close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

uploaded 062F837040

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Вологжанина Наталья Владимировна
Морфологическое и функциональное обоснование регенераторной
активности клеточных продуктов разных типов на модели
травматического повреждения роговицы
06.02.01 – Диагностика болезней и терапия животных,
патология, онкология и морфология животных
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата биологических наук
Москва – 2017
Работа выполнена в ФГБОУ ВО «Московская государственная академия
ветеринарной медицины и биотехнологии – МВА имени К.И. Скрябина»
Научный руководитель:
Слесаренко Наталья Анатольевна
доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ
Официальные оппоненты:
Шевлюк Николай Николаевич
доктор биологических наук, профессор кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии
федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего
образования «Оренбургского государственного медицинского университета»
Омельяненко Николай Петрович
доктор медицинских наук, профессор, заведующий лабораторией соединительной ткани с
группой клинической генетики ФГБУ Центрального научно-исследовательского института
травматологии и ортопедии им. Н.Н. Приорова Минздрава РФ
Ведущая организация:
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего
образования «Омский государственный аграрный университет имени П.А. Столыпина»
Защита диссертации состоится 03 октября 2017 года в 11 часов на заседании
диссертационного совета Д 220.042.02 при ФГБОУ ВО «Московская государственная
академия ветеринарной медицины и биотехнологии – МВА имени К.И. Скрябина» по
адресу: 109472, г. Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА
имени К.И. Скрябина.
Автореферат разослан «___» ________________ 2017 г. и размещен на сайте ФГБОУ
ВО МГАВМиБ – МВА имени К.И. Скрябина: http://mgavm.ru и на сайте ВАК при
Министерстве образования и науки Российской Федерации: http://vak.ed.gov.ru
Ученый секретарь
диссертационного совета Д 220.042.02,
кандидат ветеринарных наук, доцент
П.Н. Абрамов
СОКРАЩЕНИЯ, ПРИНЯТЫЕ В АВТОРЕФЕРАТЕ
1. СК – стволовые клетки
2. ММСК – мультипотентные мезенхимные стволовые клетки
3. ЛСК – лимбальные стволовые клетки
4. СВФ – стромально-васкулярная фракция
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность проблемы
В последние десятилетия неуклонно растет число животных,
страдающих офтальмопатиями различного генеза. Среди них особое место
занимают длительно незаживающие и рецидивирующие язвы роговицы
(Шилкин А.Г., 2000; Gelatt K., 1982). Данная патология может иметь
травматическую этиологию, а также может быть вызвана снижением трофики
роговицы, анатомическим лагофтальмом, ожогами и другими факторами,
приводящими к повреждению эпителия и более глубоких слоёв роговицы.
Одним из направлений в регенеративной медицине является
использование клеточных продуктов различного происхождения с целью
замещения дефекта в поврежденном органе. В медицине человека при
тяжелых повреждениях роговицы клеточная терапия показывает
обнадеживающие результаты, как в эксперименте, так и на практике, что
отражено во многих современных источниках. Вместе с тем, большинство
подобных методов находится на стадии лабораторных и клинических
испытаний. Как известно, стволовые клетки обладают способностью
оптимизировать цитокиновый статус в клеточном микроокружении после их
локальной трансплантации в органы или ткани (Moore M.A. 2002., Ченцова
Е.В., 1996, Борзенок С.А., 2010).
Следует подчеркнуть, что в ветеринарной офтальмологии клеточные
технологии до настоящего времени используют только в клинических
исследованиях, не имеющих экспериментального обоснования, о чем
свидетельствует проведенный нами анализ отечественной и зарубежной
литературы (A. Kovšca Janjatović et al, 2015).
Исходя из вышеизложенного, нами на модели травматического
повреждения роговицы у кролика было предпринято исследование по оценке
возможности и эффективности применения клеток стромально-васкулярной
фракции клеток, мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани и
лимбальных стволовых клеток в регенеративной медицине, путём введения их
суспензированной взвеси субконъюнктивально.
Цель настоящего экспериментального исследования — установить
закономерности
и
особенности
заживления
моделированного
травматического повреждения роговицы у кролика при использовании разных
типов клеточных продуктов.
Для достижения поставленной цели было необходимо решение ряда
конкретных задач:
1. В условиях моделированного травматического повреждения
роговицы у кролика выявить пролиферативный потенциал клеточных
3
продуктов следующих типов: аутологичной стромально-васкулярной
фракции, аллогенных стволовых клеток лимба, аллогенных мезенхимных
клеток жировой ткани.
2.Установить сравнительные морфологические показатели динамики
репаративной регенерации поврежденного эпителия роговицы при
использовании клеточных продуктов указанных типов.
3.На основании клинико-морфологических данных, определить тип
клеточного продукта, оптимальный по регенераторным свойствам.
4.Выявить источники репаративного морфогенеза роговицы в условиях
экспериментального повреждения и обосновать применение стволовых клеток
как индуктора клеточного пролиферативного потенциала ткани роговицы при
замещении ее дефекта;
5.Провести клиническую апробацию терапевтической эффективности
стволовых клеток при лечении животных с повреждениями роговицы и
установить
целесообразность
и
эффективность
применения
их
трансплантации при данной патологии.
Научная новизна
Научно и экспериментально обоснована возможность использования
клеточных продуктов разных типов в ветеринарной офтальмологии для
восстановления анатомической целостности роговицы, что подтверждается
установленными у подопытных животных ее морфологическими
характеристиками.
Впервые оценено влияние клеток стромально-васкулярной фракции на
регенерацию роговицы при ее повреждениях у экспериментальных животных.
Результаты гистологического исследования позволяют заключить, что
скорость и качество заживления дефекта роговицы глаза у животных после
применения клеточных продуктов превосходят таковые у животных при
спонтанном заживлении, что может свидетельствовать о пролиферативных
потенциях стволовых клеток.
Теоретическая и практическая значимость исследования
Установлено, что изучаемые типы клеточных продуктов после их
трансплантации экспериментальным животным инициируют восстановление
анатомической целостности и функциональной состоятельности тканей
роговицы в области повреждения.
На основании данных микроморфометрии выявлены морфологические
показатели, подтверждающие, что клеточные продукты могут выступать в
качестве индуктора репаративной регенерации повреждённых тканей глаза.
Установлены закономерности и особенности регенераторного
потенциала тканей роговицы в условиях моделированного повреждения с
последующей трансплантацией клеточных продуктов. Разработаны критерии
оценки течения репаративного процесса.
Сравнительный анализ регенераторного влияния изученных нами
разных типов стволовых клеток показал, что эпителизация зоны дефекта
роговицы у животных после введения лимбальных стволовых клеток
4
происходила активнее в сравнении с животными, которым вводили другие
клеточные продукты.
Представлено научное обоснование терапевтической эффективности
клеточных продуктов различных типов при повреждениях роговицы
различной этиологии.
Методология и методы исследования
Научное обоснование установления регенераторных свойств клеточных
продуктов на модели травматического повреждения роговицы глаза
определило целесообразность использования комплексного методического
подхода, включающего: микрохирургическое моделирование дефекта
роговицы, биомикроскопичекое исследование роговицы в динамике
репаративного процесса с применением витальных красителей, макро- и
микроморфометрию, обзорную световую микроскопию гистологических
срезов и статистическую обработку полученных цифровых данных.
Положения, выносимые на защиту:
1. Закономерности и особенности репаративного гистогенеза ткани
роговицы в условиях моделирования ее повреждения.
2. Морфологические показатели динамики репаративной регенерации
поврежденного
эпителия
роговицы
в
сравнительной
оценке
восстановительных свойств.
3. Клеточные продукты, как индуктор пролиферативного потенциала
тканей роговицы при замещении ее дефекта.
4. Клиническая апробация трансплантации стволовых клеток и
установление их терапевтической эффективности у животных при
лимбальной недостаточности.
Степень достоверности, апробация и публикация результатов
исследования
В работе использован комплексный методический подход, включающий
экспериментальное моделирование повреждения роговицы, офтальмическое
обследование зоны повреждения, морфологические методы исследования и
статистический анализ полученных цифровых данных.
Материалы исследований представлены на XIX Московском
международном ветеринарном конгрессе в рамках секции студентов,
аспирантов и молодых ученых (Москва, 2011); III Международной Научнопрактической конференции «Научно-техническое творчество молодежи –
путь к обществу, основанному на знаниях» в рамках XI Всероссийской
выставки научно-технического творчества молодежи НТТМ-2011, 30-ой
Международной Гаванской выставке-ярмарке «FIHAV» (Куба, Гавана, 2012),
Ежегодной
научно-практической
конференции
МГАВМиБ
имени
К.И. Скрябина «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, зоотехнии и
биотехнологии», проводимой в рамках Всероссийского фестиваля науки
(Москва, 2012), Всероссийском конкурсе на лучшую научную работу среди
студентов, аспирантов и молодых ученых высших учебных заведений
5
Минсельхоза России в номинации «Ветеринарные науки» – первое место,
(Москва, 2013), Международной выставке Salon L’Etudiant (Франция, Париж,
2014); Ежегодной научно-практической конференции МГАВМиБ имени К.И.
Скрябина «Актуальные проблемы ветеринарной медицины, зоотехнии и
биотехнологии», проводимой в рамках Всероссийского фестиваля науки
(Москва, 2015), XXIV Московском международном ветеринарном конгрессе в
рамках секции студентов, аспирантов и молодых ученых (Москва, 2015);
Санкт-Петербургской ветеринарной офтальмологической конференции
(Санкт-Петербург, 2015), Конференции «Outlook of Stem cells application in
veterinary ophthalmology» (Перу, Лима, 2016), X Международной научной
конференции «Бабухинские чтения в Орле» (Орел, 2017).
По результатам исследования опубликовано 5 научных статей, из них 3
– в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации
Рукопись диссертации изложена на 97 страницах машинописного текста
(без учета приложений), иллюстрирована 28 рисунками, 8 таблицами, состоит
из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования,
результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения,
выводов, рекомендаций по использованию научных выводов, сведений о
практическом использовании результатов. Список литературы включает 134
источников, из них 45 отечественных и 89 зарубежных.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Материал и методы исследования
Исследования выполнены на кафедре анатомии и гистологии животных
имени профессора А.Ф. Климова ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени
К.И. Скрябина, а также на базе центра ветеринарной клеточной медицины в
период с 2014 по 2017 гг. Объектом исследования являлись 55 кроликов (110
глаз) породы серый великан, массой 2,5-3,0 кг, в возрасте от 8 до 10 месяцев,
подобранных по принципу аналогов. Животных предварительно
карантинировали в течение 7 дней, осуществляли ежедневный клинический
осмотр, было сформировано 5 групп животных. Каждой группе
соответствовал исследуемый тип клеток: первой группе животных
инъецировали аллогенные стволовые клетки лимба; второй группе животных
— аллогенные мезенхимные стволовые клетки жировой ткани; третьей
группе — клетки аутологичной стромально-васкулярную фракции.
За 14 дней до проведения эксперимента у животных групп 2 и 3 под
общей анестезией производили биопсию жировой и лимбальной ткани для
последующего выращивания стволовых клеток на питательных средах.
У животных, которым планировали вводить клетки стромальноваскулярной фракции, под местной анестезией производили взятие биоптата
жировой ткани. Полученные после липосакции образцы подвергали
ферментативной обработке коллагеназой. Из суспензии отдельных клеток
путем центрифугирования выделяли осадочную фракцию клеток стромальноваскулярного фенотипа, состоящую в основном из CD34+ клеток с примесью
6
CD45+ лейкоцитарных клеток и эритроцитов. Четвертой группе животных
(контрольная группа) вводили физиологический раствор (Sol. Natrii Chloridi
0,9%), для оценки реакции тканей. Пятая группа животных была интактной.
Перед трансплантацией в условиях лаборатории суспензию клеток
тщательно отмывали от культуральной среды, подсчитывали количество
жизнеспособных клеток и суспензировали в минимальном количестве
физиологического раствора.
У всех животных проводили кератоэктомию под контролем
операционного микроскопа фирмы Opton с коаксиальным и боковым
освещением. Увеличение на разных этапах операции варьировало от 6 до 14.
Для иссечения роговицы применяли трепаны диаметром 6,5 мм, с дозируемой
глубиной режущей кромки и шагом в 10 микрон. Для расслаивания тканей
роговицы применяли лейкосапфировые округлые микролезвия. Основные
моменты операции послойной кератоэктомии осуществляли по общепринятой
методике, описанной Дроновым М.М. (2002).
На центральную зону роговицы устанавливали трепан диаметром 6,5 мм
с ограничением трепанации до 200 мкм. Роговичным расслаивателем
проводили переднюю кератоэктомию в пределах трепанационной зоны. В
подопытных группах производили субконъюнктивальную инъекцию
суспензии стволовых клеток в 0,2 мл физиологического раствора.
Клинические методы исследования включали осмотр переднего отрезка
глаз с помощью фокального и бокового освещения и биомикроскопию
щелевой лампой фирмы «Shin» с флюоресцеиновой пробой и
фоторегистрацией. Оценку состояния глаз проводили на 3, 7 и 14 сутки после
трансплантации по следующим признакам: степени выраженности
воспалительной реакции, диаметру дефекта эпителия, интенсивности
помутнения роговицы. Площадь дефекта стромы роговицы определяли с
помощью биомикроскопии. Диаметр поврежденной области роговицы
определяли с помощью роговичного циркуля по Кастровьехо. Интенсивность
помутнения роговицы оценивали по шкале Войно-Ясенецкого.
На 15 день исследования животным была проведена энуклеация глазных
яблок с целью выявления морфофункциональных изменений в роговице после
трансплантации стволовых клеток.
Содержание, уход и эвтаназию животных осуществляли согласно
требованиям приказов МЗ СССР №755 от 12.08.1977 г., № 701 от 27.07.1978 г.,
«Санитарных правил по устройству, оборудованию и содержанию
экспериментально-биологических клиник (вивариев)», «Европейской
конвенции по защите позвоночных животных, используемых для
экспериментальных и других научных целей» (1986) и «Хельсинской
декларации всемирной медицинской ассоциации» (1964).
Гистологические исследования проводили по классической методике
(Меркулов Г.А., 1956). Светооптическое изучение гистологических срезов,
окрашенных гематоксилином и эозином, а также толуидиновым синим и
микрофотосъемку проводили при помощи светового микроскопа Jenamed-2
7
(Carl Zeiss, Jena, Germany), совмещенного с системой цифровой микроскопии
ImagScope C (ООО «Системы для микроскопии и анализа»).
Микроскопическую
морфометрию
выполняли
с
помощью
сертифицированной программы ImagScope C (ООО «Системы для
микроскопии и анализа»), совмещенной с микроскопом Jenamed-2.
Определяли общую толщину роговицы в лимбальной и центральной зонах, а
также отдельно толщину всех слоев роговицы.
Статистическую обработку морфометрических данных осуществляли с
помощью программы ImagScope C (ООО «Системы для микроскопии и
анализа»), оценку статистической значимости различий исследуемых
показателей — с использованием критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ
ОБСУЖДЕНИЕ
Морфологические и морфометрические характеристики роговицы
глазного яблока кролика в контроле
При визуальном исследовании состояния глаза кролика в норме
установлено, что роговица имеет сферическую форму, она прозрачная,
гладкая, блестящая, не содержит кровеносных сосудов, покрыта слёзной
плёнкой.
Микроструктура роговицы у контрольных животных соответствует
общим закономерностям организации этой части глазного яблока.
Центральная часть дифференцирована на: наружный эпителиальный пласт,
представленный многослойным плоским неорговевающим эпителием из 5-7
слоёв клеток; боуменову мембрану, в структуре которой находится слой
уплотнённых пучков коллагеновых волокон; собственное вещество,
образованное аваскулярной плотной оформленной соединительной тканью с
выраженными межволоконными пространствами; десцеметову мембрану,
сформированную плотно упакованными пучками коллагеновых волокон;
внутреннего эпителиального пласта — однослойного эпителия, с клетками
полигональной формы.
Отличительной особенностью cтроения лимбальной зоны является
отсутствие боуменовой мембраны и наличие хорошо развитого
субэпителиального слоя из рыхлой соединительной ткани с кровеносными и
лимфатическими сосудами, многочисленными фибробластами, а также
стволовыми клетками, являющимися, как известно, источником регенерации
роговицы (Борзенок С.А., Тонаева Х.Д, 2012).
Особенности заживления роговицы глаза у животных контрольной
группы (самопроизвольное заживление)
Клиническая картина
На 3 сутки у кроликов контрольной группы наблюдали выраженный
окулярный дискомфорт с признаками блефароспазма, фотофобии и эпифоры.
Имели место острый отек конъюнктивы, ее гиперемия, блефаромейбомиит.
Роговица в зоне дефекта была воспалена и отечна, у одного животного
8
присутствовала кератомаляция, а также признаки реактивного иридоциклита.
Окрашивание роговицы флюоресцеином наблюдали у всех животных, степень
её помутнения по шкале Войно-Ясенецкого составила от 4 до 10 баллов.
На 7 сутки эксперимента окулярный дискомфорт был выражен в
меньшей степени. Наряду с этим на фоне сохранения умеренной гиперемии
снижались признаки отёка век и конъюнктивы (рисунок 1 А, Б). Признаки
реактивного увеита были сохранены (рисунок 1 А, В), а у животного с
кератомаляцией наблюдали формирование рубцовой ткани (рисунок 1 А).
Поверхностное окрашивание роговицы флюоресцеином имело место
практически у всех контрольных особей. Степень помутнения по шкале
Войно-Ясенецкого составила от 3 до 10 баллов.
Б
В
А
Рисунок 1. Состояние роговицы у животных контрольной группы
через 7 суток после нанесения дефекта (самопроизвольное заживление).
А – уплотнение воспаленных тканей роговицы в зоне повреждения, формирование лейкомы,
Блефаромейбомиит (синяя стрелка) и реактивный иридоциклит сохранены (зеленая стрелка);
Б – неоваскуляризация роговицы с периферии в медиальном секторе (синий указатель),
гиперемия пальпебральной конъюнктивы (зеленая стрелка), положительная флюоресцеиновая
проба;
В – слабоположительное прокрашивание флюоресцеином, инъекция сосудов радужной
оболочки (зеленый указатель).
На 14 сутки наблюдений у кроликов сохранялись окулярный
дискомфорт и блефаромейбомиит (рисунок 2 А, Б, В), а также гиперемия
конъюнктивы (рисунок 2 В). В то же время уменьшалась степень
выраженности признаков реактивного увеита. Поверхностное окрашивание
роговицы флюоресцеином было сохранено у двух особей (рисунок 2 А, Б). У
всех животных идентифицировались границы трепанационной зоны, а степень
помутнения роговицы по шкале Войно-Ясенецкого составила от 3 до 9 баллов.
