close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

uploaded 062FF3D047

код для вставкиСкачать
На правах рукописи
Дышловой Сергей Анатольевич
Изучение аспектов механизмов противоопухолевого действия некоторых
низкомолекулярных соединений, выделенных из морских беспозвоночных
03.01.04 – Биохимия
Автореферат диссертации на соискание ученой
степени доктора биологических наук
Владивосток – 2017
Работа выполнена в Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б.
Елякова ДВО РАН и Университетской клинике Эппендорф
Научный консультант:
доктор химических наук, профессор
Стоник Валентин Аронович
Официальные оппоненты:
Габибов Александр Габибович
доктор химических наук, профессор, Институт биоорганической химии им. академиков
М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
ВРИО директора, заведующий лабораторией
биокатализа
Булгаков Виктор Павлович
доктор биологических наук, Федеральный
научный центр биоразнообразия наземной
биоты Восточной Азии ДВО РАН, главный
научный сотрудник лаборатории биоинженерии
Имбс Андрей Борисович
доктор биологических наук, Национальный
научный центр морской биологии ДВО
РАН, заместитель директора по научной работе
Ведущая организация:
Институт молекулярной биологии им. В.А.
Энгельгардта РАН, г. Москва
Защита состоится « 24 » октября 2017 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 005.005.01 при Тихоокеанском институте биоорганической химии им. Г.Б. Елякова ДВО РАН по адресу: 690022, г. Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН. Факс: (423)231-40-50, email: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ТИБОХ ДВО РАН (г.
Владивосток, проспект 100 лет Владивостоку, 159, ТИБОХ ДВО РАН).
Текст диссертации и автореферата размещен на сайте www.piboc.dvo.ru
Автореферат разослан
«
» июля 2017 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета, к.б.н.
Черников О.В.
2
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. По данным Всемирной организации здравоохранения в 2010 году онкологические заболевания стали основной причиной
смертности в мире, обогнав по количеству летальных случаев сердечнососудистые заболевания. Несмотря на многочисленные исследования последних десятилетий по поиску и разработке новых противоопухолевых препаратов
следует признать, что на настоящий момент лечение этих заболеваний все еще
остается весьма проблематичным. Поэтому поиск новых противоопухолевых
соединений и разработка на их основе лекарственных препаратов по-прежнему,
остаётся актуальной проблемой современной науки.
С другой стороны, изучение новых природных соединений нередко открывает их неожиданные свойства, которые могут оказаться интересными и
перспективными не только для онкологии и других разделов фармакологии, но
и для клеточной и молекулярной биологии, а также биохимии. Сами эти соединения могут найти различные применения, в том числе в качестве молекулярных инструментов для различных исследований. Известно, что около 50% известных лекарственных препаратов было создано на основе природных соединений. Следует отметить, что морские метаболиты часто отличаются высокой
активностью и нередко являются хорошими молекулярными моделями для
дальнейших синтетических модификаций.
Биохимия вторичного обмена морских организмов существенно отличается от процессов, происходящих в наземных организмах. За последние 30 лет
из морских гидробионтов были выделены около 30000 новых природных соединений, несколько десятков, из которых в данный момент проходят испытания в качестве потенциальных химиотерапевтических препаратов, и ряд из них
(цитарабин, трабектидин (иондолис), эребулин мезилат, и брентуксимаб (эребулин)) уже введены в клиническую практику. В настоящее время на различных стадиях клинических испытаний находятся противоопухолевые препараты,
созданные на основе соединений, выделенных из морских беспозвоночных –
халихондринов, бриостатинов, гемиастерлина, дискодермолида, спонгистатина,
аплидина, салиноспорамида А и других.
Настоящая работа посвящена изучению особенностей молекулярного
действия серии природных соединений из морских губок, асцидий и голотурий,
в большей или меньшей степени проявляющих цитотоксические свойства в отношении опухолевых клеток. Данные соединения тестировались в большинстве
случаев на различных опухолевых клетках человека in vitro и in vivo.
Цели и задачи исследования. Целью данной работы было изучение молекулярных механизмов действия ряда морских природных соединений, проявляющих цитотоксические свойства в отношении опухолевых клеток, а также
изучение их противоопухолевого действия. Для достижения данной цели были
поставлены следующие задачи:
1. Получить в индивидуальном виде ряд соединений, ответственных
за противоопухолевую цитотоксическую активность водно-этанольных экстрактов губки Aaptos sp. и асцидии Polysincraton sp. Установить строение выде3
ленных соединений. Исследовать противоопухолевую активность выделенных
соединений in vitro, а также особенности их молекулярного действия с привлечением современных методов молекулярной и клеточной биологии, включая
протеомику.
2. Исследовать противоопухолевую in vitro активность, молекулярные
механизмы действия и зависимость «структура-активность» морского алкалоида монанхоцидина А и родственных гуанидин-содержащих алкалоидов, выделенных из морской губки Monanchora pulchra, на моделях лекарственноустойчивых и -чувствительных герминальных опухолей человека, и некоторых
других опухолевых и нормальных клетках.
3. Исследовать противоопухолевую активность и молекулярные механизмы действия морского тритерпенового гликозида фрондозида А, выделенного из дальневосточной голотурии Cucumaria okhotensis, на моделях лекарственно-устойчивого и -чувствительного рака простаты человека in vitro и in
vivo; а также в опытах in vitro – активность и молекулярные механизмы действия на моделях уротелиальной карциномы человека и лимфомы Бёркитта.
4. Исследовать противоопухолевую in vitro и in vivo активность и молекулярные механизмы действия морского биополярного сфинголипида ризохалинина на моделях лекарственно-устойчивого и -чувствительного рака
простаты человека.
Основные положения, выносимые на защиту.
1. Морская губка Aaptos sp. содержит 3-(N-морфолинил)деметилоксиааптамин, 3-(метиламино)-деметилоксиааптамин, 2,3-дигидро-2,3диоксоааптамин и 6-(N-морфолинил)-4,5-дигидро-5-оксодеметилоксиааптамин,
которые являются новыми представителями класса ааптаминовых алкалоидов.
2. Ааптаминовые алкалоиды, из морской губки Aaptos sp. обладают
канцерпревентивной, антипролиферативной и цитотоксической противоопухолевой активностью, они способны преодолевать лекарственную устойчивость
опухолевых клеток к цисплатину. Под воздействием нецитотоксических концентраций ааптамина на клетки NT2 происходит гипузинирование эукариотического фактора инициации трансляции 5A-1.
3.
Асцидиия Polysincraton sp. содержит микаламид А. Микаламид А
проявляет канцерпревентивные свойства и способность подавлять транскрипционную активность ядерных факторов AP-1- и NFκB, а также индуцирует p53независимый апоптоз опухолевых клеток.
4.
Алкалоид монанхоцидин А индуцирует цитотоксическую аутофагию и пермеабилизацию лизосомных мембран опухолевых клеток, подавляет
миграцию, а также способен преодолевать лекарственную устойчивость опухолевых клеток.
5.
Птиломикалин А-подобные соединения активируют киназы
JNK1/2 и ERK1/2, а также транискрипционную активность ядерного фактора
AP-1, индуцируя p53-независимую программируемую клеточную смерть.
Пульхранин А способен ингибировать транскрипционную активность фактора
AP-1 и активировать киназу JNK1/2, приводя к p53-независимой смерти опухо4
левых клеток. Урупоцидин А способен вызывать активацию киназ JNK1/2 и
ERK1/2 и индуцировать p53- и каспаза-независимую клеточную смерть.
6.
Фрондозид А активен в моделях лекарственно-устойчивого рака
простаты человека in vitro и in vivo. Механизм его действия включает в себя индукцию апоптоза опухолевых клеток вместе с одновременным ингибированием
цитопротекторной аутофагии. Фрондозид А способен индуцировать каспаза- и
p53-независимый апоптоз клеток уротелиальной карциномы человека in vitro,
ингибировать цитопротекторную аутофагию и усиливать цитотоксические эффекты цисплатина и гемцитабина.
7.
Фрондозид А вызывает каспаза- и p53-независимый апоптоз клеток лимфомы Бёркитта in vitro, ингибирует аутофагию и усиливает цитотоксический эффект цисплатина. Вещество способно воздействовать на митохондрии
опухолевых клеток и вызывать транслокацию апоптогенной формы AIF в ядро.
8.
Ризохалинин проявляет активность в моделях лекарственноустойчивого рака простаты человека in vitro и in vivo. Механизм его противоопухолевого действия включает в себя индукцию каспаза-зависимого апоптоза
и ингибирование цитопротекторной аутофагии. Потенциал-зависимые калиевые каналы являются одной из молекулярных мишеней исследуемого соединения.
Научная новизна и практическая ценность работы. Из губки Aaptos
sp. выделено 4 новых алкалоида ааптаминового ряда. Получены ЯМР- и массспектры новых соединений, и изучены их некоторые химические свойства.
Впервые выявлена канцерпревентивная активность соединений данного ряда, а
также охарактеризованы некоторые особенности механизма действия этих алкалоидов in vitro. Показано, что ааптамин способен активировать процесс гипузинирования эукариотического фактора инициации трансляции 5A-1 (eIF5A) –
ранее такой эффект для низкомолекулярных соединений известен не был. Из
экстракта асцидии Polysincraton sp. был выделен известный микаламид А, исследованы его канцерпревентивные свойства и некоторые детали механизма
действия. Впервые охарактеризован необычный неапоптотический механизм
цитотоксического действия алкалоида монанхоцидина А, его способность преодолевать лекарственную устойчивость опухолевых клеток, а также способность ингибировать миграцию клеток. Впервые изучены молекулярные механизмы цитотоксического действия морских гуанидиновых алкалоидов монанхоцидина B, монанхомикалина C, птиломикалина A, пульхранина A, урупоцидина А, монанхомикалина B и нормонанхоцидина D. Впервые установлено, что
морской тритепеновый гликозид фрондозид А ингибирует цитопротекторную
аутофагию опухолевых клеток, индуцирует их p53-независимый апоптоз, оказывает эффект на митохондрии и вызывает транслокацию AIF в ядро, а также
подавляет рост опухолей в моделях рака простаты человека in vivo. Впервые
исследована in vivo активность ризохалинина (агликона ризохалина) и показана
его эффективность на моделях рака простаты человека, а также исследован механизм его цитотоксического действия и способность ингибировать сигналинг
андрогенового рецептора. Полученные результаты создают основу для даль5
нейших исследований описанных веществ, как в качестве потенциальных терапевтических противоопухолевых препаратов, так и молекулярных инструментов для различных исследований.
Личный вклад автора. Автором было самостоятельно спланировано и
проведено подавляющее число описанных в настоящей работе экспериментов,
получены и проанализированы их результаты, кроме ЯМР и масс-спектров исследованных соединений, которые были получены д.х.н. Калиновским В.И. и
к.х.н. Дмитренком П.С.; идентификации белков в протеомных экспериментах,
которая была проведена доктором Симоной Фенц; экспериментов с применением электронной микроскопии, которые были выполнены профессором Керстин
Аманн. Выделение и установление структрур ааптаминовых алкалоидов и микаламида А было проведено совместно с д.х.н. Макарьевой Т.Н., к.х.н. Шубиной Л.К., д.х.н. Фёдоровым С.Н. и акад., д.х.н. Стоником В.А. Полученные результаты были самостоятельно оформлены автором в виде статей.
Апробация работы. Результаты работы представлены на международных конференциях Wilsede Meeting “Modern Trends in Human Leukemia and
Cancer” в 2012 и 2016 гг (Вильседе, Германия); на международном симпозиуме
“Efficacy of biomarkers and personalized cancer therapeutics” в 2012 г (Париж,
Франция); на международном симпозиуме FEBS Congress “Mechanisms in Biology” в 2013 г (Санкт-Петербург, Россия); на конгрессе немецкого общества гемато-онкологов в 2014 г (Гамбург, Германия); на международных симпозиумах
«Targeted Anticancer Therapies» в 2013 г, 2012 г (Амстердам, Нидерланды) и в
2011 г (Париж, Франция); на Второй международной российско-корейской
конференции «Current issues of natural products chemistry and biotechnology» в
2010 г, Новосибирск, Россия; на Международном симпозиуме по морским биоресурсам Вьетнама, 2010 г, Ханой, Вьетнам; а также на других конференциях.
Публикации. Всего опубликовано 60 работ, из которых по теме диссертации – 27, включая 17 научных статей, опубликованных в изданиях из списка
ВАК, 9 материалов конференций и 1 патент.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения,
литературного обзора, обсуждения результатов, экспериментальной части, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 422 цитируемых работы. Работа изложена на 332 страницах,
содержит 136 рисунков и 19 таблиц.
Благодарности. Автор выражает глубокую признательность своему
наставнику д.х.н. Фёдорову С.Н., а также своему научному консультанту академику Стонику В.А. Автор благодарит к.х.н. Шубину Л.К. за неоценимый
вклад в химическую часть настоящего исследования, а также работу по выделению ааптаминовых алкалоидов; д.х.н. Макарьеву Т.Н. – за предоставленные
для исследования вещества, ценные консультации, советы и идеи; м.н.с. Кузьмич А.С. – за помощь в проведении ряда биологичесих экспериментов; д.х.н.
Калиновского А.И. и к.х.н. Дмитренка П.С. – за получение и помощь в обработке спектральных данных; н.с. Красохина В.Б. – за определение видовой
принадлежности изученных морских организмов; д.х.н. Ермакову С.П. и к.б.н.
6
Аминина Д.Л. – за ряд советов по организации биологической части исследования; чл.-корр. РАН Васьковского В.Е. – за помощь в работе с научной литературой и сборе информации; к.б.н. Менчинскую Е.C. – за вклад в экспериментальную работу по изучению фрондозида А; к.х.н. Гузий А.Г., к.х.н. Табакмахер К.С., д.б.н. Калинина В.И., д.х.н. Авилова С.А., к.х.н. Сильченко А.С. – за
выделение и очистку некоторых исследуемых веществ, а также научные консультации; всех коллег из Лаборатории химии морских природных соединений
ТИБОХ ДВО РАН, и других лабораторий. Автор выражает глубокую признательность своим немецким коллегам из Университетской клиники Эппендорф
(Гамбург, Германия), и в особенности, доктору Гунхилд фон Амсбург, Джесике
Хаушильд, доктору Фридману Хонекеру, доктору Штефану Балабанову и профессору Карстену Букамаеру.
Используемые сокращения. Общие термины: 2D-Вестерн-блоттинг –
двумерный Вестерн-блоттинг; 2D-PAGE – двумерный электрофорез в полиакриламидном геле, используемый при анализе протеома клеток; AIF – апоптозиндуцирующий фактор; AR – андрогеновый рецептор; AR-V7 – андрогеновый
рецептор, вариант сплайсинга 7; BafA1 – бафиломицин A1; CQ – хлорокин; CI –
(combinational index) индекс комбинирования; DHS – деоксигипузин синтаза;
Diaz – диазоксид; DOHH – деоксигипузин гидроксилаза; eIF5A – эукариотический фактор инициации трансляции 5A-1; EGF – эпидермальный фактор роста;
IC50 – (inhibition concentration 50), концентрация исследуемого вещества, при
которой происходит уменьшение количества жизнеспособных клеток на 50%;
INCC50 – (inhibition of the number of the colonies C50) концентрация вещества,
при которой происходит ингибирование колонеобразования клеток в мягком
агаре на 50%; Minox – миноксидил; PBS – фосфатно-солевой буфер; pI – изоэлектрическая точка; PI – пропидиум йодид; PSA – простатический специфический антиген; ИФА – иммуноферментный анализ; Противоопухолевая активность – в данной работе – активность вещества по отношению к опухолевым
клеткам (in vitro и/или in vivo), так или иначе приводящая к их гибели или замедлению пролиферации; Цисплатин – цис-диаминдихлорплатина (II). Исследуемые вещества: Apt – ааптамин; DOA – деметилоксиааптамин; i-apt –
изоааптамин; iP-apt – 3-(изопентиламино)-деметилоксиааптамин; Ph-apt – 3(фенетиламино)-деметилоксиааптамин; M-DOA – 3-(N-морфолинил)-деметилоксиааптамин; ma-DOA – 3-(метиламино)-деметилоксиааптамин; MycA – микадамид А; FrA – фрондозид А; Mc-A – монанхоцидин А; Mc-B – монанхоцидин
B; Mm-C – монанхомикалин C; Pt-A – птиломикалин A; Pch-A – пульхранин A;
Ur-A – урупоцидин A; Mm-B – монанхомикалин B; nMc-D – нормонанхоцидин
D; Rhiz – ризохалинин (агликон ризохалина).
7
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объектами исследования являлись 20 низкомолекулярных соединений:
ааптаминовые алкалоиды, выделенные из морской губки Aaptos sp.; микаламид
А, выделенный из асцидии Polysincraton sp.; монанхоцидин А и другие гуанидин-содержащие алкалоиды, выделенные из морской губки Monanchora
pulchra; фрондозид А, выделенный из голотурии Cucumaria okhotensis; а также
ризохалинин (полусинтетический агликон сфинголипидоподобного соединения
ризохалина, выделенного из морской губки Rhizochalina incrustata). Биологическая активность и механизмы действия соединений были исследованы in vitro
и/или in vivo на моделях лекарственно-устойчивого и -чувствительного рака
простаты человека, лекарственно-устойчивых и -чувствительных герминальных
опухолей человека, уротелиальной карциномы человека, лимфомы Бёркитта, а
также некоторых других опухолевых и нормальных клетках.
1. Выделение и установление химического строения ааптаминовых алкалоидов
Ааптаминовые алкалоиды выделяли из двух сборов морской губки
Aaptos sp. Из водно-этанольного экстракта первого сбора губки Aaptos sp., с
помощью колоночной хроматографии на полихроме-1, силикагеле и последующей ВЭЖХ на обращенной фазе, были выделены пять ранее известных соединений: ааптамин (1), деметилоксиааптамин (2), изоааптамин (3), 3(изопентиламино)-деметилоксиааптамин
(4)
и
3-(фенетиламино)деметилоксиааптамин (5), а также один новый ааптаминовый алкалоид – 3-(Nморфолинил)-деметилоксиааптамин (6) (рис. 1). Из второго сбора губки Aaptos
sp., собранного в том же месте, но двумя годами ранее, наряду с известными
были выделены дополнительно 3 новых ааптаминовых алкалоида: 3(метиламино)-деметилоксиааптамин (7), 2,3-дигидро-2,3-диоксоааптамин (8), 6(N-морфолинил)-4,5-дигидро-5-оксо-деметилоксиааптамин (9) (рис. 1). Известные алкалоиды идентифицировали сравнением их спектральных данных с
опубликованными в литературе, структура новых соединений была установлена при помощи анализа их масс-спектров, спектров 1Н и 13С ЯМР, а также на
основании данных экспериментов HMBC, HSQC и 1D NOE.
8
OCH3
OCH3
OCH3
O
HO
CH3O
9
CH3
HN
1
2
N
N
(3)
(2)
O
CH3O
6a
3a
6
N
5
4
(2-7)
R=
H
O
N
N
HN
3
R
OCH3
OCH3
7
9b
N
N
(1)
9a
8
5'
3'
(4) R = NH
1'
4'
CH3
2'
O
N
6'
O
NH
(5) R = NH
O (8)
OCH 3
1'
(9)
3'
2'
4'
5'
6'
9'
O
O
CH3
5'
N
2'
(6) R =
4'
N
N
(6a)
(7)
7'
8'
N 1'
3'
O
2'
R=
NH CH3
1'
Pисунок 1. Ааптаминовые алкалоиды из губки Aaptos sp.
Однако полученные спектральные данные для соединения 6 не позволяли сделать однозначного заключения относительно его строения и предполагали две равновероятные структуры 6 и 6а (рис. 1). Поэтому было проведено восстановление соединения 6 / 6a дитионитом натрия с последующей обработкой
диазометаном (рис. 2), которое привело к образованию ааптамина (1) и подтвердило скелетную систему соединения 6. К настоящему времени известно
лишь несколько морфолиновых производных, выделенных из морских организмов. Алкалоид 6 является первым ааптаминовым алкалоидом, содержащим
морфолинильный фрагмент.
OCH 3
OCH3
O
CH3O
1. Na2S2O4, CH3CN+H2O
комн. т., 30 мин
N
HN
2. CH2N2, (C2H5)2O, 60 мин
N
N
N
(6)
(1)
O
Pисунок 2. Схема восстановления соединения 6
9
2. Изучение биологической активности ааптаминовых алкалоидов
2.1. Цитотоксическая активность
Цитотоксическую активность выделенных алкалоидов 1-9 по отношению к десяти линиям опухолевых клеток человека и мыши, а также одной линии нормальных мышиных эпителиальных клеток изучали MTS-методом. Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1. Цитотоксическая активность алкалоидов 1-9
Тип опухоли
Моноцитарная
лейкемия
Промиелоцитарная
лейкемия
Рак шейки матки
Рак кишечника
Рак кишечника
Меланома
Рак молочной железы
Нейробластома*
Мышиные эпителиальные
клетки**
Тестикулярная
карцинома
Тестикулярная
карцинома
(цисплатин устойчивая линия)
Клеточная
Линия
Вещество (IC50, мкM)
4
5
6
1
2
3
7
8
9
THP-1
161.3
40.9
32.2
66.3
99.6
181.6
150.2
>200
>200
HL-60
14.8
2.4
2.7
30.4
-
15.7
-
-
-
HeLa
DLD-1
SNU C-4
SK-MEL-28
MDA-MB231
Neuro2a
151.1
177.8
267
156.5
18.6
24.1
22.3
35
50.7
35.8
70.3
82.3
58.2
121.2
120.5
181.8
189.1
101.9
237.6
432.7
-
-
-
147.2
9.1
10.6
42.3
251.2
26.3
-
-
-
63.2
5
3.3
-
-
51.2
-
-
-
JB6 P+ Cl41
42.6
2.9
18.8
57.8
151.8
107.6
>200
-
-
NT2
100.5
4.4
13.2
-
-
-
-
-
-
NT2-R
106.2
4.5
12.5
-
-
-
-
-
-
* опухолевые мышиные клетки; ** нормальные мышиные клетки
Наибольшую цитотоксическую активность из выделенных веществ проявлял деметилоксиааптамин (2), немногим менее активен был изоааптамин (3),
остальные алкалоиды проявляли значительно более слабую цитотоксическую
активность. Кроме того, как видно из таблицы 1, изученные вещества проявляли более сильное цитотоксическое действие по отношению к клеткам промиелоцитарной лейкемии (HL-60). Также примечательно, что ааптамин (1), деметилоксиааптамин (2) и изоааптамин (3) показывали одинаковую цитотоксическую активность как по отношению к чувствительным, так и по отношению к
лекарственно устойчивым клеточным линиям (NT2 и NT2-R, соответственно).
2.2. Канцерпревентивная активность
Потенциальную канцерпревентивную активность ааптамина (1) и его
аналогов 2-6 исследовали методом мягкого агара. Метод основан на способности мышиных эпителиальных JB6 P+ Cl41 клеток трансформироваться в опухолевые под действием эпидермального фактора роста (EGF) в качестве промотора и образовывать колонии в мягком агаре. Проведённые эксперименты показывали, что исследуемые алкалоиды способны ингибировать злокачественную
10
трансформацию JB6 P+ Cl41 клеток в нецитотоксических концентрациях
(INCC50 приведены в таблице 2). Чем больше относительная разница между IC50
и INCC50, тем больший потенциал имеет вещество в качестве профилактического препарата. Лучший результат по этому показателю демонстрировал ааптамин (1), наиболее слабый – деметилоксиааптамин (2), для большинства алкалоидов значение IC50/INCC50 было около 10 (табл. 2). Эти результаты свидетельствовали о достаточно высоком потенциале ааптаминовых алкалоидов в качестве возможных средств для профилактики опухолевых заболеваний.
Вещество
1
2
3
4
5
6
IC50, мкM
42.6
2.9
18.8
57.8
151.8
107.6
INCC50, мкM
2.1
0.7
2.1
5.7
15.7
10.6
IC50/INCC50
20.3
4.1
9.0
10.1
9.7
10.2
Таблица 2. Значения IC50,
INCC50 и IC50/INCC50 для
алкалоидов 1-6 по отношению к клеткам JB6 P+
Cl41
Митоген-активируемые протеинкиназы ERK1/2, играют важную роль в
процессе EGF-индуцируемой опухолевой трансформации JB6 P+ Cl41 клеток, а
ингибиторы фосфорилирования ERK1/2 считаются потенциальными противоопухолевыми веществами. Однако в настоящем исследовании не было зафиксировано ингибирования EGF-индуцируемого фосфорилирования ERK1/2 в
клетках JB6 P+ Cl41 под действием алкалоидов 1-3. Напротив, в клетках, обработанных соединениями 1-3 в цитотоксических концентрациях (в отсутствии
EGF), была зафиксирована активация ERK1/2. Таким образом, ERK1/2, вероятно, играют важную роль в клеточном ответе на воздействие исследуемых алкалоидов, но, скорее всего, не опосредуют канцерпревентивный эффект, демонстрируемый соединениями 1, 2 и 3.
Показано, что обработка клеток веществами 1-3 приводит к активации
транскрипционной активности фактора AP-1. В то же время для соединений 4-7
наблюдалось ингибирование транскрипционной активности AP-1. Таким образом, изученные алкалоиды дифференцированно влияют на активность ядерного
фактора транскрипции АР-1.
Также было показано, что вещества 1-3, 5 и 6 способны активировать
NFκB-зависимую транскрипционную активность, в то время как алкалоиды 4 и
7, напротив, ингибировали её.
При исследовании эффекта алкалоидов 1-7 на транскрипционную активность белка-супрессора опухолей р53 было показано, что ааптамин (1) был
способен усиливать данную активность, в то время как все остальные соединения 2-7 ингибировали транскрипционную активность p53.
2.3. Влияние ааптамина на способность к пролиферации и жизнеспособность опухолевых клеток человека NT2
С помощью окрашивания трипановым синим было установлено, что при
действии ааптамина на клетки NT2 (50 мкМ, 48 ч) происходит ингибирование
скорости клеточного роста, что при этом не приводит к снижению жизнеспо11
собности клеток. Вестерн-блоттинг анализ показал, что ааптамин (1) в концентрациях до 50 мкМ не приводил к расщеплению PARP и активации каспазы-3.
Также было показано, что ааптамин даже в концентрациях до 100 мкМ включительно не вызывает значительного увеличения количества апоптотических клеток NT2 по сравнению с контролем (рис. 3). Таким образом, был сделан вывод,
что ааптамин в концентрациях до 50 мкМ проявляет скорее антипролиферативные, нежели чем цитотоксические свойства.
% клеток в данной фазе клеточного цикла
80
контроль
ааптамин, 50 мкM
p < 0.05
p < 0.05
60
40
н.д.
20
0
G1
S
G2/M
Pисунок 3. Исследованание апоптоз-индуцирую- Pисунок 4. Эффект аапщей активности ааптамина в клетках NT2 методом тамина на клеточный
проточной цитометрии с использованием двойного цикл клеток NT2
окрашивания аннексином-V-FLUOS и PI (А) и
окрашивание ДНК с помощью PI (Б)
Анализ распределения клеток NT2, обработанных ааптамином, по фазам
клеточного цикла выявил ингибирование прогрессии клеточного цикла в фазе
G2/M, то есть на стадии подготовки к митозу/стадии митоза (рис. 4). Это согласуется с более ранними данными об ингибировании ааптамином клеточного
цикла в G2/M фазе и увеличении экспрессии белка p21 – ингибитора циклинзависимой киназы CDK4, при обработке клеток ааптамином. Однако выполненный нами Вестерн-блоттинг и ПЦР анализ для клеток NT2 выявили только
незначительное увеличение экспрессии белка p21 и кодирующей его мРНК под
действием на клетки ааптамина. Можно предположить, что разные клеточные
линии неодинаково реагируют на воздействие ааптамина.
2.4. Исследование белков, регулируемых при действии нецитотоксических
концентраций ааптамина на NT2 клетки
На следующей стадии был исследован эффект ааптамина на протеом
клеток NT2. Белки обработанных ааптамином клеток разделили с помощью 2DPAGE. Полученный двумерный гель, представляет собой картину экспрессии
различных белков в виде окрашенных кумасси бриллиантовым синим G-250
12
белковых пятен (рис. 5). Далее было проведено сравнение данной картинки с
профилем экспрессии белков в необработанных веществом клетках.
Pисунок 5. 2D-электрофореграмма
экстракта
клеток NT2, обработанных ааптамином. На 2Dгеле отмечены регулируемые белки и представлены названия соответствующих им генов
Всего было выявлено 909 белковых пятен, интенсивность окраски 10 из
которых изменилась в 2 раза и более после обработке клеток ааптамином. Интенсивность окраски пяти пятен 1-5, при обработке клеток веществом уменьшалась, а пятен 6-10 увеличивалась. Все 10 белковых пятен вырезали из геля, и
обработали трипсином с целью получения набора пептидов, которые далее
проанализировали с помощью тандемной масс-спектрометрии. Содержащиеся в
вырезанных пятнах белки были идентифицированы на основании сравнения
полученных масс-спектров образующихся из них пептидов с информацией из
баз данных. В результате выяснили, что ап-регулируемые под действием ааптамина пятна на 2D-PAGE геле соответствовали белкам, кодируемым генами
PEA15, TPT1, CTSD CRABP2 и CFL1, даун-регулируемые пятна – белкам, кодируемым генами EIF5A, ENO1, CSDE1, ACL6A и SRSF3. Пятно 11 на рисунке
5 соответствует одной из изоформ белка eIF5A (гипузинированная изоформа),
что было выяснено в ходе дальнейших экспериментов.
Далее более подробно исследовали изменения, происходящие с четырьмя белками, наиболее существенно регулируемыми при действии ааптамина на
клетки NT2: даун-регулируемые эукариотический фактор инициации трансляции 5A-1 (eIF5A) и альфа-энолаза, а также ап-регулируемые кофилин-1 и
CRABP2. Эти белки принимают участие в таких процессах, как регулирование
клеточного роста, апоптоз, дифференциация, и пролиферация.
Регуляция интенсивности белкового пятна на 2D-PAGE геле, а, следовательно, и общего внутриклеточного уровня соответствующего белка или одной
из его изоформ, может быть вызвана изменением концентрации кодирующей
белок соответствующей мРНК (транскрипционный уровень), изменением уровня экспрессии белка (трансляционный уровень), посттрансляционной модификацией белка (в случае изменения интенсивности пятна, соответствующей одной из изоформ белка), а также деградацией белка, либо одной из его изоформ.
Для того чтобы понять, какие процессы стали причиной наблюдаемой регуля13
ции внутриклеточных уровней четырёх вышеупомянутых белков, применили
метод полимеразно-цепной реакции в реальном времени с обратной транскриптазой (ПЦР-РВ). Результаты ПЦР-РВ выявили ап-регуляцию уровня мРНК, соответствующей двум из четырёх белков – CRABP2 и кофилину-1 (рис. 6). Однако, увеличение количества мРНК, кодирующей кофилин-1, было не столь велико (~50%, рис. 6).
Pисунок 6. Уровни экспрессии мРНК, кодирующих четыре белка, наиболее сильно регулируемых под действием ааптамина на клетки
NT2 (согласно результатам 2D-PAGE). н.д.: не
достоверно (статистически недостоверное отличие значений друг от друга, p > 0.05, t-тест
Стьюдента)
Изменения, происходящие с белками eIF5A, альфа-энолаза, кофилин-1 и
CRABP2, были исследованы с помощью Вестерн-блоттинга и 2D-Вестернблоттинга. В результате для белка eIF5A было показано его гипузинирование
под действием ааптамина на NT2 клетки (рис. 7А). Процесс гипузинирования
представляет собой присоединение остатка спермидина к лизину (Lys50) с образованием гипузина (рис. 8), что приводит к активации eIF5A. Содержание негипузинированной модификации белка (pI = 5.0) уменьшалось в обработанных
ааптамином NT2 клетках (рис. 7А), в то время как определённое методом Вестерн-блоттинга общее количество белка оставалось неизменным. Этот факт
хорошо коррелировал с данными ПЦР-РВ (рис. 6) и свидетельствовал о накоплении гипузинированной формы eIF5A (pI = 5.2, рис. 7А), то есть активации
белка.
2D-Вестерн-блоттинг выявил несколько пятен, соответствующих нескольким изоформам белка альфа-энолаза. Было показано увеличение внутриклеточных уровней одних изоформ альфа-энолазы с одновременным уменьшением других (рис. 7Б) по сравнению с контролем. В то же время Вестернблоттинг не выявил никаких существенных изменений в общем количестве
альфа-энолазы (рис. 7Б), что согласуется с данными ПЦР-РВ (рис. 6).
Для белка CRABP2 с помощью 2D-Вестерн-блоттинга было выявлено 2
белковых пятна с Mw = 16 кДа, но с разными значениями pI (pI = 5.3 и pI = 5.5,
рис. 7В). Дальнейшие исследования показали, что пятно, находящееся в более
кислой области значений pI (pI = 5.3), принадлежит белку CRABP1 и было распознано поликлональными антителами против CRAPB2 вследствие их перекрёстной реактивности. В результате белковое пятно с pI = 5.5, интенсивность
которого увеличивается после обработки клеток NT2 ааптамином, было идентифицировано как CRAPB2 (рис. 7В). Поскольку ПЦР-РВ анализ также показал
значительное увеличение уровня соответствующей белку CRAPB2 мРНК (рис.
14
6), то очевидно, что ап-регуляция белка CRABP2 в клетках NT2 под действием
ааптамина происходит на транскрипционном уровне.
Pисунок 7. Результаты анализа методом Вестерн-блоттинга и 2DВестерн-блоттинга изменений, происходящих с белками eIF5A (А), альфаэнолазой (Б), CRABP2 (В) и кофилином-1 (Г) под действием ааптамина на
клетки NT2
Для кофилина-1 2D-Вестерн-блоттинг показал наличие двух пятен с pI =
6.7 и pI = 7.0 (рис. 7Г). Известно, что кофилин-1 способен претерпевать такую
посттрансляционную модификацию, как фосфорилирование. Ранее пятно, располагающееся в более кислой области pI (pI = 6.7), было описано как фосфорилированная (неактивная) форма кофилина-1, а в менее кислой области (pI = 7.0)
– как нефосфорилированная (активная) форма. Таким образом, наблюдаемое
увеличение интенсивности окраски пятна с pI = 6.7 свидетельствует о
стимулировании фосфорилирования, то есть о накоплении неактивной формы
кофилина-1 вследствие обработки NT2 клеток ааптамином (рис. 7Г).
2.5. Эффект ааптамина на процесс гипузинирования белка eIF5A в клетках
NT2
Известно, что eIF5A способен претерпевать уникальный процесс гипузинирования – включения в структуру белка (по положению Lys50) остатка
спермидина с дальнейшим гидроксилированием последнего. Данные процессы
15
контролируются ферментами деоксигипузин синтазой (DHS) и деоксигипузин
гидроксилазой (DOHH), соответственно. Лимитирующей стадией процесса является катализируемое DHS присоединение остатка спермидина (рис. 8). Гипузинирование необходимо для активирования белка eIF5A и его участия в процессах клеточной пролиферации и дифференциации.
Pисунок 8. Процесс
гипузинирования белка
eIF5A (Meier et al., 2010)
Был исследован процесс гипузинирования белка eIF5A под действием
ааптамина в концентрации 50 мкМ на NT2 клетки. Исследование масс-спектров
продуктов расщепления белков, содержащихся в пятнах 1 (негипузинированная
форма eIF5A) и 11 (гипузинированная форма eIF5A, см. рис. 5), выявило наличие остатка гипузина в белке, содержащемся в пятне 11 и его отсутствие в
пятне 1. Для подтверждения факта увеличения гипузинирования eIF5A под
действием ааптамина на клетки NT2 был проведён эксперимент, основанный на
уникальном свойстве белка eIF5A включать в свою молекулу остаток спермидина в процессе гипузинирования как in vitro, так и in vivo. В полном соответствии
с
результатами
2D-Вестерн-блоттинга,
а
также
массспектрометрического анализа, обработка NT2 клеток ааптамином в концентрациях 1-50 мкМ в присутствии 3H-сперминдина в течение 48 ч привела к дозазависимому повышению уровня радиоактивности общего белкового экстракта,
что свидетельствовало о повышении уровня потребления спермидина, а, следовательно, и о накоплении гипузинированной (активной) формы белка eIF5A. С
целью выяснения механизма данного эффекта, было исследовано влияние ааптамина на уровни экспрессии DHS и DOHH (ключевых ферментов процесса
гипузинирования) в NT2 клетках, а также на активность in vitro выделенного в
чистом виде DHS – фермента, катализирующего лимитирующую стадию процесса гипузинирования (рис. 8). Однако существенных изменений в уровнях
экспрессии DHS и DOHH в клетках NT2 под действием ааптамина зафиксировано не было. Также, не было выявлено изменения уровня in vitro ферментативной активности DHS в присутствии ааптамина. В то же время, не исключено, что ааптамин является модулятором активности DHS в живых клетках NT2,
действуя на какие-то иные факторы, отсутствующие в нашем эксперименте по
исследованию in vitro ферментативной активности очищенного DHS.
Описанное активирование процесса гипузинирования eIF5A при действии ааптамина на NT2 клетки – это первый случай данного явления, зафикси16
рованный для низкомолекулярного соединения. Для того, чтобы понять вклад
активации белка eIF5A в производимый ааптамином антипролиферативный
эффект, была исследована скорость пролиферации NT2 клеток со сверхэкспрессированным DHS. Сверхэкспрессия фермента DHS ожидаемо вызвала повышение уровня гипузинированого (активного) eIF5A на ~20%, однако это не
привело ни к активированию пролиферации NT2 клеток, ни к ее ингибированию. Таким образом, активирование eIF5A не обуславливает антипролиферативные свойства ааптамина в NT2 клетках.
2.6. Исследование воздействия ааптамина, деметилоксиааптамина и
изоааптамина на лекарственно-устойчивые NT2-R клетки тестикулярной
карциномы человека
По сравнению с «нормальными» NT2 клетками, клетки NT2-R проявляют высокую устойчивость к противоопухолевому препарату цисплатину, применяемому для лечения тестикулярной карциномы человека. С помощью MTSметода было показано, что алкалоиды 1, 2 и 3, в отличие от цисплатина, проявляют одинаковую цитотоксическую и/или антипролиферативную активность по
отношению к клеткам NT2 и NT2-R. С использованием метода окрашивания
клеток трипановым синим было установлено IC50 для ааптамина (1), деметилоксиааптамина (2) и изоааптамина (3) составляют 50 мкМ, 4.5 мкМ и 12.5 мкМ
соответственно. В последующих экспериментах эффекты алкалоидов 1, 2 и 3
были исследованы в этих концентрациях.
Pисунок 9. Исследование способности алкалоидов 1, 2 и 3 индуцировать
апоптоз клеток NT2-R: показаны экстернализация фасфотидилсерина (А),
фрагментация ДНК (Б), а также эффект на PARP и каспазу-3 (В)
С помощью проточной цитометрии была показана способность деметилоксиааптамина и изоааптамина индуцировать апоптоз в клетках NT2-R в концентрациях IC50 (рис. 9А, Б). Ааптамин же в концентрации IC50 практически не
индуцировал апоптоз в клетках NT2-R (рис. 9А, Б) и, следовательно, его эффект
на клетки NT2-R в данной концентрации также, как и на клетки NT2, является
антипролиферативным, но не цитотоксическим.
Индукция апоптоза в клетках NT2-R под действием алкалоидов 2 и 3
была подтверждена Вестерн-блоттингом, который выявил активацию каспазы-3
и расщепление PARP в обработанных исследуемыми веществами клетках (рис.
17
9В). На основании полученных результатов был сделан вывод о перспективности дальнейшего изучения исследуемых соединений как потенциальных
средств терапии лекарственно-устойчивых типов опухолей.
Далее были проанализированы изменения в протеоме устойчивых к
цисплатину клеток NT2-R, обработанных алкалоидами 1, 2 или 3 в концентрациях IC50. При анализе экстракта клеток NT2-R после воздействия на них ааптамина на гелях было выявлено 22 белковых пятна с изменённой в 2 и более раза интенсивностью окраски. Интенсивность семи соответствующих пятен в обработанных клетках увеличивалась, пятнадцати – уменьшалась. С помощью
1D- и 2D-Вестерн-блоттинга было показано, что при действии ааптамина (1) на
клетки NT2-R, аналогично клеткам NT2, происходит гипузинирование белка
eIF5A, а также фосфорилирование кофилина-1. Кроме того, показано происходящее под действием ааптамина дефосфорилирование виментина. Известно,
что подобный процесс наблюдается при регулировании стадии митоза клеток и
связан с разборкой и реорганизацией виментиновых филаментов.
При анализе экстракта клеток NT2-R после воздействия на них деметилоксиааптамина (2) на гелях было выявлено 16 белковых пятен. Интенсивность
шести пятен в обработанных клетках увеличивалась, десяти – уменьшалась. С
помощью 1D- и 2D-Вестерн-блоттинга было показано, что при действии деметилоксиааптамина на NT2-R клетки происходит увеличение общего количества
шаперона Hsp70, который, взаимодействуя с другими шаперонами, стабилизирует белки, предохраняет их от агрегации и обеспечивает правильное сворачивание (фолдинг) вновь синтезируемых белков. Кроме того, было показано изменение соотношения изоформ альфа-энолазы в NT2-R клетках при обработке
клеток деметилоксиааптамином. Интересно, что в отличие от ааптамина, деметилоксиааптамин не приводил к увеличению гипузинирования белка eIF5A.
При анализе экстракта клеток NT2-R после воздействия на них изоааптамина (3) на гелях было выявлено 17 белковых пятен. Интенсивность 13 пятен
в обработанных клетках увеличивалась, четырёх – уменьшалась. С помощью
1D- и 2D-Вестерн-блоттинга было показано, что при действии изоааптамина на
клетки NT2-R происходит увеличение количества изоформы нуклеолина с Mw
100 кДа и pI = 5.4, при этом основное количество нуклеолина находилось в виде комплекса с Mw = 110 кДа и pI ≥ 7.0. Появление данной регулируемой изоформы (белковое пятно с pI = 5.4), по всей видимости, свидетельствует о разрушении вышеупомянутого комплекса при действии изоааптамина на клетки.
Также как и в случае деметилоксиааптамина, обработка клеток изоааптамином
не приводила к гипузинированию белка eIF5A.
По результатам анализа воздействия ааптамина, деметилоксиааптамина
и изоааптамина на протеом NT2-R клеток не было выявлено ни одного одинакового белка, который бы регулировался всеми тремя исследуемыми алкалоидами.
С помощью классификационной системы PANTHER был проведён
функциональный анализ белков, регулируемых в клетках NT2-R при действии
исследуемых алкалоидов. Примечательно, что при практически полном отсут18
ствии совпадений в регулируемых белках, наблюдалось значительное сходство
в их профилях распределения по молекулярным функциям и участию в биологических процессах. Установлено, что большинство этих белков обладает каталитической, а также ДНК- и белок-связывающей активностями и принимает
участие в таких биологических процессах, как метаболизм белков и нуклеиновых кислот, а также организация клеточных компонентов.
Анализ взаимодействий белков, регулируемых под действием алкалоидов 1, 2 и 3 в клетках NT2-R, а также белков, предположительно участвующих в
клеточном ответе на воздействие исследуемых веществ, был произведён с помощью программы IPA. В центре построенной гипотетической сети взаимодействий в случае ааптамина находятся прото-онкоген MYC и белок-супрессор
опухолей p53 (TP53). В случае деметилоксиааптамина центральную позицию
занимает фактор некроза опухолей TNF, а в случае изоааптамина – все три мишени, MYC, TP53 и TNF, одновременно. Таким образом, предположительно,
механизмы действия ааптамина, деметилоксиааптамина и изоааптамина могут
быть до определённой степени сходными.
3. Выделение и установление химического строения микаламида А
Микаламид А (10, рис. 10А) – ранее известное педерин-подобное соединение – был выделен из образца асцидии Polysincraton sp. с помощью колоночной хроматографии на силикагеле и обращенной фазе и последующей
ВЭЖХ на обращенной фазе. Микаладид А был идентифицирован сравнением
его спектральных данных с опубликованными ранее в литературе.
4. Исследование биологической активности микаламида А
Исследование канцерпревентивной активности микаламида А показало,
что он способен ингибировать EGF-индуцируемую неопластическую трансформацию клеток JB6 P+ Cl41 в очень низких, фемтомолярных концентрациях.
INCC50 микаламида А составляла 0.137 ± 0.035 нM (рис. 10Б). При этом IC50
микаламида А по отношению к тем же клеткам, определённая методом с использованием прокрашивания клеток трипановым синим, составляла 6.32 ± 1.31
нМ. Таким образом, канцерпревентивный эффект микаламида А наблюдался в
концентрациях как минимум в 50 раз меньших, чем цитотоксические. Кроме
того, микаламид А в нецитотоксических концентрациях ингибировал формирование и рост колоний клеток HeLa в слое мягкого агара (INCC50 = 0.67 нМ, при
этом цитотоксическая активность по отношению к этим же клеткам была IC50 =
5.5 ± 0.8 нМ) (рис. 10В).
19
Pисунок 10. (А) Структура микаламида А (10). Ингибирование EGFиндуцируемой неопластической трансформации клеток JB6 P+ Cl41 (Б) и колонеобразования человеческих опухолевых клеток HeLa в мягком агаре (В) под
действием микаламида А. * - статистически достоверное отличие от контроля
(р ≤ 0.05, t-тест Стьюдента)
Апоптоз-индуцирующая активность микаламида А в клетках JB6 P+ Cl41
была исследована с помощью метода проточной цитометрии с использованием
двойного окрашивания красителями аннексин-V-FLUOS и пропидий йодид
(рис. 11А), а также Вестерн-блоттинга (рис. 11Б). Примечательно, что хотя количество жизнеспособных клеток снижалось после 48 ч обработки микаламидом А в концентрациях > 1.25 нМ, индукция апоптоза наблюдалась только при
концентрациях > 6.25 нМ (рис. 11А, Б). Таким образом, снижение числа жизнеспособных клеток JB6 P+ Cl41, наблюдаемое при обработке малыми концентрациями микаламида А, было обусловлено скорее ингибированием их пролиферации, нежели индукцией программируемой клеточной смерти.
Pисунок 11. Индукция апоптоза в клетках JB6 P+ Cl41 под действием
микаламида А. (А) FACS-анализ с использованием двойного окрашивания аннексином-V-FLUOS и пропидий йодидом. (В) Вестерн блоттинг анализ белковых экстрактов клеток JB6 P+ Cl41, обработанных микаламидом А
Было исследовано влияние микаламида А на MAPK-зависимые сигнальные пути. Вестерн блоттинг анализ белкового экстракта клеток JB6 P+
Cl41, обработанных микаламидом А в течение 1 ч, выявил доза-зависимую индукцию фосфорилирования киназ p38, JNK1/2 и ERK1/2. Активирование киназ
p38 и JNK1/2 может быть вовлечено в индукцию микаламидом А апоптоза. Та20
ким образом, сигнальные пути, в которых задействованы киназы p38, JNK1/2 и
ERK1/2, предположительно могут принимать участие в клеточном ответе на
воздействие микаламида А.
Известно, что ингибирование транскрипционной активности факторов
AP-1 и NF-κB приводит к подавлению EGF-индуцируемой неопластической
трансформации клеток JB6 P+ Cl41. В настоящем исследовании было показано,
что микаламид А способен ингибировать транскрипционную активность факторов AP-1, NF-κB и p53 в нецитотоксических концентрациях (после 6 ч обработки, рис. 12А-В). Также примечательно, что в отличие от многих других
проапоптотических веществ, микаламид А вызывал ингибирование p53зависимой транскрипционной активности, что может свидетельствовать о p53независимом характере индуцируемого апоптоза.
Pисунок 12. Эффект микаламида А на AP-1- (А), NF-κB- (Б) или p53(В) зависимую транскрипционную активность и жизнеспособность клеток JB6
Cl41. * - статистически достоверное отличие от контроля (р ≤ 0.05, t-тест Стьюдента)
5. Исследование биологической активности гуанидиновых алкалоидов
морской губки Monanchora pulchra
5.1. Биологическая активность монанхоцидина А (Mc-A)
5.1.1. Цитотоксическая активность Mc-А
Исследование цитотоксической активности монанхоцдинина А (Mc-A,
11, рис. 13А) выявило тот факт, что герминальные опухолевые клетки, клетки
рака простаты (включая клетки, устойчивые к гормональной терапии), а также
клетки рака мочевого пузыря имели уровень чувствительности к Mc-A в интервале IC50 = 0.2 – 0.5 мкМ, в то время как нормальные клетки человека были менее подвержены цитотоксическому действию вещества (IC50 = 0.7 – 0.8 мкМ)
(рис. 13Б). Важно отметить, что клеточные линии NCCIT-R и 2102EP-R (лекарственно-устойчивые линии GCT) проявили пониженную чувствительность к
действию цисплатина (рис. 13В), в то время как Mc-A показал схожий уровень
активности по отношению ко всем исследованным опухолевым клеточным линиям (рис. 13Б). Более того, было показано, что клетки рака мочевого пузыря,
были в 20-80 раз более чувствительны к Mc-A, чем к цисплатину. Кроме того,
21
цитотоксическая активность цисплатина по отношению к цисплатинустойчивым NCCIT-R клеткам могла быть повышена при его комбинировании
с Mc-A (рис. 13Г).
Pисунок 13. Структура монанхоцидина А (Mc-A) (А). Эффект Mc-A (Б)
и цисплатина (В) на опухолевые и нормальные клетки человека. Эффект Mc-A
в комбинировании цисплатином на цисплатин-устойчивые NCCIT-R клетки (Г).
Индекс комбинирования был рассчитан с помощью программы CompuSym
v.1.0
С помощью метода Вестерн-блоттинга было показано, что Mc-A вызывает время- и доза-зависимое активирование таких маркеров классического
апоптоза, как PARP и каспаза-3 (рис. 14А). Весьма неожиданно была обнаружена необычная способность Mc-A вызывать деградацию различных белков,
как при обработке клеток высокими концентрациями вещества (20 - 50 мкМ) в
течение короткого времени (1 ч, рис. 14Б), так и при обработке малыми концентрациями (0.5 - 2 мкМ) в течение продолжительного времени (48 ч, рис. 14В).
При этом важно отметить, что наблюдаемая белковая деградация начинается до
того момента, как становятся заметны признаки индукции апоптоза (рис. 14Г)
и, следовательно, не является результатом апоптотических процессов.
22
Pисунок 14. Анализ белкового экстракта клеток NCCIT-R, обработанных Mc-A, на наличие маркеров индукции апоптоза (А). Способность Mc-A индуцировать деградацию α-тубулина и -актина в клетках NCCIT-R, обработанных Mc-A в течение 1 ч (Б) или 48 ч (В). Анализ экстракта NCCIT-R клеток
NCCIT-R, обработанных Mc-A в течение 1 - 3 ч, на предмет на деградации αтубулина и активирование маркеров апоптоза (Г). Клетки, обработанные 10
мкМ цисплатина в течение 48 ч (Цис) использовали в качестве положительного
контроля
Значительные изменения в составе белков клеток NCCIT-R под действием на них Mc-A были обнаружены и при разделении этих белков на полиакриламидном геле с последующим окрашиванием геля кумасси брилиантовым синим (рис. 15). Интенсивное белковое пятно, обнаруженное в нижней части геля в области низких молекулярных масс было исследовано более подробно. Анализ образцов 1 и 2 (рис. 15) методом тандемной масс-спектрометрии
(после включающей трипсинолиз пробоподготовки) выявил несколько пептидов, принадлежавшие исходным белкам, имеющим большую молекулярную
массу (11-80 кДа). Таким образом, был сделан вывод о неспецифической белковой деградации, происходящей под действием Mc-A на опухолевые клетки.
Pисунок 15. Результаты электрофоретического исследования белкового
экстракта NCCIT-R клеток, обработанных 50 мкМ Mc-A в течение 1 ч.
Белки, находящиеся в верхней части
геля (область >15 кДа), подвергли переносу на PVDF мембрану с последующим окрашиванием геля кумасси
бриллиантовым синим. Нижнюю часть
геля окрасили без предварительного
переноса белков
23
Неспецифическая массивная деградация клеточных белков является,
безусловно, летальным событием. Известно несколько процессов, которые могли бы привести к ней. Данными процессами могут являться активность каспаз,
кальпаина, аутофагия, активность лизосом и различных протеаз. В связи с этим
была исследована роль данных процессов в реализации цитотоксического действия Mc-A на опухолевые клетки. Клетки NCCIT-R предварительно обработали специфическими ингибиторами вышеупомянутых процессов, после чего
подвергли их действию Mc-A. В этих экспериментах были использованы: ингибитор активности каспаз z-VAD-fmk, ингибитор ранних стадий аутофагии 3метиладенин (3-МА); ингибитор активности лизосом NH4Cl; ингибитор кальпаина – кальпептин; ингибитор активности цистеиновых, сериновых и треониновых протеаз леупептин; а также коктейль ингибиторов протеаз «cOmplete
Mini EDTA-free» от компании Roche. Поскольку некоторые из данных ингибиторов в индивидуальном виде были цитотоксичными, то их эффект на цитотоксические свойства Mc-A исследовали с помощью метода Чоу-Талалая. Данный
метод позволяет различить синергетический, аддитивный или антагонистический эффект препаратов однонаправленного действия при их одновременном
применении. В результате было установелено, что, ингибитор аутофагии – 3MA – проявляет наиболее сильный антагонистический эффект на цитотоксическую активность Mc-А (рис. 16). На основании этого, было выдвинуто предположение о том, что индукция аутофагии играет важную роль в реализации цитотоксического эффекта Mc-A.
Pисунок 16. Результаты исследования эффекта специфических ингибиторов активности каспаз, протеаз, лизосом, кальпаина и
ранних стадий аутофагии на жизнеспособность NCCIT-R клеток, обработанных Mc-A в
течение 48 ч. Индекс комбинирования был
рассчитан с помощью программы CompuSym
v.1.0 при 50% реализации цитотоксического
эффекта комбинации препаратов
Затем были проанализированы уровни экспрессии белков-маркеров
аутофагии LC3B-I/II. Было обнаружено, что уровни экспрессии обоих изоформ
данного белка повышаются после воздействия Mc-A – как краткосрочного воздействия высоких концентраций, так и долгосрочного воздействия малых концентраций (рис. 17А, Б). Кроме того, формирование аутофагосомальных вакуо24
лей (структур, содержащих двойную мембрану) было обнаружено в обработанных Mc-A клетках NCCIT-R при исследовании их методом электронной микроскопии (рис. 17В). Известно, что повышение экспрессии белков LC3B-I/II и
формирование аутофагосомальных вакуолей может являться свидетельством,
как активации, так и ингибирования аутофагии, которая в свою очередь может
быть как цитопротекторной, так и цитотоксической. В связи с этим было проведено исследование влияния ингибитора аутофагии 3-MA на способность McA индуцировать белковую деградацию. Предварительная обработка клеток ингибитором 3-MA приводила к частичной отмене белковой деградации (рис.
17Г). На основании этого был сделан вывод, что Mc-A индуцирует цитотоксическую аутофагию опухолевых клеток NCCIT-R, а неспецифическая белковая
деградация, индуцируемая Mc-A, является аутофагия-зависимой.
Pисунок 17. Анализ экспрессии белков-маркеров аутофагии LC3B-I / II
в NCCIT-R клетках, обработанных Mc-A в течение 48 ч (А) или 1 ч (Б). Результаты исследования NCCIT-R клеток, необработанных (0 мкМ) или (2 мкМ) обработанных Mc-A (2 мкМ, 48 ч), методом электронной микроскопии (В). Обработка клеток веществом приводила к появлению в цитоплазме аутофагосом
(обозначены стрелками). Анализ белкового экстракта клеток NCCIT-R, обработанных Mc-A в течение 48 ч совместно с ингибитором 3-MA или в его отсутствии. После обработки клетки были собраны, белки экстрагированы и разделены при помощи электрофореза в 15% полиакриламидном геле
В то же время обработка клеток 3-MA не приводила к отмене белковой
деградации, вызванной Mc-A, в концентрациях >2 мкМ. Таким образом, в концентрациях исследуемого вещества >2 мкМ реализуется иной механизм цитотоксического действия, отличный от цитотоксической аутофагии. Было сделано
предположение, что этот процесс может быть вызван пермеабилизацией (нарушение целостности) лизосомных мембран (ПЛМ). Известно, что в отличие от
других метаболитических процессов, ПЛМ может начинаться очень быстро после воздействия стимула и приводить к быстрой белковой деградации за счет
25
выхода во внутриклеточное пространство лизосомных протеаз. Для того чтобы
проверить это предположение, была исследована целостность лизосом с использованием лизосомотропного метахроматического флуоресцентного красителя акридинового оранжевого (АО). При облучении синим светом концентрированный (например, при его локализации в интактных лизосомах) АО испускает красную флуоресценцию, в низкой же концентрации - зелёную (при его
локализации в цитозоле и ядре, например, в случае ПЛМ). Было обнаружено
исчезновение красной флуоресценции и одновременное увеличение зелёной
флуоресценции при обработке NCCIT-R клеток 50 мкМ Mc-A в течение короткого времени (1 ч.) Данное наблюдение свидетельствовало об индукции ПЛМ
исследуемым веществом (рис. 18А). Схожий эффект был обнаружен в клетках,
обработанных хлорохином – веществом, способным индуцировать ПЛМ в своих высоких концентрации (300 мкМ), и поэтому использованному как положительный контроль (рис. 18А). Более того, дополнительным доказательством индукции ПЛМ был выход лизосомной протеазы – катепсина В – в межклеточное
пространство. Данное явление наблюдалось в клетках, обработанных Mc-A в
концентрациях ≥ 2 мкМ (рис. 18Б).
Pисунок 18. Индукция пермеабилизации лизосомных мембран клеток
NCCIT-R под действием Mc-A. Хлорохин (CQ) был использован в качестве положительного контроля. Клетки были обработаны веществами в течение 1 ч,
окрашены акридиновым оранжевым и DAPI (А). Интактные лизосомы были
идентифицированы как органеллы, испускающие интенсивную красную флуоресценцию (показаны стрелками) (А). Клетки были обработаны веществом в
течение 48 ч, иммобилизированны на стеклянной подложке и прокрашены последовательно первичными антителами (специфичными к катепсину B) и вторичными антителами (меченными Alexa Fluor 488) (Б). Микрофотографии были
сделаны при увеличении × 100. Масштаб: 1 = 50 мкм
Таким образом, Mc-A является высокоактивным цитотоксическим морским природным соединением. Mc-A показал перспективную in vitro активность на моделях опухолей мочеполовой системы, включая лекарственноустойчивые клеточные линии. Описанное свойство, вероятнее всего, связано с
необычным, по сравнению с классическими химиотерапевтическими препара26
тами, механизмом действия этого алкалоида, который включает индукцию цитотоксической аутофагии и ПЛМ. Предполагаемые механизм цитотоксической
активности показан на рисунке 19.
Pисунок 19. Предположительный механизм цитотоксического действия
Mc-A.
5.1.2. Эффект Mc-A на протеом клеток NCCIT-R
Для дальнейшего исследование Mc-A как потенциального противоопухолевого препарата, необходима идентификация белковых мишеней, а также
исследование эффектов вещества в нецитотоксических концентрациях. Для
этого, с помощью метода глобального протеомного скрининга, были исследованы изменения, происходящие в протеоме опухолевых клеток NCCIT-R под
действием 0.5 мкМ или 1 мкМ Mc-A в течение 48 ч. Профили белковой экспрессии клеток, обработанных Mc-A, а также контрольных клеток были проанализированы с помощью 2D-PAGE и сравнены между собой. Всего в обоих
экспериментах было идентифицировано 84 белковых пятна, которые были вырезаны из геля, прокрашенного кумасси бриллиантовым синим, и подвергнуты
трипсинолизу и идентификации методом тандемной масс-спектрометрии. Примечательно, было установлено, что в ряде случаев несколько белковых пятен
представляют один и тот же белок, например eIF5A (2 пятна пятна), SQSTM (7
пятен), HSP7C (два пятна), и другие. Данный феномен может быть объяснен
присутствием нескольких белковых изоформ и/или посттрансляционных модификаций. Более детальный анализ изменений происходящих с некоторыми из
целевых белков выявил даун-регуляцию одной из этих изоформ, имеющей
pI=5.0, что, скорее всего, связано с изменением его фосфорилирования; апрегуляцию общего количества apoE; а также регуляцию двух белковых пятен,
соответствующих eIF5A и имеющих pI=5.0 и 5.2 (ап-регуляция и даунрегуляция соответственно), что свидетельствовало о сдвиге равновесия Hyp5027
eIF5A → Lys50-eIF5A (т.е. ингибировании процесса гипузинирования белка
eIF5A) в клетках NCCIT-R под действием на них Mc-A.
Анализ полученных данных был произведён с помощью программы IPA
(рис. 20). В результате было предсказано, что функциональные категории «клеточное движение» (9 процессов), а также рост и пролиферация клеток (4 процесса) должны быть наиболее сильно подавляемы в клетках NCCIT-R под действием на них Mc-A (рис. 20). В то же время было предсказано, что процессы,
ассоциированные с клеточной смертью и выживанием (6 процессов) были
наиболее сильно активированы под действием Mc-A (рис. 20). Примечательно,
что только один процесс – миграция клеток – относящийся к функциональной
категории «клеточное движение», имел статистически достоверное изменение
значения z-оценки (z-оценка < 2, p < 0.05, t-тест Стьюдента, рис. 20), а, следовательно, был достоверно подавляем под действием вещества на клетки. Таким
образом, биоинформатический анализ, предсказал анти-миграторную активность Mc-A.
Pисунок 20. Функциональный анализ белков, регулируемых под действием Mc-A на клетки NCCIT-R, проведённый с использованием программы
IPA (www.ingenuity.com) и алгоритма z-оценки. Биологические процессы, для
которых была предсказана активация, имеют z-оценку > 0, для которых было
предсказано их ингибирование - имеют z-оценку < 0. Для всех представленных
на рисунке процессов p < 0.05 (t-тест Стьюдента), что означает, что связь между
набором регулируемых белков и определённой биологической функцией является статистически достоверной
Для того, чтобы проверить полученное предположение, был проведён
эксперимент по исследованию ингибирования клеточной миграции с использованием непокрытых вставок (инсёртов) для 12-луночного планшета (рис. 21).
Анти-миграторная активность вещества была проверена на нескольких линиях
опухолевых клеток человека – NCCIT-R, 2102EP, PC-3 и DU145. В результате
для всех четырёх клеточных линий было показано, что Mc-A в концентрации ≤
0.25 мкМ был способен существенно ингибировать способность различных
опухолевых клеток к миграции (рис. 21). При этом концентрации Mc-A ≤ 0.25
мкМ не вызывают ингибирование ни пролиферации, ни жизнеспособности опухолевых клеток. Кроме того, было показано, что Mc-A способен ингибировать
28
колонеобразоване опухолевых клеток человека из единичных клеток, предварительно обработанных веществом в течение 48 ч.
Pисунок 21. Оценка эффекта Mc-A на способность клеток к миграции.
Клетки были помещены в планшетные вставки в среде, содержащей исследуемое вещество, как показано на рисунке, и проинкубированы в течение 48 ч. После чего клетки были зафиксированы и окрашены. Количество клеток, мигрировавших на внешнюю сторону мембраны, было подсчитано с помощью инвертированного микроскопа
Исследование обработанных Mc-A клеток методом иммунофлуоресцентной микроскопии выявило изменения в морфологии клеток: округление
формы клеток, а также нарушение организации цитоскелета (возможно вследствие влияния на актин или тубулин). Полученные результаты говорят о том,
что Mc-A может обладать способностью предотвращать инвазию и метастатическое распространение опухолевых клеток.
5.2. Цитотоксическая и in vitro канцерпревентивная активность гуанидиновых алкалоидов губки Monanchora pulchra
На следующем этапе работы была исследована способность Mc-A (11), а
также некоторых других минорных гуанидин-содержащих алкалоидов морской
губки Monanchora pulchra (12-18) предотвращать неопластическую трансформацию клеток. Исследуемыми алкалоидами являлись монанхоцидин А (Mc-A,
11), монанхоцидин B (Mc-B, 12), монанхомикалин C (Mm-C, 13), птиломикалин
A (Pt-A, 14), пульхранин A (Pch-A, 15), урупоцидин A (Ur-A, 16), монанхомикалин B (Mm-B, 17), и нормонанхоцидин D (nMc-D, 18) (рис. 22).
29
Pисунок 22. Гуанидиновые алкалоиды губки Monanchora pulchra
Способность гуанидиновых алкалоидов 11-18 предотвращать EGFиндуцируемую неопластическую трансформацию клеток была изучена на модели мышиных эпителиальных клеток JB6 P+ Cl41 с использованием метода
мягкого агара. Изученные алкалоиды были способны предотвращать трансформацию клеток JB6 P+ Cl41 в микро- и наномолярных концентрациях (табл. 3).
Примечательно, концентрации, в которых наблюдался данный канцерпревентивный эффект (INCC50) были в 3-8 раз меньше, чем соответствующие цитотоксические концентрации (табл. 3). Наиболее высокие значения индекса
IC50/INCC50 наблюдались для соединений Mc-A, Mc-B и Ur-A (табл. 3). Высокие
значения индекса IC50/INCC50 говорят о том, что соединение может обладать
выраженной канцерпревентивной активностью без существенных побочных
эффектов.
Таблица 3. Значения IC50, INCC50 и IC50/INCC50 для алкалоидов 11-18 по
отношению к клеткам JB6 P+ Cl41 и HeLa
No
Вещество
11
12
13
14
15
16
17
18
Монанхоцидин A (Mc-A)
Монанхоцидин B (Mc-B)
Монанхомикалин C (Mm-C)
Птиломикалин A (Pt-A)
Пульхранин A (Pch-A)
Урупоцидин A (Ur-A)
Монанхомикалин B (Mm-B)
Нормонанхоцидин D (nMc-D)
Цисплатин
Цитотоксическая активность, IC50 [мкМ], 48 ч
Клетки
Клетки
HeLa
JB6 P+ Cl41
1.39
2.01
0.58
1.36
1.84
1.31
1.1
0.5
51
58
28.7
27
1.5
1.72
2.1
5.2
4.75
30.2
30
INCC50 [мкМ]
Клетки
JB6 P+ Cl41
0.27
0.17
0.26
0.17
9.35
3.2
–
–
–
IC50/INCC50
Клетки
JB6 P+ Cl41
7.4
8
5
2.9
6.2
8.4
–
–
–
Было показано, что Pch-A (15) способен подавлять AP-1-зависимую
транскрипционную активность в нецитотоксических концентрациях, которые
были, по крайней мере, в 70 раз меньше чем IC50. Птиломикалин А-подобные
соединения 11-14 вызывали активацию фактора AP-1 в концентрациях, предшествующих цитотоксическим (через 12 ч обработки клеток веществами). При
этом Ur-А (16) не оказывал существенного влияния на AP-1-зависимую транскрипционную активность. Далее был исследован эффект соединений на киназы JNK1/2 и ERK1/2 – ап-стрим регуляторы активности AP-1 в клетках JB6
Cl41. Было установлено, что все соединения за исключением Pch-A (15) в концентрациях близких к IC50 были способны вызывать активацию (фосфорилирование) киназ JNK1/2 и ERK1/2. Pch-A вызывал активацию JNK1/2, но не
ERK1/2. Для того, чтобы доказать важность киназы JNK1/2 для реализации цитотоксического ответа исследуемых алкалоидов, был проведён эксперимент по
совместной обработке клеток алкалоидами 11-18 и SP600125 – известным ингибитором JNK1/2. Было показано, что данный ингибитор способен противодействовать проявлению цитотоксической активности соединений 11-15, 17, и
18, но не Ur-A (16), несмотря на то, что активация JNK1/2 наблюдалась при обработке клеток Ur-A (16). Кроме этого, был исследован эффект алкалоидов 1116 на транскрипционную активность белка p53. Было показано, что обработка
клеток JB6-Luc p53 данными соединениями не приводит к активации транскрипционнай активности p53. В то же время в обработанных соединениями
опухолевых клетках HeLa были обнаружены признаки индукции программируемой клеточной смерти – фрагментация ДНК и активация каспазы-3/7. Кроме
того, было показано, что Pch-A не оказывал эффекта на прогрессию клеточного
цикла опухолевых клеток HeLa, в то время как Ur-A индуцировал арест цикла в
фазе G2/M, а все остальные соединения – в фазе S.
Таким образом, все соединения, кроме пульхранин А (15), были способны индуцировать арест клеточного цикла, а также фрагментацию ДНК опухолевых клеток (признак программируемой клеточной смерти, которая, повидимому, не носит апоптотический характер). Птиломикалин А-подобные соединения 11-14 активировали киназы JNK1/2 и ERK1/2, а также транискрипционную активность ядерного фактора AP-1, индуцируя p53-независимую программируемую клеточную смерть (рис. 23А).
Пульхранин А (15) индуцировал киназу JNK1/2, активация которой также вела к p53-независимой клеточной смерти. Однако, в отличии от птиломикалин А-подобных соединений, обработка клеток пульхранином А (15) не приводила к активации киназы ERK1/2. Более того, пульхранин А (15) показал
мощную ингибирующую активность по отношению к фактору AP-1. Данная активность проявлялась в концентрациях, намного меньших IC50 (рис. 23Б).
Другой структурно отличающийся алкалоид урупоцидин А (16) индуцировал фосфорилирование киназ JNK1/2 и ERK1/2. В то же время, в отличии от
других соединений, наблюдаемая активация JNK1/2 не была важна для реализации цитотоксической активности урупоцидина А (16). Кроме того, в отличии
от других соединений, p53-независимая клеточная смерть, индуцируемая уру31
поцидином А (16), не сопровождалось изменением AP-1-зависимой транскрипционной активности или активности каспазы-3/7. Эти данные говорят о том,
что механизм цитотоксического действия данного алкалоида отличается от механизма действия других исследуемых соединений (рис. 23В).
Pисунок 23. Механизм цитотоксического действия исследованных алкалоидов 11-14 (А), 15 (Б) и 16 (В) на клетки JB6 Cl41.
6. Исследование противоопухолевоой активности тритерпенового гликозида фрондозида А (FrA)
6.1. Противоопухолевая активность FrA на моделях рака простаты человека
Целью настоящего исследования было изучение активности фрондозида А (FrA, рис. 24)
на клетках рака простаты, устойчивых к депривации андрогенов
Фрондозид А (FrA)
(кастрации). Поэтому последую(19)
щие основные эксперименты были выполнены с использованием
клеток PC-3 и DU145, которые
Pисунок 24. Структура фрондозида А являются нечувствительными к
андрогенной депривации.
(FrA)
O
H3C
O
CH3
H
H
H
O
H3C
O
CH3
OAc
CH3
OH
NaO3SO
CH3
O
O
OH
CH2OH
O
O
O
OMe
HO
OO
OH
HO
OH
OH
HO
OH
Цитотоксическая активность FrA была исследована на линиях клеток
рака простаты человека PC-3, DU145, VCaP, 22Rv1 и LNCaP, а также нормальных неопухолевых человеческих клетках линий MRC-9, HEK 293T и HUVEC с
помощью MTT-теста (рис. 25). Клетки PC-3 и DU145, являясь андрогеннезависимыми, были одинаково чувствительны к действию FrA, в то время как
32
6
6
5
5
IC50 [мкM], 48 ч
IC50 [мкM], 48 ч
андроген-зависимые клетки линии LNCaP были более чувствительны к действию вещества. Примечательно, что линии клеток рака простаты 22Rv1 и
VCaP, обе экспрессирующие альтернативный вариант 7 сплайсинга андрогенного рецептора (AR-V7) и, вследствие чего, являющиеся устойчивыми к действию препаратов энзалутамида и абиратерона, были также чувствительны к
действию FrA. Цитотоксический эффект FrA на нормальные клетки человека
был существенно меньше, нежели эффект на клетки рака простаты
4
3
2
Pисунок 25. Эффект FrA на жизнеспособность пяти линий клеток рака простаты, а также нормальных неопухолевых клеток человека, измеренные с
помощью MTT-теста после 48 ч обработки клеток веществом. * - статистически достоверное отличие значений
от контроля (p ≤ 0.05, t-тест Стьюдента)
*
4
3
2
1
1
0
0
-3 45 aP v1 aP -9 EC 93
PC U1 NC 22R VC RC UV K 2
D L
M H
E
H
Кл
ки
ет
ра
ка
ос
пр
ты
та
ь
ал
ны
е
кл
ки
ет
м
ор
Н
Также было показано, что в нецитотоксических концентрациях FrA был
способен ингибировать формирование колоний клеток PC-3, DU145 и 22Rv1,
после обработки клеток в течение 48 ч.
Примечательно, FrA проявлял различный эффект на прогрессию клеточного цикла разных опухолевых клеток. Так, обработанные FrA клетки PC-3, показали арест клеточного цикла в фазе G2/M, в то время для клеток DU145 и
LNCaP не было выявлено какого-либо эффекта. Данный факт может быть связан с более выраженным увеличением экспрессии белка p21 под действием FrA
на клетки PC-3, по сравнению с клетками DU145 и LNCaP. Наблюдаемая в обработанных FrA клетках доза-зависимая фрагментация ДНК, а также экстернализация фосфатидилсерина (рис. 26А) свидетельствовала об индукции апоптоза. Примечательно, что ингибирование активности каспаз с помощью ингибитора zVAD существенно уменьшала долю апоптотических клеток в экспериментах с клетками линии DU145, но не с клетками линий PC-3 или LNCaP (рис.
26А). В то же время предварительная обработка ингибитором zVAD существенно снижала апоптоз-индуцирующий эффект анизомицина – известного
индуктора классического апоптоза – во всех трёх клеточных линиях (рис. 26Б).
Проведённый с помощью метода Вестерн-блоттинга анализ эффекта FrA
на экспрессию ряда белков в клетках PC-3 и DU145 выявил индукцию таких
маркеров апоптоза, как расщеплёный PARP и активированная каспаза-3, апрегуляцию про-апоптотических белков Bax, Bad и PTEN, а также даунрегуляцию анти-апоптотических белов сурвивина и Bcl-2.
33
Pисунок 26. Исследование методом проточной цитометрии эффекта ингибитора активности каспаз zVAD на проапоптотический эффект FrA и анизомицина. Экстернализация фосфатидилсерина была измерена методом проточной цитометрии с использованием двойного окрашивания клеток аннексиномV-FITC и PI. * - статистически достоверное отличие от контроля (р ≤ 0.05, tтест Стьюдента)
Был показано, что при действии FrA на клетки PC-3 происходит увеличение уровня экспрессии LC3B-II (рис. 27А), вакуолизации цитоплазмы (рис.
27Б), формирование двухмембранных структур (рис. 27В), перераспределение
содержащегося в цитозоли LC3B-I/II в аутофагосомы и аутолизосомы, а также
увеличение внутриклеточного количества этих органелл (рис. 27Г). Однако, в
зависимости от типа клеток и стимула, накопление LC3B-II может быть признаком как инициации, так и ингибирования аутофагии. Изучение кинетики аккумуляции-деградации LC3B-II показало, что при обработке клеток FrA, а также ингибиторами поздних стадий аутофагии – бафиломицином А1 (BafA1) или
хлорокином (CQ) – наблюдалась время-зависимая аккумуляция LC3B-II (рис.
27Д). В противоположность этому, в клетках, обработанных рапамицином (Rapa, индуктор аутофагии) или находящихся в условиях голодания (стимуляция
аутофагии), наблюдалось кратковременное повышение уровня экспрессии
LC3B-II, а затем его устойчивое ингибирование (рис. 27Д). 3-MA, будучи ингибитором начальный стадий аутофагии, не вызывал значительных изменений в
уровнях экспрессии LC3B-I/II (рис. 27Д). Таким образом, был сделан вывод,
что FrA является ингибитором поздних стадий аутофагии.
Обработка клеток комбинацией FrA и 3-MA выявила аддитивный цитотоксический эффект, что говорит о том, что оба вещества могут иметь однонаправленный биологический эффект, т.е. способны ингибировать цитопротекторную аутофагию в опухолевых клетках.
Исследование эффекта FrA на протеом клеток PC-3 выявило регуляцию
30 различных белковых пятен под действием FrA. В экспериментах по валидации полученных результатов, помимо прочего, методами 1D- и 2D-Вестернблоттинга было показано увеличение уровня экспрессии белков IL-1β и CrkII,
34
даун-регуляция активированной формы катепсина B, а также ап-регуляция одной специфической изоформы кератина 81. Биоинформатический анализ протеомных данных показал, что около половины предсказанных наиболее релевантных биологических процессов и молекулярных путей были так или иначе
связаны c иммунными процессами. Также было предсказано, что такие транскрипционные факторы как CREB1, c-Myc, SP1, p53, а также андрогеновый рецептор (AR) могут быть также вовлечены в клеточный ответ на обработку FrA.
Pисунок 27. (A) Вестерн-блоттинг анализ экспрессии белка LC3B-I/II в
обработанных FrA клетках PC-3. Детектирование вакуолей методом световой
микроскопии (Б), а также аутофагосом/аутолизосом (обозначены стрелками)
методами электронной (В) и иммунофлуоресцентной микроскопии (Г). Вестерн-блоттинг анализ экспрессии белка LC3B-I/II в клетках PC-3, обработанных FrA, CQ, BafA1, Rapa, 100% PBS (симуляция голодания) или 3-MA в течение 48 ч (Д)
Эффективность и токсичность FrA in vivo была изучена на мышиных
моделях ксенографтов человеческих клеток рака простаты PC-3 и DU145, при
этом FrA вводили внутрибрюшинно в дозе 0.1 мг/кг/день или 0.8 мг/кг/день соответственно (рис. 28А). Было показано, что FrA существенно снижал количество опухолевых клеток в лёгочной ткани животных (рис. 28Б), количество лёгочных микрометастазов (для ксенографтов клеток PC-3, рис. 28В), а также количество циркулирующих в крови опухолевых клеток (рис. 28Г).
В целом, FrA был хорошо переносим животными, не было замечено изменений в поведении, весе тела животных, а также каких-либо признаков боли
или стресса. Наблюдаемое увеличение количества лимфоцитов и моноцитов, а
35
также увеличение селезёнки в группе животных, которым вводили FrA, может
говорить об иммуностимулирующей активности FrA. Данные наблюдения хорошо согласуется как с более ранними публикациям, так и с результатами биоинформатического анализа, который предсказал эффект FrA на процессы, так
или иначе связанные с иммунитетом.
Pисунок 28. Рост опухолей в мышиных ксенографтах клеток PC-3 или
DU145 (животные линии NOD SCID) (А). Квантификация опухолевых клеток в
лёгочной ткани с помощью Alu-ПЦР в реальном времени (Б). Квантификация
лёгочных микрометастазов при помощи гистологического прокрашивания гематоксилином-эозином (В), метастазы отмечены астериском (*), кровяные сосуды – жёлтыми стрелками. Квантификация опухолевых клеток в крови животных с помощью Alu-ПЦР в реальном времени (Г). Статистически достоверное
отличие от контроля: * р ≤ 0.05, ** р ≤ 0.01, t-тест Стьюдента
6.2. Противоопухолевая активность FrA на моделях уротелиальной карциномы человека
FrA проявил цитотоксическую активность по отношению к шести клеточным линиям уротелильной карциномы человека (RT112, RT4, HT-1197,
486p, T-24 и ЕСС-SUP), имея IC50 в пределах от 0.55 мкM до 2.33 мкM. Примечательно, что применяемый при лечении данного типа рака препарат цисплатин
был существенно менее активен. Цитотоксичность FrA реализовывалась посредствам индукции апоптоза, который был ассоциирован с активацией каспазы-3, -8, и -9, а также расщеплением PARP и регуляцией белков Bax и p21. Несмотря на наблюдаемую активацию каспаз, ингибирование их активности при
помощи ингибитора zVAD не снижало про-апоптотический эффект FrA в клет36
ках RT112. В то же время, про-апоптотический эффект анизомицина значительно снижался под действием zVAD. На основании этих результатах, был
сделан вывод о каспаза-независимом характере индуцируемого FrA апоптоза в
клетках уротелальной карциномы человека. FACS анализ не выявил какоголибо существенного эффекта FrA на прогрессию клеточного цикла клеток
RT112.
Обработка клеток FrA приводила к ингибированию активных форм киназ p38 и ERK1/2, и одновременной активации JNK1/2. Активация JNK1/2 может играть про- или анти-апоптотическую роль, в зависимости от типа клеток,
природы стимула и других факторов. Было показано, что ингибирование
JNK1/2 с помощью ингибитора SP600125 приводит к усилению цитотоксического эффекта FrA, таким образом, активация JNK1/2 под действием FrA является в данном случае анти-апоптотическим фактором.
Также была показана важная способность FrA индуцировать апоптоз
опухолевых клеток вне зависимости от наличия и активности белка p53 (рис.
29А-Д). Данное свойство FrA было доказано с помощью двух методов – подавления экспрессии гена p53 с помощью siRNA (рис. 29В), а также ингибирования транскрипционной активности p53 при помощи пифитрина-α (Pif-α) (рис.
29Г, Д). В подтверждение этих результатов было показано, что FrA проявляет
одинаковую активность по отношению к клеткам уротелиальной карциномы
человека, экспрессирующих как дикий (линии RT112, RT4 и HT-1197), так и
мутантный (линии T-24 и TCC-SUP) тип белка p53. Примечательно, что FrA
был даже немного более активен в клетках с подавленной экспрессией или заингибирванной активностью белка p53 – в противоположность этому цисплатин был менее активен в таких клетках.
Pисунок 29. Эффект FrA на экспрессию p53 в клетках RT112 (А). Эффект трансфекции клеток RT112 с помощью p53 siRNA (Б). Жизнеспособность
клеток с подавленным уровнем экспрессии p53, обработанных FrA или цисплатином (В) (определена методом проточной цитометрии после 48 ч обработки).
Эффект Pif-α на цитотоксическую активность FrA (Г) и цисплатина (Д) в нетрансфецированных клетках RT112 (определена с помощью MTT-теста после
37
48 ч обработки). Статистически достоверное отличие значений от контроля: * p
≤ 0.05, ** p ≤ 0.01, *** p ≤ 0.001 (t-тест Стьюдента)
Кроме того, было показано, что FrA способен одновременно индуцировать апоптоз и, в отличие от других цитотоксических веществ, ингибировать
аутофагию в клетках уротелиальной карциномы. Вывод о способности ингибировать аутофагию был сделан на основе обнаруженной доза- и времязависимой аккумуляции LC3B-II, а также иммуноцитохимического анализа,
выявившего аккумуляцию LC3B-II-положительных структур (рис. 30А). Также
было показано, что FrA проявляет сильный синергический эффект при его комбинировании с другими химиотерапевтическими препаратами цисплатином и
гемцитабином (рис. 30Б). Этот эффект, по крайней мере, отчасти может быть
объяснён способностью FrA ингибировать цитопротекторную аутофагию, поскольку схожая картина наблюдалась ранее при комбинации цисплатина с другими ингибиторами аутофагии на клетках уротелиальной карциномы человека.
Pисунок 30. Аккумуляция аутофагосом под действием FrA на клетки
RT112 (А). Органеллы, окрашенные антителами к LC3B-I/II (аутофагосомы и
аутолизосомы) обозначены стрелками. Эффект FrA в комбинации его с цисплатином или гемцитабином (Б). Индекс комбинирования (CI) был рассчитан с
помощью программы CompuSyn v.1.0.
6.3. Противоопухолевая активность FrA на моделях лимфомы Бёркитта
Для FrA была показана способность время- и доза-зависимо ингибировать жизнеспособность восьми линий клеток лимфомы Бёркитта, а именно, BL2, Daudi, DG-75, EB1, Namalwa, Raji, Ramos, а также клетки CA46, которые являются устойчивыми к множественным цитотоксическим стимулам вследствие
пониженной экспрессии ряда проапоптотических белков. В зависимости от
клеточной линии, после обработки клеток FrA в концентрации 0.3 мкМ в течение 48 ч, их жизнеспособность была снижена до 13 – 68%.
Апоптотические маркеры, такие как активированные каспаза-3, расщепление PARP, экстернализация фосфатидилсерина и фрагментация ДНК, а также
снижение экспрессии анти-апоптотических белков сурвивина и Bcl-2 были обнаружены в обработанных FrA клетках. При этом ингибирование активности
каспаз с помощью ингибитора zVAD не приводило к снижению цитотоксической активности FrA. В то же время, наличие активных каспаз было критичным
для реализации цитотоксической активности анизомицина. Также эффект ани38
зомицина на активацию каспаз был значительно более выражен, по сравнению
с эффектом FrA. Кроме того, FrA был одинаково активен в клетках с низким
(CA46 и Namalwa) и высоким (BL-2 и Ramos) уровнем экспрессии каспазы-3, в
то время как активность анизомицина существенно коррелировала с уровнем
экспрессии данного белка. Таким образом, был сделан вывод о способности
FrA индуцировать неклассический каспаза-независимый апоптоз клеток лимфомы Бёркитта.
В общем случае, каспаза-независимая клеточная смерть может быть реализована по одному из нескольких сценариев. Один из таких сценариев – это
митохондриальный стресс. Данное событие может приводить к последующему
выходу в цитоплазматическое пространство некоторых митохондриальных
белков, что в свою очередь ведёт к инициации каспаза-независимой клеточной
гибели. Одним из таких медиаторов является AIF (апоптоз-индуцирующий
фактор). После выхода из митохондрий AIF переходит в свою апоптогенную
форму (57 кДа) и транслоцируется в ядро, где вызывает конденсацию хроматина с последующей каспаза-независимой клеточной гибелью. В проведённых
экспериментах был показан выход таких белков, как цитохром С, HtrA2/Omi и
AIF из митохондрий клеток CA46, BL-2 и Ramos обработанных FrA. Данное
событие было детектировано с помощью Вестерн-блоттига (рис. 31А). Более
того, был обнаружен переход прекурсорной формы AIF (67 кДа) в апоптогенную форму (57 кДа), а также увеличение уровня апоптогенной формы AIF в
ядерной фракции обработанных FrA клеток (рис. 31А). Выход AIF из митохондрий в цитоплазму был также подтверждён с помощью иммунофлуоресцентного анализа клеток CA46, обработанных FrA (рис. 31Б). Более того, в подтверждение влияния фрондозида А на митохондрии клеток лимфомы Бёркитта, было показано уменьшение продукции активных форм кислорода ROS в обработанных FrA клетках CA46 (рис. 31В), что может быть объяснено нарушением
митохондриальной целостности.
Также было показано, что FrA индуцирует апоптоз в клетках лимфомы
Бёркитта независимо от статуса и активности белка p53, в то время как цитотоксическая активность цисплатина зависела от транскрипционной активности
p53. Дополнительно была показана способность FrA ингибировать аутофагию в
клетках лимфомы Бёркитта. Таким образом, FrA был способен индуцировать
каспаза- и p53-независимый апоптоз клеток лимфомы Бёркитта в наномоляных
концентрациях, который может быть связан с индуцируемым митохондриальным стрессом и транслокацией апоптогенной формы AIF в ядро.
39
Pисунок 31. Эффект FrA на выход некоторых митохондриальных белков
в цитоплазматическое пространство и их транслокацию в ядро (А). Иммуноцитохомический анализ локализации AIF в клетках CA46, обработанных 0.6 мкM
FrA в течение 48 ч (Б). Локализованный в митохондиях AIF обозначен стрелками (Б). Эффект FrA и H2O2 на уровень ROS в клетках CA46 (В). Статистически достоверное отличие от контроля: * р < 0.05 (t-тест Стьюдента)
7. Исследование противоопухолевой активности «двухголового» сфинголипидоподобного соединения ризохалинина на моделях рака простаты человека
Была исследована циNH
OH
тотоксическая
активность
CH
CH
ризохалинина (Rhiz, рис. 32)
NH
O
OH
Ризохалинин (Агликон ризохалина, Rhiz) (20) по отношению к клеткам пяти линий рака простаты чеPисунок 32. Структура ризохалинина (Rhiz)
ловека – PC-3, DU145,
LNCaP, 22Rv1 и VCaP.
2
3
3
2
Соединение проявляло цитотоксическую активность по отношению к
данным клеточным линиям в низких микромолярных концентрациях (0.46 мкМ
– 1.37 мкМ). Наиболее сильный цитотоксический эффект наблюдался по отношению к клеткам 22Rv1 и VCaP, содержащим один из транскрипционных вариантов андрогенного рецептора, AR-V7, экспрессия которого ответственна за
устойчивость данных клеток к препаратам абиратерону и энзалутамиду.
40
Про-апоптотическая активность Rhiz была исследована на клетках PC-3
и DU145. Показано, что обработка клеток соединением способна индуцировать
фрагментацию ДНК, время- и доза-зависимую активацию каспазы-3 и экстернализацию фосфатидилсерина. Предварительная обработка клеток ингибитором каспаз zVAD существенно уменьшала количество апоптотических клеток,
что говорило о каспаза-зависимом характере индуцируемого апоптоза. Также
было показано, что обработка клеток Rhiz приводит к ап-регуляции таких проапоптотических белков, как p21, p53 и Bad, а также расщеплению PARP и активации каспазы-8. В то же время наблюдалась даун-регуляция антиапоптотического сурвивина. Уровни экспрессии белков Bax, Pak1, каспазы-9 и
Bcl-2 не изменялись.
Далее был исследован эффект Rhiz на аутофагию в клетках PC-3. Показана способность Rhiz вызывать сдвиг соотношения LC3B-I / LC3B-II в сторону
аккумуляции LC3B-II. Факт формирования и аккумуляции двухмембранных
структур (аутофагосом/аутолизосом) под действием Rhiz на опухолевые клетки
был также подтверждён методом электронной микроскопии. Кроме того, используя метод иммунофлуоресцентной микроскопии, был подтверждён факт
формирования и аккумуляция LC3B-I/II-позитивных структур. С помощью метода Чоу-Талалая был доказан аддитивный цитотоксический эффект Rhiz в его
комбинации с 3-метиладенином. Наконец, показано, что обработка клеток Rhiz
приводит к время-зависимой аккумуляции LC3B-II. Точно такая же картина
наблюдалась в случае обработки клеток ингибиторам аутофагии BafA1 и CQ. В
то время как индукция аутофагии под действием Rapa или в условиях голодания, приводит к кратковременному повышению уровня экспрессии LC3B-II, а
затем его устойчивому ингибированию, как это было показано в экспериментах
по исследованию активности фрондозида А (рис. 27Д).
Было установлено, что обработка клеток BafA1 приводила к ингибированию цитотоксического эффекта Rhiz. Помимо способности BafA1 ингибировать аутофагию, известно также его способность выступать в качестве ионофора ионов калия, т.е. обеспечивать их перенос через мембрану. Таким образом,
можно предположить, что один из механизмов цитотоксического действия Rhiz
заключается в его способности ингибировать калиевые каналы. В подтверждении этого показано, что известные активаторы (открыватели) калиевых каналов
– миноксидил (Minox) и диазоксид (Diaz) – способны ингибировать цитотоксический эффект Rhiz в опухолевых клетках PC-3 и DU145 (рис. 33А, Б). Кроме
того, был показан прямой ингибирующий эффект Rhiz на потенциал-зависимые
калиевые каналы heag1 и Kv1.3 в экспериментах in vitro и использованием экспрессионной системы, основанной на ооцитах лягушки Xenopus. Показано, что
Rhiz в концентрации 10 мкМ быстро и обратимо индуцировал 50% ингибирование heag1-зависимого тока (рис. 33В). Более высокие концентрации Rhiz были способны ингибировать Kv1.3-зависимый ток (рис. 33Г).
41
Pисунок 33. Эффект Minox (А) и Diaz (Б) на цитотоксическую активность Rhiz, измеренный MTT-методом. Эффект Rhiz на токи, опосредованные
калиевыми каналами heag1 (В) и Kv1.3 (Г). Пунктиром отмечены уровни нулевого напряжения. Статистически достоверное отличие от контроля: * р < 0.05
(t-тест Стьюдента)
Была исследована способность Rhiz воздействовать на экспрессию ARV7 (варианта сплайсинга 7 андрогенного рецептора, AR-variant 7) и AR-FL (андрогеновый рецептор полной длины, AR-full length) в клетках 22Rv1 и VCaP.
Rhiz был способен вызывать снижение уровня экспрессии AR-V7 в клетках, в
то время как экспрессия AR-FL не изменялась (рис. 34А). Было показано, что
обработка клеток Rhiz приводит к снижению экспрессии PSA и IGF-1 – двух
генов-мишеней AR-рецептора, находящихся ниже по сигнальному каскаду (рис.
34Б, В). Примечательно, что в клетках VCaP Rhiz индуцировал даун-регуляцию
IGF-1, хотя изменения уровня экспрессии PSA обнаружено не было. На основании полученных данных был сделан вывод, что Rhiz способен возвращать ARV7-положительным клеткам 22Rv1 и VCaP чувствительность к энзалутамиду
(Enza).
42
Pисунок 34. Эффект Rhiz на экспрессию AR-V7 и AR-FL (А), IGF-1 (Б)
и PSA (В) и в клетках 22Rv1, VCaP и LNCaP. Уровень экспрессии PSA (концентрация PSA в супернатанте культуральной среды) был измерен с помощью метода ИФА и был нормализован к количеству жизнеспособных клеток. * - статистически достоверное отличие от контроля (р ≤ 0.05, t-тест Стьюдента)
Исследование протеома обработанных Rhiz клеток PC-3 выявило регуляцию таких белков как статмин, LASP1, Grp75, кератин 81 и прекурсорной
формы IL-1β. Биоинформатический анализ данных предсказал антимиграторную активность Rhiz, а также его эффект на киназу ERK1/2, что было
подтверждено последующим функциональным анализом. Дополнительно было
показано, что ингибирование сигнального пути MEK/ERK с помощью ингибиторов PD98059 и FR180204 ведёт к усилению цитотоксического эффекта Rhiz.
Таким образом, фосфорилирование ERK1/2 в опухолевых клетках под действием Rhiz является анти-апоптотическим фактором.
Эффективность и токсичность Rhiz in vivo были изучены на моделях
ксенографтов человеческих клеток рака простаты PC-3 и 22Rv1 в мышах линии
NOD SCID. Пилотные эксперименты по подбору дозы показали, что при внутрибрюшинном введении Rhiz вплоть до 1.8 мг/кг/день не наблюдалось потери
массы тела животных или признаков дискомфорта. Таким образом, для дальнейших исследований in vivo была выбрана именно эта доза Rhiz. В результате
показано, что Rhiz способен эффективно ингибировать рост опухолей, а также
снижать конечную массу опухоли в обеих используемых моделях (рис. 35А).
Эффект Rhiz на индукцию апоптоза опухолевых клеток in vitro был подтверждён в экспериментах in vivo. Так было показано, что в образцах опухолей,
полученных от животных, которым вводили Rhiz, был существенно повышен
процент мёртвых опухолевых клеток, определённых гистологически (рис. 35Б),
а также уровень активированной каспазы-3 (рис. 35В)
Анализ крови животных, которым вводили Rhiz, показал, что уровень
содержания тромбоцитов и гемоглобина был в пределах нормы. В то же время,
наблюдалось увеличение массы селезёнки, а также значительное повышение
концентрации белых кровяных клеток, а именно – моноцитов, нейтрофилов и
лимфоцитов. Данное наблюдение может говорить о том, что Rhiz, возможно,
43
обладает иммуностимулирующим эффектом in vivo, однако данное предположение требует дальнейшей проверки.
Pисунок 35. Рост привитых опухолей, а также их массы по окончании
эксперимента (А). Гистологическое исследование опухолей прокрашенных гематоксилином-эозином (Б). Области мертвых клеток показаны стрелкой. Исследование уровня активированной каспазы-3 в лизатах опухолей ex vivo (В). *
- статистически достоверное отличие от контроля (р ≤ 0.05, t-тест Стьюдента)
Потенциал-зависимые
калиевые каналы
Таким образом, механизм
противоопухолевого
дейKv 11.1
ствия Rhiz включает в себя
индукцию
каспазаАпоптоз
зависимого апоптоза, ингиRhiz
бирование AR-сигналинга и
цитопротекторной
аутофаAR-сигналинг
гии, а также возможную имАктивация каспаз
муностимуляцию. ПотенциzVAD
ал-зависимые калиевые канаЛекарственная
Гибель клеток
устойчивость и
Пролиферация клеток
лы являются одной из молевыживание
кулярных мишеней Rhiz (рис.
Pисунок 36. Схема возможного механизма ци- 36).
тотоксического действия Rhiz в клетках рака
простаты человека
Иммуностимулация
Kv 10.1
K+ K+
K+
K+
Kv.1.3
Миноксидил,
диазоксид,
BafA1
Аутофагия
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В процессе изучения метаболитов, выделенных из морских беспозвоночных были идентифицированы два соединения – фрондозид А и ризохалинин
– проявляющие достоверное противоопухолевое действие в условиях экспериментов in vivo на бестимусных мышах, которым были привиты опухоли челове44
ка. Кроме того, были обнаружены несколько неожиданных особенностей молекулярного действия изучаемых соединений на опухолевые клетки, открывающих дополнительные перспективы для их дальнейшего изучения и применения
в различных областях онкологии, молекулярной биологии и биохимии. К таким
находкам можно отнести, эффект алкалоида ааптамина на процесс гипузинирования эукариотического фактора инициации трансляции 5A-1 (eIF5A), влияние
фрондозида А на проницаемость митохондриальных мембран, эффективное ингибирование пульхранином А транскрипционной активности фактора AP-1,
стимулирование монанхоцидином А цитотоксической аутофагии опухолевых
клеток, влияние ризохалинина на калиевый транспорт, синергетические эффекты некоторых изученных веществ в комбинации с известными противоопухолевыми лекарствами, одновременная стимуляция некоторыми природными веществами апоптоза опухолевых клеток и ингибирование ими цитопротекторной
аутофагии, и др.
ВЫВОДЫ
1. Из спиртовых экстрактов губки Aaptos sp. выделены 4 новых и 5
ранее известных ааптаминовых алкалоида. Структура новых соединений установлено
как
3-(N-морфолинил)-деметилоксиааптамин,
3-(метиламино)деметилоксиааптамин, 2,3-дигидро-2,3-диоксоааптамин и 6-(N-морфолинил)4,5-дигидро-5-оксо-деметилоксиааптамин. Изученные ааптаминовые алкалоиды
обладают канцерпревентивной, а также цитотоксической противоопухолевой
активностью. Ааптамин, деметилоксиааптамин и изоааптамин способны преодолевать лекарственную устойчивость герминальных опухолевых клеток человека.
2. Механизм канцерпревентивного и цитостатического действия ааптамина может включать арест клеточного цикла в фазе G2/М, регулирование
внутриклеточных уровней экспрессии и активности белков eIF5A, альфаэнолазы, кофилина-1 и CRABP2; а также фосфорилирование ERK1/2, модуляцию транскрипционной активности ядерных факторов АР-1, NFB и р53, что
приводит к индукции апоптоза опухолевых клеток. Ааптамин является первым
низкомолекулярным активатором процесса гипузинирования эукариотического
фактора инициации трансляции 5A-1 (eIF5A).
3. Из спиртового экстракта асцидии Polysincraton sp. был выделен ранее известный микаламид А. Показаны канцерпревентивные свойства микаламида А, его способность подавлять транскрипционную активность ядерных
факторов AP-1 и NFκB, а также p53-независимый характер индуцируемого им
апоптоза.
4. Новый гуанидиновый алкалоид монанхоцидин А, ранее выделенный в нашей лаборатории, индуцирует цитотоксическую аутофагию и увеличивает проницаемость лизосомных мембран, а также проявляет антимиграторную активность и способность преодолевать лекарственную устойчивость опухолевых клеток. Установлено, что механизм противоопухолевого действия монанхоцидина А может включать регулирование внутриклеточных
45
уровней экспрессии и активности белков аполипопротеина E, виментина и
eIF5A.
5. Изучены противоопухолевые и канцерпревентивные свойства серии
новых гуанидиновых алкалоидов из губки Monanchora pulchra. Исследованы
зависимости типа «структура-активность» для монанхоцидинов А и B, монанхомикалинов В и C, птиломикалина A, пульхранина A, урупоцидина А и нормонанхоцидина D. Для некоторых из этих соединений показана канцерпревентивная активность. Также установлено, что птиломикалин А-подобные соединения активируют киназы JNK1/2 и ERK1/2, а также транискрипционную активность ядерного фактора AP-1, индуцируя p53-независимую программируемую клеточную смерть. Пульхранин А способен ингибировать транскрипционную активность фактора AP-1 и активировать киназу JNK1/2, приводя к p53независимой клеточной смерти опухолевых клеток. Урупоцидин А способен
вызывать активацию киназ JNK1/2 и ERK1/2 и индуцировать p53- и каспазанезависимую клеточную смерть.
6. Тритерпеновый гликозид фрондозид А провляет высокую эффективность и низкую токсичность при исследовании на моделях лекарственноустойчивого рака простаты человека in vitro и in vivo. Механизм его противоопухолевого действия включает в себя индукцию апоптоза опухолевых клеток
вместе с одновременным ингибированием прогрессии клеточного цикла и цитопротекторной аутофагии. Показано, что фрондозид А способен индуцировать
каспаза- и p53-независимый апоптоз клеток уротелиальной карциномы человека in vitro, ингибировать цитопротекторную аутофагию и усиливать цитотоксические эффекты цисплатина и гемцитабина.
7. Показано, что фрондозид А в наномоляных концентрациях способен индуцировать каспаза- и p53-независимый апоптоз клеток лимфомы
Бёркитта in vitro, ингибировать аутофагию и усиливать цитотоксический эффект цисплатина. Вещество способно увеличивать проницаемость митохондриальных мембран опухолевых клеток и вызывать транслокацию апоптогенной
формы AIF в ядро.
8.
Показано, что ризохалинин – агликон биполярного сфинголипида
ризохалина – проявляет высокую эффективность и низкую токсичность при исследовании на моделях лекарственно-устойчивого рака простаты человека in
vitro и in vivo. Механизм его противоопухолевого действия включает в себя индукцию каспаза-зависимого апоптоза, ингибирование цитопротекторной аутофагии, и, возможно, иммуностимуляцию. Потенциал-зависимые калиевые каналы, по-видимому, являются одной из молекулярных мишеней ризохалинина.
46
ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Dyshlovoy S.A., Madanchi R., Hauschild J., Otte K., Alsdorf W.H., Schumacher U., Kalinin V.I., Silchenko A.S., Avilov S.A., Honecker F., Stonik V.A.,
Bokemeyer C., von Amsberg G. The marine triterpene glycoside frondoside A induces
p53-independent apoptosis and inhibits autophagy in urothelial carcinoma cells // BMC
Cancer. 2017. V. 17. P. 93 [1-10].
2. Dyshlovoy S.A., Rast S., Hauschild J., Otte K., Alsdorf W.H., Madanchi
R., Kalinin V.I., Silchenko A.S., Avilov S.A., Dierlamm J., Honecker F., Stonik V. A.,
Bokemeyer C., von Amsberg G. Frondoside A induces AIF-associated caspaseindependent apoptosis in Burkitt's lymphoma cells // Leukemia and Lymphoma. 2017.
doi: 10.1080/10428194.2017.1317091. Статья принята в печать.
3. Dyshlovoy S.A., Otte K., Venz S., Hauschild J., Junker H., Makarieva
T.N., Balabanov S., Alsdorf W.H., Madanchi R., Honecker F., Bokemeyer C., Stonik
V.A., von Amsberg G. Proteomic-based investigations on the mode of action of the marine anticancer compound rhizochalinin // PROTEOMICS. 2017. P. 1700048 [1-11].
4. Dyshlovoy S.A., Menchinskaya E.S., Venz S., Rast S., Amann K.,
Hauschild J., Otte K., Kalinin V.I., Silchenko A.S., Avilov S.A., Alsdorf W., Madanchi
R., Bokemeyer C., Schumacher U., Walther R., Aminin D.L., Fedorov S.N., Shubina
L.K., Stonik V.A., Balabanov S., Honecker F., von Amsberg G. The marine triterpene
glycoside frondoside A exhibits activity in vitro and in vivo in prostate cancer // International Journal of Cancer. 2016. V. 138. P. 2450-2465.
5. Dyshlovoy S.A., Otte K., Alsdorf W., Hauschild J., Lange T., Venz S.,
Bauer C., Bähring R., Amann K., Mandanchi R., Schumacher U., Schröder-Schwarz J.,
Makarieva T.N., Guzii A.G., Tabakmakher K.M., Fedorov S.N., Shubina L.K., Kasheverov I.E., Ehmke H., Steuber T., Stonik V.A., Honecker F., von Amsberg G. Marine
compound rhizochalinin shows high in vitro and in vivo efficacy in castration resistant
prostate cancer // Oncotarget. 2016. V. 7. P. 69703-69717.
6. Dyshlovoy S.A.,Venz S., Hauschild J., Tabakmakher K.M., Otte K.,
Madanchi R., Walther R., Guzii A.G., Makarieva T.N., Shubina L.K., Fedorov S.N.,
Stonik V.A., Bokemeyer C., Balabanov S., Honecker F., von Amsberg G. Antimigratory activity of marine alkaloid monanchocidin A – proteomics-based discovery
and confirmation // PROTEOMICS. 2016. V. 16. P. 1590-1603.
7. Dyshlovoy S.A., Tabakmakher K.M., Hauschild J., Makarieva T.N., Guzii
A.G., Ogurtsova E.S., Otte K., Shubina L.K., Fedorov S.N., Madanchi R., Honecker F.,
Bokemeyer C., Stonik V.A., von Amsberg G. Anticancer activity of eight rare guanidine
alkaloids isolated from marine sponge Monanchora pulchra // Marine Drugs. 2016. V.
14. P. 133 [1-17].
8. Dyshlovoy S.A., Hauschild J., Amann K., Tabakmakher K.M., Venz S.,
Walther R., Guzii A.G., Makarieva T.N., Shubina L.K., Fedorov S.N., Stonik V.A.,
Bokemeyer C., Balabanov S., Honecker F., Amsberg G. Marine alkaloid monanchocidin
A overcomes drug resistance by induction of autophagy and lysosomal membrane permeabilization // Oncotarget. 2015. V. 6. P. 17328–17341.
9. Dyshlovoy S.A., Honecker F. Marine compounds and cancer: where do we
stand? // Marine Drugs. 2015. V. 13. P. 5657–5665.
10. Dyshlovoy S.A., Fedorov S.N., Shubina L.K., Kuzmich A.S., Bokemeyer
C., Keller-von Amsberg G, Honecker F. Aaptamines from the marine sponge Aaptos sp.
47
display anticancer activities in human cancer cell lines and modulate AP-1-, NF-kB-,
and p53-dependent transcriptional activity in mouse JB6 Cl41 Cells // BioMed Research
International. 2014. V. 2014. P. 1-7.
11. Dyshlovoy S.A., Venz S., Shubina L.K., Fedorov S.N., Walther R., Jacobsen C., Stonik V.A., Bokemeyer C., Balabanov S., Honecker F. Activity of aaptamine
and two derivatives, demethyloxyaaptamine and isoaaptamine, in cisplatin-resistant
germ cell cancer // Journal of Proteomics. 2014. V. 96. P. 223−239.
12. Dyshlovoy S.A., Fedorov S.N., Kalinovsky A.I., Shubina L.K., Bokemeyer
C., Stonik V.A., Honecker F. Mycalamide A shows cytotoxic properties and prevents
EGF-induced neoplastic transformation through inhibition of nuclear factors // Marine
Drugs. 2012. V. 10. P. 1212–1224.
13. Dyshlovoy S.A., Naeth I., Venz S., Preukschas M., Sievert H., Jacobsen C.,
Shubina L.K., Gesell Salazar M., Scharf C., Walther R., Krepstakies M., Priyadarshini
P., Hauber J., Fedorov S.N., Bokemeyer C., Stonik V.A., Balabanov S., Honecker F.
Proteomic profiling of germ cell cancer cells treated with aaptamine, a marine alkaloid
with antiproliferative activity // Journal of Proteome Research. 2012. V. 11. P. 23162330.
14. Fedorov S.N., Krasokhin V.B., Shubina L.K., Dyshlovoy S.A., Nam N.H.,
Minh C.V. The extracts of some marine invertebrates and algae collected off the coast
waters of vietnam induce the inhibitory effects on the activator protein-1 transcriptional
activity in JB6 Cl41 сells // Journal of Chemistry. 2013. V. 2013. Article ID 896709. [16].
15. Shubina L.K., Makarieva T.N., Dyshlovoy S.A., Fedorov S.N., Dmitrenok
P.S., Stonik V.A. Three New Aaptamines from the marine sponge Aaptos sp. and their
proapoptotic properties // Natural Products Communications. 2010. V. 5. P. 1881-1884.
16. Guzii A.G., Makarieva T.N, Denisenko V.A., Dmitrenok P.S., Kuzmich
A.S., Dyshlovoy S.A., Krasokhin V.B., Stonik V.A. Monanchocidin: a new apoptosisinducing polycyclic guanidine alkaloid from the marine sponge Monanchora pulchra //
Organic Letters. 2010. V. 12. P. 4292–4295.
17. Shubina L.K., Kalinovsky A.I., Fedorov S.N., Radchenko O.S., Denisenko
V.A., Dmitrenok P.S., Dyshlovoy S.A., Krasokhin V.B., Stonik V.A.. Aaptamine alkaloids from the Vietnamese sponge Aaptos sp. // Natural Products Communications.
2009. V. 4. P. 1085-1088.
18. Dyshlovoy S.A., Otte K., Hauschild J., Venz S., Christ T., Bauer C.K.,
Bahring R., Amann K., Alsdorf W., Madanchi R., Schumacher U., Walther R., Makarieva T., Guzii A., Tabakmakher K., Kasheverov I., Kudryavtsev D., Stonik V.,
Bokemeyer C., Honecker F., von Amstrong G. Marine compound rhizochalinin shows
high anticancer activity in castration resistant and AR-V7 positive prostate cancer cell
lines : annual meeting of the German, Austrian and Swiss associations of hematology
and medical oncology, Basel, Switzerland, 9–13 Okt. 2015 : abstrs // Oncology Research
Treatment. 2015. V. 38. Suppl. 5. P. 265–266.
19. Dyshlovoy S., Tabakmakher K., Venz S., Hauschild J., Guzii A., Makarieva T., Stonik V., Bokemeyer C., Balabanov S., von Amsberg G., Honecker F. Marine alkaloid Monanchocidin A induces lysosome membrane permeabilization and overcomes cisplatin resistance in germ cell tumor cells : Jahrestagung der Deutschen, Qsterreichischen und Schweizerischen Gesellschaften fur Hamatologie und Medizinische
48
Onkologie, Germany, Hamburg, 10–14 Okt. 2014 : abstrs // Oncology Research and
Treatment. 2014. V. 37. Suppl. 5. P. 4-5.
20. Dyshlovoy S., Menchinskaya E., Rast S., Venz S., Hauschild J., Jacobsen
C., Kalinin V., Silchenko A., Avilov S., Bokemeyer C., Schumacher U., Stonik V.,
Aminin D., Honecker F., von Amsberg G. Marine triterpene glycosides frondoside A
exhibits high in vitro and in vivo activity in prostate cancer : Jahrestagung der
Deutschen, Qsterreichischen und Schweizerischen Gesellschaften fur Hamatologie und
Medizinische Onkologie, Germany, Hamburg, 10–14 Okt. 2014 : abstrs // Oncology Research and Treatment. 2014. V. 37. Suppl. 5. P. 177–177.
21. Dyshlovoy S.A., Fedorov S.N., Kalinovsky A.I., Shubina L.K., Bokemeyer
C., Honecker F., Stonik V.A. In vitro anticancer activity of mycalamide A − a metabolite
of marine ascidian Polysincraton sp. // FEBS Journal. 2013. V. 280. Suppl. 1. P.
507−507.
22. Dyshlovoy S.A., Venz S., Guzii A., Makarieva T., Tabakmakher K., Stonik
V., Balabanov S., Bokemeyer C., Honecker F. Marine alkaloid monanchocidin: a proteomic-based screening of protein targets in cisplatin-resistant tumor cells // Annals of
Oncology. 2013. V. 24. P. i23-i24.
23. Dyshlovoy S.A., Naeth I., Venz S., Shubina L.K., Fedorov S.N., Stonik
V.A., Balabanov S., Honecker F. Proteomic-based screening of protein targets of aaptamine, a marine alkaloid with antiproliferative activity // Annals of Oncology. 2012. V.
23. P. i32.
24. Dyshlovoy S.A., Naeth I., Venz S., Fedorov S.N., Shubina L.K., Stonik
V.A., Balabanov S., Honecker F. Aaptamine, demethyloxyaaptamine, and isoaaptamine:
a proteomic-based screening of protein targets in cisplatin-resistant tumor // Annals of
Oncology. 2012. V. 23. P. 28–28.
25. Dyshlovoy, S., Fedorov, S., Shubina, L., Honecker, F., Stonik, V. Anticancer activity of aaptamine and its derivatives isolated from marine Vietnamese sponge
Aaptos sp. // Annals of Oncology. 2011. V. 22. P. 33-33.
26. Dyshlovoy S.A., Fedorov S.N., Shubina L.K., Stonik V.A. Anticarcinogenic activity of aaptamine and its derivatives isolated from the marine Vietnamese sponge
Aaptos sp. // International workshop on marine living resources of Vietnam, Hanoi, Vietnam, May 29th – 31th, 2010: abstr. Hanoi, 2010.
27. Дышловой С.А., Шубина Л.К., Федоров С.Н, Кузьмич А.С., Радченко
О.С., Красохин В.Б., Стоник В.А. Средство, предотвращающее трансформацию
нормальных клеток млекопитающих в опухолевые // Патент РФ на изобретение №
2429840 (RU 2429840 C1). Заявка № 2010102268. Приоритет изобретения
22.01.2010. Зарегистрировано 27.09.2011. Срок действия до 22.01.2030.
49
Изучение аспектов механизмов противоопухолевого действия некоторых
низкомолекулярных соединений, выделенных из морских беспозвоночных
Автореферат диссертации на соискание ученой
степени доктора биологических наук
50
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
3
Размер файла
3 855 Кб
Теги
062ff3d047, uploaded
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа