uploaded 0B2F90303F

На правах рукописи
Николаев Алексей Алексеевич
КЛИНИКО - МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ У ЖИВОТ­
НЫХ ПОСЛЕ СПЛЕНЭКТОМИИ И АУТОЛИЕНОТРАНСПЛАНТАЦИИ
06.02.01 - Диагностика болезней и терапия животных,
патология, онкология и морфология животных
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени кандида­
та ветеринарных наук
Москва - 2017
Работа выполнена в ФГБОУ ВО «Московская государственная академия
ветеринарной медицины и биотехнологии — MBA имени К.И. Скрябина»
Научный руководитель:
Байматов Валерий Нурмухаметович
доктор ветеринарных наук, профессор,
заслуженный деятель науки РБ, профессор
кафедры общей патологии имени В.М.
Коропова ФГБОУ ВО «Московская
государственная ветеринарная академия
ветеринарной медицины и биотехнологии MBA имени К.И. Скрябина»
Официальные оппоненты:
Жуков Алексей Петрович доктор вете
ринарных наук (06.02.01), профессор
кафедры внутренних незаразных бо­
лезней ФГОУ ВО«Оренбургский госу­
дарственный аграрный университет»,
профессор
Маннапова Рамзия Тимергалиева доктор
биологических наук (06.03.01), профессор
кафедры микробиологии ФГБОУ ВО «Рос­
сийский государственный аграрный университет-ТСХА», профессор
Ведущая организация:
ФГБОУ ВО «Башкирский государственный
аграрный университет»
Защита диссертации состоится «03»октября 2017 г. в 13 часов на заседа­
нии диссертационного совета Д 220.042.02 при ФГБОУ ВО «Московская госу­
дарственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии — MBA имени
К.И. Скрябина» по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23, тел.:
(495)377-93-83.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВО «Московская
государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии — MBA
имени К.И. Скрябина» по адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23
http://mgavm.ru/.
Автореферат разослан « ______»____2017 г. и размещен на сайте ВАК РФ.
Ученый секретарь
диссертационного совета Д 220.042.02,
кандидат ветеринарных наук, доцент
2
П.Н. Абрамов
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Селезенка - основной орган фагоцитарной ак­
тивности, бактериальный фильтр крови элиминирующий поврежденные эритро­
циты, лейкоциты, тромбоциты и чужеродные элементы. Она принимает уча­
стие в процессе свертывания крови, подавляет аутоиммунные процессы, вы­
полняет функцию дифференцировки лейкоцитов и образования антител, тетра­
пептида тафтсина. За последние годы исследователи обогатили сведения о
структуре селезенки, иммунном и цитокиновом ответе в норме и патологии
[Озерный Е.В., 2017; Rose А.Т., Newman M.I., Debelak J. et al., 2000; Power R.E.,
Kay E.W., Bouchier-Hayes D., 2002; Knezevic S., Stefanovic D., Petrovic M ,
Djordjevic Z., Made S., Artiko V., Milovanovic A., Popovic M.A., 2002]. Повре­
ждения селезенки сопровождаются кровопотерей, что способствует широкому
распространению спленэктомий [Тимофеев С.В., 2006, 2008; Позябин С.В.,
2006.. .2012; Кузьмичева Е.В., 2008; WhiteS.A. et.al., 2000; Ohanaca Е.С., 2001.
Спленэктомия показана при гематологических и аутоиммунных заболевани­
ях, спленомегалии различного генеза, опухолях, инфарктах селезенки [Popo­
vic М. et.al., 1997]. Описано состояние организма и его иммунной системы после
спленэктомии, названное послеспленэктомическим гипоспленизмом, проявляю­
щимся снижением общего тонуса, работоспособности, эмоциональной лабильно­
стью, развитием стойкого тромбоцитоза и моноцитоза, снижением фагоцитарной
активности лейкоцитов [Григорьев Е.Г., Апарцин К.А. и др., 2001; Позябин С.В.,
2006.. .2012]. У спленэктомированых животных имеется риск развития крипто­
генного сепсиса с коротким и неспецифическим продромальным периодом. Затем
следуют септический шок и симптомы диссеминированного внутрисосудистого
свертывания крови [Черненко Н.В., 2006, 2008]. Наблюдений по аутолиенотрасплантации невелико, не разработан алгоритм диагностических мероприя­
тий у разных видов животных. В последние годы начато изучение возможности
пересадки эмбриональной селезеночной ткани в экспериментальных моделях. В
частности, предлагается ксеногенная и аллогенная трансплантация на лабора­
торных мышах [Галибин О.В. и др., 2001; M ko I. et al., 2001]. Однако до настоя­
щего времени функционирование систем, органов и тканей после спленэкто­
мии остаются не конца невыясненными. Все вышеизложенное свидетельствует
об актуальности изучения проблем распознавания заболеваний селезенки, ее
спленэктомии, пост спленэктомического синдрома, лечения животных с помощью
аутолиенотрансплантации.
Цель настоящего исследования - разработать модель аутолиенотранс­
плантации у крыс, собак после спленэктомиии и на этом основании устано­
вить клинико-морфологические изменения.
В соответствие с этим были поставлены следующие задачи:
3
1.
Провести спленэктомию и определить клинико-биохимические измене­
ния в организме крыс и собак.
2.
Установить структурно-функциональные изменения организма крыс и
собак после резекции селезенки.
3. Воспроизвести различными методами аутолиенотрансплантацию у
крыс.
4.
Изучить отдаленные клинико - морфологические последствия аутолиенотрансплантации на организм животных.
Научная новизна. Представлены новые данные о состоянии организма
крыс и собак после спленэктомии и аутолиенотрансплантации. Проведены ис­
следования по оценке сравнительной эффективности методов аутотрансплан­
тации селезенки у крыс. Показана несостоятельность у крыс, после спленэкто­
мии и аутолиенотрантации, клеточного иммунитета из-за видовых особенно­
стей кроветворения и нарушения функции мононуклеарномакрофагальной си­
стемы. Выявленные клинические, гематологические, биохимические, морфоло­
гические изменения в организме животных позволяют рассмотреть особенно­
сти механизма структурно-функциональных перестроек после спленэктомии и
аутотрансплантации у крыс и собак. Показано влияние спленэктомии на орга­
низм собак, декомпенсация защитных механизмов у крыс, что коррелирует с
методами аутолиенотрансплантации и продолжительностью жизни животных.
На основании гистологических, биохимических исследований выявлена вариа­
бельность в формировании гемомикроциркуляторных структур во внеорганных образованиях селезеночной ткани - спленоидах у крыс и собак.
Теоретическая и практическая значимость. Научно обоснована и экс­
периментально подтверждена эффективность методов аутотрансплантации се­
лезенки у животных различных видов, основанная на изучении клинических,
гематологических, биохимических и морфологических особенностей. На кры­
сах разработаны патологические модели для изучения неспецифической и спе­
цифической резистентности при сепсисе. На основании результатов исследова­
ний предложена методика для базы дальнейших исследований и совершенство­
ваний методов повышения резистентности организма и аутотрансплантации.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Универсальность спленэктомии и различие ответной реакции у живот­
ных.
2.
Клинико-морфологические особенности послеоперационного периода у
крыс и собак после спленэктомии.
3.
Структурно-функциональная характеристика в организме крыс с разлиными методами аутолиенотрансплантацией селезенки.
4.
Сравнительная эффективность методов аутолиенотрансплантации селе­
зенки у крыс и патологическая модель септических процессов.
Методология и методы исследования.
4
Моделирование патологических процессов у крыс проводили современ­
ными методами, что позволило контролировать их генез. Клинические, биохи­
мические, морфологические методы отражают состояние организма животных
при постспленэктомическом синдроме. Доказана видовая особенность в генезе
тромбоцитоза, лейкопении и эритропении после аутолиенотрансплантации. По­
лученные данные являются базой для возможной оценки эффективности лекар­
ственных средств.
Апробация работы. Основные положения работы доложены, обсуждены
и одобрены: на научной конференции молодых ученых ФГОУ ВПО МГАВМиБ имени К.И. Скрябина [Москва, 2012]; XX Международном ветеринарном
конгрессе [Москва, 2012]; Международной научно - практической конферен­
ции: Современная наука: теоретический и практический взгляд, [Уфа, 2014];
Международной научной конференции: Современные аспекты сельскохозяй­
ственной микробиологии, М.: РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева [Москва,
2016]; расширенном заседании кафедр: МГАВМиБ- MBA имени К.И. Скряби­
на [Москва, 2017].
Производственные испытания проходили на базе СББЖ г. Москвы.
Внедрение результатов исследований. Диссертация выполнена в рамках
научно-исследовательской работы и внедрена на кафедре ветеринарной хирур­
гии ФГБОУ ВО МГАВМиБ - MBA имени К.И. Скрябина. Разработанные мето­
дики лечения используются в СББЖ г. Москвы.
Публикации. По результатам исследований опубликованы 6 научных ра­
бот, 2 из которых в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 135 страни­
цах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, соб­
ственных исследований (результатов исследований, обсуждения результатов
исследований и заключения), выводов, практических рекомендаций, списка ли­
тературы, включающего 200 источников, из которых 78 зарубежных изданий,
иллюстрирована 69 рисунками, 22 таблицами.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материал и методы исследования
Исследование проводили на базе кафедры общей патологии имени В.М.
Коропова ФГБОУ ВО МГАВМиБ - MBA имени К.И. Скрябина. Для проведе­
ния экспериментальных исследований было использовано 108 беспородных
белых лабораторных крыс и 15 собак [10 опытные и 5 - контрольные].
Клинические исследования проводили по общепринятой методике. В день
операции проводили осмотр животных: измеряли температуру тела ректально,
подсчитывали частоту сердечных сокращений и число дыхательных движений
в минуту. Операционное поле готовили путем выбривания волосяного покрова
с вентральной брюшной стенки, с последующей обработкой 10% - ным раство­
ром йода.
Гематологические исследования проводили на автоматическом гематоло­
гическом анализаторе марки ABCVET [Франция], BC-2800Vet Mindrey, количе­
ство эритроцитов крови определяли в камере Горяева [по общепринятой мето­
5
дике]. Биохимические исследования проводили на анализаторе Random AcessA15 [BioSystems,USA].
Морфологические исследования выполняли на базе лаборатории ВЕТТЕСТ [г. Москва]. Препараты окрашивали гематоксилином и эозином, по Ро­
мановскому - Гимза. Микроархитектонику тканей изучали с использованием
микроскопа ок. 8,10 и об. 10, 40.
Патоморфологические исследования проводили на кафедре общей пато­
логии имени В.М. Коропова ФГБОУ ВО МГАВМиБ - MBA имени К.И. Скря­
бина.
Методика выполнения спленэктомии заключалась в следующем: для
наркоза исрользовали препарат золетил из расчета 4-8 мг/кг массы тела жи­
вотного внутривенно. Лапаратомию выполняли по белой линии живота, каудальнее мечевидного хряща с соблюдением правил асептики и антисептики.
Далее селезенку извлекали из брюшной полости, фиксировали, лигировали
желудочно-селезеночную связку и резецировали [ Позябин С.В.,2012] . Лапаротомную рану у крыс ушивали послойно узловатым швом. Опыты по спленэк­
томии и аутолиенотрансплантации проводили на 5 группах животных: 1 - кон­
трольная [п = 10]; 2- после удаления селезенки [п = 10]; 3- со свободной аутолиенотрансплантацией в перитонеальную полость [п = 10], 4 - с подшиванием к
мышцам живота [п = 10] и 5 - с подшиванием к сосудам брыжейки [п = 10]. У
каждого животного до опыта, а затем на 1,7,14 и 21 сутки проводили термомет­
рию тела, подсчитывали пульс и количество дыхательных движений. Отбирали
пробы крови для биохимических исследований. После завершения экспериментов
животных подвергали эвтаназии в соответствии с Хельсинской декларацией Все­
мирной медицинской ассоциации [2013]. Далее проводили патологоанатомиче­
ское вскрытие, оценивали состояние паренхиматозных органов, определяли их
массу путем взвешивания на электронных весах [SCL-300, Россия], с точностью
до 0,001 г. Для проведения гистологического исследования брали образцы орга­
нов, фиксации в нейтральном формалине, заливали в парафин, готовили на мик­
ротоме гистологические срезы, которые окрашивали гематоксилином и эозином и
анализировали при различном увеличении под микроскопом. Фотосъемку гисто­
логических препаратов проводили с использованием цифровой камеры. Стати­
стическую обработку данных выполняли при помощи общепринятых методов
с оценкой достоверности полученных результатов исследований по трем поро­
гам вероятности и критериям достоверности по Стьюденту. Для достижения
данных целей использовали пакет «MS Excel» для компьютера «Pentium - 4».
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБ­
СУЖДЕНИЕ
1. Клинико-биохимические изменения у крыс после спленэктомии
Полученные данные показывают, что спленэктомия не безразлична для
организма и после нее развивается обычная клиническая картина послеопера­
ционного синдрома. У животных на 1 - 2 С° градуса повышаются температура
тела, на 12 - 30% от нормы частота сердечных сокращений и дыхательных
6
движений [рис.1 - 3]. Животные первой и второй серии опытов находясь в ви­
варии принимали корм, активно передвигались.
-♦-кошрольная группа
-•-крысы после сгиенэктомии
1 день
Здень
7 день
11 день 15 день 21 день
Рис. 1. Температурная кривая у крыс после спленэктомии
-♦-контролъная группа
-•-крысы после
сгиенэктомии
Рис.2. Частота сердечных сокращений у крыс после экстирпации селезёнки
7
100
контрольная группа
80
-•-крысы после
сплеюктомии
60
40
20
1 день
Здень 7 день 11 день 15 день 21 день
Рис. 3. Изменение частоты дыхания у крыс после спленэктомии
Результаты опытов показывают, что эктомированные селезёнки у крыс, в
разных сериях опытов, по массе, длине и ширине достоверно не отличались. Более
существенные изменения после спленэктомии происходят в крови крыс. Результа­
ты гематологических исследований представлены в [таб.1].
1. Показатели крови у крыс
Показатели
Гемоглобин, г%
Контрольные
крысы (М±ш)
14,12± 2,44
Опытные
крысы (М±т)
15,02± 3,21
Эритроциты, 10 /л
4,84 ±0,52***
8,43 ± 2,30
Лейкоциты, 109/л
17,61± 2,12*
13,22± 1,47
Лимфоциты,%
53,52± 4,15*
70,30± 5,68
Нейтрофилы,%
17,94± 1.43**
27,10± 3,46
Примечание: *р=0,05, **р=0,01, ***р=0,001
У животных опытной группы в показателях крови выявлен дисбаланс
между форменными элементами крови. Содержание гемоглобина в начале
8
опыта имело тенденцию к снижению, вместе с тем, количество эритроцитов,
лимфоцитов, нейтрофилов достоверно снижалось на фоне выраженного лей­
коцитоза. На 21 сутки наблюдений лейкоцитоз сменялся на лейкопению, а
другие показатели снижались еще значительнее [табл.2 - 3] и даже в отдален­
ные периоды (на 210 сутки опыта) не происходило изменения их уровня.
2. Гематологические показатели крыс на 21 сутки после спленэктомии
Показатели
Опытные
крысы (М ± ш)
Контрольные
крысы (М ± ш)
Гемоглобин, г%
11,28± 1,89*
16,12± 2,22
Эритроциты, 1012/л
5,03 ±0,84**
9,04 ± 1,90
Лейкоциты, 109/л
8,14± 1,95***
14,33± 2,05
Лимфоциты, %
42,32± 3,49**
67,20± 4,09
Нейтрофилы, %
16,73± 1.55*
24,04± 2,98
Примечание: *р=0,05, **р=0,01, ***р=0,001
З.Гематологические показатели крыс на 210 сутки после спленэктомии
Показатели
Опытные
крысы (М ± ш)
Контрольные
крысы (М±т)
Г емоглобин, г%
12,59± 1,89*
15,76± 2,40
Эритроциты, 10 /л
5,18 ±0,92***
9,19 ± 1,50
Лейкоциты, 10%
6,94± 0,98***
14,20± 2,01
Лимфоциты, %
40,03± 2,37***
65,10± 3,17
Нейтрофилы, %
18,33± 1.66***
27,00± 2,13
Примечание: *р=0,05, ***р=0,001
Примечание: * достоверно по сравнению с контролем, р < 0,05; *** р < 0,01
9
Биохимические показатели крови у крыс также подвергаются вариабель­
ности. Из таблицы 4 видно, что на 21 сутки опыта биохимические изменения в
крови сопровождаются гиперпротеинемией, гиперальбуминемией, гипербилирубинемией, в отдельные периоды увеличением АЛТ, ACT, щелочной фосфотазы и гипоглобулинемией. В основном, они отражают нарушение функции
печени и резистентности организма.
4. Показатели хромопротеидного обмена у крыс (М ± щ)
Показатели крови
Общий белок,г/л
До опыта
68,44 ± 1,45
Через 7 су­
ток после
спленэкто­
мии
Через 14 су­
ток после
сплен­
эктомии
69,68±1,89
89,41 ± 9,78*
58,01 ±2,97**
Через 21 сутки
после сплен­
эктомии
90,82±4,74**
Альбумины, г/л
27,87 ±1,74
28,48±1,29
Глобулины, г/л
40,2 ± 1.33
35,2 ± 1,54
Мочевина, ммоль/л
5,58± 0.53
6Д2 ±0,79
6,86 ±0.55
6,84± 0.45
Креатинин, мкмоль/л
58,01 ±2.26
56,11± ЗД7
46,62± 1,85*
64,45±1,83
Общий билирубин,
мкмоль/л
8,78±1,57
14,.34±3,21**
8,82 ±1,39
6,22±1,16
Прямой билирубин,
мкмоль/л
2,76±0,57
6,68±038***
4,72 ±0,.26**
3,74 ± 0,53
ACT, нмоль/мл/мин
226,45±5,79
246,43± 6,61
259Д2 ±6,77*
233,83 ±4,24
АЛТ нмоль/мл/мин
59,66± 1,.84
55,01 ±2,95
60,32± 3,83
94,22±1,95**
Щелочная фосфотаза,
ед/л
162,66±16,2
127,47± 11,86
184,35± 13,71
207,07± 11,28**
25,4 ± 1.54**
6531 ± 1,49***
2 1,44± 2.46**
Примечание: *р=0,05; **р=0,01, ***р=0,001
Изменение функции органов у животных, снижение защитных своств ча­
сто приводит к осложнениям. При одних и тех же заболеваниях они возникают
в 58 раз чаще, чем у животных с сохраненным органом, а летальность в 14 раз
выше [Бордуновский В.Н., 1995]. Мы солидарны с этими сведениями и объясня­
ем их выраженной лейкопенией и гипоглобулинемией. Именно эти изменения
обуславливают снижение резистентности животных.
2.Морфологические изменения в организме крыс после спленэктомии.
Структурная организация органов у интактной крысы имеет детерминизм
и соответствует гистологическим критериям. Одним из важных тестов для
10
оценки органа является состояние гемомикроциркуляторного русла, его видо­
вые, морфометрические характеристики. В послеоперационный период после
спленэктомии нами выявлено изменение структуры паренхиматозных органов
и микроциркуляторного русла. Так, в печени после спленэктомии появляют­
ся макроскопические изменения в паренхиме и стромальных элементах. Све­
тооптически видно, что они локализованы в перипортальной и перифериче­
ской зоне. По интенсивности окраски они существенно отличаются. Измене­
ния в сосудисто-паренхиматозных компонентах печени имеют определенную
взаимосвязь, и выраженность уже на 1 0 - 2 1 сутки эксперимента. В этот пе­
риод у крыс отмечаются локальные дистрофические изменения в гепатоцитах. Архитектоника печени нарушается, отсутствует организация пластинча­
того строения, появляются вакуоли и зернистость в гепатоцитах. Состояние
синусоидных капилляров в дольке варьирует, они несколько увеличены, раз­
нообразной формы, изменяется толщина стенок сосудов приносящего и дре­
нажного звеньев по сравнении с контролем. Микроциркуляторное русло пече­
ни, вероятно, не обеспечивает орган достаточным количеством пластических
веществ и возникают структурные изменения. На 21 сутки после операции в
печени отмечается лимфоидно - клеточная реакция вокруг центральных вен. В
локальных участках паренхимы печени крыс возникают явления проявляющи­
еся кариопикнозом. В перипортальных зонах отмечаются явления фиброза и
возникают септы, несколько суживаются просветы желчных канальцев и про­
токов. Клинико-экспериментальные данные показывают, что структурно функциональные компоненты почки крыс страдают от спленэктомии еще
сильнее, чем в печени. Изменения дистрофического характера касаются как
почечных телец, так и проксимальных канальцев. Если в клубочках почечных
телец изменяются капилляры, то в проксимальных канальцах преобладают
процессы вакуолизации, некроза, появляются просветленные, бесструктурные
участки. Причем эти процессы носят не локальный, а тотальный характер. Во­
круг измененных проксимальных канальцев достаточно лимфоидных клеток,
которые располагаются как одиночно, так и скоплениями. В отдельных местах
почек обнаружено разрастание нежноволокнистой соединительной ткани и
выявлены жироподобные вакуоли. Есть основание полагать, что это ответная
реакция организма на общетоксическое действие, которое проявляется в тече­
ние первых дней после спленэктомии. В миокарде видна существенная де­
структивная перестройка с гемоциркуляторными расстройствами. В отдельных
случаях выражен стаз с диапедезом клеток, а в других дистрофические измене­
ния кардиомиоцитов и миофибрилл. В кишечнике наблюдается десквамация
эпителия, увеличивается количество бокаловидных клеток, слизи с разнооб­
разными включениями. В ворсинах уменьшается количество лимфоцитов.
Вероятно, после спленэктомии в организме происходят сложные аутоиммун­
ные процессы, связанные с несостоятельностью важных барьеров организма.
У крыс возникает интоксикация и микроциркуляторные расстройства крово­
обращения, снижаются защитные механизмы. Известно, что селезенка обладает
большим гемопоэтическим потенциалом, влияет на гемопоэз в костном мозге и
11
выход клеток крови из костного мозга в периферическую кровь [Marques R.G.,
Petroianu A., Coelho J.M., Portela М.С., 2002]. В ней осуществляется регуляция
тромбоцитопоэза и вырабатываются фактор свертывания крови секвестрируя
около 30% общего количества тромбоцитов. При постспленэктомическом син­
дроме количество тромбоцитов может достигать до 1 млн/мкл и приводить к
развитию тромбоза вен, конечностей, мезентериальных сосудов, портальной
вены и эмболии легочного ствола, вплоть до синдрома диссеменированного
внутрисосудистого свертывания. Как видно из приведенных данных, число пе­
ременных величин по ходу патологии увеличивается.
3.
Клинико-биохимические изменения у крыс после аутосплентрансплантции.
Для проведения аутолиенотрансплантации нами использованы все этапы
подготовки животного и оперативного удаления селезенки, которые описаны
ранее. После спленэктомии селезенку промывали физраствором, делили на дветри части и помещали в перитонеальную полость, к мышце или сосудам бры­
жейки. При первом способе аутолиенотрансплантации у крыс вначале наблю­
дали гипотермию, животные после наркоза были вялыми в течение нескольких
часов, слабо реагировали на внешние раздражители. Через 1 8 - 2 4 часа у них
возникала гиперпиретическая лихорадка, животные съеживались, волосяной
покров был взъерошен, дыхание и сердцебиение
Рис.4.Температура тела у крыс после
спленэктомии и аутотрансплантации
Ж
^
±
/
—♦ — Т е м п е р а т у р а
у кры с
груп п ы
п
■H“ - T e M n e p a T V P d
la
aiL_. —
удаления
селезен ки
—а г ~ Т е м п е р а т у р а
О
»
<£■
12
»
.»
*
9?
аутотрансп л а
нтации
Рис. 5. Динамика сердечных сокращений
у крыс после спленэктомии и аутотрансп
Д ы хание у
кры с
контрольной
гр у п п ы
—• — Д ы хание у
крыс после
удаления
сел езенки
~-я1г— Д ы х а н и е у
кры с после
а у т о тр а н с п л а
н та ц и и
учащались. Крысы отказывались от
корма, мало двигались, были апатичны­
ми. В течение 2 - 3 суток крысы этой
группы погибали. У вскрых крыс в
брюшной полости обнаруживали экссу­
дат соломенно-зеленого цвета. Внутрен­
ние органы имели признаки геморраги­
ческого воспаления, особенно это каса­
лось кишечника. Крысы других
Рис.6. Изменение дыхательных движений у
крыс после спленэктомии и аутотрансплантации
групп аутолиенотрансплантациию переносили легче. Уже через 1 - 2 часа они
начинали реагировать на раздражители. Однако активность животных была
снижена, температура тела, пульс и количество дыхательных движений в тече­
ние первых двух дней были ниже, чем у контрольных животных. Затем все по­
казатели резко увеличивались и находились на таком уровне до 14-15 суток
опыта. Повышение температуры тела отражает интенсивность воспалительной
реакции в организме животных [рис.4 - 6]. У животных 3 группы учащался
пульс, дыхание и неоднозначно изменялась температура тела. У крыс на 10
сутки после аутосплентрансплантации, независимо от метода, был выражен
лейкоцитоз, с нейтрофилией, который наблюдали в течение всего эксперимен­
та [табл. 5 - 6 ] . В тоже время количество гемоглобина, эритроцитов, лимфоци­
тов в крови достоверно снижалось.
5- Гематологические показатели крыс на 10 сутки после аутолиенотрансплантации в мышцу (М ± ш)
Показатели
Опытные
крысы (М ± м)
Гемоглобин, г%
13,44± 0,98*
15,33± 1,94
Эритроциты, 10 /л
8,12 ±0,89*
9,44 ± 1,15
19,10± 1,95***
14,11± 0,88
58,29± 2,96
66,30± 5,00
36,73± 2,44*
25,51± 3,08
Лейкоциты, 109/л
Лимфоциты, %
Нейтрофилы, %
Примечание: *р=0,05, ***р=0,001
13
Контрольные
крысы (М ± м)
6. Гематологические показатели крыс на 10 сутки после аутолиенотрансплантации к сосудам брыжейки (М ± т)
Показатели
Гемоглобин, г%
Опытные
крысы (М±м)
12,95± 1,22
Контрольные
крысы (М ± м)
14,87± 1,66
Эритроциты, 1012/л
Лейкоциты, 109/л
7,79±0,89
21,44±3,07***
9,44 ± 1,15
14,92± 1,33
Лимфоциты, %
52,32±4,38*
64,20± 4,62
Нейтрофилы, %
37,04±2,44**
24,99± 3,63
Примечание: *р=0,05; **р=0,01, ***р=0,001
Гемаюлогические показатели крыс на 21 сутки после аутолиенотрансплантации в мышцу сохраняют аналогичную динамику. Количество гемогло­
бина, эритроцитов снижается при выраженном лейкоцитозе. Гематологические
показатели у крыс на 31 сутки после аутолиенотрансплантации в мышцу
имеют достоверную разницу по сравнению с контролем. Однако, отмечается
незначительный лейкоцитоз, лимфоцитопения и нейтропения в обеих опытных
группах. В то же время лейкоцитоз был более выражен у крыс на трансплан­
тат, находящийся в брыжейке. Анализ биохимических данных показывает, что
в эти же сроки происходит сложная перестройка метаболизма [табл. 7 - 8] в ор­
ганизме животных. .
7-Показатели хромопротеидного обмена у крыс с аутосплентрансплантацией
к мышце (М ± ш)
Показатели крови
До опыта
Через 7 суток
после спленэктомии
Общий белок, г/л
64,21 ± 1,04
68, 86±1,93
Через 14 суток
после спленэктомимии
78,41 ± 6,88*
Через 21 сутки
после спленэктомимии
89,18±3,17**
Альбумины, г/л
29,23 ± 2,04
37,46±1,01
68,01 ±4,08***
66,11 ±3,77***
Глобулины, г/л
34,98 ± 2,04
31,40 ±2 ,39
10,40 ± 0.94***
23,09± 3.34**
Мочевина, ммоль/л
5.58± 0.53
6,32 ±0,79
6,86 ±0.55
6,84± 0.45
Креатинин, мкмоль/л
59,18±4.16
53,22 ± 438
48,55± 3,34*
44,22±5,75*
14
Общий
билирубин,
мкмоль/л
6,59±0,78
12,.23±2.34***
17,52 ±3,97***
16,18±5,01***
Прямой билирубин,
мкмоль/л
2,02±0,57
5,88± 3,20***
5,93 ±3,.15***
6,14 ± 1,33***
ACT, нмоль/мл/мин
206,01± 3,04
266,20± 4,11**
269,56 ±6,80**
294,18 ±6,44***
АЛТ, нмоль/мл/мин
59,66± 1,84
55,01 ±2,95
60,32± 3,83
177,10± 22,19
178,92± 32,01
Щелочная фосфатаза, 160,66±10,92
ед/л
94,22±1,95***
199,84± 24,88**
Примечание: *р=0,05; **р=0,01 , ***р=0,001
8- Показатели хромопротеидного обмена у крыс с аутосплентрансплантацией к сосудам брыжейки (М ± т)
Показатели
крови
Общий белок,
г/л
До опыта
69,15 ±3,00
Через 7 суток
после спленэктомии
Через 14 суток
после спленэктомимии
Через 21 сутки
после
спленэктомимии
65,23±3,35
64,09 ±5,15
58,47±2,99*
34,22±4,51
44,22± 3,05**
47Д5 ±5,66***
1 1,1 2± 2.52***
Альбумины, г/л
30,18 ±2,04
Глобулины, г/л
38,87 ± 1,97
31,03 ±3 ,42*
15,67 ± 1.86***
Мочевина,
ммоль/л
5,89± 0.79
4,02 ±0,49*
4,59 ±0.92
3,90± 0.97**
Креатинин,
мкмоль/л
54,13 ±3.24
52,00 ± 3,55
45,31± 2,53*
51,49±4,13
6,11±0,59
14,.48±5,02***
15,97 ±2,88***
19,13±4,77***
2,26±0,34
5,90±0,97***
6,23 ±0,15***
6,99 ± 1,01***
201,89± 13,93
258,09± 14,21*
296,66 ±11,44**
69,01± 2,84
65,99 ±4,85
74,13±5,90*
152,33 ±14,22
189,44± 19,37*
189,96± 21,10*
Общий били­
рубин,
мкмоль/л
Прямой били­
рубин,
мкмоль/л
ACT,
нмоль/мл/мин
АЛТ, нмоль
/мл/мин
Щелочная
фосфатаза, ед/л
Примечание: *р=0,05; **р=0,01, ***р=0,001
15
300,20 ±26,00**
89,92±7,77**
198,99± 22,00**
Выявленные биохимические изменения в крови организма объясняются
диспротеинемией: регистрировали гиперпротеинемию, гиперальбуминемию,
увеличение АЛТ и гипоглобулинемию, гипербилирубинемию.
4.
Морфологические изменения в организме крыс после аутосплентрансплантации.
У интактной крысы структурная организация органов соответствует
гистологическим критериям. Нарушение полифункциональности селезенки у
крыс приводит к полиорганной патологии. Снижение способности к реоргани­
зации и гемоостатике появляется морфологическими изменениями. Проведен­
ное нами ранжирование по выраженности патологических изменений в орга­
нах показало, что на первом месте почка, затем поджелудочная железа, серд­
це, печень, кишечник. Важно отметить, что во все периоды после аутосплентрансплантации в органах имеются нарушения структуры клеток и гемомикроциркуляторного русла.
Так, в печени, после аутосплентрансплантации, макроскопически видна
ишемичность, пятнистость. При светооптических исследованиях деструктив­
ные процессы затрагивают паренхиму, стромальные элементы перипортальной и периферической зон. На 10 сутки опыта отмечаются дистрофические
изменения гепатоцитов, нарушается архитектоника дольчатости и пластинча­
того строения. В гепатоцитах появляются вакуоли, зернистость, отмечается их
вариабельность. Просветы синусоидных капилляров в дольке расширяются,
толщина стенок сосудов приносящих и дренажных звеньев, в портальных
участках, увеличена. Изменения в сосудисто-паренхиматозных компонентах
печени имеют определенную взаимосвязь, выраженность, которых прогресси­
руют к 2 1 - 3 1 суткам эксперимента. В этот период увеличивается лимфоид­
но-клеточная реакция вокруг центральных вен и в синусоидах. Появившийся
экссудат сдавливает дренажные структуры и желчные канальцы. В гепатоци­
тах крыс возникает
кариопикноз, встречается незначительное количество
двуядерных клеток. В разных участках возникают септы из нежноволокнисто
соединительной ткани. Структурно - функциональные компоненты почки крыс
после аутосплентрансплантации изменяются непосредственно после опера­
тивного вмешательства и усугубляются к 31 суткам опыта. Дистрофические
изменения затрагивают в органе почечные тельца и проксимальные канальцы.
Диаметр клубочков изменяется и увеличивается просвет в капсуле. В прокси­
мальных канальцах активируются процессы вакуолизации, накопления угле­
водно-белкового детрита, некроза, увеличивается количество лимфоидных
клеток, которые располагаются как одиночно так и группами. В миокарде де­
структивная перестройка затрагивает мышечный аппарат и гемомикроциркуляторное русло. Выражен стаз, образуются межклеточные полости, в которых
происходит деструкция эмигрировавших эритроцитов и лейкоцитов. Образую­
щиеся ферменты обуславливают лизис и деструкцию миокарда. Кардиомио­
циты теряют поперечную исчерченность, исчезают вставочные диски, нередко
происходит увеличение межклеточных пространств. В тонком отделе кишеч­
16
ника десквамируется эпителий, увеличивается количество слизи и конгло­
мератов разного размера в ней. Во всех слоях кишечной стенки уменьшается
количество лимфоцитов (особенно в ворсинах). Чем ближе к сосудам находят­
ся подсаженные трансплантаты, тем дольше оказывается срок жизни живот­
ных. У крыс после аутолиенотрансплантации отмечали случаи спленоза - ком­
пенсаторной постспленэтомической имплантации селезеночной ткани, что явля­
ется приспособительной реакцией, эктопической регенерации ткани, замещающей
часть удаленной. Светооптическая структура узелков показывает, что в них из­
меняется красная, белая пульпы, трабекулы. У животных опытной группы уста­
новлено утолщение капсулы, по сравнению с контролем. Она сформирована за
счет коллагеновых волокон и гладких миоцитов. Выраженность различных от­
делов имплантированной ткани зависит от ее кровоснабжения, особенно в 1-е
сутки наблюдений. Крысы, которым трансплантировали селезенку к мышеч­
ной ткани через 30-40 суток погибают, к сосудам брыжейки через 70-90. Это
связано с недостатком иммуномодулирующих и других биологически актив­
ных веществ - лимфокинов, монокинов, лейкотриенов, иммуноглобулинов,
опсонинов, интерферонов, лизоцима, пропердина, что имеет главное зна­
чение в патогенезе послеопераионного гипоспленизма [Najjar V.A., Nishioka
К., 1970; Phillips J.H., Babcock G.F, Nishioka К., 1981; Nishioka К., Wagle J. R.,
Minter A.M., 1990; Naim J.O., Lanzafame R.J., Van Oss C.J. 1991; Zhang Y., Ma
H., Cai Z., 1996 ]. Известно, что селезенка вырабатывает тафтсин - глобулин,
который стимулирует фагоцитарную активность нейтрофилов, образование
Т- и В-лимфоцитов [Лиарцин К.А., 1995; Nishioka К., 1979; Wleklik М., Рапаsiak W., Luszak М., 1988]. Полученные нами данные позволяют полнее понять
клинико - биохимические изменения у крыс после спленэктомии и аутолиено­
трансплантации, проследить корреляционные взаимоотношения между биохи­
мическими и морфологическими изменениями.
б.Морфофункциональные изменения в организме собак после спле­
нэктомии и аутосплентрансплантации
Исследованные нами собаки достаточно хорошо переносили спленэктомию и аутосплентрансплантацию. Клинические показатели, у них были в пре­
делах физиологической нормы. Гематологичекие показатели через 8 месяцев
после оперативного вмешательства характеризовались тенденцией к снижению
количества эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитоз. Биохимические показате­
ли крови не имели существенных выраженных изменений и были близки к та­
ковым контрольных животных. Благоприятный исход спленэктомии и ауто­
сплентрансплантации, по нашему мнению, связан с появлением очагов рези­
дуальной селезеночной ткани, что детерминировано пролиферативным типом
воспаления у собак.
Заключение. Нами установлено, что жизнедеятельность крыс с удален­
ной селезенкой по клиническим, гематологическим, биохимическим и морфо­
логическим показателям отличается от контрольных. В первую очередь у экс­
периментальных животных изменяются в сторону увеличения показатели тем­
пературы тела, пульса и числа дыхательных движений. Особые проявления
17
имеют гематологические показатели, которые после спленэктомии и до 210
суткам опыта имеют дисбаланс по соотношению форменных элементов крови.
Эритропения и лейкопения у крыс несет за собой отрицательные последствия:
в частности такие животные имеют пониженный обмен веществ, резистент­
ность и они подвержены различным заболеваниям. Это закономерно, так как
по сравнению с нормой, снижается количество лимфоцитов, глобулинов.
Наши клинико-экспериментальные исследования показывают, что после аутолиенотрансплантации косвенные показатели состояния иммунной системы у
крыс, по сравнению со спленэктомированными, имеют отличия. В данном
случае, вероятно, сказывается недостаток активного вещества, вырабатывае­
мого селезенкой, тетрапептида - тафтсина. Он обладает гормоноподобным,
иммуномодулирующим свойством, усиливает резистентность, фагоцитоз, ока­
зывает действие на моноциты / макрофаги, нейтрофилы, натуральные килле­
ры, т.е. на все клетки, где есть Fc- рецептор к IgG. Морфологические измене­
ния в органах крыс, после аутотрансплантации, в различные сроки после
операции, продемонстрировали системную ответную реакцию организма.
В частности, когда у крыс извлеченную из брюшной полости селезёнку, раз­
резали на части и снова располагали свободно в брюшной полости - результа­
ты были отрицательные. Животные переносили оперативное вмешательство,
отходили от наркоза, но в течение первых - вторых суток с клиническими
признаками гиперпиретической лихорадки погибали. При вскрытии павших
животных обнаруживали геморрагическое воспаление кишечника, наличие в
перитонеальной полости экссудата, изменение цвета печени. Следовательно, у
крыс селезёнка после её удаления и последующего свободного введения в
брюшинную полость не отторгается. Кроме того, она, лизируясь, губительно
влияет на организм животного. Можно предположить, что была передозиров­
ка препаратов для наркоза, но препарат и дозы во всех сериях были одинако­
выми. В литературе отмечается, что через 10-20 минут после введения золетила УЗ - видимых изменений в органах не обнаруживается [Wleklik М., Рапаsiak W., Luszak М., 1988]. Так, в печени изменяется выраженность сосуди­
стого рисунка и увеличиваются линейные гиперэхогенные структуры (стенки
и диаметр каудальной полой вены, отходящих от неё печеночные вены). Визиализируются ранее не определяемые в паренхиме мелкие ветви кровеносных
сосудов. Указанные изменения достигают максимума через 30-60 минут после
введения золетила, но через 2,5-3 часа они возвращаются к первоначальным
значениям. Нам представляется возможным сделать предположение, что ткань
селезенки, богатая лимфоцитами, помещенная в брюшинную полость, подвер­
гается аутолизу. В результате этого образуется большое количество биологи­
чески активных веществ, в частности интерлейкинов и тафтсина. Временное
приживление селезеночной ткани к мышце и сосудам брыжейки происхо­
дит с формированием структурных элементов, которые не имеют дальнейшего
развития и подвергаются некрозу. Нарушение функции мононуклеарномакрофагальной системы, различных барьерных приспособлений организма приводят
к повышенному проникновению из крови к трансплантанту пневмококков,
18
ишерихий и других микроорганизмов. Условия некроза и лизиса трансплантан­
та оказываются благоприятными для перехода асептического воспаления в сеп­
тическое. Микроорганизмы, эндотоксины, биологически активные вещества
первичного очага инфекции с синдромом системной реакции и полиорганной
дисфункцией приводят к полиорганной недостаточности и сепсису. У собак
процессы аутолиенотрансплантации проявляются достаточно выраженной
функциональной активностью спленоида. Таким образом, спленэктомия и
аутолиенотрансплантация у крыс и собак проявляется определенными стоха­
стическими свойствами в организме, но позволяет проводить коррекцию реор­
ганизации функций в послеоперационный период. Полученные данные являют­
ся базовыми для сравнительных исследований спленэктомий и аутолиенотрансплантаций у животных разного вида.
Заключение
1. После спленэктомии в организме крыс происходят сопряженные, по
времени клинические, гематологические, биохимические и морфологические
изменениями. Последствием постспленэктомического синдрома является
нарушение гемопоэза проявляющегося эритропенией, лейкопенией и де­
струкцией в сосудисто - паренхиматозных структурах печени, почек, мио­
карда, кишечника, поджелудочной железы.
2. Архитектоника и структурная организация органов крыс через 21 день
после спленэктомии характеризуется развитием дистрофических процессов и
перераспределением лимфоцитов в гемомикроциркуляторном русле. В отда­
ленные периоды постпленэктомического синдрома иммунонобиологические
механизмы не обеспечивают полифункциональность селезенки, адаптацию
органов и компенсацию утраченной функции. В организме крыс возникает
лимфоцитопения, нейтрофилопения, гипоглобулинемия, гиперпротеинемия,
гиперальбуминемия, увеличивается ACT, АЛТ и щелочная фосфатаза.
3. Через 7 месяцев после спленэктомии в печени, почках, миокарде, ки­
шечнике, поджелудочной железе изменяется цитоархитектоника: увеличива­
ется количество клеток с базофилией ядра и увеличением размеров цитоплаз­
мы. В перипортальных зонах печени появляются явления фиброза. В почках
деструктивные процессы выражены сильнее: преобладает патология почечных
телец и проксимальных канальцев с накоплением детрита, а в других органах
исследованных органах выражена лимфоидно - клеточная реакция.
4.
Аутолиенотрансплантация крысам, в различных модификациях,
позволяет проследить системный ответ организма на спленоиды и сформиро­
вать стратегию клинико-экспериментальных исследований, по купированию
септических процессов. Патологическая модель сепсиса, от селезеночного
трансплантата, имеет разный генез, варьирует по интенсивности проявления,
что обусловлено местом его локализации. Острое течение сепсиса иниции­
19
руется аутолиенотрансплантацией в перитонеальную полость; подострое - к
мышце брюшной стенки; хроническое - к сосудам брыжейки.
5. Показатели иммунной системы у спленэктомированных крыс значи­
тельно снижаются после аутолиенотрансплантации, так как нарушается вы­
работка агранулоцитов. Морфологические и функциональные показатели, в
различные сроки после трансплантации, демонстрируют незначительное
приживление аутотрансплантированной ткани с формированием структур
селезенки. Через 4-5 месяцев прогрессирует лейкопения, гипоглобулинемия,
активируется некроз спленоидов, инициируя септические процессы.
6. Собаки с костно - мозговым типом кроветворения значительно лег­
че, по сравнению с крысами, переносят спленэктомию и аутолиенотрансплантацию. Через один год после оперативного вмешательства морфологические,
биохимические показатели крови у них недостоверно отличаются от кон­
троля.
РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ
1.Разработана патологическая модель сепсиса у крыс, моделируемая
разными методами аутолиенотрансплантации. Острое течение инициирует
аутолиенотрансплантация в брюшинную полость; подострое - к мышце
брюшной стенки; хроническое - к сосудам брыжейки.
2.
Патологические модели сепсиса можно использовать при апробации и
выявлении антимикробной эффективности новых лекарственных веществ.
3.
Полученные данные могут быть использованы на клинических кафед­
рах ветеринарных вузов для учебных и научно-исследовательских целей, а
также при написании справочной литературы, монографий и учебников.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
ПУБЛИКАЦИИ В ВЕДУЩИХ
РЕЦЕНЗИРУЕМЫХ НАУЧНЫХ ИЗДАНИЯХ ВАК
*1. Байматов, В.Н. Клинико - биохимические изменения у крыс после
спленэктомии и аутотрансплантации селезенки /В.Н. Байматов, А.А. Николаев//Вестник АПК Ставрополья, 2015, №1. - С.97-100
*2. Николаев, А.А. Показатели крови у собак после спленэктомии/А.А.
Николаев// Научно - практический журнал/ Ветеринария, зоотехния и биотех­
нология, 2016, №6. - С.74 - 77 .
ПУБЛИКАЦИИ В ДРУГИХ ИЗДАНИЯХ
3. Гильдиков, Д.И. Влияние спленэктомии на клинико-биохимические
показатели у крыс /Д.И. Гильдиков, А.А. Николаев, О.С. Лучкова // Вестник
Мичуринского филиала российского университета кооперации, 2013, №3. С .142- 145
20
4. Николаев, А.А. Клинико-биохимические изменения у крыс после
аутотрансплантации селезенки/ А.А. Николаев, В.Н. Байматов: Мат. Меж.
научно - практич. конф. :Современная наука: теоретический и практический
взгляд. - Уфа, 2014. - С.254 - 256
5. Николаев, А.А. Биохимические изменения у крыс после спленэктомии/ А.А. Николаев, В.Н. Байматов: Мат. Меж. научно - практич. конф. : Со­
временная наука: теоретический и практический взгляд. - Уфа, 2014. - С.256 258
6.
Николаев, А.А. Изменение показателей резистентности у крыс после
спленэктомии // А.А.Николаев /Современные аспекты сельскохозяйственной
микробиологии .- Мат. Международной конференции, М.: РГАУ-МСХА имени
К.А. Тимирязева, 2016.- 59-60
СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АЛТ - аланинаминотрансфераза
ACT - аспартатаминотрансфераза
ВОСТ - внеорганные образования селезеночной ткани
СОЭ - скорость оседания эритроцитов
ЧДВ - частота дыхательных движений
ЧСС - частота сердечных сокращений
21