А
В
Б
Рисунок 2 Состояние роговицы у животных контрольной группы
на 14 сутки наблюдений (самопроизвольное заживление).
9
А – положительное флюоресцеиновое прокрашивание, формирование рубца по типу лейкомы,
сохранение блефаромейбомиита (зеленый указатель);
Б – положительное флюоресцеиновое прокрашивание в центральной зоне дефекта, воспаление и
отечность век (зеленый указатель);
В – формирование рубца в зоне повреждения по типу нубекулы, гиперемия и отек
пальпебральной и бульбарной конъюнктивы (зеленый указатель).
Результаты морфологических исследований
По данным морфологического исследования на 7 сутки отмечали
эпителизацию периферических зон дефекта. В собственном веществе
роговицы наблюдали отёк, лейкоцитарно-фибробластическую инфильтрацию,
присутствие
большого
количества
фибробластов
с
признаками
биосинтезирующей активности (обширная цитоплазма, светлое ядро с
ядрышком), а также неоваскуляризацию в поверхностных слоях основного
вещества роговицы (рисунок 3).
1
3
2
Рисунок 3. Микроморфологическая картина центральной зоны роговицы глаза у кролика
контрольной группы через 7 суток после нанесения дефекта.
1 – эпителиальный пласт, наползающий на соединительнотканный регенерат основного
вещества роговицы (2), кровеносный сосуд (3).
Толуидиновый синий, об.40, ок.10.
Через 14 суток у всех животных, за исключением одной особи, была
обнаружена эпителизация центральной области дефекта. С формированием
регенерата роговицы,
представленного
(2-3
слоя)
истонченным
эпителиальным
пластом.
Субэпителиально
располагалась
зрелая
грануляционная ткань с признаками умеренной клеточной инфильтрации,
содержащая кровеносные сосуды, а под ней — фиброзная ткань с плотно
упакованными, параллельно расположенными пучками коллагеновых волокон
и очагами дезорганизации. Далее располагались десцеметова мембрана и
внутренний эпителий (рисунок 4 А, Б).
10
1
1
2
2
3
3
А
5
Б
4
Рисунок 4. Структурное состояние центральной зоны роговицы кролика контрольной группы
на 14 сутки после нанесения дефекта.
Гематоксилин и эозин, А – об.10, ок.10.; Б – об.40, ок.10.
А – общий вид: эпителиальный пласт (1), созревающая грануляционная ткань (2),
основное вещество (3).
Б, – эпителиальный пласт (1), 2 – созревающая грануляционная ткань (2), очаги дезорганизации
стромы (3), десцеметова мембрана (4), внутренний эпителий (5).
В лимбальной зоне эпителиальный пласт был сохранен, в
субэпителиальной соединительной ткани выявлено расширение сосудов
микроциркуляторного русла и умеренная клеточная инфильтрация (рисунок 5
А, Б).
1
1
2
Б
А
2
Рисунок 5. Структурная организация лимбальной зоны роговицы
у кролика контрольной группы на 14 сутки наблюдения.
Гематоксилин и эозин, А – об.20, ок.10. Б – об.40, ок.10.
А – эпителиальный пласт (1), субэпителиальная соединительная ткань (2) с расширенными
сосудами микроциркуляторного русла (стрелки) и признаками выраженной клеточной
инфильтрации.
Б – область, пограничная между лимбальной и центральной: расширение сосудов и клеточная
инфильтрация субэпителиальной зоны.
Заживление роговицы глаза кролика при использовании аллогенных
стволовых клеток лимба (лимбальные стволовые клетки – ЛСК)
Клиническая картина
На 3 сутки после введения гомологичных ЛСК у животных был
выраженный блефароспазм, сочетающийся с острым блефаромейбомиитом и
гиперемия конъюнктивы в зоне введения клеточной суспензии. Сильный
окулярный дискомфорт наблюдали только в одном случае, у остальных
животных признаки болезненности и фотофобии отсутствовали. Окрашивание
роговицы флюоресцеином выражено слабо, а степень ее помутнения по шкале
Войно-Ясенецкого составляла от 1 до 4 баллов.
11
На 7 сутки после введения ЛСК степень выраженности воспаления
пальпебральной конъюнктивы была менее выражена, чем в предыдущие сроки
наблюдения, но гиперемия в зоне введения ЛСК сохранялась (рисунок 6 Б, В,
стрелки). Явления блефарита, а также степень окулярного дискомфорта
нивелировались. Поверхностное окрашивание роговицы флюоресцеином
наблюдали только у одного животного (рисунок 6 В), а степень её помутнения
по шкале Войно-Ясенецкого составила от 1 до 4 баллов (рисунок 6 А, Б, В).
А
В
Б
Рисунок 6. Макрокартина глаза кроликов после моделирования дефекта и введения суспензии
ЛСК на 7 сутки наблюдения.
А, Б – окулярный дискомфорт не выражен, окрашивание роговицы флюоресцеином отсутствует,
видны четкие границы трепанационной зоны, имеет место гиперемия бульбарной конъюнктивы
в месте введения клеточной суспензии; В – слабоположительная флюоресцеиновая проба,
сильная гиперемия пальпебральной конъюнктивы в зоне введения клеточной суспензии
(стрелка)
На 14 сутки после введения ЛСК окулярный дискомфорт у всех
животных отсутствовал, гиперемия конъюнктивы и явления блефарита
сохранялись у одного животного (рисунок 7 А, Б). Поверхностное
окрашивание роговицы флюоресцеином не выраженно. Границы зоны
трепанации были нечёткими, было выявлено лишь центральное помутнение
роговицы в виде нубекулы (рисунок 7 А, Б), а степень её помутнения по шкале
Войно-Ясенецкого составила от 0 до 4 баллов (рисунок 7 А, Б, В).
А
В
Б
Рисунок 7. Клиническая картина глаза кроликов после введения ЛСК на 14 сутки.
А, Б – окулярный дискомфорт отсутствует, границы трепанационной зоны размыты, степень
помутнения по шкале Войно-Ясенецкого 2-4 балла, сохранена воспалительная реакция век
(стрелка) и гиперемия конъюнктивы (стрелка); В – окулярный дискомфорт полностью
отсутствует, степень помутнения роговицы по шкале Войно-Ясенецкого 0 баллов.
Результаты морфологических исследований
При морфологическом исследовании области повреждения через 7 суток
выявлено полное закрытие дефекта роговицы регенератом, имеющим
12
соединительнотканную и эпителиальную части. В центральной части
регенерата (рисунок 8 А) эпителиальный пласт представлен 3-4 слоями
уплощенных клеток, боуменова мембрана — рыхло упакованными пучками
коллагеновых волокон с расширенными кровеносными сосудами. В
собственном веществе роговицы дифференцировалась зрелая грануляционная
и фиброзная ткань с веретеновидными фибробластами и тонкими пучками
коллагеновых волокон.
В периферической части регенерата (рисунок 8 Б) в эпителиальном
пласте количество слоёв возрастало до 8-10, они характеризовались
признаками вертикальной анизоморфии. Соединительнотканная часть
регенерата представлена тонковолокнистой фиброзной тканью, богатой
фибробластами (рисунок 8 А, Б).
1
1
2
3
А
2
Б
Рисунок 8. Структурная организация роговицы кролика после введения ЛСК
на 7 сутки наблюдения. Центральная (А) и периферическая (Б) зоны регенерата.
Толуидиновый синий, об.40, ок.10.
А – эпителиальный пласт (1) тонкий, количество слоев уменьшено. Собственное вещество
роговицы (2) сформировано плотно упакованными пучками коллагеновых волокон, среди
которых видны фибробласты.
Б – эпителиальный пласт с признаками вертикальной анизоморфии (1), уплотнение
композиции пучков коллагеновых волокон и увеличение количества фибробластов в области
боуменовой оболочки (2), фиброзная ткань с разнонаправленными пучками коллагеновых
волокон в собственном веществе роговицы (3).
Через 14 суток наблюдений выявлено уплотнение и истончение
центральной части роговицы без выраженных признаков отёка.
Восстановление эпителиального пласта выражалось в присутствии 5-6 слоёв
эпителиоцитов. Собственное вещество роговицы было сформировано
фиброзной тканью, в поверхностных слоях которой обнаружен диффузный
клеточный инфильтрат (рисунок 9 А, Б).
1
1
2
Б
3
5
А
4
13
Рисунок 9. Состояние центральной зоны роговицы кролика на 14 сутки после введения ЛСК.
Гематоксилин и эозин, А, Б – об.20, ок.10.
1 - эпителиальный пласт, 2 – фиброзная ткань регенерата, 3 – собственное вещество роговицы,
4 – десцеметова мембрана, 5 – внутренний эпителий.
В области лимба эпителиальный пласт был сохранен, в
субэпителиальной рыхлой соединительной ткани обнаружены расширенные
кровеносные и лимфатические сосуды, умеренная клеточная инфильтрация. В
собственном веществе роговицы выявлены сосуды микроциркуляторного
русла, незначительный отёк межклеточного вещества и диффузная клеточная
инфильтрация (рисунок 10).
1
2
3
4
5
Рисунок 10. Микроморфологическая характеристика лимбальной зоны роговицы у животных на
14 сутки после моделирования дефекта и введения суспензии ЛСК.
Гематоксилин и эозин. об.20, ок.10.
1 - эпителиальный пласт, 2 – субэпителиальная соединительная ткань, 3 – собственное вещество
роговицы, 4 – десцеметова мембрана, 5 – внутренний эпителий. Стрелками показаны
кровеносные сосуды.
Таким образом, после трансплантации ЛСК через 7 суток в 100%
случаев происходила полная эпителизация дефекта роговицы, в то время как
в контрольной группе сохранялся поверхностный дефект, а в 50% –
персистирующая эрозия. Через 14 суток в группе ЛСК выявлено
формирование по сравнению с контрольной группой более нежного бельма
роговицы (5 и 10 баллов по шкале Войно-Ясенецкого, соответственно). При
этом степень васкуляризации в группе ЛСК по сравнению с контролем,
составила 1 и 3 балла, а выраженность воспалительной реакции – 0 и 1 балл,
соответственно.
Заживление роговицы глаза кролика при использовании аллогенных
мезенхимных стволовых клеток жировой ткани
(ММСК)
Клиническая картина
На 3 сутки после введения ММСК во всех случаях наблюдали
гиперемию конъюнктивы в зоне введения клеточной суспензии, у одного
животного блефароспазм и признаки блефаромейбомиита и окрашивание
роговицы флюоресцеином. Степень её помутнения по шкале ВойноЯсенецкого составила от 1 до 4 баллов.
14
На 7 сутки эксперимента в подопытной группе животных, которым
вводили гомологичные ММСК, признаки окулярного дискомфорта
отсутствовали, вместе с тем, сохранялось незначительное (на 1,5 мм в зоне
дефекта) окрашивание роговицы флюоресцеином. Степень помутнения
роговицы по шкале Войно-Ясенецкого соответствовала 3-5 баллам
(рисунок 11).
Рисунок 11. Клиническая картина глаза кролика после введения гомо-ММСК
на 7 сутки наблюдения.
Окулярный дискомфорт, блефароспазм, фотофобия отсутствуют. Помутнение роговицы по
шкале Войно-Ясенецкого 3-5 баллов. Положительная флюоресцеиновая проба в нижней части
моделированного дефекта.
На 14 сутки после введения ММСК блефароспазм и признаки
блефаромейбомиита были выражены у двух животных (рисунок 12 А, Б).
Поверхностное окрашивание роговицы флюоресцеином, диаметром1 на 1 мм
имело место только у одного подопытного животного (рисунок 12 А). В одном
случае наблюдали неоваскуляризацию дефекта по его периферии и
стромальный отек (рисунок 12 А). Степень помутнения роговицы по шкале
Войно-Ясенецкого составила от 2 до 6 баллов.
Б
А
Рисунок 12. Макрокартина глаза экспериментальных животных на 14 сутки
после введния гомо-ММСК.
А – воспалительная реакция век, слабоположительное окрашивание роговицы флюоресцеином в
зоне дефекта, неоваскуляризация роговицы со стороны зоны введения клеточной суспензии
(стрелка);
Б – присутствует блефаромейбомиит, сохранен незначительный окулярный дискомфорт,
флюоресцеиновый тест – отрицательный, степень помутнения роговицы по шкале ВойноЯсенецкого 4 балла.
Результаты морфологических исследований
15
На 7-е сутки после трансплантации гомологичных мезенхимальных
стволовых клеток жировой ткани в большинстве случаев наблюдали
практически полное закрытие дефекта роговицы регенератом, структурно
оформленным эпителиальным пластом и соединительной тканью.
Тонкий эпителиальный пласт был представлен 2-3 слоями
эпителиоцитов, из которых базальные имели кубическую форму, а
поверхностные
—
уплощенную.
Субэпителиально
располагалась
грануляционная ткань с явлениями умеренного отёка и клеточной
инфильтрации. В собственном веществе роговицы выявлены очаги
деструкции (рисунок 13).
1
4
2
3
Рисунок 13. Микроморфологическая картина роговицы кролика на 7 сутки после
моделирования дефекта и введения суспендированной взвеси гомо-ММСК.
Толуидиновый синий, об.10., ок.10.
1 – эпителиальный пласт, 2 – грануляционная ткань, 3 – ткань основного вещества роговицы,
4 - очаг дистрофических изменений.
На 14 сутки центральная часть дефекта по структурному оформлению
была неоднородной. Так, в самом центре этой зоны (рисунок 14 А, Б)
наблюдали признаки фиброза, здесь, в эпителиальном пласте количество
слоёв клеток кубической формы увеличилось до 4-5.
1
1
2
2
А
3
Б
4
Рисунок 14. Структурное состояние центральной зоны роговицы
на 14 сутки после введения гомо – ММСК.
Гематоксилин и эозин. А – об.10, ок.10, Б – об.40, ок.10.
А, Б – область с фиброзными изменениями: 1 – регенерировавший эпителиальный пласт,
2 – фиброзная ткань, 3 – собственное вещество роговицы, 4 – десцеметова мембрана.
В лимбальной зоне дифференциация роговицы была сохранена (рисунок
15 А). Вместе с тем, здесь отмечали признаки отёка и неравномерную
клеточную инфильтрацию (рисунок 15 Б). Наряду с умеренной диффузной
16
наблюдали плотную диффузную и очаговую инфильтрацию. Кровеносные
1
2
1
2
3
А
Б
4
5
Рисунок 15. Микроструктура лимбальной зоны роговицы глаза у животных, после введения
гомо-ММСК на 14 стуки наблюдений.
Гематоксилин и эозин, А – об.10, ок.10; Б – об.40, ок.10.
А – общий вид: 1 – поверхностный эпителий, 2 – субэпителиальная соединительная ткань с
признаками клеточной инфильтрации и расширенными кровеносными сосудами,
3 – собственное вещество роговицы с явлениями отёка, 4 – десцеметова мембрана,
5 – внутренний эпителий.
Б – область с выраженной диффузно-очаговой лимфоцитарно-макрофагальной инфильтрацией
субэпителиальной соединительной ткани (2). 1 – поверхностный эпителий.
сосуды при этом были расширены.
После субьконъюнктивального введения ММСК выявлен интенсивный
регенераторный процесс в области повреждения роговицы, с
неоваскуляризацией, сопровождающийся острой воспалительной реакцией у
8 подопытных животных из 10.
Результаты применения стромально-васкулярной фракции
Клиническая картина
На 7 сутки наблюдения блефароспазм, эпифора и фотофобия
отсутствовали, вместе с тем, признаки конъюнктивита сохранялись.
Окрашивание роговицы флюоресцеином в зоне дефекта достигало диаметра
1,5-3 мм (рисунок 16 А, Б), а степень её помутнения по шкале ВойноЯсенецкого составляла 5 баллов.
А
Б
Рисунок 16. Макроморфологическая картина состояния глаз животных на 7 сутки после
моделирования дефекта и введения суспензированной взвеси стромально-васкулярной фракции.
А – блефароспазм, эпифора и фотофобия отсутствуют, положительное окрашивание
флюоресцеином в центральной зоне повреждения;
17
Б – отсутствие окулярного дискомфорта при положительном флюоресцеиновом окрашивании
роговицы, видны четкие границы зоны трепанации, незначительная гиперемия век.
На 14 сутки у всех кроликов подопытной группы регистрировали
заживление дефекта роговицы, при отсутствии признаков воспаления
конъюнктивы, блефароспазма, слезотечения и светобоязни. У всех особей
роговица была прозрачная, отсутствовала неоваскуляризация, границы
трепанационной зоны были четкими. Степень помутнения роговицы по шкале
Войно-Ясенецкого составляла 0-3 баллов (рисунок 17 А, Б).
Исключение составил один случай, с локальным прокрашиванием
роговицы диаметром 1 на 1,5 мм. Несмотря на это, у данного животного
признаков окулярного дискомфорта не выявлено (рисунок 17 Б).
Б
А
Рисунок 17. Картина глаза после введения СВФ на 14 сутки наблюдения.
А – видны четкие границы трепанации при отсутствии окрашивания флюоресцеином, степень
помутнения роговицы по шкале Войно-Ясенецкого 1 балл;
Б – положительное окрашивание дефекта флюоресцеином (1 на 1,5 мм) при отсутствии
окулярного дискомфорта, степень помутнения роговицы по шкале Войно-Ясенецкого 3 балла.
Результаты микроскопических исследований
На 14 сутки после введения клеток стромально-васкулярной фракции в
центральной зоне роговицы отмечали эпителизацию дефекта и
субэпителильно — формирование фиброзной ткани с плотно упакованными
пучками коллагеновых волокон, богатой фибробластами (рисунок 18 А, Б).
Основное вещество роговицы представлено плотно расположенными пучками
коллагеновых волокон, без явлений отёка.
1
1
2
3
4
2
А
3
Б
Рисунок 18. Микроморфологическая картина роговицы глаза экспериментального животного,
которому вводили СВФ на 7 сутки наблюдений.
Центральная зона роговицы, область с явлениями фиброза.
Гематоксилин и эозин, А – об.10, ок.10; Б – об.10, ок.20.
1 – наружный эпителий, 2 – фиброзная ткань регенерата с явлениями макрофагальнофибробластической инфильтрации, 3 – основное вещество роговицы, 4 – десцеметова мембрана.
18
По периферии от центральной области была сформирована зона с
субэпителиально созревающими грануляциями (рисунок 19 А, Б), при этом
как в грануляционной ткани, так и в собственном веществе роговицы были
выражены признаки отёка.
1
2
3
1
2
3
Б
4
А
5
Рисунок 19. Микроструктура лимбальной зоны роговицы глаза у животных после введения
СВФ на 14 сутки наблюдений. Центральная зона роговицы, область с созревающими
грануляциями.
Гематоксилин и эозин, А – об.10, ок.10. Б – об.10, ок.20.
1-наружный эпителий, 2 – созревающая грануляционная ткань, 3 – основное вещество роговицы
с признаками отёка, 4 – десцеметова мембрана, 5 – внутренний эпителий.
В лимбальной зоне роговицы обращает на себя внимание склероз
субэпителиальной рыхлой соединительной ткани с умеренным отёком и
диффузной клеточной инфильтрацией. Собственное вещество роговицы
характеризуется признаками умеренного отёка и незначительной диффузной
клеточной инфильтрацией. Десцеметова мембрана и внутренний эпителий
зонально дифференцированы (рисунок 20 А, Б).
1
1
2
2
3
3
А
4
Б
5
Рисунок 20. Структурное состояние лимбальной зоны роговицы у животных, после введния
клеток СВФ на 14 сутки наблюдений.
Гематоксилин и эозин, А – об.10, ок.10, Б – об.10, ок.20, В – об.40, ок.10.
А – общий вид: 1 – наружный эпителий, 2 – субэпителиальная соединительная ткань с
явлениями фиброза, 3 – собственное вещество роговицы с признаками умеренного отёка,
4 – десцеметова мембрана, 5 – внутренний эпителий.
Б – область с умеренной клеточной инфильтрацией и признаками прогрессирующего фиброза.
1 – наружный эпителий, 2 - субэпителиальная соединительная ткань с явлениями фиброза,
3 – собственное вещество роговицы.
19
Таблица 1
Сравнительная оценка скорости эпителизации роговицы
от периферии к центру (мм)
ЛСК
ММСК
СВФ
Контроль
3-5 суток
5,3±1,1
5,1±1
30,5*
3,5±0,7
7 суток
6,2±1,2
5,9±1,2*
4,51,1
5,1±1
14 суток
6,4±0,1
6,3±0,2
6,10,3
4,5±1,5
Все показатели сравниваемых совокупностей относительно контроля
достоверны P0,05
Примечание: * – различия между сравниваемыми величинами не достоверны
Таблица 2
Сравнительные морфометрические показатели толщины слоев
роговицы кролика
Показатели
1 Контроль
2 ММСК
3 СВФ
4 ЛСК
6 (норма)
Центральная зона
403,40±18,75
330,20±45,34
225,81±18,74
345,50±12,97
379±17,15
Лимбальная зона
Эпителиальный
слой
Строма
Десцеметова
мембрана
Эндотелиальный
слой
348,4±17,09
407,60±19,45
432,50±19,62
398,00±19,86
226±21,49
19,79±0,43
20,06 ±0,34
12,35±0,44
13,86±0,61
24,4±0,92
381,4±1,48
296,40 ±1,38
219,80±1,60
325±1,28
334±1,95
6,68±0,49
6,47±1,32
5,06±0,51
5,68±0,39
8,01±0,84
3,54±0,25*
4,73±0,41
3,93±0,51*
3,84±0,55*
3,68±0,18
Все показатели сравниваемых совокупностей относительно нормы
достоверны P0,05
Примечание: * – различия между сравниваемыми величинами не достоверны
Клиническая апробация
Применение мезенхимных стволовых клеток нами было апробировано
на пяти собаках породы метис с незаживающими эрозиями роговицы после
отсутствия положительной динамики на медикаментозное лечение.
Пациентам с данной патологией, после удаления патологического эпителия
вводили субьконъюнктивально суспензированную взвесь ММСК. Результаты
учитывали на первые, третьи и седьмые сутки при помощи флюоресцеинового
теста и биомикроскопии переднего отрезка глаза щелевой лампой фирмы Shin.
На седьмые сутки дефект был полностью эпителизирован у всех
пациентов. У одного животного была сохранена нубекула на месте бывшей
эрозии роговицы.
20
Полученные результаты доказывают эффективность применения
стволовых клеток при лечении животных с индолентными язвами и эрозиями
роговицы, как альтернативы медикаментозному лечению, поверхностной
кератоэктомии и другим методикам, которые применяют при данной
патологии (рисунок 21 А, Б).
А
Б
Рисунок 21. Клиническая картина глаза собаки с хронической эрозией роговицы при введении
ММСК. А – состояние роговицы глаза в день введения клеточной суспензии – обширная эрозия
роговицы, положительное окрашивание флюоресцеином; Б – состояние роговицы глаза на 7
сутки – отсутствуют признаки окулярного дискомфорта, флюоресцеиновый тест
отрицательный, нубекула в зоне бывшей эрозии.
В результате проведенных клинических и морфологических
исследований выявлено, что у животных, которым вводили клеточные
продукты окулярный дискомфорт после нанесения дефекта в динамике
наблюдения был менее выражен, чем у их контрольных аналогов. При
проведении биомикроскопии роговицы щелевой лампой установлено, что в
группе животных, с локальной трансплантацией гомологичных стволовых
клеток лимба, эпителизация дефекта происходила быстрее и степень ее
помутнения была наименее выражена, чем во всех исследуемых случаях, что
согласуется с результатами исследований (Поздеева Н. А., Тонаева Х. Д.,
Борзенок С. А., 2014).
Лидером по степени прозрачности роговицы явились особи, которым
вводили гомологичные стволовые клетки лимба. По количеству слоев в
центральной части роговицы опережали особи, которым вводили стромальноваскулярную фракцию, а в группе животных с трансплантированными
гомологичными стволовыми клетками лимба морфометрические показатели
роговицы были наиболее приближены к норме, чем во всех остальных
случаях.
На сегодняшний момент, наши исследования направлены на выяснение
тонких механизмов регуляции процессов дифференцировки стволовых
клеток, после трансплантации их на поверхность глаза. После подтверждения
эффективности и безопасности нового метода лечения станет возможным его
применение у пациентов с тяжелыми заболеваниями и повреждениями глаз,
ранее неизбежно приводивших к значительному снижению зрительного
восприятия и утрате зрительных функций.
При некоторых заболеваниях органа зрения нет острой необходимости
прибегать к клеточной терапии, однако при ожоговой болезни глаз или при
рецидивирующей эрозии роговицы стандартное лечение зачастую не
21
приводит к желаемым результатам. А позднее закрытие эпителиального
повреждения заканчивается необратимыми изменениями в тканях роговицы.
Поэтому в данных случаях трансплантация стволовых клеток не только
желательна, но и необходима, ведь их внедрение в организм приводит к
снижению помутнения роговицы, стимуляции процессов репаративного
гистогенеза, затуханию воспалительного процесса и нормализации кровотока
в конъюнктиве.
Положительный эффект от внедрения стволовых клеток дают такие
содержащиеся в них элементы, как цитокины, интерлейкины и факторы роста,
именно их наличие активизирует восстановительные процессы и
поддерживает жизнедеятельность клеток в тканях. Проведение процедуры
трансплантации стволовых клеток животному отличает чрезвычайная
простота, атравматичность и отсутствие необходимости хирургического
вмешательства.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
1. На основании проведенных исследований экспериментально
обоснована возможность использования разных типов клеточных продуктов в
ветеринарной офтальмологии для лечебной коррекции повреждений
роговицы, что подтверждается установленными нами ее клиникоморфологическими характеристиками у животных.
2. В экспериментальный период наблюдений у животных, подвергшихся
регенеративной терапии клеточными продуктами, воспалительная реакция на
травму была менее выражена, чем в контроле, в поврежденных тканях активно
протекали пролиферативные процессы, что косвенно указывает на индукцию
их заживления стволовыми клетками.
3. Результаты гистологического исследования позволяют заключить,
что скорость и качество заживления дефекта роговицы глаза у подопытных
животных превосходили таковые у контрольных, что согласуется с
морфометрическими линейными показателями его эпителизации у
экспериментальных животных на 14 сутки наблюдений (от 6,1±0,3 в
подопытной группе против 4,5±1,5 мм в контрольной), что может
свидетельствовать о пролиферативных потенциях стволовых клеток.
4. Сравнительный анализ регенераторного влияния разных типов
стволовых клеток показал, что эпителизация зоны дефекта роговицы у
животных после введения лимбальных СК происходила активнее и в более
короткие сроки в сравнении с животными, которым вводили другие клеточные
продукты. Лидером по количественному представительству эпителиальных
слоёв явились особи, которым вводили стромально-васкулярную фракцию (5
слоев клеток в центральной части роговицы, при анатомической норме – 6
слоев), а по толщине роговицы в зоне повреждения – стволовые клетки лимба
(345±12,97 в опыте и 379±17,15 у интактных животных).
5. Клиническое наблюдение за животными в динамике показало, что
после введения стволовых клеток лимба было более интенсивное, чем в
контроле проявление воспалительной реакции, раннее созревание
22
грануляционной ткани, быструю трансформацию ее в соединительную, а
также активизацию процесса эпителизации дефекта, что привело к
формированию органоспецифического регенерата и сокращению общих
сроков заживления.
6. Установлено, что трансплантация стромально-васкулярной фракции
экспериментальным животным восполняет полнослойный дефект роговицы с
восстановлением
его
структурной
полноценности.
В
области
индуцированного повреждения при трансплантации стволовых клеток по
сравнению с самопроизвольным заживлением, уменьшается степень
выраженности воспалительной реакции, ускоряется процесс восстановления
поврежденных тканей и прозрачности роговицы. Наилучший результат по
степени прозрачности роговицы после ее восстановления выявлен у животных
с локальной трансплантацией стволовых клеток лимба (от 0 до 4 баллов по
шкале Войно-Ясенецкого).
7. Клиническая апробация терапевтической эффективности клеточных
продуктов на пяти собаках с поверхностными повреждениями роговицы
подтверждает эффективность применения стволовых клеток лимбальной и
жировой ткани.
РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ
1. Полученные данные об особенностях морфологического и
морфометрического строения роговицы кролика вносят вклад в
сравнительную межвидовую морфологию животных и могут быть
использованы в учебном процессе на кафедрах анатомии, гистологии,
звероводства, биологии и патологии мелких домашних, лабораторных и
экзотических животных, ветеринарной хирургии, а также при написании
соответствующих разделов учебников, учебных пособий и монографий.
2. Полученные экспериментальные данные по применению стволовых
клеток разных типов являются базовыми для использования в практической
ветеринарной медицине при терапии повреждений роговицы глаза.
3. Трансплантация клеточных продуктов может быть показана
животным, при состояниях, сопровождающихся синдромом лимбальной
недостаточности, а также при кератопластике высокого риска с целью
улучшения приживления трансплантата за счет улучшения пролиферации и
миграции собственных стволовых клеток роговицы из их биологического
пула.
СВЕДЕНИЯ О ПРАКТИЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ РЕЗУЛЬТАТОВ
Результаты исследований используются в учебном процессе (при чтении
лекций и проведении лабораторно-практических занятий) и научноисследовательской работе на кафедрах анатомии и гистологии животных
имени профессора А.Ф. Климова ФБГОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени
К.И. Скрябина; морфологии, физиологии и патологии Оренбургского
аграрного университета, анатомии; акушерства и хирургии Самарской
государственной сельскохозяйственной академии; анатомии и ветеринарной
23
хирургии Казанской государственной академии ветеринарной медицины
имени Н.Э. Баумана. Полученные результаты исследований внедрены в
лечебный процесс отделения офтальмологии Инновационного ветеринарного
центра Московской ветеринарной академии.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Вологжанина Н.В. Перспективы применения стволовых клеток
различных типов в ветеринарной офтальмологии (Экспериментальное
исследование) / Слесаренко Н.А., Ставицкий С.Б., Еремин И.И. //
Естественные и технические науки. – 2013. – № 3. – С. 105
2. Вологжанина Н.В. Морфологическое обоснование применения
стволовых клеток разных типов в условиях моделированного дефекта
роговицы глаза у кролика // Морфология. – 2016. – №3. – С. 52
3. Вологжанина
Н.В.
Морфологическая
и
функциональная
характеристика регенерации роговицы после применения аутологичной
стромально-васкулярной фракции. Экспериментальное исследование. //
Ветеринария, зоотехния и биотехнология. – 2017. – №4. – С. 6
4. Вологжанина Н.В. Клеточные технологии в ветеринарной
офтальмологии // PetСовет. – 2017. – №2. – С. 17
5. Вологжанина Н.В. Аутотрансплантация лимба при унилатеральном
симблефароне у кошек / Н.А. Слесаренко, Н.В. Вологжанина // Сборник
трудов VI всероссийской межвузовской конференции по ветеринарной
хирургии 2016 г. ФГБОУ ВО МГАВМиБ – МВА имени К.И. Скрябина. – 2016.
24
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
2
Размер файла
1 579 Кб
Теги
062f837040, uploaded
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа