базе кафедры общей патологии имени В.М. Коропова ФГБОУ ВО МГАВМиБ - MBA имени К.И. Скрябина. Для проведе ния экспериментальных исследований было использовано 108 беспородных белых лабораторных крыс и 15 собак [10 опытные и 5 - контрольные]. Клинические исследования проводили по общепринятой методике. В день операции проводили осмотр животных: измеряли температуру тела ректально, подсчитывали частоту сердечных сокращений и число дыхательных движений в минуту. Операционное поле готовили путем выбривания волосяного покрова с вентральной брюшной стенки, с последующей обработкой 10% - ным раство ром йода. Гематологические исследования проводили на автоматическом гематоло гическом анализаторе марки ABCVET [Франция], BC-2800Vet Mindrey, количе ство эритроцитов крови определяли в камере Горяева [по общепринятой мето 5 дике]. Биохимические исследования проводили на анализаторе Random AcessA15 [BioSystems,USA]. Морфологические исследования выполняли на базе лаборатории ВЕТТЕСТ [г. Москва]. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, по Ро мановскому - Гимза. Микроархитектонику тканей изучали с использованием микроскопа ок. 8,10 и об. 10, 40. Патоморфологические исследования проводили на кафедре общей пато логии имени В.М. Коропова ФГБОУ ВО МГАВМиБ - MBA имени К.И. Скря бина. Методика выполнения спленэктомии заключалась в следующем: для наркоза исрользовали препарат золетил из расчета 4-8 мг/кг массы тела жи вотного внутривенно. Лапаратомию выполняли по белой линии живота, каудальнее мечевидного хряща с соблюдением правил асептики и антисептики. Далее селезенку извлекали из брюшной полости, фиксировали, лигировали желудочно-селезеночную связку и резецировали [ Позябин С.В.,2012] . Лапаротомную рану у крыс ушивали послойно узловатым швом. Опыты по спленэк томии и аутолиенотрансплантации проводили на 5 группах животных: 1 - кон трольная [п = 10]; 2- после удаления селезенки [п = 10]; 3- со свободной аутолиенотрансплантацией в перитонеальную полость [п = 10], 4 - с подшиванием к мышцам живота [п = 10] и 5 - с подшиванием к сосудам брыжейки [п = 10]. У каждого животного до опыта, а затем на 1,7,14 и 21 сутки проводили термомет рию тела, подсчитывали пульс и количество дыхательных движений. Отбирали пробы крови для биохимических исследований. После завершения экспериментов животных подвергали эвтаназии в соответствии с Хельсинской декларацией Все мирной медицинской ассоциации [2013]. Далее проводили патологоанатомиче ское вскрытие, оценивали состояние паренхиматозных органов, определяли их массу путем взвешивания на электронных весах [SCL-300, Россия], с точностью до 0,001 г. Для проведения гистологического исследования брали образцы орга нов, фиксации в нейтральном формалине, заливали в парафин, готовили на мик ротоме гистологические срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином и анализировали при различном увеличении под микроскопом. Фотосъемку гисто логических препаратов проводили с использованием цифровой камеры. Стати стическую обработку данных выполняли при помощи общепринятых методов с оценкой достоверности полученных результатов исследований по трем поро гам вероятности и критериям достоверности по Стьюденту. Для достижения данных целей использовали пакет «MS Excel» для компьютера «Pentium - 4». РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБ СУЖДЕНИЕ 1. Клинико-биохимические изменения у крыс после спленэктомии Полученные данные показывают, что спленэктомия не безразлична для организма и после нее развивается обычная клиническая картина послеопера ционного синдрома. У животных на 1 - 2 С° градуса повышаются температура тела, на 12 - 30% от нормы частота сердечных сокращений и дыхательных 6 движений [рис.1 - 3]. Животные первой и второй серии опытов находясь в ви варии принимали корм, активно передвигались. -♦-кошрольная группа -•-крысы после сгиенэктомии 1 день Здень 7 день 11 день 15 день 21 день Рис. 1. Температурная кривая у крыс после спленэктомии -♦-контролъная группа -•-крысы после сгиенэктомии Рис.2. Частота сердечных сокращений у крыс после экстирпации селезёнки 7 100 контрольная группа 80 -•-крысы после сплеюктомии 60 40 20 1 день Здень 7 день 11 день 15 день 21 день Рис. 3. Изменение частоты дыхания у крыс после спленэктомии Результаты опытов показывают, что эктомированные селезёнки у крыс, в разных сериях опытов, по массе, длине и ширине достоверно не отличались. Более существенные изменения после спленэктомии происходят в крови крыс. Результа ты гематологических исследований представлены в [таб.1]. 1. Показатели крови у крыс Показатели Гемоглобин, г% Контрольные крысы (М±ш) 14,12± 2,44 Опытные крысы (М±т) 15,02± 3,21 Эритроциты, 10 /л 4,84 ±0,52*** 8,43 ± 2,30 Лейкоциты, 109/л 17,61± 2,12* 13,22± 1,47 Лимфоциты,% 53,52± 4,15* 70,30± 5,68 Нейтрофилы,% 17,94± 1.43** 27,10± 3,46 Примечание: *р=0,05, **р=0,01, ***р=0,001 У животных опытной группы в показателях крови выявлен дисбаланс между форменными элементами крови. Содержание гемоглобина в начале 8 опыта имело тенденцию к снижению, вместе с тем, количество эритроцитов, лимфоцитов, нейтрофилов достоверно снижалось на фоне выраженного лей коцитоза. На 21 сутки наблюдений лейкоцитоз сменялся на лейкопению, а другие показатели снижались еще значительнее [табл.2 - 3] и даже в отдален ные периоды (на 210 сутки опыта) не происходило изменения их уровня. 2. Гематологические показатели крыс на 21 сутки после спленэктомии Показатели Опытные крысы (М ± ш) Контрольные крысы (М ± ш) Гемоглобин, г% 11,28± 1,89* 16,12± 2,22 Эритроциты, 1012/л 5,03 ±0,84** 9,04 ± 1,90 Лейкоциты, 109/л 8,14± 1,95*** 14,33± 2,05 Лимфоциты, % 42,32± 3,49** 67,20± 4,09 Нейтрофилы, % 16,73± 1.55* 24,04± 2,98 Примечание: *р=0,05, **р=0,01, ***р=0,001 З.Гематологические показатели крыс на 210 сутки после спленэктомии Показатели Опытные крысы (М ± ш) Контрольные крысы (М±т) Г емоглобин, г% 12,59± 1,89* 15,76± 2,40 Эритроциты, 10 /л 5,18 ±0,92*** 9,19 ± 1,50 Лейкоциты, 10% 6,94± 0,98*** 14,20± 2,01 Лимфоциты, % 40,03± 2,37*** 65,10± 3,17 Нейтрофилы, % 18,33± 1.66*** 27,00± 2,13 Примечание: *р=0,05, ***р=0,001 Примечание: * достоверно по сравнению с контролем, р < 0,05; *** р < 0,01 9 Биохимические показатели крови у крыс также подвергаются вариабель ности. Из таблицы 4 видно, что на 21 сутки опыта биохимические изменения в крови сопровождаются гиперпротеинемией, гиперальбуминемией, гипербилирубинемией, в отдельные периоды увеличением АЛТ, ACT, щелочной фосфотазы и гипоглобулинемией. В основном, они отражают нарушение функции печени и резистентности организма. 4. Показатели хромопротеидного обмена у крыс (М ± щ) Показатели крови Общий белок,г/л До опыта 68,44 ± 1,45 Через 7 су ток после спленэкто мии Через 14 су ток после сплен эктомии 69,68±1,89 89,41 ± 9,78* 58,01 ±2,97** Через 21 сутки после сплен эктомии 90,82±4,74** Альбумины, г/л 27,87 ±1,74 28,48±1,29 Глобулины, г/л 40,2 ± 1.33 35,2 ± 1,54 Мочевина, ммоль/л 5,58± 0.53 6Д2 ±0,79 6,86 ±0.55 6,84± 0.45 Креатинин, мкмоль/л 58,01 ±2.26 56,11± ЗД7 46,62± 1,85* 64,45±1,83 Общий билирубин, мкмоль/л 8,78±1,57 14,.34±3,21** 8,82 ±1,39 6,22±1,16 Прямой билирубин, мкмоль/л 2,76±0,57 6,68±038*** 4,72 ±0,.26** 3,74 ± 0,53 ACT, нмоль/мл/мин 226,45±5,79 246,43± 6,61 259Д2 ±6,77* 233,83 ±4,24 АЛТ нмоль/мл/мин 59,66± 1,.84 55,01 ±2,95 60,32± 3,83 94,22±1,95** Щелочная фосфотаза, ед/л 162,66±16,2 127,47± 11,86 184,35± 13,71 207,07± 11,28** 25,4 ± 1.54** 6531 ± 1,49*** 2 1,44± 2.46** Примечание: *р=0,05; **р=0,01, ***р=0,001 Изменение функции органов у животных, снижение защитных своств ча сто приводит к осложнениям. При одних и тех же заболеваниях они возникают в 58 раз чаще, чем у животных с сохраненным органом, а летальность в 14 раз выше [Бордуновский В.Н., 1995]. Мы солидарны с этими сведениями и объясня ем их выраженной лейкопенией и гипоглобулинемией. Именно эти изменения обуславливают снижение резистентности животных. 2.Морфологические изменения в организме крыс после спленэктомии. Структурная организация органов у интактной крысы имеет детерминизм и соответствует гистологическим критериям. Одним из важных тестов для 10 оценки органа является состояние гемомикроциркуляторного русла, его видо вые, морфометрические характеристики. В послеоперационный период после спленэктомии нами выявлено изменение структуры паренхиматозных органов и микроциркуляторного русла. Так, в печени после спленэктомии появляют ся макроскопические изменения в паренхиме и стромальных элементах. Све тооптически видно, что они локализованы в перипортальной и перифериче ской зоне. По интенсивности окраски они существенно отличаются. Измене ния в сосудисто-паренхиматозных компонентах печени имеют определенную взаимосвязь, и выраженность уже на 1 0 - 2 1 сутки эксперимента. В этот пе риод у крыс отмечаются локальные дистрофические изменения в гепатоцитах. Архитектоника печени нарушается, отсутствует организация пластинча того строения, появляются вакуоли и зернистость в гепатоцитах. Состояние синусоидных капилляров в дольке варьирует, они несколько увеличены, раз нообразной формы, изменяется толщина стенок сосудов приносящего и дре нажного звеньев по сравнении с контролем. Микроциркуляторное русло пече ни, вероятно, не обеспечивает орган достаточным количеством пластических веществ и возникают структурные изменения. На 21 сутки после операции в печени отмечается лимфоидно - клеточная реакция вокруг центральных вен. В локальных участках паренхимы печени крыс возникают явления проявляющи еся кариопикнозом. В перипортальных зонах отмечаются явления фиброза и возникают септы, несколько суживаются просветы желчных канальцев и про токов. Клинико-экспериментальные данные показывают, что структурно функциональные компоненты почки крыс страдают от спленэктомии еще сильнее, чем в печени. Изменения дистрофического характера касаются как почечных телец, так и проксимальных канальцев. Если в клубочках почечных телец изменяются капилляры, то в проксимальных канальцах преобладают процессы вакуолизации, некроза, появляются просветленные, бесструктурные участки. Причем эти процессы носят не локальный, а тотальный характер. Во круг измененных проксимальных канальцев достаточно лимфоидных клеток, которые располагаются как одиночно, так и скоплениями. В отдельных местах почек обнаружено разрастание нежноволокнистой соединительной ткани и выявлены жироподобные вакуоли. Есть основание полагать, что это ответная реакция организма на общетоксическое действие, которое проявляется в тече ние первых дней после спленэктомии. В миокарде видна существенная де структивная перестройка с гемоциркуляторными расстройствами. В отдельных случаях выражен стаз с диапедезом клеток, а в других дистрофические измене ния кардиомиоцитов и миофибрилл. В кишечнике наблюдается десквамация эпителия, увеличивается количество бокаловидных клеток, слизи с разнооб разными включениями. В ворсинах уменьшается количество лимфоцитов. Вероятно, после спленэктомии в организме происходят сложные аутоиммун ные процессы, связанные с несостоятельностью важных барьеров организма. У крыс возникает интоксикация и микроциркуляторные расстройства крово обращения, снижаются защитные механизмы. Известно, что селезенка обладает большим гемопоэтическим потенциалом, влияет на гемопоэз в костном мозге и 11 выход клеток крови из костного мозга в периферическую кровь [Marques R.G., Petroianu A., Coelho J.M., Portela М.С., 2002]. В ней осуществляется регуляция тромбоцитопоэза и вырабатываются фактор свертывания крови секвестрируя около 30% общего количества тромбоцитов. При постспленэктомическом син дроме количество тромбоцитов может достигать до 1 млн/мкл и приводить к развитию тромбоза вен, конечностей, мезентериальных сосудов, портальной вены и эмболии легочного ствола, вплоть до синдрома диссеменированного внутрисосудистого свертывания. Как видно из приведенных данных, число пе ременных величин по ходу патологии увеличивается. 3. Клинико-биохимические изменения у крыс после аутосплентрансплантции. Для проведения аутолиенотрансплантации нами использованы все этапы подготовки животного и оперативного удаления селезенки, которые описаны ранее. После спленэктомии селезенку промывали физраствором, делили на дветри части и помещали в перитонеальную полость, к мышце или сосудам бры жейки. При первом способе аутолиенотрансплантации у крыс вначале наблю дали гипотермию, животные после наркоза были вялыми в течение нескольких часов, слабо реагировали на внешние раздражители. Через 1 8 - 2 4 часа у них возникала гиперпиретическая лихорадка, животные съеживались, волосяной покров был взъерошен, дыхание и сердцебиение Рис.4.Температура тела у крыс после спленэктомии и аутотрансплантации Ж ^ ± / —♦ — Т е м п е р а т у р а у кры с груп п ы п ■H“ - T e M n e p a T V P d la aiL_. — удаления селезен ки —а г ~ Т е м п е р а т у р а О » <£■ 12 » .» * 9? аутотрансп л а нтации Рис. 5. Динамика сердечных сокращений у крыс после спленэктомии и аутотрансп Д ы хание у кры с контрольной гр у п п ы —• — Д ы хание у крыс после удаления сел езенки ~-я1г— Д ы х а н и е у кры с после а у т о тр а н с п л а н та ц и и учащались. Крысы отказывались от корма, мало двигались, были апатичны ми. В течение 2 - 3 суток крысы этой группы погибали. У вскрых крыс в брюшной полости обнаруживали экссу дат соломенно-зеленого цвета. Внутрен ние органы имели признаки геморраги ческого воспаления, особенно это каса лось кишечника. Крысы других Рис.6. Изменение дыхательных движений у крыс после спленэктомии и аутотрансплантации групп аутолиенотрансплантациию переносили легче. Уже через 1 - 2 часа они начинали реагировать на раздражители. Однако активность животных была снижена, температура тела, пульс и количество дыхательных движений в тече ние первых двух дней были ниже, чем у контрольных животных. Затем все по казатели резко увеличивались и находились на таком уровне до 14-15 суток опыта. Повышение температуры тела отражает интенсивность воспалительной реакции в организме животных [рис.4 - 6]. У животных 3 группы учащался пульс, дыхание и неоднозначно изменялась температура тела. У крыс на 10 сутки после аутосплентрансплантации, независимо от метода, был выражен лейкоцитоз, с нейтрофилией, который наблюдали в течение всего эксперимен та [табл. 5 - 6 ] . В тоже время количество гемоглобина, эритроцитов, лимфоци тов в крови достоверно снижалось. 5- Гематологические показатели крыс на 10 сутки после аутолиенотрансплантации в мышцу (М ± ш) Показатели Опытные крысы (М ± м) Гемоглобин, г% 13,44± 0,98* 15,33± 1,94 Эритроциты, 10 /л 8,12 ±0,89* 9,44 ± 1,15 19,10± 1,95*** 14,11± 0,88 58,29± 2,96 66,30± 5,00 36,73± 2,44* 25,51± 3,08 Лейкоциты, 109/л Лимфоциты, % Нейтрофилы, % Примечание: *р=0,05, ***р=0,001 13 Контрольные крысы (М ± м) 6. Гематологические показатели крыс на 10 сутки после аутолиенотрансплантации к сосудам брыжейки (М ± т) Показатели Гемоглобин, г% Опытные крысы (М±м) 12,95± 1,22 Контрольные крысы (М ± м) 14,87± 1,66 Эритроциты, 1012/л Лейкоциты, 109/л 7,79±0,89 21,44±3,07*** 9,44 ± 1,15 14,92± 1,33 Лимфоциты, % 52,32±4,38* 64,20± 4,62 Нейтрофилы, % 37,04±2,44** 24,99± 3,63 Примечание: *р=0,05; **р=0,01, ***р=0,001 Гемаюлогические показатели крыс на 21 сутки после аутолиенотрансплантации в мышцу сохраняют аналогичную динамику. Количество гемогло бина, эритроцитов снижается при выраженном лейкоцитозе. Гематологические показатели у крыс на 31 сутки после аутолиенотрансплантации в мышцу имеют достоверную разницу по сравнению с контролем. Однако, отмечается незначительный лейкоцитоз, лимфоцитопения и нейтропения в обеих опытных группах. В то же время лейкоцитоз был более выражен у крыс на трансплан тат, находящийся в брыжейке. Анализ биохимических данных показывает, что в эти же сроки происходит сложная перестройка метаболизма [табл. 7 - 8] в ор ганизме животных. . 7-Показатели хромопротеидного обмена у крыс с аутосплентрансплантацией к мышце (М ± ш) Показатели крови До опыта Через 7 суток после спленэктомии Общий белок, г/л 64,21 ± 1,04 68, 86±1,93 Через 14 суток после спленэктомимии 78,41 ± 6,88* Через 21 сутки после спленэктомимии 89,18±3,17** Альбумины, г/л 29,23 ± 2,04 37,46±1,01 68,01 ±4,08*** 66,11 ±3,77*** Глобулины, г/л 34,98 ± 2,04 31,40 ±2 ,39 10,40 ± 0.94*** 23,09± 3.34** Мочевина, ммоль/л 5.58± 0.53 6,32 ±0,79 6,86 ±0.55 6,84± 0.45 Креатинин, мкмоль/л 59,18±4.16 53,22 ± 438 48,55± 3,34* 44,22±5,75* 14 Общий билирубин, мкмоль/л 6,59±0,78 12,.23±2.34*** 17,52 ±3,97*** 16,18±5,01*** Прямой билирубин, мкмоль/л 2,02±0,57 5,88± 3,20*** 5,93 ±3,.15*** 6,14 ± 1,33*** ACT, нмоль/мл/мин 206,01± 3,04 266,20± 4,11** 269,56 ±6,80** 294,18 ±6,44*** АЛТ, нмоль/мл/мин 59,66± 1,84 55,01 ±2,95 60,32± 3,83 177,10± 22,19 178,92± 32,01 Щелочная фосфатаза, 160,66±10,92 ед/л 94,22±1,95*** 199,84± 24,88** Примечание: *р=0,05; **р=0,01 , ***р=0,001 8- Показатели хромопротеидного обмена у крыс с аутосплентрансплантацией к сосудам брыжейки (М ± т) Показатели крови Общий белок, г/л До опыта 69,15 ±3,00 Через 7 суток после спленэктомии Через 14 суток после спленэктомимии Через 21 сутки после спленэктомимии 65,23±3,35 64,09 ±5,15 58,47±2,99* 34,22±4,51 44,22± 3,05** 47Д5 ±5,66*** 1 1,1 2± 2.52*** Альбумины, г/л 30,18 ±2,04 Глобулины, г/л 38,87 ± 1,97 31,03 ±3 ,42* 15,67 ± 1.86*** Мочевина, ммоль/л 5,89± 0.79 4,02 ±0,49* 4,59 ±0.92 3,90± 0.97** Креатинин, мкмоль/л 54,13 ±3.24 52,00 ± 3,55 45,31± 2,53* 51,49±4,13 6,11±0,59 14,.48±5,02*** 15,97 ±2,88*** 19,13±4,77*** 2,26±0,34 5,90±0,97*** 6,23 ±0,15*** 6,99 ± 1,01*** 201,89± 13,93 258,09± 14,21* 296,66 ±11,44** 69,01± 2,84 65,99 ±4,85 74,13±5,90* 152,33 ±14,22 189,44± 19,37* 189,96± 21,10* Общий били рубин, мкмоль/л Прямой били рубин, мкмоль/л ACT, нмоль/мл/мин АЛТ, нмоль /мл/мин Щелочная фосфатаза, ед/л Примечание: *р=0,05; **р=0,01, ***р=0,001 15 300,20 ±26,00** 89,92±7,77** 198,99± 22,00** Выявленные биохимические изменения в крови организма объясняются диспротеинемией: регистрировали гиперпротеинемию, гиперальбуминемию, увеличение АЛТ и гипоглобулинемию, гипербилирубинемию. 4. Морфологические изменения в организме крыс после аутосплентрансплантации. У интактной крысы структурная организация органов соответствует гистологическим критериям. Нарушение полифункциональности селезенки у крыс приводит к полиорганной патологии. Снижение способности к реоргани зации и гемоостатике появляется морфологическими изменениями. Проведен ное нами ранжирование по выраженности патологических изменений в орга нах показало, что на первом месте почка, затем поджелудочная железа, серд це, печень, кишечник. Важно отметить, что во все периоды после аутосплентрансплантации в органах имеются нарушения структуры клеток и гемомикроциркуляторного русла. Так, в печени, после аутосплентрансплантации, макроскопически видна ишемичность, пятнистость. При светооптических исследованиях деструктив ные процессы затрагивают паренхиму, стромальные элементы перипортальной и периферической зон. На 10 сутки опыта отмечаются дистрофические изменения гепатоцитов, нарушается архитектоника дольчатости и пластинча того строения. В гепатоцитах появляются вакуоли, зернистость, отмечается их вариабельность. Просветы синусоидных капилляров в дольке расширяются, толщина стенок сосудов приносящих и дренажных звеньев, в портальных участках, увеличена. Изменения в сосудисто-паренхиматозных компонентах печени имеют определенную взаимосвязь, выраженность, которых прогресси руют к 2 1 - 3 1 суткам эксперимента. В этот период увеличивается лимфоид но-клеточная реакция вокруг центральных вен и в синусоидах. Появившийся экссудат сдавливает дренажные структуры и желчные канальцы. В гепатоци тах крыс возникает кариопикноз, встречается незначительное количество двуядерных клеток. В разных участках возникают септы из нежноволокнисто соединительной ткани. Структурно - функциональные компоненты почки крыс после аутосплентрансплантации изменяются непосредственно после опера тивного вмешательства и усугубляются к 31 суткам опыта. Дистрофические изменения затрагивают в органе почечные тельца и проксимальные канальцы. Диаметр клубочков изменяется и увеличивается просвет в капсуле. В прокси мальных канальцах активируются процессы вакуолизации, накопления угле водно-белкового детрита, некроза, увеличивается количество лимфоидных клеток, которые располагаются как одиночно так и группами. В миокарде де структивная перестройка затрагивает мышечный аппарат и гемомикроциркуляторное русло. Выражен стаз, образуются межклеточные полости, в которых происходит деструкция эмигрировавших эритроцитов и лейкоцитов. Образую щиеся ферменты обуславливают лизис и деструкцию миокарда. Кардиомио циты теряют поперечную исчерченность, исчезают вставочные диски, нередко происходит увеличение межклеточных пространств. В тонком отделе кишеч 16 ника десквамируется эпителий, увеличивается количество слизи и конгло мератов разного размера в ней. Во всех слоях кишечной стенки уменьшается количество лимфоцитов (особенно в ворсинах). Чем ближе к сосудам находят ся подсаженные трансплантаты, тем дольше оказывается срок жизни живот ных. У крыс после аутолиенотрансплантации отмечали случаи спленоза - ком пенсаторной постспленэтомической имплантации селезеночной ткани, что явля ется приспособительной реакцией, эктопической регенерации ткани, замещающей часть удаленной. Светооптическая структура узелков показывает, что в них из меняется красная, белая пульпы, трабекулы. У животных опытной группы уста новлено утолщение капсулы, по сравнению с контролем. Она сформирована за счет коллагеновых волокон и гладких миоцитов. Выраженность различных от делов имплантированной ткани зависит от ее кровоснабжения, особенно в 1-е сутки наблюдений. Крысы, которым трансплантировали селезенку к мышеч ной ткани через 30-40 суток погибают, к сосудам брыжейки через 70-90. Это связано с недостатком иммуномодулирующих и других биологически актив ных веществ - лимфокинов, монокинов, лейкотриенов, иммуноглобулинов, опсонинов, интерферонов, лизоцима, пропердина, что имеет главное зна чение в патогенезе послеопераионного гипоспленизма [Najjar V.A., Nishioka К., 1970; Phillips J.H., Babcock G.F, Nishioka К., 1981; Nishioka К., Wagle J. R., Minter A.M., 1990; Naim J.O., Lanzafame R.J., Van Oss C.J. 1991; Zhang Y., Ma H., Cai Z., 1996 ]. Известно, что селезенка вырабатывает тафтсин - глобулин, который стимулирует фагоцитарную активность нейтрофилов, образование Т- и В-лимфоцитов [Лиарцин К.А., 1995; Nishioka К., 1979; Wleklik М., Рапаsiak W., Luszak М., 1988]. Полученные нами данные позволяют полнее понять клинико - биохимические изменения у крыс после спленэктомии и аутолиено трансплантации, проследить корреляционные взаимоотношения между биохи мическими и морфологическими изменениями. б.Морфофункциональные изменения в организме собак после спле нэктомии и аутосплентрансплантации Исследованные нами собаки достаточно хорошо переносили спленэктомию и аутосплентрансплантацию. Клинические показатели, у них были в пре делах физиологической нормы. Гематологичекие показатели через 8 месяцев после оперативного вмешательства характеризовались тенденцией к снижению количества эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитоз. Биохимические показате ли крови не имели существенных выраженных изменений и были близки к та ковым контрольных животных. Благоприятный исход спленэктомии и ауто сплентрансплантации, по нашему мнению, связан с появлением очагов рези дуальной селезеночной ткани, что детерминировано пролиферативным типом воспаления у собак. Заключение. Нами установлено, что жизнедеятельность крыс с удален ной селезенкой по клиническим, гематологическим, биохимическим и морфо логическим показателям отличается от контрольных. В первую очередь у экс периментальных животных изменяются в сторону увеличения показатели тем пературы тела, пульса и числа дыхательных движений. Особые проявления 17 имеют гематологические показатели, которые после спленэктомии и до 210 суткам опыта имеют дисбаланс по соотношению форменных элементов крови. Эритропения и лейкопения у крыс несет за собой отрицательные последствия: в частности такие животные имеют пониженный обмен веществ, резистент ность и они подвержены различным заболеваниям. Это закономерно, так как по сравнению с нормой, снижается количество лимфоцитов, глобулинов. Наши клинико-экспериментальные исследования показывают, что после аутолиенотрансплантации косвенные показатели состояния иммунной системы у крыс, по сравнению со спленэктомированными, имеют отличия. В данном случае, вероятно, сказывается недостаток активного вещества, вырабатывае мого селезенкой, тетрапептида - тафтсина. Он обладает гормоноподобным, иммуномодулирующим свойством, усиливает резистентность, фагоцитоз, ока зывает действие на моноциты / макрофаги, нейтрофилы, натуральные килле ры, т.е. на все клетки, где есть Fc- рецептор к IgG. Морфологические измене ния в органах крыс, после аутотрансплантации, в различные сроки после операции, продемонстрировали системную ответную реакцию организма. В частности, когда у крыс извлеченную из брюшной полости селезёнку, раз резали на части и снова располагали свободно в брюшной полости - результа ты были отрицательные. Животные переносили оперативное вмешательство, отходили от наркоза, но в течение первых - вторых суток с клиническими признаками гиперпиретической лихорадки погибали. При вскрытии павших животных обнаруживали геморрагическое воспаление кишечника, наличие в перитонеальной полости экссудата, изменение цвета печени. Следовательно, у крыс селезёнка после её удаления и последующего свободного введения в брюшинную полость не отторгается. Кроме того, она, лизируясь, губительно влияет на организм животного. Можно предположить, что была передозиров ка препаратов для наркоза, но препарат и дозы во всех сериях были одинако выми. В литературе отмечается, что через 10-20 минут после введения золетила УЗ - видимых изменений в органах не обнаруживается [Wleklik М., Рапаsiak W., Luszak М., 1988]. Так, в печени изменяется выраженность сосуди стого рисунка и увеличиваются линейные гиперэхогенные структуры (стенки и диаметр каудальной полой вены, отходящих от неё печеночные вены). Визиализируются ранее не определяемые в паренхиме мелкие ветви кровеносных сосудов. Указанные изменения достигают максимума через 30-60 минут после введения золетила, но через 2,5-3 часа они возвращаются к первоначальным значениям. Нам представляется возможным сделать предположение, что ткань селезенки, богатая лимфоцитами, помещенная в брюшинную полость, подвер гается аутолизу. В результате этого образуется большое количество биологи чески активных веществ, в частности интерлейкинов и тафтсина. Временное приживление селезеночной ткани к мышце и сосудам брыжейки происхо дит с формированием структурных элементов, которые не имеют дальнейшего развития и подвергаются некрозу. Нарушение функции мононуклеарномакрофагальной системы, различных барьерных приспособлений организма приводят к повышенному проникновению из крови к трансплантанту пневмококков, 18 ишерихий и других микроорганизмов. Условия некроза и лизиса трансплантан та оказываются благоприятными для перехода асептического воспаления в сеп тическое. Микроорганизмы, эндотоксины, биологически активные вещества первичного очага инфекции с синдромом системной реакции и полиорганной дисфункцией приводят к полиорганной недостаточности и сепсису. У собак процессы аутолиенотрансплантации проявляются достаточно выраженной функциональной активностью спленоида. Таким образом, спленэктомия и аутолиенотрансплантация у крыс и собак проявляется определенными стоха стическими свойствами в организме, но позволяет проводить коррекцию реор ганизации функций в послеоперационный период. Полученные данные являют ся базовыми для сравнительных исследований спленэктомий и аутолиенотрансплантаций у животных разного вида. Заключение 1. После спленэктомии в организме крыс происходят сопряженные, по времени клинические, гематологические, биохимические и морфологические изменениями. Последствием постспленэктомического синдрома является нарушение гемопоэза проявляющегося эритропенией, лейкопенией и де струкцией в сосудисто - паренхиматозных структурах печени, почек, мио карда, кишечника, поджелудочной железы. 2. Архитектоника и структурная организация органов крыс через 21 день после спленэктомии характеризуется развитием дистрофических процессов и перераспределением лимфоцитов в гемомикроциркуляторном русле. В отда ленные периоды постпленэктомического синдрома иммунонобиологические механизмы не обеспечивают полифункциональность селезенки, адаптацию органов и компенсацию утраченной функции. В организме крыс возникает лимфоцитопения, нейтрофилопения, гипоглобулинемия, гиперпротеинемия, гиперальбуминемия, увеличивается ACT, АЛТ и щелочная фосфатаза. 3. Через 7 месяцев после спленэктомии в печени, почках, миокарде, ки шечнике, поджелудочной железе изменяется цитоархитектоника: увеличива ется количество клеток с базофилией ядра и увеличением размеров цитоплаз мы. В перипортальных зонах печени появляются явления фиброза. В почках деструктивные процессы выражены сильнее: преобладает патология почечных телец и проксимальных канальцев с накоплением детрита, а в других органах исследованных органах выражена лимфоидно - клеточная реакция. 4. Аутолиенотрансплантация крысам, в различных модификациях, позволяет проследить системный ответ организма на спленоиды и сформиро вать стратегию клинико-экспериментальных исследований, по купированию септических процессов. Патологическая модель сепсиса, от селезеночного трансплантата, имеет разный генез, варьирует по интенсивности проявления, что обусловлено местом его локализации. Острое течение сепсиса иниции 19 руется аутолиенотрансплантацией в перитонеальную полость; подострое - к мышце брюшной стенки; хроническое - к сосудам брыжейки. 5. Показатели иммунной системы у спленэктомированных крыс значи тельно снижаются после аутолиенотрансплантации, так как нарушается вы работка агранулоцитов. Морфологические и функциональные показатели, в различные сроки после трансплантации, демонстрируют незначительное приживление аутотрансплантированной ткани с формированием структур селезенки. Через 4-5 месяцев прогрессирует лейкопения, гипоглобулинемия, активируется некроз спленоидов, инициируя септические процессы. 6. Собаки с костно - мозговым типом кроветворения значительно лег че, по сравнению с крысами, переносят спленэктомию и аутолиенотрансплантацию. Через один год после оперативного вмешательства морфологические, биохимические показатели крови у них недостоверно отличаются от кон троля. РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ 1.Разработана патологическая модель сепсиса у крыс, моделируемая разными методами аутолиенотрансплантации. Острое течение инициирует аутолиенотрансплантация в брюшинную полость; подострое - к мышце брюшной стенки; хроническое - к сосудам брыжейки. 2. Патологические модели сепсиса можно использовать при апробации и выявлении антимикробной эффективности новых лекарственных веществ. 3. Полученные данные могут быть использованы на клинических кафед рах ветеринарных вузов для учебных и научно-исследовательских целей, а также при написании справочной литературы, монографий и учебников. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ ПУБЛИКАЦИИ В ВЕДУЩИХ РЕЦЕНЗИРУЕМЫХ НАУЧНЫХ ИЗДАНИЯХ ВАК *1. Байматов, В.Н. Клинико - биохимические изменения у крыс после спленэктомии и аутотрансплантации селезенки /В.Н. Байматов, А.А. Николаев//Вестник АПК Ставрополья, 2015, №1. - С.97-100 *2. Николаев, А.А. Показатели крови у собак после спленэктомии/А.А. Николаев// Научно - практический журнал/ Ветеринария, зоотехния и биотех нология, 2016, №6. - С.74 - 77 . ПУБЛИКАЦИИ В ДРУГИХ ИЗДАНИЯХ 3. Гильдиков, Д.И. Влияние спленэктомии на клинико-биохимические показатели у крыс /Д.И. Гильдиков, А.А. Николаев, О.С. Лучкова // Вестник Мичуринского филиала российского университета кооперации, 2013, №3. С .142- 145 20 4. Николаев, А.А. Клинико-биохимические изменения у крыс после аутотрансплантации селезенки/ А.А. Николаев, В.Н. Байматов: Мат. Меж. научно - практич. конф. :Современная наука: теоретический и практический взгляд. - Уфа, 2014. - С.254 - 256 5. Николаев, А.А. Биохимические изменения у крыс после спленэктомии/ А.А. Николаев, В.Н. Байматов: Мат. Меж. научно - практич. конф. : Со временная наука: теоретический и практический взгляд. - Уфа, 2014. - С.256 258 6. Николаев, А.А. Изменение показателей резистентности у крыс после спленэктомии // А.А.Николаев /Современные аспекты сельскохозяйственной микробиологии .- Мат. Международной конференции, М.: РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, 2016.- 59-60 СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ АЛТ - аланинаминотрансфераза ACT - аспартатаминотрансфераза ВОСТ - внеорганные образования селезеночной ткани СОЭ - скорость оседания эритроцитов ЧДВ - частота дыхательных движений ЧСС - частота сердечных сокращений 21
1/--страниц