close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Исследование кальциевой сигнализации культивируемых белых адипоцитов. Конвергенция сигнальных путей, сопряженных с IP3- и рианодиновыми рецепторами

код для вставкиСкачать
ФИО соискателя: Туровский Егор Александрович Шифр научной специальности: 03.01.02 - биофизика Шифр диссертационного совета: Д 002.038.01 Название организации: Институт биофизики клетки РАН Адрес организации: 142290, г.Пущино, ул. Институтская, 3 Тел
На правах рукописи
Туровский Егор Александрович
ИССЛЕДОВАНИЕ КАЛЬЦИЕВОЙ СИГНАЛИЗАЦИИ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ
БЕЛЫХ АДИПОЦИТОВ. КОНВЕРГЕНЦИЯ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ,
СОПРЯЖЕННЫХ С IP3- И РИАНОДИНОВЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ
03.01.02 – Биофизика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Пущино – 2012
-1-
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки
Институте биофизики клетки Российской академии наук.
Пущинском Государственном естественно-научном институте
Научный руководитель:
кандидат биологических наук
Долгачева Людмила Петровна
Официальные оппоненты:
Новоселов Владимир Иванович – доктор биологических наук, профессор,
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биофизики
клетки РАН, главный научный сотрудник лаборатории механизмов рецепции
Гончаров Николай Васильевич – доктор биологических наук, НИИ гигиены,
профпатологии и экологии человека ФМБА России, ведущий научный сотрудник
лаборатории аналитической токсикологии.
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение
науки Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской
академии наук.
Защита диссертации состоится «15» ноября 2012 г. в 15 ч. 30 мин. на заседании
Диссертационного совета Д 002.038.01 при Федеральном государственном
бюджетном учреждении науки Институте биофизики клетки Российской академии
наук по адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, д. 3.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной библиотеке НЦБИ РАН по
адресу: 142290, г. Пущино, ул. Институтская, 3.
Автореферат разослан «____» октября 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук
Смолихина Татьяна Ивановна
-2-
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Ожирение рассматривается как один из основных
факторов высокой смертности населения вследствие развития неалкогольного
стеатогепатита, диабета 2-го типа и сердечно-сосудистых заболеваний (Асташкин и
Глезер, 2008; Boguszewski et al., 2010). Развитие этих заболеваний при ожирении
обусловлено «дислипидэмией» – избытком циркулирующих в крови токсинов –
жирных кислот. Гипертрофия и дисфункция белой жировой ткани (WAT) несет в
себе большой патогенный потенциал, ввиду ее неспособности эффективно
устранять из крови жирные кислоты, а также за счет трансформации эндокринных и
иммунных функций жировой ткани (Bays et al., 2008). Известно, что симпатическая
нервная система и нейротрансмиттер норадреналин (НА) играют важную роль в
процессе липолиза WAT (Tavernier et al., 2005). Модулирующий эффект
норадреналина на функции жировой клетки является комплексным и вовлекает не
только различные подтипы адренорецепторов, но и различные системы трансдукции
сигналов. В ряде работ показано, что липолиз, стимулированный норадреналином,
обеспечивается активацией β-адренорецепторов, аденилатциклазы и синтезом
сАМР, а также ключевых липаз HSL и ATGL и фосфорилированием перилипина.
Ингибирование этого процесса обеспечивается в результате активации α2адренорецепторов, гетеротримерного белка Gi, αi-субъединицы, ингибирующей
аденилатциклазу и синтез сАМР. Важную роль в процессах передачи сигналов от
рецептора к мишеням играют и βγ-субъединицы Gi-белков. В последние годы стало
известно, что липолиз также может быть стимулирован предсердным
натрийуретическим пептидом с последующим накоплением сGMP и активацией
протеинкиназы G.
Что касается парасимпатической нервной системы и ее нейротрансмиттера
ацетилхолина, то кроме ингибирования процесса липолиза, о его действии на
жировые клетки ничего не известно.
Роль Ca2+ в регуляции липолиза и липогенеза белой жировой ткани
практически не исследована, несмотря на то, что в роли вторичного мессенджера
ионы кальция опосредуют действие более 100 нейротрансмиттеров и гормонов и
регулирует многочисленные клеточные функции. Считается, что рост Ca2+ должен
приводить к ингибированию липолиза протеинкиназой CaMKII и Ca2+-зависимыми
фосфодиэстеразами (PDEIII, IV), снижению концентрации сAMР и cGMP и
активности протеинкиназ A и G, соответственно.
Цель исследования. Целью данной работы является получение новых знаний о
функционировании системы кальциевой сигнализации белых адипоцитов.
Основные задачи исследования.
1. Исследовать механизмы генерации кальциевых сигналов белыми
адипоцитами в культуре в ответ на стимуляцию адренергических и
холинергических рецепторов.
2. Изучить механизм действия L-аргинина на кальциевую сигнализацию
-3-
культивируемых белых адипоцитов;
3. Выяснить механизм генерации колебаний
мускариновых ацетилхолиновых рецепторов;
[Са2+]i
при
активации
4. Изучить механизмы конвергенции сигнальных систем, сопряженных с
IP3-зависимыми (IP3R) и рианодиновыми (RyR) рецепторами.
Научная новизна работы. В работе показано, что норадреналин, действуя на
α- и β-адренергические рецепторы белых адипоцитов, вызывает 3 типа кальциевых
ответов, отличающихся по амплитуде и длительности сигнала. Агонисты
α1-адренорецепторов активируют фосфоинозитидный путь передачи сигналов, что
приводит к генерации кальциевого ответа типа пик-плато. Для α2-адренергических
рецепторов, помимо известного пути ингибирования аденилатциклазы, показано
функционирование нового пути передачи сигнала за счет βγ-субъединиц Gi-белков
на рианодиновый рецептор эндоплазматического ретикулума, активация которого
вызывает импульсное увеличение Са2+ в цитозоле.
Показан механизм возникновения и поддержания кальциевых колебаний,
индуцируемых ацетилхолином, в котором ведущее значение имеет рианодиновый
рецептор (RyR).
Продемонстрирована
конвергенция
сигнализации
для
рецепторов,
сопряженных с IP3R и RyR, основанная на том, что гормоны, действуя через
рецепторы, сопряженные с G-белком, включают общую схему сигнализации с
участием βγ-субъединиц для Gq, Gi и Gs белков, которые активируют одну общую
мишень – фосфатидилинозитол 3-киназу (PI3K).
Научно-практическая ценность. Полученные результаты позволяют
расширить понимание механизмов сигнализации белых адипоцитов. Исследованная
трансдукция сигналов с М3-холинорецепторов и адренергических рецепторов
способствует не только пониманию действия ацетилхолина и норадреналина на
клетки белого жира, но и может быть использована как потенциальная
фармакологическая цель для понимания механизмов возникновения ожирения и
связанных с ним нарушений обмена веществ. В силу универсальности
PI3K-PKG-RyR пути передачи сигнала и существования множества заболеваний,
связанных с нарушениями этого пути, полученные результаты могут стать основой
для нового направления фармакологической коррекции этих заболеваний.
Апробация диссертации. Материалы диссертации были представлены на
международных конференциях «Рецепция и внутриклеточная сигнализация»
(Пущино, 2009, 2011), на конференции «Фундаментальная наука и клиническая
медицина» (Санкт-Петербург, 2008), на школе-конференции для молодых ученых
«Методы культивирования клеток» (Санкт-Петербург, 2008), Международной
научной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы
функционирования биосистем» (Минск, 2012), IV съезде биофизиков России
(Нижний Новгород, 2012), а также на Международной конференции молодых
ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика '12» (Пущино, 2012).
-4-
Публикации. Основные материалы диссертации опубликованы в 15 печатных
работах, из них 5 статей в реферируемых журналах, 5 статей в сборниках и 5 тезисов
докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 104
страницах с использованием 51 рисунка, 3 таблиц и включает: введение, обзор
литературы, материалы и методы исследования, собственные экспериментальные
данные и их обсуждение, заключение и выводы. Список литературы содержит 263
ссылки.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
ВЫДЕЛЕНИЕ И КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ПРЕАДИПОЦИТОВ БЕЛОЙ
ЖИРОВОЙ ТКАНИ. Все операции по выделению преадипоцитов из белой жировой
ткани мышей линии NMRI (возраст 5–6 недель) производились в стерильных
условиях на льду. Процедура выделения и культивирования клеток подробно
описана в нашей работе (Туровский, 2011). Полученную суспензию преадипоцитов
ресуспендировали в культуральной среде, включающей DMEM (Sigma), 10% FBS
(Gibco), 4мМ L-Glutamine acid (Sigma), 4нм инсулина (Sigma), 0,004% гентамицина
и 0,25мкг/мл аскорбата натрия (Sigma), и наносили на круглые покровные стекла
диаметром 25мМ из расчета 30000 клеток на 1 стекло в объеме 100 мкл и помещали
в 35мм чашки Петри. Культивировали во влажной атмосфере СО2-инкубатора (5%
СО2 и 95% воздуха). Для ингибирования пролиферации фибробластов использовали
10нM цитозин-арабинозида. В экспериментах использовали культуру в возрасте
9 дней (9 DIV). Белые адипоциты в культуре идентифицировали по
морфологическим признакам: форма клеток и наличие жировых включений в
цитоплазме.
ИЗМЕРЕНИЯ УРОВНЯ ЦИТОЗОЛЬНОГО КАЛЬЦИЯ МЕТОДОМ
ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ МИКРОСКОПИИ. Эксперименты проводили с помощью
флуоресцентной станции на базе инвертированного микроскопа Axiovert 200M,
оснащенного монохромной CCD-камерой AxioCam HSM (Carl Zeiss, Германия) и
системой высокоскоростной смены возбуждающих светофильтров Ludl MAC5000. В
эксперименте получали серии изображений культуры белых адипоцитов с
интервалом 3 секунды. При измерении уровня цитозольного кальция и NO
использовались объектив Plan Neofluar 10×/0,3 и 20×/0,7. Для регистрации уровня
цитозольного кальция использовали зонд Fura-2. Флуоресценцию Fura-2 в двух
длинах волн возбуждали с помощью светофильтров BP 340/30 и BP 387/15.
Регистрацию проводили в диапазоне 465–555нм. После предварительного
вычитания фонового сигнала рассчитывали отношение интенсивности
флуоресценции Fura-2 при возбуждении в 340 и 380нм (Fura-2, 340/380).
ИЗМЕРЕНИЕ ПРОДУКЦИИ ОКСИДА АЗОТА (NO). Для регистрации
продукции NO клеточную культуру белых адипоцитов нагружали 10мкМ DAF FM в
течение 40мин при 37оС. Затем клетки дважды промывали HBSS и оставляли на
10мин. После этого вновь промывали HBSS и монтировали в специальную
-5-
измерительную камеру для инвертированного микроскопа. Среда HBSS на всех
стадиях загрузки зондом и отмывки, а также при аппликации различных агонистов
включала 200мкМ L-аргинина для поддержания NO-синтазы в активном состоянии.
Для возбуждения флуоресценции DAF-FM применяли светофильтр BP 475/40. Для
регистрации флуоресценции использовали фильтр BP 530/50.
Изображения клеток регистрировали с интервалом в 20 сек. Полученные серии
8-битных изображений анализировали с помощью программы ImageJ.
СИСТЕМА АППЛИКАЦИИ И ОТМЫВКИ ВЕЩЕСТВ. Для аппликации
веществ нами была разработана система смены раствора в экспериментальной
ячейке. Эта система позволяет осуществлять перфузию со скоростью 10 мл/мин.
Разработанная система позволяет производить добавки известных концентраций
агонистов и антагонистов рецепторов, а также растворов других соединений, и
осуществлять полную их отмывку.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
УВЕЛИЧЕНИЕ [Ca2+]i ПОД ДЕЙСТВИЕМ НОРАДРЕНАЛИНА. Аппликации
норадреналина (НА) к культивируемым белым адипоцитам (9 DIV) в диапазоне
концентраций от 300нM до 30мкM инициирует Са2+-ответы (рис. 1А), которые
можно разделить на три группы: 1) высокоамплитудный ответ типа пик-плато с
полумаксимальной длительностью 27±15 секунд; 2) импульсный ответ с
полумаксимальной длительностью 10±0,5 секунд; 3) медленный Са2+-ответ с лагпериодом 3-5 мин. Следует отметить, что каждый из трех типов ответов
существенно отличается друг от друга и достоверно воспроизводится.
Известно, что норадреналин действует через различные типы α- и βадренорецепторов, сопряженных с различными системами трансдукции сигналов.
Для выяснения типа рецепторов, ответственных за формирование каждого из Са2+сигналов был проведен ингибиторный анализ. Преинкубирование адипоцитов с
антагонистом α1-адренорецепторов празозином полностью подавляет Са2+-ответы 1го типа (пик-плато) (рис. 1В). Антагонист α2-адренорецепторов – раувольфин
препятствует появлению импульсных Са2+-сигналов 2-го типа (рис. 1Г), а
антагонист β-адренорецепторов – пропранолол, ингибирует медленные ответы 3-го
типа (рис. 1Д).
Второй путь доказательства наличия нескольких популяций клеток,
отличающихся набором адренорецепторов, основывается на предположении, что
каждый из этих рецепторов сопряжен со своей системой передачи сигналов.
Известно, что α1-адренорецепторы сопряжены с фосфоинозитидной системой
передачи сигналов и IP3-зависимой мобилизацией Са2+. Ингибирование ключевых
молекул этого пути (фосфолипазы С и IP3-рецептора) подавляет ответ 1-го типа
(рис. 1Б), и не влияет на генерацию импульсных и медленных сигналов 2-го и 3-го
типов.
-6-
Рис. 1. Изменение [Са2+]i в белых адипоцитах под действием норадреналина. Ингибиторный
анализ.
(А) – три типа Са2+-ответов белых адипоцитов на аппликацию норадреналина; (Б) – добавление
400 nM ксестоспонгина С – ингибитора IP3-рецепторов; (В) добавление 3мкM празозина –
антагониста α1-адренорецепторов; (Г) – добавление 3мкM раувольфина – антагониста α2адренорецепторов; (Д) – добавление 5мкM пропранолола – антагониста β-адренорецепторов;
Антагонисты добавляли за 5 минут до аппликации норадреналина. Эксперименты выполнены на
(3-5)-ти клеточных культурах, с 5-ю повторами для каждой культуры.
КАЛЬЦИЕВЫЕ
ОТВЕТЫ
АДИПОЦИТОВ
НА
АГОНИСТЫ
α1АДРЕНЕРГИЧЕСКИХ РЕЦЕПТОРОВ. ВКЛАД α1А-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ. Третий
путь доказательства наличия нескольких популяций клеток, отличающихся набором
адренорецепторов, состоит в применении агонистов, селективных к отдельным
типам адренорецепторов. Селективные активаторы α1-адренорецепторов –
фенилэфрин, циразолин и А61603 (α1А-адренорецепторы) дозозависимо вызывают
кальциевые ответы типа пик-плато (рис. 2А), подобные 1-му типу сигналов при
аппликации норадреналина.
-7-
Данные, полученные в результате ингибиторного анализа (рис. 2Б),
свидетельствуют в пользу того, что α1-адренорепторы культивируемых белых
адипоцитов инициируют Ca2+-ответы по классическому фосфоинозитидному пути.
Известно, что адипоциты WAT разных видов млекопитающих могут
экспрессировать различные подтипы α1-адренорецепторов: α1А, α1B или α1D. Для
исследования подтипа α1-адренергических рецепторов, ответственных за генерацию
Ca2+-сигнала 1-го типа в белых адипоцитах мыши, нами были использованы
селективный агонист α1А-подтипа адренорецепторов – А61603 и селективный
антагонист – WB4101, который полностью предотвращает появление Са2+- ответов
на аппликацию не только А61603, но и фенилэфрина, и циразолина (рис. 2Б).
Следовательно, α1А-адренорепторы белых адипоцитов мыши играют ведущую роль
в реализации Ca2+-ответа по классическому фосфоинозитидному пути.
Рис. 2. Изменение [Ca2+]i при активации α1-адреноргических рецепторов, участие ключевых
молекул.
(А) – типичные Са2+-ответы клеток при аппликации селективных агонистов α1-адренорецепторов:
кривая 1 – А61603 (активатор α1А-адренорецепторов), кривая 2 – фенилэфрин, кривая 3 –
циразолин; (Б) – ингибиторный анализ: действие антагонистов и ингибиторов ключевых молекул
фосфоинозитидного сигнального каскада на амплитуду кальциевого ответа (АКО) при аппликации
активаторов α1-адренорецепторов. U73122 – ингибитор фосфолипазы C, фентоламин – антагонист
α1,2-адренорецепторов, ксестоспонгин С (XeC) – ингибитор IP3-рецепторов, празозин – антагонист
α1-адренорецепторов, BMY7378 – антагонист α1D-адренорецепторов, WB4101 – антагонист α1Аадренорецепторов. В процентах выражена доля клеток, в которых наблюдается подавление
амплитуды Са2+-сигналов.
Са2+-ОТВЕТЫ
БЕЛЫХ
АДИПОЦИТОВ
НА
АГОНИСТЫ
α2АДРЕНЕРГИЧЕСКИХ РЕЦЕПТОРОВ. ИССЛЕДОВАНИЕ ПУТИ ПЕРЕДАЧИ
СИГНАЛОВ. Более тридцати лет назад с помощью радиолигандных методов были
идентифицированы α2-адренорецепторы в белой жировой ткани. Позже установлена
их способность подавлять процесс липолиза. Для активации α2-адренорецепторов
были использованы селективные агонисты – гуанабенц и UK-14,304 в присутствии
физиологической концентрации (200мкМ) L-аргинина (рис. 3А). Са2+-ответы имеют
вид быстрых одиночных импульсов, которые отличаются от ответов под действием
-8-
агонистов α1-адренорецепторов и характеризуются высокой скоростью нарастания
амплитуды, что указывает на активацию выброса Са2+ из внутриклеточного депо.
Аналогичный Са2+-ответ регистрировали при аппликации норадреналина (2-й тип
ответов). Во всех случаях Са2+-сигнал не зависит от присутствия антагонистов α1адренорецепторов и полностью подавляется антагонистами α2-адренорецепторов –
раувольфином и иохимбином. Ингибиторы PLC и IP3R не влияли на генерацию
Са2+-сигнала в адипоцитах. При этом инкубирование клеток с ингибитором
рианодинового рецептора рианодином препятствует появлению кальциевых
импульсов
на
аппликацию
селективных
α2-агонистов.
Кроме
этого,
преинкубирование клеток с коклюшным токсином, который препятствует
диссоциации Gβγ-субъединиц Gi-белков (Michal et al., 2007), также ингибирует
появление импульсных сигналов. В виду того, что мобилизация Са2+ при активации
α2-адренорецепторов происходит не за счет IP3-рецептора, а рианодинового
рецептора, активатором которого (по литературным данным) является циклическая
АДФ-рибоза, а рецепторы, связанные с активацией Gq-и Gi-белков за счет Gβγсубъединиц, могут участвовать в активации Akt/PKB (Joshi et al., 2007, McCarthy et
al., 2003) мы предположили функционирование сигнального каскада:
Akt/PKB→eNOS→sGC→PKG→СD38→RyR→Ca2+, приводящего к высвобождению
Са2+ через RyR.
Ингибиторный анализ данного сигнального пути показал, что ингибиторы
PI3K – LY294002 и вортманнин подавляли появление Са2+-ответов на активацию α2рецепторов селективными агонистами (рис. 3Б). Ингибиторы NO-синтазы – LNAME и 7NI, а также АДФ-рибозилциклазы (СD38) – никотинамид –
препятствовали генерации Са2+-импульсов.
Рис. 3. Изменение [Ca2+]i в ответ на гуанабенц и UK-14,304, участие ключевых молекул.
(А) – генерация Са2+-импульсов при повторной аппликации селективных агонистов α2адренорецепторов не подавляется ингибиторами PLC (U73122) и IP3R (ксестоспонгин С, XeC). (Б)
– подавление АКО (в %) на аппликацию 1мкM гуанабенца в присутствии: U73122 – ингибитор
PLC, празозин – антагонист α1 –адренорецепторов, ксестоспонгин С (XeC) – ингибитор IP3Rрецепторов, рианодин (Rya)– ингибитор RyR, NAM – конкурентный ингибитор CD38, Wort и LY
294,002 – ингибиторы PI3K.
-9-
РЕЦЕПТОР-ОПОСРЕДОВАННОЕ ДЕЙСВИЕ L-АРГИНИНА НА БЕЛЫЕ
АДИПОЦИТЫ МЫШИ. В соответствии с литературными данными, L-аргинин
оказывает
многочисленные
эффекты
на
клетки
различных
типов.
Продемонстрировано положительное воздействие аргинина на метаболизм
животных, страдающих диабетом 2 типа (Fu et al., 2005). Кроме того, в
экспериментах на кардиомиоцитах было показано, что наличие в средах выделения
клеток небольших концентраций L-аргинина (200мкМ) способствует стабилизации
получаемых ответов (Са2+-токов L-каналов) при действии норадреналина и
ацетилхолина (Dynnik et al., 2005). Было также показано, что L-аргинин при
добавлении в среду инкубации, участвует в регуляции L-токов, действуя через
α2-адренорецепторы, PI3K, eNOS и PKG (Ненов и др., 2009).
Преинкубирование белых адипоцитов с 200мкМ L-аргинина в течение 10 и
более минут с последующей кратковременной (30–40 сек.) аппликацией
миллимолярных (1–10мМ) концентраций L-аргинина (pH=7,4), приводит к
генерации кальциевого импульса. После отмывки аргинина и паузы, последующая
добавка такой же концентрации L-аргинина приводит к повторному появлению
кальциевого ответа, амплитуда которого в среднем может совпадать с первой
амплитудой. По типу кальциевого ответа и амплитуде, увеличение [Ca2+]i на добавку
L-аргинина крайне похоже на активациею α2-адренорецепторов селективными
агонистами (рис. 4А – черная кривая). Ингибиторы PLC и IP3R не влияют на
кальциевый ответ, вызываемый аппликацией 10мМ L-аргинина, но, как и в случае с
селективными
агонистами
α2-рецепторов,
подавляется
селективными
антагонистами.
Рис. 4. Импульсное увеличение [Са2+]i в белых адипоцитах мыши.
(А) – увеличение [Са2+]i в белых адипоцитах мыши под действием 1мкМ гуанабенца, 3мкМ
UK-14,304 и 10мМ L-аргинина; (Б) – преинкубирование адипоцитов с ингибитором PKG – KT5822
(5мкМ) в течение 5 мин. подавляет генерацию импульсных сигналов на добавку 10мМ Lаргинина. Представлены усредненные ответы клеток. В процентах выражена доля клеток, для
которых характерен представленный Са2+-сигнал.
- 10 -
Данный кальциевый сигнал на аргинин полностью подавляется ингибиторами
сигнального пути: Akt/PKB→eNOS→sGC→PKG→СD38→RyR→Ca2+, что говорит о
его действии через α2-адренергические рецепторы на мобилизацию Са2+ через
рианодиновые рецепторы ЭПР белых адипоцитов. При этом, в случае
инкубирования клеток с ингибитором PKG – KT5822, происходит подавление
импульсных Са2+-сигналов на L-аргинин, однако, ответ клеток приобретает вид
медленного увеличения [Са2+]i (рис. 4Б), что может быть обусловлено либо
действием L-аргинина на аденилатциклазу и увеличение концентрации сАМР
(Kersten, 2001), либо ингибированием АТФазы плазматической мембраны.
РОЛЬ
β-АДРЕНЕРГИЧЕСКИХ
РЕЦЕПТОРОВ
В
КАЛЬЦИЕВОЙ
СИГНАЛИЗАЦИИ БЕЛЫХ АДИПОЦИТОВ. В культивируемых белых адипоцитах
мыши, аппликация агониста β-адренорецепторов – изопротеренола на фоне
антагониста α1-, α2-адренорецепторов фентоламина приводит к появлению
кальциевых ответов, схожих с 3-им типом сигналов при добавлении норадреналина
(рис. 5А), к подобным эффектам приводит активация β2-адренорецепторов –
добутамином и β3-адренорецепторов – BRL37344 и CGP12177. Пропранолол –
антагонист β-адренорецепторов приводит к полному подавлению такого типа
Са2+-ответа адипоцитов (рис. 5Б).
Рис. 5. Увеличение [Ca2+]i в дифференцированных белых адипоцитах при активации
β-адренорецепторов и протеинкиназы А.
(А) – активация β-адренорецепторов селективными агонистами – изопротеренол (β1,2,3, кривая 1),
BRL-37344 (β3, кривая 2), аденилатциклазы (форсколин, кривая 3) и протеинкиназы А (8-BromocAMP, кривая 4) приводит к медленному увеличению [Ca2+]i;. (Б) – изопротеренол (1мкМ),
добавленный на фоне антагониста β-адренорецепторов – пропранолола (3мкМ) и антагониста αадренорецепторов – фентоламина 5мкМ. Контроль – кривая 1, добавка изопротеренола (1мкМ).
добавлен в начале записи. Антагонисты адренорецепторов добавлены к клеткам за 5 минут до
начала эксперимента, их концентрацию поддерживали в течение всего эксперимента.
- 11 -
Непосредственная активация аденилатциклазы форсколином или инкубация
клеток с проникающим аналогом сАМР (8-Bromo-cAMP) приводит к медленному
росту [Ca2+]i (рис. 5А кривая 3 и 4 соответственно). Наблюдаемое увеличение [Ca2+]i
происходит после 5 минутного лаг-периода в случае форсколина, а в случае
8-Bromo-cAMP – лаг-период составляет более 10 минут, что, по-видимому, связано
с необходимостью проникновения соединения через плазматическую мембрану
клеток до необходимой концентрации, активирующей PKA. Ингибитор
протеинкиназы А (PKA) – Н-89, добавленный в концентрации 200нМ за 5 минут до
аппликации агонистов β3-адренорецепторов, либо форсколина, предотвращает
появление кальциевых ответов белых адипоцитов у 76% клеток, у остальных 24%
адипоцитов АКО уменьшалась в 3–4 раза по сравнению с контролем.
Таким образом, в адипоцитах белой жировой ткани мыши, норадреналин,
способен вызывать 3 типа кальциевых ответов, отличающихся по механизму
формирования. Действуя через α1-адренорецепторы (α1А), сопряженные с Gq белком
и фосфоинозитидным сигнальным каскадом, НА приводит к мобилизации кальция
через IP3-рецептор. Через α2-адренорецепторы норадреналин и L-аргинин
активируют
сигнальный
каскад
с
участием
ряда
ферментов:
2+
Akt/PKB→eNOS→sGC→PKG→СD38→RyR→Ca и интермедиатов (NO, cGMP,
cADPR). Появление 3-го типа ответов (медленное увеличение [Ca2+]i) обусловлено
действием норадреналина на β-адренорецепторы и аденилатциклазный сигнальный
каскад.
ХОЛИНЕРГИЧЕСКАЯ СИГНАЛИЗАЦИЯ В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ БЕЛЫХ
АДИПОЦИТАХ МЫШИ. Са2+-СИГНАЛЫ, ГЕНЕРИРУЕМЫЕ БЕЛЫМИ
АДИПОЦИТАМИ В ОТВЕТ НА АЦЕТИЛХОЛИН. Помимо симпатической
иннервации, белая жировая ткань также регулируется парасимпатической нервной
системой и нейротрансмиттером ацетилхолином (ACh). Аппликация AСh к клеткам
белого жира в концентрации от 0,1 до 10мкМ инициирует колебания цитозольного
кальция (рис. 6) в 61–93% клеток. Сразу после аппликации AСh, наблюдается
быстрый ответ клеток с увеличением [Са2+]i относительно исходного уровня в 2–3
раза. Затем происходят колебания, у которых максимумы и минимумы постепенно
опускаются (дрейфуют) до некоторого окончательного положения. При этом
амплитуда колебаний обычно растет, частота уменьшается за счет удлинения
межспайкового интервала и достигает ~1мин-1. Между спайками [Са2+]i достоверно
выше начального уровня. В целом, колебания у большинства (67–78%) клеток
длятся менее 5 минут. У остальных 22–33% клеток колебания имеют те же
характеристики, но могут длиться до 10 минут (рис. 6 серая кривая).
- 12 -
Рис. 6. Действие ацетилхолина на культивируемые белые адипоциты мыши.
В процентах выражена доля клеток, для которых характерен данный тип кальциевого ответа.
Представлены типичные кальциевые ответы одиночных адипоцитов.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ РЕЦЕПТОРА АЦЕТИЛХОЛИНА, УЧАСТВУЮЩЕГО В
ФОРМИРОВАНИИ Са2+-СИГНАЛА. Периодические режимы изменения [Са2+]i
сохраняются в присутствии антагонистов M1- (телензепин) и M2- (methoctramine)
холинорецепторов. Преинкубирование клеточной культуры белых адипоцитов
мыши с антагонистом М3-холинорецепторов (p-Fluorohexahydro-sila-difenidol
hydrochloride) в концентрациях от 1нМ до 100нМ всегда приводит к подавлению
кальциевых ответов (в том числе периодических режимов) на ацетилхолин у 90%
клеток. При этом 10% адипоцитов отвечают на агонист транзитным увеличением
цитозольного кальция, который подавляется в присутствии антагониста
М3-холинорецепторов совместно с ингибитором PLC (U73122).
ИССЛЕДОВАНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО ПУТИ ПЕРЕДАЧИ СИГНАЛА С
М3-ХОЛИНОРЕЦЕПТОРА АДИПОЦИТОВ. Чтобы исследовать роль входа Са2+
через плазматическую мембрану была использована среда, не содержащая кальция с
добавлением 0,5мМ EGTA. Появление нескольких Са2+-спайков в бескальциевой
среде говорит о том, что в механизме AСh-индуцируемых колебаний модуляция
входящего потока внеклеточного кальция не играет принципиальной роли. В то же
время затухание колебаний показывает необходимость входа Са2+ для их
поддержания. Ответы [Са2+]i на AСh полностью предотвращаются преинкубацией
клеток с 1мкМ тапсигаргина, ингибирующего Са2+-АТФазу эндоплазматического
ретикулума.
Механизмы кальциевых колебаний могут быть разделены на два больших
класса в зависимости от использования IP3R или RyR для мобилизации Са2+ из
внутриклеточных структур (Thomas et al., 1996; Keizer and Levine, 1996). Чтобы
различить возможные пути высвобождения Са2+, мы использовали ингибиторы PLC,
IP3R и RyR. Инкубация белых адипоцитов с ингибиторами PLC (U73122) и IP3R –
- 13 -
ксестоспонгином С (XeC) не только не предотвращает колебания, возникающие при
последующей добавке AСh, но и никак не влияет на их вид. Более того,
эксперимент, представленный на рисунке 7А демонстрирует, что у адипоцитов с
незатухающими в течение 10 минут колебаниями, последовательное добавление
ксестоспонгина С и затем U73122, не подавляет периодические режимы на
аппликацию AСh. Для определения роли RyR в колебаниях, перед стимуляцией
ацетилхолином клетки инкубировали с рианодином, который блокирует RyR в
состоянии малой проводимости при микромолярной концентрации и в закрытом
состоянии при высоких дозах (около 100мкМ) (Dupont and Croisier, 2010). В
диапазоне 100нМ – 10мкМ рианодин подавляет кальциевые колебания, вызванные
5мкМ ацетилхолина у 100% адипоцитов в поле зрения (рис. 7Б). Таким образом,
механизм колебаний, индуцируемых в адипоцитах ацетилхолином, не зависит от
PLC и IP3R, а включает высвобождение Са2+ через RyR из тапсигаргинчувствительного пула.
Рис. 7. Изменения [Са2+]i в белых адипоцитах под действием 5 мкМ ацетилхолина.
(А) – совместное действие ингибиторов PLC (U73122, 3мкМ) и IP3R (ксестоспонгин С, XeC),
500нМ) на ход кальциевых колебаний; (Б) – аппликация ацетилхолина на фоне ингибитора RyR –
рианодина (1мкМ). В процентах выражена доля клеток с характерным типом ответа.
ВКЛАД NO-cGMP СИГНАЛЬНОГО ПУТИ В ПЕРЕДАЧУ СИГНАЛА С М3ХОЛИНЕРГИЧЕСКИХ РЕЦЕПТОРОВ. Рианодиновый рецептор (RyR) имеет
множество регуляторов (Dupont and Croisier, 2010), которые могут опосредовать
пути к нему от рецепторов AСh. Для исследования сигнального пути c
М3-холинорецептора, направленного на мобилизацию Са2+ рианодиновым
рецептором,
нами
были
использованы
ингибиторы
соответствующих
внутриклеточных ферментов. Результаты ингибиторного анализа представлены на
рис. 8.
Преинкубирование белых адипоцитов с любым ингибитором NO-cGMP
сигнального пути препятствует генерации Са2+-колебаний в большинстве клеток.
При этом клетки белого жира реагируют на аппликацию AСh кратковременным
увеличением [Са2+]i.
- 14 -
Рис. 8. Изменения [Са2+]i в белых адипоцитах под действием ингибиторов NO-cGMP
сигнального пути.
(А) – аппликация AСh на фоне ингибитора PI3Kγ – AS605240; (Б) – аппликация ингибитора
Akt/PKB (Akt1/2 kinase inhibitor) на фоне колебаний, индуцированных ACh; (В) – предварительное
инкубирование клеток с ингибиторома NOS – L-NAME; (Г) – предварительное инкубирование
адипоцитов с ингибитором протеинкиназы G – Rp-8-Br-cGMPS препятствует генерации колебаний
в 92% адипоцитов. Представлены ответы одиночных клеток.
Исчезновение индуцируемых AСh колебаний после ингибирования NOсинтазы говорит о важной роли данного фермента в генерации периодических
режимов в белых адипоцитах. Подтверждением этому является параллельное
измерение продукции оксида азота (NO) и кальция во время Са2+-колебаний (рис. 9).
Под действием ацетилхолина, удалось установить, что индуцируя колебания
цитозольного кальция, AСh вызывает увеличение продукции NO в 15 раз.
Ингибиторы NO-синтазы – 7NI и L-NAME, добавленные на фоне кальциевых
колебаний приводят к подавлению продукции NO, при этом происходит
уменьшение амплитуды кальциевых колебаний с дальнейшим прекращением.
- 15 -
Видно, что периодические изменения уровня [Ca2+]i (рис. 9, кривая 3) в
адипоцитах сопряжены с периодическими изменениями скорости продукции NO
(рис. 9, кривая 2). Фаза повышения уровня [Ca2+]i сопровождается увеличением
продукции NO (рис 9, кривая 1), что, по-видимому, свидетельствует об активации
eNOS посредством Ca2+.
Рис. 9. Параллельное измерение с помощью флуоресцентных зондов Fura-2 и DAF
внутриклеточной концентрации ионов кальция [Са2+]i и оксида азота [NO] в белых
адипоцитах мыши при аппликации 5мкМ ацетилхолина.
Уровень [Ca2+]i, выражен в единицах отношения флуоресценции Fura-2 при возбуждении
в 340 и 380нм (кривая 3). Продукция NO выражена в относительных значениях
флуоресценции DAF-FM во времени (кривая 1), где ∆F = F - Fo (F – значение
флуоресценции DAF-FM в данной точке, а Fо – уровень флуоресценции в начале
эксперимента), а также флуоресценция DAF FM (кривая 2), представленная в виде
производной. Стрелками показаны моменты аппликации AСh и ингибитора NO-синтазы –
7NI. Представлен ответ одиночной клетки.
Циклическая АDP-рибоза (cADPR), которая производится ферментом ADPрибозилциклазой (CD38) из NAD, является активатором рианодинового рецептора.
Преинкубирование белых адипоцитов с конкурентным ингибитором CD38 –
никотинамидом, предотвращает появление Са2+-колебаний, а аппликация
никотинамида на фоне ацетилхолина, прекращает колебания в течение нескольких
секунд. Кроме того, активатор и субстрат для CD38 – βNAD приводит к генерации
колебаний, подобных индуцированным ацетилхолином.
Таким образом, при активации М3-холинорецептора происходит генерация
устойчивых Са2+ колебаний при активации сигнального каскада, включающего
- 16 -
активацию: PI3K→Akt→eNOS→NO→cGMP→PKG→CD38→RyR→Ca2+, за счет βγсубъединиц Gq-белков, с которыми сопряжен ацетилхолиновый рецептор.
КОНВЕРГЕНЦИЯ СИГНАЛЬНЫХ ПУТЕЙ, СОПРЯЖЕННЫХ С IP3 и
РИАНОДИНОВЫМИ РЕЦЕПТОРАМИ В БЕЛЫХ АДИПОЦИТАХ МЫШИ. Ввиду
того, что норадреналин, L-аргинин и ацетилхолин вызывают различные Са2+-ответы
у белых адипоцитов за счет активации различных рецепторов и сигнальных
каскадов, а общим для этих агонистов является то, что они действуют через G-белок
зависимые рецепторы, которые включают общую систему сигнализации с участием
βγ субъединиц Gq-белков от α1 и М3-рецепторов, а также Gi-белков α2-рецепторов.
Кроме того, эти рецепторы имеют собственные пути сигнализации с участием Gq
белков на фосфолипазу С и IP3-рецепторы, а со стороны β-адренорецепторов – Gsбелков на аденилатциклазу и протеинкиназу А. В таких условиях возможно
существование конвергенции сигнализации и наличие различных нелинейных
явлений, включая генерацию спайков и периодических процессов. Поэтому
представляет интерес исследование взаимодействия адренергической и
холинергической сигнальных систем белых адипоцитов.
При концентрации AСh 1–10нМ в среде, Са2+ ответы отсутствуют у 100%
клеток. Последующая добавка 1мкМ НА приводит к генерации Са2+-колебаний в 40–
50% клеток (рис. 10Б). Как было показано выше, норадреналин, несмотря на
активацию различных подтипов α- и β-адренорецепторов, не приводит к
возникновению периодических колебаний в адипоцитах, что подтверждается
нашими экспериментами, в которых на фоне концентраций норадреналина,
вызывающих транзитное повышение [Ca2+]i, аппликация наномолярных доз AСh
приводит к появлению периодических кальциевых сигналов в адипоцитах мыши
(рис. 10В). При более высоких концентрациях AСh, вызывающих колебания [Ca2+]i,
добавка микромолярных доз НА увеличивает частоту колебаний без изменения их
амплитуды.
Таким образом, преинкубированием белых адипоцитов мыши с низкими
дозами ацетилхолина приводит к преобразованию кальциевого ответа клеток на
норадреналин, который из транзитного приобретает вид колебательного. В то же
время, аппликация наномолярных концентраций ацетилхолина на фоне
норадреналина, аппликация которого уже вызвала транзитное увеличение [Ca2+]i,
приводит также к генерации кальциевых колебаний. Следовательно, в адипоцитах
имеет место потенцирование эффекта AСh посредством норадреналина за счет
конвергенции сигналов с М3-холинорецепторов и адренергических рецепторов.
Общая схема сигнализации с участием α- и М3-рецепторов, и
соответствующих сигнальных путей, а также различных регуляторных связей
представлена на рисунке 10А. При достаточно высоких концентрациях AСh (5мкМ),
действуя через М3-холинорецепторы и активируя PI3Kγ с участием Gβγ белков,
запускает периодический процесс. В этом случае НА, действуя через
адренорецепторы, способен модулировать частоту колебаний. При слабой передаче
сигнала со стороны AСh с участием Gβγ белков, когда AСh (10нМ) не способен
запустить периодические процессы, добавка НА приводит к возникновению
- 17 -
автоколебательного режима за счет первичного IP3-зависимого выброса Са2+ и
активации eNOS, находящейся в петле положительной обратной связи.
Рис. 10. Конвергенция сигналов с М3-холинорецепторов и адренергических рецепторов.
(А) – аппликация норадреналина (1мкМ) на фоне 10нМ ацетилхолина; (Б) – аппликация 10нМ
ацетилхолина на фоне 5мкМ норадреналина; (В) – схема конвергенции сигнальных каскадов,
активируемых α1-, α2-адренорецепторами и M3-холинорецепторами.
Обозначения: DAG – диацилглицерол, PIP2 – фосфатидилинозитол бисфосфат, PIP3 –
фосфатидилинозитол трисфосфат, PI3K – фосфатидилинозитол-3-киназа, PLC – фосфолипаза С,
eNOS – эндотелиальная NO-синтетаза, sGC – растворимая гуанилат-циклаза, Akt (PKB) и PKG –
протеинкиназы B и G, CD38 – АДФ-рибозил циклаза, СаМКII – кальций/кальмодулин-зависимая
протеинкиназа 2, АМРК – АМФ-активируемая протеинкиназа, СаМККβ – кальций/кальмодулинзависимая протеинкиназа киназа β, IP3 – инозитолтрисфосфат, IP3R – рецептор IP3, cADPR –
циклическая АДФ-рибоза, RyR – рианодиновый рецептор.
Таким образом, при наличии высокой суммарной концентрации Gβγ белков,
активация PKG выполняет несколько функций: обеспечивает селективное
- 18 -
выключение IP3R, активацию закачки Са2+ в ретикулум (SERCA) и активацию
выброса Са2+ из RyR-зависимых депо, за счет активации CD38 и накопления cADPR.
Для исследования возможных вариантов конвергенции сигнальных путей,
активируемых различными типами рецепторов, нами использована инкубация
клеток с малыми дозами AСh с последующей добавкой агонистов к различным
рецепторам.
КОНВЕРГЕНЦИЯ СИГНАЛИЗАЦИИ М3-ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ И α1АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ. Активация α1-адренорецептора селективным агонистом –
фенилэфрином способна вызвать только кратковременный (транзитный) Са2+-ответ
у белых адипоцитов. Однако характер ответов на фенилэфрин радикальным образом
изменяется в присутствии малых концентраций AСh в среде инкубации клеток. В
разных клетках регистрируются динамические режимы двух типов:
высокочастотные с высоким уровнем базального [Ca2+]i (рис. 11А – черная кривая)
или низкочастотные, происходящие без повышения базальной концентрации [Ca2+]i
(рис. 11А – серая кривая), но с большими амплитудами. Подобное изменение
кальциевых ответов происходит при активации α1-адренорецепторов циразолином и
А61603. Общей характеристикой Са2+-ответов, вызываемых агонистами
α1-адренорецепторов на фоне малой концентрации ацетилхолина является
транзитное увеличение [Ca2+]i при аппликации агониста, после чего происходят
кальциевые колебания, различающиеся частотой и амплитудой у одиночных клеток.
В отличие от колебаний, индуцируемых микромолярными дозами ацетилхолина,
данные периодические режимы не прекращаются в течение времени регистрации
(15 минут) у всех отвечающих клеток.
КОНВЕРГЕНЦИЯ
СИГНАЛИЗАЦИИ
М3-ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ
И
α2-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ. Селективные агонисты α2-адренорецепторов –
UK14,304, гуанабенц, а также миллимолярные концентрации L-аргинина, приводят
в комбинации с низкими дозами AСh к генерации кальциевых колебаний (рис. 11Б).
Общей чертой таких колебаний является отсутствие базального увеличения [Ca2+]i
во всех клетках.
- 19 -
Рис. 11. Конвергенция сигнальных путей с М3-холинергических рецепторов и
адренергических рецепторов (α1, α2, β3).
(А) – аппликация 1мкМ фенилэфрина на фоне 2нМ ацетилхолина; (Б) – аппликация 3мкМ UK14,304 на фоне 1нМ ацетилхолина; (В) – аппликация β3-селективного CGP12177 (10мкМ) на фоне
1нМ ацетилхолина; (Г) – аппликация 5мкМ активатора аденилатциклазы – форсколина на фоне
1нМ ацетилхолина. В процентах выражена доля адипоцитов с представленными типами Са2+сигналов.
КОНВЕРГЕНЦИЯ
СИГНАЛИЗАЦИИ
М3-ХОЛИНОРЕЦЕПТОРОВ
И
β1,β3-АДРЕНОРЕЦЕПТОРОВ.
Аппликация
агонистов
β-адренорецепторов
(изопротеренол, CGP12177, добутамин) на фоне низких концентраций AСh
вызывает появление кальциевых колебаний в культивируемых белых адипоцитах.
Колебания, в отличие от активации α-адренорецепторов, сопровождаются ростом
базального уровня Са2+ в клетках и наличием лаг-периода (рис. 11В) перед началом
колебаний, продолжительность которого различается у отдельных адипоцитов и
наблюдается при любой концентрации агониста..
Активация β-адренорецепторов связана с последующей активацией Gs белков
и действием cAMP и РКА на различные ферменты и каналы в клетке, включая
фосфорилирование и активацию IP3R, RyR и Са2+-АТФазы ретикулума (SERCA),
что накладывается на регуляцию этих и других клеточных мишеней с участием NO,
cGMP, cADPR и PKG. Подтверждением этому являются эффекты, вызванные
активатором аденилатциклазы – форсколином. Видно, что форсколин, который
приводит к накоплению сАМР и последующей активации РКА, в присутствии
малых концентраций ацетилхолина, вызывает генерацию Са2+-колебаний (рис. 11Г),
- 20 -
также сопровождающихся увеличением базального уровня [Ca2+]i и наличием лагпериода у большинства адипоцитов.
Это свидетельствует об известной по литературным данным активации Са2+каналов ретикулума и Са2+-АТФаз с участием РКА.
Таким образом, в белых адипоцитах имеет место конвергенция сигнализации
для всех перечисленных агонистов, основанная на том, что данные гормоны,
действуя через G белок зависимые рецепторы:
– включают общую систему сигнализации с участием βγ субъединиц (Gβγ) для
Gq, Gi и Gs белков, и имеющих одну общую мишень – фосфоинозитидкиназу PI3Kγ:
Gβγ→PIP3Kγ→Akt/PKB→eNOS→NO→sGC→cGMP→PKG→CD38→cADPR→RyR→Са2+
– имеют классические пути сигнализации с участием Gαq белков (PLC, IP3) и
Gs белков (сАМР, РКА).
Gαq, Gβγ → PLC → IP3 → IP3R → Са2+,
Gαs → AC → cAMP → PKA → (RyR, IP3R)
Gαi
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Фундаментальные механизмы регуляции сигнальных систем жировых клеток
изучены недостаточно. Практически не исследованы и не принимаются во внимание
механизмы конвергенции различных сигнальных систем, как на уровне входов –
рецепторов для различных гормонов и трансмиттеров, так и на уровне вторичных
мессенджеров – сАМР, сGМР, Са2+, NO, IP3, cADP.
В представленном исследовании показано, что белые адипоциты при
воздействии естественного гормона – норадреналина, способны генерировать
различные кальциевые сигналы. Причиной данного различия кальциевых ответов
является не только экспрессия нескольких типов адренергических рецепторов, но и
активация разных сигнальных каскадов. Первый тип кальциевых ответов
характеризуется быстрым транзитным кальциевым ответом, являющимся
результатом активации через α1-адренорецептор фосфоинозитидного сигнального
каскада и мобилизацией кальция из ЭПР. Второй тип ответов белых адипоцитов
характеризуется быстрым кратковременным одиночным импульсом, по кинетике и
механизму формирования отличающемуся от первого типа. В основе этого (впервые
показанного для адипоцитов) механизма лежит активация сигнального пути
PI3K→Akt/PKB→eNOS→sGC→PKG→CD38→RyR при действии норадреналина на
α2-адренорецептор через Gβγ-субъединицы Gi-белков. Третий тип ответов
представляет собой медленное высокоамплитудное увеличение Са2+ в цитозоле,
связанное с активацией аденилатциклазного сигнального каскада при действии
норадреналина на β-адренорецепторы.
Впервые показано действие ацетилхолина на клетки белой жировой ткани. С
помощью ингибиторного анализа продемонстрирована экспрессия функционального
М3-холинорецептора, активация которого приводит к возникновению колебаний
- 21 -
[Са2+]i за счет Gβγ-субъединицы Gq-белков, в результате приводящих к мобилизации
Са2+ через активацию рианодинового рецептора. В поддержании таких кальциевых
колебаний ключевую роль играет NO-синтаза и оксид азота, продукция которого
возрастает под действием ацетилхолина, а ингибирование фермента предотвращает
генерацию периодических режимов в цитоплазме белых адипоцитов мыши.
В работе продемонстрирована конвергенция сигнализации с рецепторов,
запускающих сигнальные каскады, сопряженные с активацией IP3R и RyR за счет
сопряжения
сигналов
G-белок
зависимых
рецепторов
с
участием
βγ-субъединиц на одну общую мишень – фосфоинозитидкиназу (PI3Kγ).
ВЫВОДЫ
1.
В клетках белого жира мыши экспрессируются α1А-, α2- и β1,3адренергические рецепторы, активация которых норадреналином способна
вызывать различные по типу и механизму формирования кальциевые ответы.
2.
При действии норадреналина и селективных агонистов на
α1А-адренорецепторы в белых адипоцитах наблюдается типичное для невозбудимых
клеток транзитное увеличение [Ca2+]i за счет активации фосфоинозитидного пути
передачи внутриклеточных сигналов.
3.
При активации α2-адренорецепторов норадреналином, L-аргинином и
селективными агонистами может активироваться сигнальный путь с участием
PI3Kγ→Akt→eNOS→NO→sGC→cGMP→PKG→CD38→RyR, что приводит к
импульсному выбросу ионов кальция из эндоплазматического ретикулума.
4.
Ацетилхолин вызывает колебания кальция в адипоцитах, которые
обусловлены его взаимодействием с М3-холинорецепторами и селективной
активацией
RyR
по
сигнальному
каскаду
PI3Kγ→Akt→eNOS→NO→sGC→cGMP→PKG→CD38→RyR.
5.
В белых адипоцитах имеет место взаимодействие адренергической и
холинергической сигнальных систем, выраженное в конвергенции сигналов от α1,
α2-адренорецепторов и М3-холинорецепторов на одну общую мишень – PI3K, за счет
ее активации βγ-субъединицами соответствующих G-белков.
6.
Конвергенция сигналов с М3-холинорецепторов и β-адренергических
рецепторов происходит за счет активации PI3K с помощью βγ-субъединиц Gs- и Gqбелков, а также за счет активации PKA, которая приводит к фосфорелированию
каналов эндоплазматического ретикулума и Са2+-АТФаз плазматической мембраны.
- 22 -
СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Статьи в журналах
1. Туровский Е.А., Туровская М.В., Бережнов А.В., Толмачева А.В., Каймачников
Н.П., Долгачева Л.П., Зинченко В.П., Маевский Е.И., Дынник В.В.
Конвергенция Са2+-сигнальных путей в адипоцитах. Роль L-аргинина и
протеинкиназы G в генерации импульсных и периодических Са2+ сигналов.
Биологические мембраны, 2011. Т.28(6): 1-11.
2. Туровский Е.А., Каймачников Н.П., Туровская М.В., Бережнов А.В., Дынник
В.В., Зинченко В.П. Два механизма кальциевых колебаний в адипоцитах.
Биологические мембраны, 2011. Т.28(6):463-72.
3. Туровский Е.А., Конаков М.В., Бережнов А.В., Зинченко В.П., Бронников Г.Е.,
Долгачева Л.П. Изменение Са2+-ответов культивируемых бурых адипоцитов
при адренергической активации. Цитология, 2011. Т.53(6): 466-73.
4. Конаков М.В., Долгачева Л.П., Туровский Е.А., Бронников Г.Е. Изменение
концентрации ионов кальция в цитоплазме бурых преадипоцитов при
адренергической стимуляции. Биологические мембраны 2010, Т27(1): 77-83.
5. Долгачева Л.П., Туровский Е.А., Туровская М.В., Зинченко В.П., Дынник В.В. αадренергический контроль двух Са2+-сигнальных путей адипоцитов.
Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова, 2012 (в печати)
Статьи в сборниках
1. Туровский Е.А., Туровская М.В., Бережнов А.В., Толмачева А.В., Ненов М.Н.,
Долгачева Л.П., Зинченко В.П., Маевский Е.И., Дынник В.В. Регуляция уровня
[Ca2+]i в адипоцитах мыши норадреналином, аргинином и ацетилхолином.
Конвергенция сигнализации α1, α2 и m3 рецепторов. Международная
конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино 2011. (2426 мая) 1, стр. 57-63.
2. Туровский Е.А., Туровская М.В., Бережнов А.В., Долгачева Л.П., Зинченко В.П.,
Маевский Е.И., Дынник В.В. Регуляция уровня Ca2+ в адипоцитах
ацетилхолином. Роль m3-холинорецепторов и PKG. Международная
конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино 2011. (2426 мая) 1, стр. 64-70.
3. Конаков М.В., Туровский Е.А., Туровская М.В., Бережнов А.В., Зинченко В.П.,
Долгачева Л.П. Развитие кальциевого ответа и ретикулума в процессе
дифференцировки адипоцитов в культуре. Международная конференция
«Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино 2011. (24-26 мая) 1, стр.
352-57.
4. Туровский Е.А., Каймачников Н.П., Туровская М.В., Бережнов А.В., Дынник
В.В., Зинченко В.П. Два механизма кальциевых колебаний в адипоцитах.
Международная конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация».
Пущино 2011. (24-26 мая) 1, стр. 391-96.
5. Конаков М.В., Долгачева Л.П., Туровский Е.А., Агафонова Т.А., Бронников Г.Е.
Сравнение Са2+-ответов преадипоцитов мышей и сусликов (SPERMOPHILIS
UNDULATUS)
при
адренергической
стимуляции.
Международная
- 23 -
конференция «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино 2009. (2-4
июня) 1, стр. 278-82.
Тезисы докладов
1. Дынник В.В., Туровский Е.А., Туровская М.В., Толмачева А.В., Долгачева Л.П.,
Зинченко В.П. Активация М3-мускариновых рецепторов вызывает колебания
концентрации
Са2+
и
NO
в
адипоцитах,
действуя
через
2+
2+
Са →NO→cGMP→cADP-ribose→Ca обратную связь. IV съезд биофизиков
России. Нижний Новгород 2012 год.
2. Дынник В.В., Туровский Е.А., Долгачева Л.П., Зинченко В.П. Ожирение, диабет
2-го типа и дисфункция жировой ткани. Международная научная конференция
«Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования
биосистем», Минск 2012. стр. 126.
3. Туровский Е.А., Конаков М.В. Суслики (SPERMOPHILIS UNDULATUS) и мыши
скорее всего имеют разные механизмы индукции гиперплазии бурой жировой
ткани. Школа-конференция для молодых ученых «Методы культивирования
клеток», Санкт-Петербург 2008 год, стр.827.
4. Конаков М.В., Туровский Е.А. Суслики (SPERMOPHILIS UNDULATUS) и мыши
имеют разные механизмы индукции гиперплазии бурой жировой ткани.
Всероссийская медико-биологическая научная конференция молодых учёных
«Фундаментальная наука и клиническая медицина» (XI Всероссийская
конференция «Человек и его здоровье»), Санкт-Петербург 2008 год, стр.162.
5. Туровский Е.А., Долгачева Л.П., Туровская М.В., Дынник В.В., Зинченко В.П. αадренергический контроль двух Cа2+-сигнальных путей белых адипоцитов.
Международная конференция молодых ученых «Экспериментальная и
теоретическая биофизика '12», Пущино, 2012 год, стр. 52-53.
- 24 -
Документ
Категория
Биологические науки
Просмотров
144
Размер файла
662 Кб
Теги
кандидатская
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа