close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

Цитомегаловирус IgG авидность - Аналитика

код для вставкиСкачать
Avidity determination of IgG antibodies against CMV ELISA, EUROIMMUN AG
1
_____________________________________________________________________________________________________
Регистрационное удостоверение ФС №2005/1125 от 18.08.2005 г.
Цитомегаловирус IgG авидность
(Avidity determination of IgG antibodies against CMV ELISA)
Иммуноферментный тест для определения авидности IgG-антител к CMV в сыворотке или плазме крови
Номер по каталогу:
ЕI 2570-9601-1 G
Набор на 96 определений
НАЗНАЧЕНИЕ НАБОРА И ПРИНЦИП МЕТОДА
Определение различий между недавней инфекцией и инфекциями, которые протекают уже какое-то время
– одна из важнейших проблем, с которой сталкивается серология. До настоящего времени наиболее
распространенным методом дифференциации было исследование специфических антител класса IgM,
которые обычно появляются в начальной фазе инфекции и определение которых часто бывает
ненадежным и проблематичным. Мешающими факторами являются длительный IgM ответ, не
определяемый уровень или задержка образования IgM-антител, а также неспецифическое образование
IgM-антител в ответ на поликлональную стимуляцию В-клеток.
Для надежного определения недавней первичной инфекции в последние несколько лет принято определять
авидность антител класса IgG. Первой реакцией иммунной системы после инфицирования является
образование низко-авидных антител. По мере развития инфекции образуются IgG, адаптированные к
антигену, и авидность антител возрастает. До тех пор, пока в сыворотке крови не обнаружены высокоавидные антитела IgG, можно предполагать, что инфекция все еще находится на ранней стадии.
МАТЕРИАЛЫ И РЕАГЕНТЫ
Состав тест-системы: ЕI 2570-9601-1 G
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Компонент
Набор Anti-CMV ELISA
(IgG, кат. № ЕI 2570-9601 G)
Положительный контроль HA
Высокоавидные антитела к CMV (IgG, человека),
готов к использованию
Положительный контроль LA
Низкоавидные антитела к CMV (IgG, человека),
готов к использованию
Раствор мочевины
Для анализа (ELISA) на антитела к CMV; готов к
использованию
Фосфатный буфер
Готов к использованию
Инструкция по применению
Серия
Для in vitro диагностики
Цвет
–
Количество
красный
1 × 1,3 мл
Обозначение
POS CONTROL HA
синий
1 × 1,3 мл
POS CONTROL LA
желтый
1 × 12 мл
UREA
голубой
–
1 × 12 мл
PBS BUFFER
1 буклет
Температура хранения
Невскрытый набор использовать до
Хранение и стабильность набора: Набор следует хранить при температуре от +2 °С до +8 °С. Не
замораживать. Невскрытые компоненты набора сохраняют стабильность в течение всего указанного срока
годности набора.
Утилизация отходов: Образцы пациентов, калибраторы, контроли и стрипы после инкубации следует
рассматривать как инфицированные отходы и обращаться с ними соответствующим образом. Все реагенты
следует утилизировать в соответствии с действующими официальными инструкциями.
ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ РЕАГЕНТОВ
Примечание: Перед использованием все реагенты необходимо прогреть до комнатной температуры (от
+18 °С до +25 °С) в течение 30 минут. После первого использования реагенты сохраняют стабильность в
течение указанного срока годности, если они хранятся при температуре от +2 °С до +8 °С и защищены от
микробной контаминации. Прочие сведения о стабильности отдельных реагентов указаны ниже.
Контроли: Готовы к использованию. Необходимо тщательно перемешать перед использованием.
Раствор мочевины: Готов к использованию.
Фосфатный буфер: Готов к использованию.
Предостережение: Использованные контрольные сыворотки были проверены на антитела к ВИЧ-1 и ВИЧ-2
и вирусу гепатита С, а также на наличие HBsAg, методами иммуноферментного анализа и непрямой
иммунофлуоресценции и показали отрицательные результаты. Тем не менее, все используемые
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Avidity determination of IgG antibodies against CMV ELISA, EUROIMMUN AG
2
_____________________________________________________________________________________________________
материалы следует считать потенциально опасными и обращаться с ними, соблюдая необходимые меры
предосторожности. Некоторые реагенты ядовиты (буфер, раствор хромогена/субстрата). Избегайте
попадания на кожу. Если контакт произошел, промойте кожу мылом и большим количеством воды.
ПОДГОТОВКА И СТАБИЛЬНОСТЬ ОБРАЗЦОВ ПАЦИЕНТОВ
Материал образцов: Сыворотка или плазма (ЭДТА, гепарин или цитрат) крови человека.
Стабильность: Образцы пациентов, предназначенные для исследования этим методом, можно хранить до
14 дней при температуре от +2 оС до +8 оС. Разведенные образцы необходимо использовать в течение
одного рабочего дня.
Разведение образцов: Образцы пациентов разводят 1:101 буфером для образцов. Например: разведите
10 мкл сыворотки в 1,0 мл буфера для образца и тщательно перемешайте на вортексе (пипетки для этого
не подходят).
ПРИМЕЧАНИЕ: Контроли готовы к использованию, их разводить не надо.
ПРОЦЕДУРА ИССЛЕДОВАНИЯ
Инкубация с образцом (1 стадия)
Внесите по 100 мкл каждого контроля или разведенных образцов пациентов в отдельные лунки
микропланшета в соответствии с протоколом. Инкубируйте планшет при комнатной температуре (от +18 °С
до + 25 °С) в течение 30 минут.
Промывка
Вручную. Удалите содержимое лунок, затем промойте 1 раз все лунки, внося по 300 мкл приготовленного
промывочного буфера в каждую лунку.
Автоматическая: проводите промывку в режиме с переполнением, для чего установите в программе для
соответствующего автоматического вошера, например, TECAN Columbus Washer, параметр “Overflow” с
одним циклом промывки и внесением в лунки по 450 мкл рабочего промывочного буфера.
Оставляйте промывочный буфер в каждой лунке в течение 30 – 60 секунд во время цикла промывки, затем
удаляйте содержимое лунок. После промывки (вручную или автоматической) тщательно удаляйте остатки
промывочного буфера из лунок, постукивая перевернутым планшетом о фильтровальную бумагу.
Инкубация с мочевиной (2 стадия)
Внесите в каждую лунку одного стрипа по 200 мкл раствора мочевины и по 200 мкл фосфатного буфера в
каждую лунку другого параллельного стрипа (в который вносили аналогичные образцы и контроли, см.
протокол размещения на планшете образцов и контролей). Так продолжите по всему планшету согласно
протоколу. Инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре (от +18 °С до + 25 °С).
Промывка
Удалите жидкость из лунок. Промойте, как описано ранее, увеличив количество циклов промывания до 3.
Примечание: Остаточная жидкость (больше 10 мкл), обычно остающаяся в лунках после промывания,
может помешать действию субстрата и снизить оптическую плотность (ОП) раствора в лунках.
Недостаточно полное промывание (например, менее 3 раз, или при маленьком объеме добавляемого
промывочного буфера, или при коротком времени выдерживания буфера в лунках) может в результате
привести к завышенным величинам ОП в лунках.
Инкубация с конъюгатом (3 стадия)
Внесите в каждую лунку по 100 мкл ферментного конъюгата (меченные пероксидазой антитела к IgG
человека). Инкубируйте в течение 30 минут при комнатной температуре (от +18 °С до + 25 °С).
Промывка
Удалите жидкость из лунок. Промойте, как описано ранее, увеличив количество циклов промывания до 3.
Инкубация с субстратом (4 стадия)
Внесите в каждую лунку по 100 мкл раствора хромогена/субстрата. Инкубируйте планшет в течение 15
минут при комнатной температуре (от +18 °С до +25 °С) в защищенном от прямого солнечного света месте.
Остановка реакции
Добавьте в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента (в той же последовательности и с такой же скоростью,
как вносился раствор хромогена/субстрата).
Измерение
Фотометрическое измерение интенсивности окрашивания раствора в лунках проводят при основной
длине волны 450 нм и при референтной длине волны между 620 нм и 650 нм в течение 30 минут после
добавления стоп-реагента. Перед измерением слегка покачайте планшет, чтобы добиться гомогенного
распределения раствора.
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Avidity determination of IgG antibodies against CMV ELISA, EUROIMMUN AG
3
_____________________________________________________________________________________________________
СХЕМА РАЗМЕЩЕНИЯ НА ПЛАНШЕТЕ ОБРАЗЦОВ И КОНТРОЛЕЙ
A
B
C
D
E
F
G
H
1
Pos
HA
Pos
LA
Р1
P2
P3
P4
P5
P6
2
Pos
HA
Pos
LA
P1
P2
P3
P4
P5
P6
3
P7
4
P7
5
Р 15
6
Р 15
P8
P8
Р 16
Р 16
P9
P 10
P 11
P 12
P 13
P 14
P9
Р 10
Р 11
Р 12
Р 13
Р 14
Р 17
Р 18
Р 17
Р 18
7
8
9
10
11
12
Представленная выше схема представляет собой пример размещения на планшете проб для определения
авидности IgG-антител в 18 образцах пациентов (от Р 1 до Р 18).
Положительные контроли (PosHA и PosLA), а также образцы пациентов следует инкубировать в
дубликатах, разместив их в двух лунках соседних стрипов. Лунки стрипов 1, 3, 5 и т. д. обрабатывают
раствором мочевины после проведения инкубации с образцами пациентов; лунки стрипов 2, 4, 6 и т. д. –
обрабатывают фосфатным буфером.
Лунки можно отламывать от стрипов по одной. Это позволяет привести в соответствие используемое
количество субстрата и количество исследуемых образцов и, таким образом, минимизировать расход
реагентов.
Оба положительных контроля с высокоавидными и низкоавидными антителами выполняют роль внутренних
контролей для проверки правильности процедуры тестирования. Их следует использовать при каждой
постановке анализа.
РАСЧЕТ РЕЗУЛЬТАТОВ
Полуколичественный анализ
Присутствие низкоавидных антител в сыворотках пациентов считается доказанным, если значение ОП в
соответствующих лунках при проведении ИФА существенно уменьшается в результате обработки лунок
мочевиной. Для объективной оценки результатов рассчитывают индекс относительной авидности (RAI) и
выражают его в процентах, используя величины ОП в лунках, не прошедших и прошедших обработку
мочевиной.
ОП образца, обработанного мочевиной × 100
ОП образца без обработки мочевиной
= индекс относительной авидности (RAI), в %
Верхняя граница интервала для низкоавидных антител (величина cut-off), рекомендованная фирмой
EUROIMMUN, составляет 40 % RAI. Величины ниже указанного cut-off должны свидетельствовать о
наличии в образце низкоавидных IgG-антител, величины между 40 % и 60 % - должны определять
пограничный результат, а величины превышающие 60 % - указывать на присутствие высокоавидных IgGантител. Если результат оценивается как пограничный, рекомендуется взять еще один образец у пациента
повторно не ранее, чем через 7 дней после первого и проанализировать его вместе с первым образцом.
RAI < 40 %:
RAI в интервале от 40 % до 60 %:
RAI > 60 %:
указывает на наличие низкоавидных антител
пограничный результат
указывает на наличие высокоавидных антител
Достоверные результаты измерения авидности IgG антител могут быть получены только в том случае, если
в образце пациента содержится диагностически значимое количество специфических антител. В целом,
определение индекса относительной авидности в образцах, ОП которых после обработки мочевиной <
0,140, не целесообразно.
При постановке диагноза всегда помимо результатов серологических исследований необходимо учитывать
клинические симптомы пациента.
ВНИМАНИЕ: У некоторых пациентов с острой инфекцией обнаруживаются очень высокие титры IgG
антител. Даже если популяция антител класса IgG находится на разных стадиях созревания (и
высокоавидные, и низкоавидные), свободные эпитопы антигенов в сыворотках с высоким титром антител
будут заниматься преимущественно высокоавидными антителами. Определение авидности для всей
популяции антител класса IgG в таких образцах может привести к получению ложноповышенного
соотношения.
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Avidity determination of IgG antibodies against CMV ELISA, EUROIMMUN AG
4
_____________________________________________________________________________________________________
Ложно повышенное соотношение может наблюдаться в некоторых случаях острой инфекции, когда ОП в
лунках с образцом необработанным мочевиной >1,200. В таком случае рекомендуется повторить
исследование на авидность в разведении 1:401. Если при ОП>1,200 были определены низкоавидные
антитела, то в дальнейшем исследовании с большим разведением нет необходимости
КЛИНИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
В большинстве случаев ЦМВ-инфекция протекает субклинически или бессимптомно. Заболевание может
протекать с поражением почти всех органов, но в первую очередь характеризуется гепатитом и
пневмонией, которые сопровождаются длительной лихорадкой. Серопозитивные цитомегаловирусные
инфекции с воспалительным ответом (интерлейкин-6) позволяет предсказать смертность у пациентов с
болезнями коронарных артерий. Антитела к цитомегаловирусу могут обнаруживаться в сыворотке
практически всех пациентов, после того как началось заболевание. Как правило, развивается длительный
иммунитет. Частота встречаемости цитомегаловирусной инфекции зависит от географического района,
социального и экономического статуса. Распространенность серопозитивности (IgG), описанная для
Западной Европы и Канады, составляет 30-50 % у мужчин и 20 – 50 % у женщин репродуктивного возраста.
В США частота встречаемости ЦМВ инфекции чуть выше. Наибольшая частота встречаемости инфекции
отмечена в Азии и Африке, достигая 95 % у взрослых. Однако ранее перенесенная инфекция может
реактивироваться при ослаблении иммунологических механизмов защиты.
Возможно, цитомегаловирусы являются наиболее частыми возбудителями пренатальной инфекции у
новорожденных детей, и у одного из 20 новорожденных с врожденным инфицированием отмечаются
тяжелые признаки поражения. Врожденная цитомегалия в первую очередь вызывает поражения печени,
селезенки и центральной нервной системы. Приблизительно в 1% из всех летальных случаев
инфицирование произошло внутриутробно и отмечается образование IgM антител. ЦМВ, основная
вирусная причина врожденных заболеваний, ведет к нарушению в местах прикрепления плаценты к матке с
различным исходом, в зависимости от напряженности гуморального иммунитета матери и гестационного
возраста. Вирионы ЦМВ могут распространяться в плаценте путем кооптации опосредованного
рецепторами транспортного пути для IgG. Эти находки могут объяснить эффективность гипериммунизации
IgG при лечении первичной ЦМВ инфекции во время беременности и поддерживают вакцинацию.
У серо-негативных пациентов с иммунодефицитом, таких как пациентов с опухолевыми заболеваниями и
реципиентов после трансплантации, часто показана пассивная иммунизация специфическими
иммуноглобулинами. Таким пациентам и детям на грудном кормлении (особенно новорожденным) нельзя
вводить препараты крови от доноров крови, инфицированных ЦМВ (положительных по ЦМВ), так как
антигены, как правило, локализируются в лейкоцитах.
При определенных условиях, особенно у беременных женщин, диагноз ЦМВ инфекции в первую очередь
базируется на определении IgG и IgM антител; однако, наличие IgM антител не является единственным
маркером острой инфекции. Для определения стадии требуется проведение дополнительных тестов.
Ложно-положительные IgM результаты определения ЦМВ могут наблюдаться у пациентов с острой фазой
инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр. Поражения плода преимущественно связаны с первичной
инфекцией матери, поэтому у беременных женщин крайне важно дифференцировать первичную инфекцию
от рецидивирующей или стойкой ЦМВ инфекции. Для этого лучшим методом является определение
авидности IgG антител. Более того, высокая нагрузка ДНК ЦМВ амниотической жидкости может служить
показателем симптоматической врожденной инфекции на относительно ранних сроках беременности.
Определение специфических IgM антител в крови плода коррелирует с исходом заболевания для плода
или новорожденного.
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
Список литературы приведен в оригинале инструкции на английском языке.
Внимание! Перевод сделан с английского оригинала инструкции. Перед постановкой исследования
сверьте номер и дату издания вложенного в набор оригинала с указанными в настоящем переводе (см.
внизу справа). При несовпадении номеров или дат обратитесь в «Аналитику» за новым переводом, либо
руководствуйтесь оригиналом инструкции.
Anti-CMV_Avidity_ ELISA_EI_2570-9601-1G_rus.doc
16.06.2009 16:42
Оригинал EI_2570G-1G_A_UK_C06.doc
Version: 09.04.2009 8:35
_____________________________________________________________________________________________________
© Перевод на русский язык ЗАО «АНАЛИТИКА», Москва, 2009
тел.: 737-0363, факс: 737-0365, e-mail: info@analytica.ru
Документ
Категория
Медицина
Просмотров
134
Размер файла
256 Кб
Теги
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа