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[5][_]
Physical
(318/ 508)
[6][_]
6 N
(18)
[7][_]
4 N
(16)
[8][_]
15 minutes
(12)
[9][_]
30 minutes
(11)
[10][_]
100 %
(8)
[11][_]
1 g
(7)
[12][_]
50 g
(7)
[13][_]
50 %
(5)
[14][_]
20 %
(5)
[15][_]
0,6 L
(4)
[16][_]
5 minutes
(4)
[17][_]
5 ml
(4)
[18][_]
1 ml
(4)
[19][_]
50 ml
(4)
[20][_]
16 g
(4)
[21][_]
0,5 M
(4)
[22][_]
10 g
(4)
[23][_]
60 minutes
(4)
[24][_]
0,5 %
(4)
[25][_]
4 % de
(3)
[26][_]
de 2 % de
(3)
[27][_]
4 %
(3)
[28][_]
15 %
(3)
[29][_]
1 M
(3)
[30][_]
200 ml
(3)
[31][_]
1,5 g
(3)
[32][_]
1 N
(3)
[33][_]
2 minutes
(3)
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100 ml
(3)
[35][_]
3 %
(3)
[36][_]
1 litre
(3)
[37][_]
14 %
(3)
[38][_]
1 %
(3)
[39][_]
0,2 M
(3)
[40][_]
40 minutes
(3)
[41][_]
275 nm
(3)
[42][_]
4 g
(3)
[43][_]
20 g
(3)
[44][_]
240 minutes
(3)
[45][_]
250 ml
(3)
[46][_]
10 kg
(3)
[47][_]
10 %
(3)
[48][_]
200 g
(3)
[49][_]
85 %
(2)
[50][_]
200 L
(2)
[51][_]
15 % de
(2)
[52][_]
96 %
(2)
[53][_]
3 % de
(2)
[54][_]
40 % de
(2)
[55][_]
de 100 %
(2)
[56][_]
50 m
(2)
[57][_]
1 % de
(2)
[58][_]
4,0 g
(2)
[59][_]
1 mole
(2)
[60][_]
10 minutes
(2)
[61][_]
40 g
(2)
[62][_]
20 minutes
(2)
[63][_]
de 500 litres
(2)
[64][_]
1,2 kg
(2)
[65][_]
300 litres
(2)
[66][_]
150 litres
(2)
[67][_]
0,25 % de
(2)
[68][_]
2 %
(2)
[69][_]
425,8 g
(2)
[70][_]
de 4000 g
(2)
[71][_]
86,7 %
(2)
[72][_]
10 % de
(2)
[73][_]
90 g
(2)
[74][_]
0,4 g
(2)
[75][_]
0,20 g
(2)
[76][_]
300 g
(2)
[77][_]
de 100 ml
(2)
[78][_]
2,0 %
(2)
[79][_]
6,1 %
(2)
[80][_]
20 % de
(2)
[81][_]
90 %
(1)
[82][_]
de 90 %
(1)
[83][_]
de 10 %
(1)
[84][_]
de 3 bars
(1)
[85][_]
6 L
(1)
[86][_]
1000 g
(1)
[87][_]
310 g
(1)
[88][_]
de 60 cm
(1)
[89][_]
de 34,5 minutes
(1)
[90][_]
6 %
(1)
[91][_]
de 47,12 minutes
(1)
[92][_]
67 %
(1)
[93][_]
de 41,25 minutes
(1)
[94][_]
27 %
(1)
[95][_]
55 %
(1)
[96][_]
de 45 %
(1)
[97][_]
0,10 M
(1)
[98][_]
50 o C
(1)
[99][_]
4 K
(1)
[100][_]
45 %
(1)
[101][_]
de 25 ml
(1)
[102][_]
10 mg
(1)
[103][_]
30 mg
(1)
[104][_]
300 ml
(1)
[105][_]
15 g
(1)
[106][_]
450 ml
(1)
[107][_]
280 nm
(1)
[108][_]
2000 ml
(1)
[109][_]
10 ml
(1)
[110][_]
500 m
(1)
[111][_]
100 cm
(1)
[112][_]
de 30 ml
(1)
[113][_]
3 J
(1)
[114][_]
6-GB
(1)
[115][_]
0,3 M
(1)
[116][_]
20 ml
(1)
[117][_]
80 ml
(1)
[118][_]
15 ml
(1)
[119][_]
de 10 cm
(1)
[120][_]
10 cm
(1)
[121][_]
de 2,5 cm
(1)
[122][_]
10 ul
(1)
[123][_]
210 minutes
(1)
[124][_]
212 minutes
(1)
[125][_]
0,6 M
(1)
[126][_]
1,0 M
(1)
[127][_]
de 50 ml
(1)
[128][_]
4,5 K
(1)
[129][_]
8,12 g
(1)
[130][_]
0,5 N
(1)
[131][_]
120 minutes
(1)
[132][_]
0,1 M
(1)
[133][_]
5,0 g
(1)
[134][_]
0,33 N
(1)
[135][_]
de 10 minutes
(1)
[136][_]
5 s
(1)
[137][_]
0,006 N
(1)
[138][_]
43,65 g
(1)
[139][_]
6 g
(1)
[140][_]
2 g
(1)
[141][_]
1000 ml
(1)
[142][_]
7,2 kg
(1)
[143][_]
3,6 kg
(1)
[144][_]
240 litres
(1)
[145][_]
de 2500 litres
(1)
[146][_]
90 kg
(1)
[147][_]
20 kg
(1)
[148][_]
150 ml
(1)
[149][_]
de zero atmosphere
(1)
[150][_]
1080 litres
(1)
[151][_]
0,5 atmosphere
(1)
[152][_]
8 litres
(1)
[153][_]
22 kg
(1)
[154][_]
6 kg
(1)
[155][_]
325 litres
(1)
[156][_]
360 litres
(1)
[157][_]
725 litres
(1)
[158][_]
1850 litres
(1)
[159][_]
de 561 g
(1)
[160][_]
de 12,7 %
(1)
[161][_]
100 g
(1)
[162][_]
de 3 m
(1)
[163][_]
4 litres
(1)
[164][_]
28 l
(1)
[165][_]
400 ml
(1)
[166][_]
de 94,0 %
(1)
[167][_]
de 58,7 %
(1)
[168][_]
85,2 g
(1)
[169][_]
664,8 g
(1)
[170][_]
de 7,5 ml
(1)
[171][_]
4,00 g
(1)
[172][_]
6,4 %
(1)
[173][_]
21,2 %
(1)
[174][_]
42,0 %
(1)
[175][_]
82,7 %
(1)
[176][_]
de 91,4 %
(1)
[177][_]
de 83 %
(1)
[178][_]
3574,2 g
(1)
[179][_]
20,1 g
(1)
[180][_]
de 45 g
(1)
[181][_]
1550 g
(1)
[182][_]
de 17 g
(1)
[183][_]
425,6 g
(1)
[184][_]
3574 g
(1)
[185][_]
de 44,8 g
(1)
[186][_]
de 1,7 g
(1)
[187][_]
1575 g
(1)
[188][_]
de 34,5 g
(1)
[189][_]
3524,2 g
(1)
[190][_]
7 g
(1)
[191][_]
24 g
(1)
[192][_]
26 g
(1)
[193][_]
10 J
(1)
[194][_]
56,4 %
(1)
[195][_]
60,2 %
(1)
[196][_]
65,5 %
(1)
[197][_]
90,2 %
(1)
[198][_]
91,3 %
(1)
[199][_]
45 minutes
(1)
[200][_]
97,4 %
(1)
[201][_]
73,7 %
(1)
[202][_]
90,0 %
(1)
[203][_]
51,1 %
(1)
[204][_]
78,2 %
(1)
[205][_]
de 0,3 ml
(1)
[206][_]
0,9 g/ml
(1)
[207][_]
4 minutes
(1)
[208][_]
7 cm
(1)
[209][_]
9 cm
(1)
[210][_]
de 1 mm
(1)
[211][_]
12 %
(1)
[212][_]
de 7,3 cm
(1)
[213][_]
de 5,0 cm
(1)
[214][_]
25,6 %
(1)
[215][_]
172 g
(1)
[216][_]
98,0 %
(1)
[217][_]
680 g
(1)
[218][_]
0,2 g
(1)
[219][_]
0,8 g
(1)
[220][_]
1,6 g
(1)
[221][_]
5 g
(1)
[222][_]
6,25 lx
(1)
[223][_]
5 % de
(1)
[224][_]
100 kg
(1)
[225][_]
8 bars
(1)
[226][_]
25 sec
(1)
[227][_]
96,5 %
(1)
[228][_]
9 %
(1)
[229][_]
70 g
(1)
[230][_]
560 g
(1)
[231][_]
0,025 g
(1)
[232][_]
0,40 g
(1)
[233][_]
0,050 g
(1)
[234][_]
0,10 g
(1)
[235][_]
8 %
(1)
[236][_]
15 kg
(1)
[237][_]
35 litres
(1)
[238][_]
75 g
(1)
[239][_]
18 g
(1)
[240][_]
440 minutes
(1)
[241][_]
800 L
(1)
[242][_]
3,5 %
(1)
[243][_]
450 g
(1)
[244][_]
de 4,1 ml
(1)
[245][_]
250 g
(1)
[246][_]
8 g
(1)
[247][_]
1,00 g
(1)
[248][_]
79,7 %
(1)
[249][_]
7,4 %
(1)
[250][_]
12,2 %
(1)
[251][_]
8,1 %
(1)
[252][_]
84,4 %
(1)
[253][_]
3,7 %
(1)
[254][_]
5,7 %
(1)
[255][_]
80 %
(1)
[256][_]
63 %
(1)
[257][_]
87 %
(1)
[258][_]
66 %
(1)
[259][_]
35 %
(1)
[260][_]
71 %
(1)
[261][_]
30 %
(1)
[262][_]
de 24 %
(1)
[263][_]
de 70 % de
(1)
[264][_]
60 L
(1)
[265][_]
2 N
(1)
[266][_]
de 1,75 litre/tonne
(1)
[267][_]
200 N
(1)
[268][_]
de 100 g
(1)
[269][_]
2000 g
(1)
[270][_]
de 300 g
(1)
[271][_]
4,18 % de
(1)
[272][_]
220 g
(1)
[273][_]
8,0 %
(1)
[274][_]
1,0 %
(1)
[275][_]
0,01 N
(1)
[276][_]
de 0,05 %
(1)
[277][_]
84 % de
(1)
[278][_]
de 0,15 %
(1)
[279][_]
de 86 %
(1)
[280][_]
de 78 %
(1)
[281][_]
2518570 g
(1)
[282][_]
50 % de
(1)
[283][_]
275 gr
(1)
[284][_]
52 o C
(1)
[285][_]
4-GB
(1)
[286][_]
2-GB
(1)
[287][_]
0,05 g
(1)
[288][_]
0,18 g
(1)
[289][_]
120 ml
(1)
[290][_]
135 ml
(1)
[291][_]
160 ml
(1)
[292][_]
170 ml
(1)
[293][_]
60 %
(1)
[294][_]
150 g
(1)
[295][_]
25 % de
(1)
[296][_]
90 minutes
(1)
[297][_]
1,65 g
(1)
[298][_]
0,033 g
(1)
[299][_]
48 ml
(1)
[300][_]
98 ml
(1)
[301][_]
111 ml
(1)
[302][_]
15 min.
(1)
[303][_]
70 litres
(1)
[304][_]
5 litres
(1)
[305][_]
20,45 %
(1)
[306][_]
20,06 % de
(1)
[307][_]
20,26 %
(1)
[308][_]
de 500 ml
(1)
[309][_]
3,0 %
(1)
[310][_]
1,20 g
(1)
[311][_]
20,3 %
(1)
[312][_]
20,7 %
(1)
[313][_]
18,0 %
(1)
[314][_]
19,4 %
(1)
[315][_]
88,6 %
(1)
[316][_]
93,5 %
(1)
[317][_]
de 150 gr
(1)
[318][_]
4,5 g
(1)
[319][_]
98 %
(1)
[320][_]
de 14,1 kg
(1)
[321][_]
5 atm
(1)
[322][_]
de 19,0 kg
(1)
[323][_]
16,9 % de
(1)
[324][_]
Gene Or Protein
(60/ 333)
[325][_]
Protein
(100)
[326][_]
Etre
(64)
[327][_]
La Protein
(33)
[328][_]
Cellulases
(15)
[329][_]
Pectinase
(14)
[330][_]
Protein A
(8)
[331][_]
BIII
(7)
[332][_]
NSI
(7)
[333][_]
Hemoglobin
(6)
[334][_]
Protease
(5)
[335][_]
Acti
(4)
[336][_]
Est-a
(4)
[337][_]
Beta-glucanase
(4)
[338][_]
Inulinase
(4)
[339][_]
Vege
(3)
[340][_]
Bc 1
(3)
[341][_]
Protein Et
(2)
[342][_]
Meme Protein
(2)
[343][_]
Proteinase
(2)
[344][_]
CES
(2)
[345][_]
Trai
(2)
[346][_]
Tric
(2)
[347][_]
Ine
(2)
[348][_]
Osm
(2)
[349][_]
DANS
(1)
[350][_]
Sila Protein
(1)
[351][_]
Hela Protein
(1)
[352][_]
APS-1
(1)
[353][_]
Fic
(1)
[354][_]
Yse
(1)
[355][_]
GR60
(1)
[356][_]
JUP
(1)
[357][_]
Drc
(1)
[358][_]
Cla
(1)
[359][_]
IRF
(1)
[360][_]
OVO
(1)
[361][_]
Pec
(1)
[362][_]
Pectinesterase
(1)
[363][_]
Ical
(1)
[364][_]
Prepl
(1)
[365][_]
Frac
(1)
[366][_]
Soja Protein
(1)
[367][_]
Soj
(1)
[368][_]
G Protein
(1)
[369][_]
Noi
(1)
[370][_]
E Protein
(1)
[371][_]
Pro Protein
(1)
[372][_]
Protein I
(1)
[373][_]
B-I
(1)
[374][_]
Lic
(1)
[375][_]
Cl 1
(1)
[376][_]
Lipases
(1)
[377][_]
Alpha-amylase
(1)
[378][_]
Amylase
(1)
[379][_]
Ote
(1)
[380][_]
Glucoamylase
(1)
[381][_]
Appa
(1)
[382][_]
Sepa
(1)
[383][_]
Osr
(1)
[384][_]
HPL
(1)
[385][_]
Molecule
(81/ 327)
[386][_]
water
(97)
[387][_]
OH
(25)
[388][_]
Asp
(21)
[389][_]
ethanol
(21)
[390][_]
nitrogen
(17)
[391][_]
Cl
(17)
[392][_]
CO
(8)
[393][_]
carbon
(7)
[394][_]
glucose
(7)
[395][_]
acetate
(6)
[396][_]
galactose
(6)
[397][_]
sulfite
(5)
[398][_]
tyrosine
(4)
[399][_]
xylose
(3)
[400][_]
arabinose
(3)
[401][_]
acetic acid
(3)
[402][_]
acetic acid glacial
(3)
[403][_]
ISSPH
(3)
[404][_]
c-galacturonic acid
(2)
[405][_]
fucose
(2)
[406][_]
acetone
(2)
[407][_]
Tris
(2)
[408][_]
citrate
(2)
[409][_]
trichloroacetic acid
(2)
[410][_]
iron
(2)
[411][_]
suspen
(2)
[412][_]
DES
(1)
[413][_]
phic
(1)
[414][_]
quide
(1)
[415][_]
Dde
(1)
[416][_]
INFOR
(1)
[417][_]
SY-
(1)
[418][_]
S=
(1)
[419][_]
Nal
(1)
[420][_]
rhamnopyranose
(1)
[421][_]
xylopyranose
(1)
[422][_]
urea
(1)
[423][_]
2-Chlorite
(1)
[424][_]
methane
(1)
[425][_]
DEAE
(1)
[426][_]
sodium acetate
(1)
[427][_]
KCl
(1)
[428][_]
formic acid
(1)
[429][_]
Citr
(1)
[430][_]
Po-
(1)
[431][_]
Be-
(1)
[432][_]
talmon
(1)
[433][_]
phosphate
(1)
[434][_]
citric acid monohydrate
(1)
[435][_]
hydrogen-phosphate disodium
(1)
[436][_]
Asn
(1)
[437][_]
phosphoric acid
(1)
[438][_]
Serine
(1)
[439][_]
Proline
(1)
[440][_]
Glycine
(1)
[441][_]
Alanine
(1)
[442][_]
Histidine
(1)
[443][_]
Arginine
(1)
[444][_]
Isoleucine
(1)
[445][_]
Leucine
(1)
[446][_]
Lysine
(1)
[447][_]
Phenylalanine
(1)
[448][_]
Cystine
(1)
[449][_]
Methionine
(1)
[450][_]
Threonine
(1)
[451][_]
Tryptophane
(1)
[452][_]
Valine
(1)
[453][_]
B-300
(1)
[454][_]
dans-6
(1)
[455][_]
Pa-
(1)
[456][_]
Hanq
(1)
[457][_]
hexane
(1)
[458][_]
betanine
(1)
[459][_]
maltose
(1)
[460][_]
minee
(1)
[461][_]
5,o5,97,3-Fructose
(1)
[462][_]
33,2-Galacturonic acid
(1)
[463][_]
hydroxyproline
(1)
[464][_]
sulfuric acid
(1)
[465][_]
paration
(1)
[466][_]
Et
(1)
[467][_]
Generic
(18/ 97)
[468][_]
carbohydrate
(24)
[469][_]
sugar
(19)
[470][_]
acid
(13)
[471][_]
alcohol
(7)
[472][_]
amino acids
(7)
[473][_]
disaccharide
(4)
[474][_]
saccharide
(3)
[475][_]
salts
(3)
[476][_]
monosaccharide
(3)
[477][_]
ester
(3)
[478][_]
cation
(3)
[479][_]
oligosaccharides
(2)
[480][_]
polyphenols
(1)
[481][_]
trisaccharide
(1)
[482][_]
amines
(1)
[483][_]
galacturonic acids
(1)
[484][_]
peptides
(1)
[485][_]
hydrates
(1)
[486][_]
Polymer
(12/ 77)
[487][_]
Polysaccharide
(22)
[488][_]
Starch
(18)
[489][_]
Cellulose
(7)
[490][_]
Pectine
(6)
[491][_]
Dextrane
(5)
[492][_]
Pectin
(5)
[493][_]
Agarose
(4)
[494][_]
AVICEL
(4)
[495][_]
Inulin
(2)
[496][_]
Pluronic
(2)
[497][_]
Hemicellulose
(1)
[498][_]
Alginates
(1)
[499][_]
Organism
(13/ 21)
[500][_]
Aspergillus
(4)
[501][_]
B licheniformis
(3)
[502][_]
Aspergillus niger
(2)
[503][_]
Aspergillus aculeatus
(2)
[504][_]
manioc
(2)
[505][_]
lion
(1)
[506][_]
Tarpon
(1)
[507][_]
bovine
(1)
[508][_]
citrus
(1)
[509][_]
rat
(1)
[510][_]
Trichoderma
(1)
[511][_]
meles
(1)
[512][_]
Trichoderma reesei
(1)
[513][_]
Chemical Role
(5/ 18)
[514][_]
adjuvant
(7)
[515][_]
colorants
(6)
[516][_]
pigments
(2)
[517][_]
antibiotic
(2)
[518][_]
vitamins
(1)
[519][_]
Disease
(8/ 16)
[520][_]
Tic
(6)
[521][_]
Alcoholic
(2)
[522][_]
Agita
(2)
[523][_]
Pain
(2)
[524][_]
Rales
(1)
[525][_]
Infection
(1)
[526][_]
Flatulance
(1)
[527][_]
Gout
(1)
[528][_]
Company Reg No.
(3/ 4)
[529][_]
GB 1000
(2)
[530][_]
CC 20236 x
(1)
[531][_]
GB 1500
(1)
[532][_]
Substituent
(1/ 1)
[533][_]
trisacryl
(1)
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Publication
_________________________________________________________________
Number FR2518570A1
Family ID 7526703
Probable Assignee Novo Industri As
Publication Year 1983
Title
_________________________________________________________________
FR Title ENZYME DESTINEE A LA DECOMPOSITION D'UN carbohydrate A POIDS
MOLECULAIRE ELEVE, carbohydrate AINSI OBTENU, PROCEDE DE SELECTION
D'UN MICRO-ORGANISME PRODUISANT LADITE ENZYME ET PROCEDE DE PRODUCTION
D'UNE TELLE ENZYME
Abstract
_________________________________________________________________
L'INVENTION A POUR OBJET UNE CARBOHYDRASE SOUS FORME UTILISABLE
APPELEE SPS-ASE. LA SPS-ASE EST CAPABLE DE DECOMPOSER LE SPS EN
PRODUITS DE DECOMPOSITION QUI SE FIXENT EUX-MEMES A UNE protein, EN
MILIEU AQUEUX, A UN DEGRE MOINDRE QUE NE LE FERAIT LE SPS AVANT
DECOMPOSITION. LE PROCEDE DE SELECTION DE MICRO-ORGANISMES PRODUISANT
UNE SPS-ASE EST BASE SUR LE FAIT QUE LA SOURCE DE carbon PRINCIPALE DU
MILIEU DE CULTURE EST LE SPS ET SUR UN TEST QUALITATIF SUR LE PLAN
D'AGAR.
APPLICATION DE LA SPS-ASE DANS LA FABRICATION ET L'INDUSTRIE TRAITANT
DES FRUITS ET LEGUMES.
Description
_________________________________________________________________
Enzyme destinee a la decomposition d'un carbohydrate a poids
moleculaire eleve, carbohydrate ainsi Cbaud procede de selection d'un
microorganisme produisant ladite
nyme et procede de production d'une telle enzyme.
La presente invention concerne une enzyme destinee a la decomposition
d'un carbohydrate a poids moleculaire eleve, l'carbohydrate a poids
moleculaire eleve isole ainsi obtenu, un procede de selection d'un
microorganisme produisant cette enzyme ainsi qu'un procede
de production d'une telle enzyme.
Un procede de preparation d'une protein vegetale purifiee (pvp) par
elimination enzymatique-de la remanence, sans dissolution et
reprecipitation de la protein, est decrit dans le brevet BE 882 769 La
purete de la pvp pouvant etre obtenue par ce procede connu n'est pas
satisfaisante et demande donc a etre amelioree Dans les exemples, on a
mis en evidence une purete de la pvp d'environ 85 % Meme s'il est
possible d'obtenir une pvp presentant une purete d'environ 90 %
suivant le procede
connu, ceci n'est possible qu'en utilisant certaines sub-
stances de depart pretraitees, par exemple un concentre de proteins de
soja Il serait souhaitable d'obtenir une purete de pvp superieure ou
proche de 90 % avec une gamrne de substances de depart beaucoup plus
large, particuliere;-ent de
la farine de soja decortiquee et degraissee.
La presente invention repose sur la decouverte
surprenante qu'une certaine partie du produit de la decom-
position de la remanence,tel qu'il apparait pendant le traitement
enzymatique precite, a savoir un carbohydrate a poids moleculaire
eleve soluble dans l'water, se fixe lui-reme sur une partie de la
protein vegetale ccmme il sera explique plus en detail ci-apres Il en
resulte, bien entendu, une purete moins bonne de la protein Il est
egalement apparu que l'carbohydrate a poids moleculaire eleve est
capable de se fixer a des proteins
-22518570
d'origine animale.
L'invention vise donc tout particulierement a fournir une enzyme pour
la decomposition des carbohydrates a poids moleculaire eleve precites
et qui ouvrent la possibilite de produire une pvp de purete amelioree,
ainsi qu'un procede pour la production d'une telle enzyme.
Le principe de l'invention peut etre decrit de la maniere suivante en
reference a la figure 1 qui n'indique que les substances existant en
tant que solides non dissous alors que tous les surnageants sont omis
Une charge de farine de soja a ete divisee en deux parties
egales,partie I et partie Il (colonne a dans la figure 1).
La partie I a ete decomposee par voie proteolytique a un
p H d'environ 8 au moyen d'ALCALASE (nom cm-mercial pour une-
enzyme proteolyticue produite au noven de B lichenformis et vendue Dar
NOVO INDUSTRI A/S, 2880 Bagsvoe rd, Danemark) et a ete ensuite lavee a
p H d'environ 8 afin d'eliminer la quantite totale de protein et la
remanence a ete separee
du surnageant et a ete lavee (voir partie I, colonne a et b.
figure 1) De cette maniere, on a isole une remanence pure (designee
par remanence I) (colonne b a la figure) La partie II de la farine de
soja n'a pas ete traitee; pour plus de concision, la remanence de la
partie II a ete denommee remanence II (colonne b a la figure 1)
Ensuite, la remanence I et la partie II sont decomposees au moyen
d'une pectinase commerciale, par exemple PECTINEX (nom c OM Ier-
cial Dour une enzyme pectolytique produite par Schweizerische Ferment
A/G Bale, Suisse) (voir colonnes b et c a la figure 1) On a decouvert
de maniere inattendue que la partie non dissoute de la remanence I est
beaucoup plus faible que la partie non dissoute de la remanence II,
sur base des bilans d'nitrogen et de la masse de matieres seches (voir
figure 1 dans
laquelle les surfaces hachurees de la colonne c correspon-
dent aux substances insolubles differentes des proteins dans l'etape
indiquee ci-dessus) En outre, si le
18570
surnageant de la remanence I traitee a la pectinase est est ajoute a
la suspension de protein de soja a p H 4,5, un
polysaccharide du surnageant est lie a la protein de soja.
Ce polysaccharide du surnageant de la remanence 1, qui est une partie
du produit de decomposition de la, remanence et qui est nettement
soluble dans l'water en l'absence de protein de soja mais qui est lie
a la protein de soja au point isoelectrique de la protein de soja ou
autour de ce point,
sila protein de soja est presente, est designe par SPS (nolvsaccha-
ride soluble; voir figure 1 Le SPS presente une dis-
tribution de poids moleculaire comprise entre 5 x 10 et 4,9 x 104 La
preparation de SPS isole apparait dans le diagramme synoptique
represente a la figure 2 qui recouvre egalement certains des procedes
indiques a la figure 1 Le probleme consiste donc a trouver une enzyme
qui est capable de decomposer la SPS de telle maniere que les produits
de decomposition de SPS ne lient pas la protein de soja ou lient
celle-ci dans une mesure beaucoup moindre que le SPS
ne hela protein de soja.
Bien que la description concerne principalement
la decomposition d'une protein de soja, l'invention n'est pas limitee
a une telle protein mais concerne toutes les especes de proteins
vegetales, notamment par exemple les proteins citees dans le brevet BE
992 769, page 1.
Suivant la presente invention, on a a piesent.
trouve qu'en examinant l'aptitude a decomposer du SPS de soja, il est
possible de selectionner des microorganismes
qui sont aptes a produire un compose qui presente une acti-
vite enzymatique,en decoiposant effectivement le SPS de soja, compose
designe ci-dessous, pour plus de concision, SPS-ase.
Par consequent, sous un premier aspect, l'inven-
tion concerne une SPA-ase, une carbohydrase sous une forme utilisable
et capable de decomposer le SPS de soja dans des
18570
condit-ions appropriees pour donner des produits de decompo-
sition qui se fixent eux-memes sur une protein en milieu aqueux, a un
degre moindre que celui auquel le SPS de soja
se.serait fixe lui-meme, avant-decomposition, sur la meme.
protein dans des conditions correspondantes.
En outre, on a trouve que cette SPS-ase permettant de degrader le SPS
de soja est capable de degrader des
polysaccharides similaires au SPS et provenant de legumes.
et de fruits, de maniere plus complete que ne le font les
pectinases commerciales et les cellulases commerciales.
L'expression "forme utilisable" indiquee ci-dessus, vise a exclure de
l'invention par exemple une preparation contenant une SPS-ase qui
contient des substances toxiques ou qui presente une activite de
SPS-ase si basse qu'elle necessite l'utilisation de plus de 10 % d'une
preparation contenant la SPS-ase, par rapport au poids du SPS dans le
substrat dans une reaction effectuee pendant 24 heures, a
500 C et au p H optimal de la SPS-ase en question, pour obte-
nir la decomposition du SPS presentant une importance pratique.
La purete de la protein vegetale finale est neces-
sairement amelioree par une elimination totale ou partielle du SPS de
la protein vegetale finale par rapport a la purete de la protein
vegetale finale obtenue suivant le procede du brevet BE' 882 769 du
fait que' cette
protein
vegetale connue etait contaminee avec du SPS.
On ne sait pas a present, si la SPS-ase particuliere decrite ci-apres
developpe son activite enzymatique a partir
d'une seule enzyme ou a partir d'un complexe d'enzymes com-
prenant au moins deux enzymes Certaines recherches semblent indiquer
qu'au moins deux enzymes sont responsables de l'effet de decomposition
de la SPS-ase,-une de ces enzymes etant capable de n'effectuer qu'une
legere decomposition du SPS, apres quoi une ou plusieurs-enzymes sont
capables d'effectuer une decomposition plus importante du-SPS Une
telle-hypothese ou des hypotheses semblables
18570
ne doivent cependant pas limiter la portee de l'invention.
Suivant une forme d'execution particulierement preferee de
l'invention, la SPS-ase est caracterisee en ce qu'elle est capable de
decomposer du SPS de soja, en milieu aqueux, pour donner des produits
de decomposition
qui se fixent eux-memes sur une protein vegetale, en mi-
lieu aqueux, a un degre moindre que celui auquel le SPS de soja se
serait fixe lui-meme, avant decomposition, sur
la meme protein vegetale, en milieu aqueux.
Suivant une forme d'execution preferee de la pre-
sente invention, la SPS-ase est caracterisee en ce qu'elle permet de
decomposer du SPS de soja en milieu aqueux a un p H ne s'ecartant pas
de plus de 1,5 unites de la valeur 4,5, pour donner des produits de
decomposition qui se fixent eux-memes sur une protein de soja, en
milieu aqueux, a un degre moindre que celui auquel le SPS de soja
se serait fixe lui-meme, avant decomposition, sur la pro-
teine de soja, en milieu aqueux.
Suivant une forme particulierement preferee de la presente invention
la SPS-ase est caracterisee en ce que
les produits de decomposition du SPS de soja, apres degra-
dation complete, se fixent eux-memes sur la protein vege-
tale a un degre representant une valeur inferieure a 50 %,
en particulier inferieure a 20 %, que celui auquel le SPS-
de soja se serait fixe lui-meme, avant decomposition, sur
la protein vegetale, en milieu aqueux.
Suivant une forme particulierement preferee de la presente invention
la SPS-ase est caracterisee en ce
qu'elle reagit positivement au test de la SPS-ase, lors-
qu'il est execute suivant le procede de determination qualitative et
quantitative de la SPS-ase decrite dans
cette description.
Suivant une forme d'execution particulierement pre-
fere de la presente invention, la SPS-ase est produite au moyen d'un
microorganisme appartenant au genre d'Aspergillus,
de preference appartenant au groupe Aspergillus niger.
Suivant une autre forme d'execution particuliere-
ment prefere de la presente invention, la SPS-ase est derivee des
enzymes pouvant etre obtenue au moyen de
Asp aculeatus CBS 101 -43 La meime SPS-ase peut etre obte-
nue par A Sp japonicus IFO 4408 On a trouve que Asp.
aculeatus CBS 101 43 produit egalement des remanases, des cellulases,
des pectinases et des hemicellulases tres effi-
caces En outre, on a trouve que toutes les souches appar-
tenant aux souches Asp aculeatus ou As japonicus ne con-
viennent pas pour produire une SPS-ase necessaire dans le cadre de
l'invention Ainsi, comme il apparait dans un
paragraphe ulterieur de la presente description (partie 5),
on a prouve que Asp japonicus ATCC 20236 ne produit pas suffisamment
de SPS-ase pour que celle-ci puisse etre detectee par la determination
enzymatique de la SPS-ase
decrite dans le present memoire descriptif.
Suivant une autre forme d'execution particuliere-
ment preferee de l'invention, la SPS-ase est identique au
point de vue de l'immunoelectrophorese a la SPS-ase produi-
te au moyen de Asp aculeatus CBS 101 43 et peut etre iden-
tifiee au moyen de la technique de recouvrement electropho-
retique (cfr parties 6 et 7).
Lorsque la SPS-ase est produite par voie microbio-
logique, elle est obtenue en melange avec differentes
substances accompagnantes, particulierement d'autres enzymes.
Si on le desire, la SPS-ase en question peut etre purifiee,
par exemple au moyen des procedes de separation chromatogra-
phic, comme on le verra plus tard dans ce memoire (partie 8). Dans Agr
Biol Chem 40 ( 1), 87-92, 1976, on decrit qu'une souche de Asp
japonicus, ATCC 20236 produit un
complexe d'enzymes qui-est capable d'effectuer une decom-
position partielle d'un polysaccharide aciddans une sauce de soja,
nommee APS, dont une fraction est designee par APS-1 Ce polysaccharide
acide n'est pas identiquacid au SPS,
ce qui sera montre plus loin et plus en detail dans ce memoire des-
criptif a la partie 3 Ainsi les chromatooramnes de chromatographie li-
quide de haute performance (HPLC)de filtration sur gel du SPS et de
-A - "- 2518570
l'APS sont nettement differents, et,en outre, les chromratooramnes de
filtration sur gel de l'APS decomposee par la pectinase commerciale
Pectolyaseet d'un SPS traite avec la pectinase commerciale Pectolyase
sont nettement differents En outre, il n'apparait pas dans cet article
que le polysaccharide
acidest lie a la protein de soja et que le polysacchari-
de aciddecompose n'est pas lie a la protein de soja ou y
est lie a un degre nettement inferieur a celui d'un poly-
saccharide acidnon decompose On a egalement prouve que
cette souche ne forme pas de SPS-ase en une quantite suffi-
sante pour une detection au moyen d'une determination enzy-
matique de la SPS-ase decrite dans cette description Ceci creait
un prejuge a l'egard de toute souche de Asp Japonicus en
tant que producteur de SPS-ase;^cependant, suivant -
l'invention, on a trouve de maniere inattendue quecertaines
souches de Asp japonicus-sont des producteurs de SPS-ase.
Suivant un deuxieme aspect, la presente invention concerne le SPS
isole, produit a partir d'une
protein
vegetale brute servant de substance de depart.
Un mode d'execution prefere du SPS isole suivant la presente invention
est caracterise en ce que
la protein
vegetale brute consiste en une farine de soja degraissee.
La preparation de ce SPS isole est decrite dans ce-qui precede,
en reference a la figure 2.
Suivant un troisieme aspect, la presente inven-
tion concerne un procede de selection d'un microorga-
nisme produisant une SPS-ase permettant de produire la SPS-
ase suivant l'invention, dans lequel le microoraanisme a tester est
cultive S u r u N milieu de fermentation dont la source principale de
carbon est le SPS, apres quoi un echantillon du milieu de fermentation
est analyse Dour la determination de la SPS-ase et le microorganisme
en question est choisi en tant que microorganisme produisant une
SPS-ase si l'analyse de determination de la SPS-ase est
positive.
CBS 101 43 produit egalement des enzymes solubilisant la
remanence,des cellulases, des pectinases et des hemicellu-
lases tres efficaces en plus de la SPS-ase et que le com-
plexe d'enzymes produit au moyen de la souche Asp aculeatus CBS 101 43
convient extremement bien en tant qu'agent des-
tine a la desintegration de parois cellulaires des substan-
ces vegetales Ainsi, le complexe d'enzymes produit par Asp aculeatus
101 43 peut etre utilise dans l'industrie
alimentaire avec d'excellents resultats, pour le traite-
ment de purees de fruits et de legumes et-pour clarifier et reduire la
viscosite lors de la production de jus et de
vins; on peut egalement l'utiliser comme agent de deshydra-
tation (a savoir un agent de decomposition de polysaccha-
rides et par consequent de liberation de l'water liee a l'interieur de
la structure polymere des polysaccharides)
dans le traitement de vegetaux.
Un cinquieme aspect de la presente invention concer-
ne l'utilisation d'une SPS-ase ou un procede de decomposi-
tion de polysaccharides, de preference des polysaccharides
de parois cellulaires de plantes, au moyen d'une carbohy-
drase, procede dans lequel on met une preparation de SPS-
ase suivant la presente invention en contact avec un sub-
strat pour ladite preparation de SPS-ase, en un milieu aqueux,
exception faite des decompositions deja decrites
dans la demande de brevet danois n 5691/81.
Ainsi, on a trouve, suivant la presente invention, que les
preparations de SPS-ase sont des preparations
d'enzymes efficaces pour la liquefaction ou la decomposi-
tion partielle ou totale de differentes substances, de preference des
substances vegetales, par exemple des fruits et des dechets de
plantes, contenant des proteins, de la cellulose, de
l'hemicellulose,(par exemple des glucannes, du xylane, des galactanes
et de l'arabanne), des gommes, de la pectine, des lipides, de
l'inulin, des polyphenols, de l'starch et des alginates; elles peuvent
egalement etre utilisees pour des applications qui y sont apparentees,
Suivant un quatrieme aspect, la presente inven-
tion concerne un procede de production de SPS-ase, suivant lequel une
souche choisie suivant le procede ci-dessus de selection d'un
microorganisme produisant une SPS-ase est cultivee dans un milieu
nutritif La culture peut etre effectuee e N fermentation noyee (basse)
ou en
fermentation en surface (haute&#x003E;.
Un mode d'execution prefere du procede suivant
l'invention est caracterise en ce que la souche s.
aculeatus CBS 101 43 ou Asp japonicus IFO 4408 est cultive
dans un milieu nutritif.
Suivant un mode d'execution prefere de l'inven-
tion, le procede est caracterise en ce que la culture.
est effectuee e N culture noyee a un p H compris dans l'intervalle de
3 a 7, de preference de 4 a 6, a une temperature comprise dans
l'intervalle de 20 a 40 OC, de preference de 25 a 35 OC et en ce que
le milieu nutritif contient des sources de carbon et d'nitrogen et des
salts inorganiques.
Suivant un autre mode d'execution particuliere-
ment prefere de l'invention, le procede est caracterise en ce que le
milieu nutritif contient de la farine desoja,
de preference grillee.
Suivant un autre mode d'execution particuliere-
ment prefere de la presente invention, le procede est caracterise en
ce que la farine de soja est traitee par une enzyme proteolytique
avant d'etre utilisee comme composant du substrat, l'enzyme
proteolytique etant, de preference, produite par voie microbiologique
au moyen du
B licheniformis.
Suivant un autre mode d'execution prefere de l'invention, le procede
est caracterise en ce qu'on ajoute une solution de pectine de maniere
aseptique au bouillon
de fermentation pendant la culture.
On a trouve que la souche Asp aculeatus
voir le tableau ci-dessous dans la description A titre
d'exemple pour de telles applications onpeut citer toutes
les applications pour lesquelles les pectinases et cellu-
lases commerciales sont utilisees-de nos jours Differents
exemples seront donnes plus loin dans cette description.
En ce qui concerne le procede d'extraction (d'isolation) decrit dans
l'exemple 2, par exemple, il faut noter que la preparation de SPS-ase
est essentiellement exempte de proteinase, etant donne que le produit
final desire, a savoir la protein, serait decompose dans le cas
contraire De meme, si l'on desire extraire (isoler),
d'une substance biologique brute, des substances biologi-
ques differentes de la protein, la preparation de SPS-ase utilisee
sera essentiellement exempte de toute-enzyme degradant cette autre
substance biologique Une telle preparation de SPS-ase modifiee peut
etre produite par
inactivation selective-de l'enzyme indesiree, par fraction-
nement ou par-un autre procede connu en soi.
Ainsi, un mode d'execution prefere de la presente invention est
caracterise en ce que la composition est accompagnee par l'isolation
ou l'extraction d'une substance
biologique differente d'une protein de soja et de proteins vege-
tales apparentees d'une substance biologique brui 2 e, la preparation
de SPS-ase etant essentiellement exempte de
toute enzyme capable de decomposer ladite substance biolo-
gique. Suivant la presente invention, on a donc trouve que les
preparations modifiees de SPS-ase (modifiees dans le sens qu'elles
sont essentiellement exemptes d'enzymes capables de decomposer la
substance biologique a extraire ou a isoler) sont des preparations
d'enzymes efficaces pour
l'extraction (isolation) de-substances biologiques speci-
fic, par exemple l'starch, les lipides, les aromes, les
pigments et les essences de substances biologiques brutes.
Plusieurs exemples seront donnes plus tard dans cette des-
cription. Suivant un m Dde particulierement prefere de la presente
invention, l'utilisation suivant l'invention est caracterisee en ce
que l'un ou plusieurs des produits de reaction (sans distinguer s'ils
sont des produits finals recherches ou des dechets) sont traites ulte-
rieurement en meme temps que le traitement par enzyme ou apres
celui-ci.
Ceci fournit une utilisation plus flexible et pouvant etre
mieuxadaptee.
Suivant un autre mode d'execution particulierement prefere de la
presente invention, l'utilisation est caracterisee en ce que le
traitement ulterieur consiste en une fermentation alcoholic dans le
cas o le produit de reaction est un sugar fermentable Ainsi on
fournit un procede simple et bon marche pour la production d'alcohol.
Afin de mieux expliciter la nature de la presente invention,
on se referera a la description qui suit et qui est divisee en diffe-
rentes parties numerotees de 1 a 10 decrivant chacune les details spe-
cifiques relatifs a la presente invention Les differentes parties sont
comne suit:
1 Preparation du SPS.
2 Caracterisation du SPS, en particulier la distribution
du poids moleculaire de celui-ci.
3 Essais prouvant la difference entre SPS et APS.
4 Selection de microorganismes produisant de la SPS-ase.
Caracterisation de certains microorganismes formant de
la SPS-ase.
6 Description generale de la technique de recouvrement
associee a des imnunoelectrophoreses.
7 Caracterisation imnnunoelectrophoretique de la SPS-ase
avec un anticorps polyspecifique et recouvrement.
8 Purification d'une preparation de SPS-ase.
9 Dependance de l'activite a l'egard du p H et de la tem-
perature et stabilite d'une SPS-ase.
Determination de l'activite enzymatique.
-.251857-0
PARTIE 1.
PREPARATION DU SPS.
Comme deja mentionne precedemment, la substance de depart pour-la
preparation du SPS peut etre la remanence de soja C'est pourquoi, on
decrira d'abord la preparation
d'une remanence de soja.
La remanence de soja est une fraction d'carbohydrate exempte de
proteins (qui, en pratique, peut
contenir de faibles quantites de lignine et matieres mine-
rales), contenue dans la farine de soja degraissee et decortiquee,
ladite fraction d'carbohydrate etant insoluble dans un milieu aqueux a
p H 4,5 et pouvant etre preparee de la maniere suivante, en reference
a:u tableau
synoptique n 1.
La farine de soja degraissee (Sojamel 13 de Aarhus Oliefabrik A/S) est
mise en suspension dans de l'water desionisee a 50 C dans un
proportion ponderale de farine de
soja a l'water de 1:5, dans un reservoir contenant un equi-
pement de stabilisation de p H et de temperature On regle le p H a 8,0
au moyen de Na OH 4 N ( 1 I) On effectue une hydrolyse a p H
stationnaire aiu moyen d'ALCALASE 0,6 L (une enzyme proteolytique a
base de B licheniformis ayant une activite de 0,6 unites Anson par
gramme, l'activite'etant determinee suivant la methode Anson, comme
decrit dans NOVO ENZYME INFOR-t ATION IB No 058 e-GB) Le rapport
enzyme/ substrat correspond a 4 % de la proteins dans la farine de
soja (II) Apres une hydrolyse pendant une heure, la boue est separee
par centrifugation (III) et on lave (IV), cette operation etant
effectuee- deux fois (V, VI, VII) La boue ainsi traitee est-ensuite
hydrolysee une fois de plus pendant une heure au moyen d'ALCALASE 0,6
L (VIII,
IX), de maniere similaire a ce qui a ete dit-ci-dessus.
Ensuite la boue separee par centrifugation (X) est lavee deux fois
(XI, XII, XIII, XIV}, la boue finalement lavee ( 6) etant sechee par
pulverisation (XV) La poudre ainsi produite, sechee par pulverisation
est la remanence de soja
servant de materiau brut pour la production de SPS.
Le SPS est la fraction soluble a l'water de poly-
saccharide qui est obtenue par un traitement classique de
la remanence de soja susmentionnee avec de la pectinase.
Le SPS est prepare de la maniere suivante au moyen des 14 etapes
reactionnelles indiquees ci-dessous, en reference au
tableau synoptiquen 2.
1 On determine la teneur en matiere seche de la remanence
susmentionnee et on dilue la remanence de soja dans de l'water a
raison de 2 % de matiere seche et ladite remanence de soja est
maintenue en suspension a 50 C
dans un reservoir comportant un reglage de temperature.
2 On regle-lavaleur du n HE 4,50 au moyen de Na O Hi 6 N. 3 On ajoute
en une quantite de 200 g/kg de matiere seche du Pectinex Super
concentreL(pectinase commerciale de la Schweizerische Ferment AG,
Bale, Suisse presentant une activite en pectinase de 750 000 MOU,
determinee suivant le feuillet "Determination of the Pectinase units
of Apple Juice (MOU)" du 12 6 1981, disponible a la Schweizerische
Ferment AG, Bale, Suisse) et on ajoute egaaement en quantite de 20
g/kg de matiere seche du Celluclast 200 L (cellulase commerciale
decrite dans le feuillet NOVO enzymes, information sheet B-153 e-GB
1000 juillet 1981, disponible chez NOVO INDUSTRIE A/S,Novo Alle, 2880
Bacsvaerd, Danemark) 4 Le contenu du reservoir est maintenu a 50 C
pendant 24
*heures en agitant.
3 Les enzymes sont inactivees en augmentant le p H a 9,0
au moyen de N;a OH 4 N Le melange reactionnel est main-
tenu tel quel pendant 30 minutes et le p H est ensuite reajuste a 4,5
au moyen de HC 1 6 N. 6 Le melange reactionnel est centrifuge et on
recupere le
produit de centrifugation ainsi que la boue.
7 Le produit de centrifugation de l'etape 6 subit une filtration de
controle sur un filtre presse (le filtre
est lave a l'water avant la filtration de controle).
8 Le filtrat de controle est soumis a une ultrafiltratior
a une diafiltration et ensuite encore a une ultrafiltra-
tion sur une membrane presentant une valeur de coupure de 30 000 (DDS
GR 60-P de De Danske Sukkerfabrikker), en ayant recours aux parametres
suivants: 1 Ultrafiltration correspondant a une concentration de
volume de 6.
2 Diafiltration jusqu'a ce que le pourcentage en matiere seche dans le
permeat soit egal a(I O Brix), 3 Ultrafiltration jusqu'a-environ 15 %
de matiere seche
dans le concentrat.
La temperature est de 50 C, le p H est de 4,5 et la
pression moyenne de 3 bars.
9 Le concentrat soumis a l'ultrafiltration est refroidi
jusqu'a 5 C et on ajoute un volume egal d'ethanol a 96 %.
10 On recupere le precipite au moyen d'une centrifugeuse.
11.Le precipite est lave deux fois par de l'ethanol dans l'water a 50
% v/v, correspondant au volume du produit de centrifugation de l'etape
10, c'est-a-dire qu'on effectue
deux centrifugations. 12 Le precipite lave est remis en solution dans
l'water en un volume qui
correspond au volume de concentrat de l'etape
9 soumis a ultrafiltration.
13.Le liquide de l'etape 12 est soumis a une filtration de
controle sur un filtre de verre.
14 Le filtrat clair contenant du SPS pur est lyophylise.
251 '8570
TABLEAU SY-, 'OPTIQUE Z 1
li O Na OH jusqu'a p H 8 Farine de soja serais 2 e d"i%,drolyse
Alcalase O 6 L (E/S= 4 %) yse 1 heure avant dec 11-iargeme p'1-stat 8
T = 50 ' CI Na OH 4 LI 1)roduit de lere centrifugation III 4
"centrifug 1 boue 1 1 vers decharge H ler 1-avace produit -de 2 c
centrifugation V cen tri fug 2 boue 2 ' vers decharge H 2 O 2 c lavage
T'roduit de trifugation VU r 7 c cen E C_ entrifug 3 boue 3, fers
decharge
C II 1
Z;ouveau melange d'hydrolys lJI Na Cii issu, a r, i i = 5 Ilydrolvse 1
avant decharqement pli 50,C) I:aoli, n-duit de 4 c centrifu:aticn X
C(, ntrifug 4 ALCALASE 0,6 L boue 4 vers decharge H 20 ier lavage 1)1
iduit de e centrifugation I I C -r-ntrifug 5
1 E_ -1-1 -
247 1 H Decomposition par pectinase et 1, 2, 3, 4,5 cellulose li 1 = 1
5: 24 hetirp, y-
1 Centrifugation -1-
I i:'1 traticn-de ccn'rElei y j Precipita-lion r _ y - I
2518570 _
r AB-L EiU SYNOPTYQUE No 2 1000 g Pectinex Super Conc L cr Celluclast
250 S kg remanence sechee par pulverisation Bnuf, 3 a kg'
Ultrafiltration, diafiltration, ultrafiltration
(GR60 P) ( 19 A26OC) -
T surnageant ic; 2 5 I('z a goe" (decharge) produit de centrifugation
1 _,_ 10
ite 2 x produit de Centrifugatior 2 x lavage
1 centrifugation-
1 1 precipite 1 3 Redissolution y
1 Bc JUP de r)rotei Drc -
-:111 de conti Er (decharge)
1 -
y 1 Lyophilisat 310 g de SPS lyophilise
18 1 H 20 __
24-1 de per-
meat 1 O recir y
2 1 H 20
PARTIE 2
CARACTERISATION DUSPS, EN PARTICULIER DISTRIBUTION DU
POIDS MOLECULAIRE DE CELUI-CI.
On a determine (fig 4), la distribution du poids moleculaire du SPS
dont la productioh est effectuee comme indique dans ce memoire, au
moyen d'une chromatographie sur gel dans un equipement f IPLC (pompe
Waters, modele 6000, module de donnees 730 de Waters et refractometre
R 401 de Waters) On a egalement determine (fig 5) la distribution du
poids moleculaire des produits de decomposition du SPS par la SPS-ase
suivant le mime brocede En outre, on a montre par la m eme
methode,l'effet de liaison entre la prot Aine de soja et le SPS (fig
6) et l'absence d'effet de liaison entre la protein de soja et le SPS
decompose par l'agent suivant
l'invention (fig 7).
La courbe de calibrage (le logarithme du poids moleculaire en fonc-
tion de Rf o la valeur Rf pour le glucose est arbitrairement lefinie
corme etant 1 et o la valeur Rf d'un dextrane smecifique est definie
en tant que temps de retention de ce dextrane divise par le temps de
retention du glucose) a ete etablie au moyen de plusieurs dextranes
etalons ayant des poids moleculaires connus (T 4, T 10,T 40, T 70, T
110, T 500) vendus par Pharmacia Fine Chemicals AB, Boite 175,
S-75104, Uppsala, Suede On a trouve la valeur R, pour le maximum de
chaque pic de dextrane et le poids moleculaire correspondant a ete
calcule en tant qu n
ou est la valeur moyenne ponderale du poids molecu-
laire et M est la valeur moyenne numerique du poids mole-
n culaire On a utilise du a Nal O 3 0,1 MI corie eluant pour ce
processus chrcmatographique Les colonnes utilisees dans ce processus
chromatocraphique sont la colonne PW 5000 de cm suivie par une colonne
PW 3000 de 60 cm vendues par Toyo Soda Mtanufacturing Co, Japon On a
etabli la relation entre le poids moleculaire et la valeur R pour les
dextranes indiques ci-dessus de cette maniere, cfr fig 3.
A partir de la fig 4, on peut calculer que le SPS presente une
distribution de poids moleculaire qui est Islis O caracterisee par une
valeur ew d'environ 5,4 x 105 et par w 4 une valeur;i d'environ 4,2 x
10 Il apparait egalement n dans cette figure que le chromatogramme
presente deux pics distincts a un temps de retention de 34,5 minutes (
6 %) correspondant a un poids moleculaire d'environ 5 x 10 et
a un temps de retention de 47,12 minutes ( 67 %) correspon-
dant a un poids moleculaire d'environ 4,9 x 10 Il
apparait egalement de cette courbe qu'il existe un epaule-
ment entre ces deux pics a un temps de retentibn de 41,25 minutes ( 27
%) correspondant a un poids moleculaire de 2,8 x 105 Apres la
decomposition du SPS par la SPS-ase, le melange d'hydrolyse a ete
filtre sur membrane et le filtrat a ete soumis a la chromatographie On
a trouve qu'environ 55 % du SPS est decompose en monosaccharide,
disaccharide ' et trisaccharide et que le residu de 45 % a ete
decompose en un polymere presentant trois pics correspondant au poids
moleculaires suivants: 5 x 104, 10 et 44 x 103, cfr fig 5.
Dans le but de demontrer l'effet de la liaison entre la pro-
teine de soja et le-SPS et la reduction substantielle de l'effet de
liaison entre la protein ce soja et le SPS decompose au moyen de la
SPSase, on a effectue les essais suivants 3 % de SPS dans un tampon
acetate 0,10 M a pli 4,5 est ajoute a une boue d'un isolat de soja
(Purina E 500) afin de generer une suspension presentant le rapport
isolat/ SPS correspondant a 10:1 On fait incuber cette suspension
pendant 18 heures dans un bain agite a 50 o C Apres incubation, la
suspension est centrifugee et le surnageant cla r es L analyse par
IIPLC con me decrit precedem ent En comparant la fig 6 a la fig 4, il
apparait que le SPS est
completement adsorbe sur l'isolat de soja.
Le-m mre processus que celui mentionne dans le paragraphe precedent
est mis en oeuvre avec une solution a 3 % de SPS hydrolyse avec une
SPS-ase produite par CBS 101 43 (fig 7) En comparant la fig 7 et la
fig 5, on constate qu'aucun compose du SPS hydrolyse presentant un
poids moleculaire inferieura-environ 104 n'est adsorbe sur l'iso-
lat de soja L'hydrolyse reduit la liaison quantitative jusqu'a environ
10 a 15 % par rapport a la liaison du SPS a la protein de soja. Une
analyse R 4 K du SPS, dont la production est
effectuee commrse indique dans ce memoire, revele la composi-
tion approximative suivante du SPS: 1) c-galacturonic acid en une
quantite d'environ 45 %, approximativement 40 % de la quantite totale
d'c-galacturonic acid etant presentsen tant qu'ester methylique. 2)
rhamnopyranose en une quantite d'environ 20 %, 3) galacto O yrannose
en une quantite d'environ 15 %, et
t 5 4) -1 xylopyranose en une quantite d'environ 20 %.
Les constituants semblent etre presents suivant une
structure comprenant une chaine principale rhamnogalacturo-
nicue et des chaines laterales de xylose et de galactose.
L'hydrolyse acidco&#x003E;lete du SPS ( 8 heures dans H 2504 IN) et
l'analyse par chromatographie en couche mince (TLC)ulterieure ont
revele qu'il y a egalement de faibles monosaccharides fucose et
arabinose dans le SPS hydrolyse.
Une analyse HPLC du SPS decompose par le complexe d'enzymes SPS-ase
forme par CBS 101 43 montre une importante reduction du poids
moleculaire De maniere semblable, le spectre R M du SPS decompose
con-me indique cidessus montre qu'une majeure partie des groupes
estera disparu et que, egalement, la teneur en xylose et galactose
dans la substance A poids moleculaire plus eleve a diminue Le spectre
P-l de la partie du produit de decomposition du SPS qui precipite par
addition d'un volume d'ethanol a un volume de produit de
decompositiondu SPS est semblable au spectre R-:; du SPS qui a subi
les modifications susmentionnees en ce qui concerne les groupes
esteret la teneur en xylose et galactose
PARTIE 3
ESSAIS PROUVANT LA DIFFERENCE ENTRE SPS ET APS
On a prepare le APS comme mentionne dans-Agr.
Biol Chem, Vol 36, No 4, p 544 550 ( 1972).
On a ensuite hydrolyse ce polysaccharide et le SPS avec ci'fferentes
cenzymes, puis on a soumis le melange de decomoresition a une
chromatographie sur gel par un equipement Hi PLC, comme mentionne dans
la deuxieme
partie, "Caracterisation du SPS, en particulier la dis.
tribution du poids moleculaire de celle-ci".
Plus precisement, on a effectue les hvdrolyses par traitement d'une
solution de 25 ml de 2 % de APS ou de 2 % de SPS dans un tampon
acetate 0, 1 M ayant un p H-de 4,5 par 10 mg de KRF 68 ou 30 mg de
Pectolyase Le IRF 68 est une preparation de SPS-ase dont la
fabrication est decrite a l'exemple 1 Les resultats sont repris dans
le tableau suivant:
PARTIE 4
SELECTION DE MICROORGANISMES PRODUISANT DE LA SPS-ASE.
Le microorganisme a tester est soumis a une incubation sur un substrat
incline d'agar presentant une
cor mosition qui permet la croissance du microorganisme.
Apre's une croissance initiale sur le substrat incline d'agar, le
microorganisme est transfere dans un substrat
principal liquide dans lequel la source de carbon princi-
pale est le SPS (prepare comme indique), dans lequel la
PolysaccharideA¦ Enzym-e J Chrcmatogranme Polysaccharide _ __ IIPLC
sur gel De Cfc Sep JO I I l I I l' 'as e APS ct ' fig 8 x APS KRF 63
fici9 x SPS r ectc fig 10 x l_.ase S PS,-Ut F 68 fig 5 source
d'nitrogen est du NO 3,NH 4 de l'urea, des acides
amines libres, des proteins ou d'autres composes conte-
nant de l'nitrogen et qui contient en outre, un melange de salts
necessaires et de vitamins, de preference sous forme d'un extrait de
levure La composition du substrat prin- cipal depend du genre du
microorganisme, la consideration principale consistant en ce que le
substrat principal est capable de supporter la croissance et le
metabolisme du microorganisme Lorsque la croissance a eu lieu pendant
une duree adequate, de l'ordre de 1 a 7 jours, en fonction de la
vitesse de croissance du microorganisme en question, on analyse un
echantillon du bouillon de culture pour la
determination de la SPS-ase suivant la determination enzy-
matique de la SPS-ase decrite dans cette description ou
suivant toute autre determination de SPS-ase adaptee a des
utilisations specifiques de la SPS-ase differentes de
l'utilisation en tant que composant d'un agent de decompo-
sition de la remanence de soja.
Afin d'avoir une technique plus sensible pour la determination de
l'activite enzymatique, on peut abaisser
la temperature a 40 C et on peut augmenter le temps d'incu-
bation a 20 heures pendant la determination de l'activite de SPS-ase,
des antibiotic pouvant etre ajoutes au
substrat dans le but d'eviter une infection.
Par cette technique, on peut trouver d'autres microorganis-
mes produisant de la SPS-ase appartenant au genre Aspergillus ainsi
qu'a d'autres genres.
PARTIE 5
CARA Cr ERISATION DE CERTAINS MICROORGANISMES [email protected] DE LA SPS-ASE
Par la technique de selection pour des microorga-
nismes produisant de la SPS-ase indiquee dans ce memoire descriptif,
on a trouve que les microorganismes cites dans la partie superieure du
tableau suivant sont des producteurs de SPS-ase Le tableau contient
egalement une souche appartenant a l'espece Asp ja Donicus qui n'est
pas un producteur de SPS-ase Une identification courte des souches
indiquees' ci-dessus peut etre trouvee dans les catalogues de culture
suivants List of Cultures 1978, Centraalbureau voor
Schimmelcultures, Baarn, Pays-Bas.
List of Cultures, 1972, 5 e edition, de l'"Institute for Fermentation"
Osaka, 17-85,Juso -honmachi 2-Chlorite, Yodogawa-ku, Osaka 532, Japon
The American Type Culture Collection Catalogue of Strains I, 14 e
edition 1980, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland 20852, Etats-Unis d'Anmerique.
Toutes les souches du tableau indique ci-dessus
correspondent etroitement a la description taxonomique-de S'
especes Asp japonicus et Asp aculaetus decrites dans "The genus
Aspergillus" de Raper et Fennell, 1965 (voir
particulierement les pages 327 a 330).
PARTIE 6
DESCRIPTP'ION ' GE ERALE DE LA TECHNIQUE DE RECOUVREMENT
ASSOCIEE A r ES I",MUN'OELECTROPHIORESES.
La demanderesse a develo Dpe un procede donomme "tech-
niaue de recouvrement de top-a Tar" nour identifier les caposants
individuels d'un complexe d'enzymes par immunoelectrophorese croisee
au moyen d'un anticorps polyspecifique pourtous les cc osants d'enzyme
du complexe d'enzymes Le -procede est 7 roducteurj e -S ascEspeces
Denomrination Premier 2.e SF S-asoI Epce Js.: I de la Denomination
depot Oui A¦;on j ajo laedemnanderesse officielle annee x x A 805 CBS
101 43; DSI 1 M 2344-1943 x x A 1443 IFO 4408; DSM 23461950 -x x A
1384 ATCC 20236-; DSM 23451969 base sur le fait que les enzymes sont
encore actives apres la liaison specifique entre l'enzyme et
l'anticorps ou, exprime de maniere differente, le procede est base sur
le fait que le site enzymatique actif n'est pas identique au site de
la liaison enzyme- anticorps Les complexes enzyme-anticorps
precipitent en tant qu' arcs distincts dans le gel pendant
l'electrophorese La plaque de gel est recouverte avec du SPS soluble
dans' diu"top-agar' Apres chauffage a 45 C pendant 20 heures dans une
atmosphere ayant une humidite relative de 100 %, l'arc qui possede une
activite de SPS-ase apparait en tant que zone claire dans la
couverture de SPS apres precipitation par un melange de parts &,ales
en voiic d'ethanol et d'acetone, lorsqu'on
regarde du dessus contre up fond noir Les arcs qui ne presen-
tcmt pas d'activite SPS-ase restent invisibles.
PARTIE 7.
CARACTERISATION I' -I Ur NOELECTROPHORETIQUE DE LA SPS-ASE AVEC UN
ANTICORPS POLYSPECIFIQUE ET RECOUWRE 1 E Nt T. On a irmmunise des
lapins par le complexe d'enzymes contenant la SPS-ase Cbtenu par
fermentation de Aspergillus aculeatus CBS 10 11 o 43, comme indique
dans
l'exen Dmple 1 (KRF 68) et on a recupere l'anticorps polyspe-
cifique d'une maniere connue en soi Au moyen de cet
anticorps poiyspecifique on a effectue une immunoelectro-
phorese croisee du complexe d'enzymes obtenu par fermentation de
l'Aspergjillus aculeatus CBS 101 43, comme indique a l'exemple I (KRF
68), i'immunoelectrophorese croisee ayant ete decrite par N l Axelser
et autres, dans "A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis", Eune
edition/ 1977 On se refere a la fig 11 qui montre les arcs
correspondant aux differentes proteins produites par le microorcanisme
On a trouve, au moyen de la"technique de recouvrnement de "top-agar"
decrite precede mment, que la surface
hachuree correspond a la SPS-ase.
Si l'hypothese susmentionnee supposant que la SPS-ase consiste en au
moins deux enzymes est correcte, la surface hachuree est la surface
dans laquelle se trouvent toutes les enzymes responsables de
l'activite de SPSase Si, suivant d'autres modes d'execution de la
presente invention, on peut separer des enzymes par
irmunoelectrophorese de telle maniere qu'elles ne couvrent aucune
surface mutuelle, on peut-encore identifier une
partie de l'activite de SPS-ase aul moyen d'immunoelectro-
phorese avec un recouvrement avec a la fois le SPS et une
pectinase commerciale.
PARTIE 8.
PURIFICATION D'UNE PREPARATION DE SPS-ASE.
On a effectue la purification de la preparation
de SPS-ase KRF 92 (voir exemple 1) par echange d'ions.
Le tampon est le Tris (tris-hvdroxvnethvlamino-methane ( 50 m 1) qui
est regle a p H 7 au moyen de HC 1 La colonne est une colonne K 5/30
vendue par Pharmacia, Suede La substance d'echange d'ions est du
DEAE-trisacryl vendu par LKB, Bromma, Suede ( 300 ml) La vitesse de
passage est de
ml/heure.
On a dissous 15 g de la preparation de SPS-ase KRF 92 dans 450 ml de I
120 at 6 C et toutes les operations
indiquees ci-dessous ont ete effectuees entre 6 et 10 C.
On a regle le p H a 7,0 au moyen de Tris 1 La colonne a ete equilibree
au moyen du tampon et on a ensuite introduit l'"chantillon de SPS-ase
dans la colonne On a mesure OD 280 (densite optique a 280 nm) et la
conductivite de l'eluat; voir a la fig 12 La fraction 1 correspond a
l'eluat qui n'est pas lie a la substance d'echange d'ions Ensuite la
colonne a ete lavee avec 2000 ml de tampon, ce cui donne la fraction 2
On a ensuite etabli un gradient de Na Cl 0-500 iri ce crui donne les
fractions 3 9 Les neuf fractions ont ete concentrees a 200 ml et ont
ete dyalisees contre l'water a une conductivite de 2 m Si par dialyse
(Hollow Fiber DP 2 de Amicon, Massachussetts, U S A) Ensuite les neuf
fractions ont ete lyophilisees Uniquement les
fractions 1 et 2 presentaient une activite de SPS-ase.
La fraction 1 a ete purifiee ulterieurement par une filtration sur gel
On a dissous 1,5 g de la fraction 1 dans 10 ml d'sodium acetate 50 m M
ayant un EDH de 4,5 (KCl 500 m M) La colonne est une colonne de 2,5 x
100 cm de LKB La substance servant a la filtration sur gel est le
Sephacryl S200 de Pharmacia, Suede La vitesse de passage est de 30
ml/heure Les fractions contenant des substances ayant un poids
moleculaire compris entre 70 000 et 100 000, calibrees avec des
proteins globulaires, contenaient un complexe d'enzymes-designe par
facteur G qui ne peut decomposer le SPS lorsque l'on pratique l'essai
suivant le test qualitatif d'agar; cependant, le SPS est decompose
suivant le test qualitatif d'agar lorsque l'on relange le facteur G
avec une pectinase Ona trouve que le facteur G est capable de separer
le galactose, le fucose et certains galacturonic acids du SPS; mais le
produit de decomposition principal suivantl'analyse HPLC est encore un
oroduit a poids moleculaire eleve ressemblant
tres fort au SPS.
PARTIE 9.
DLEPENDAI CE DE L'ACTIVTIE A L'EGARD DU pl I ET DE LA TEMPERA-
T'Rs E Tr S/LBILITE D'Ui L SPS-ASE La fig 13 montre l'uctivite en
fonction du p H de la preparation de SPS-ase XRF 68 De pli 2,7 a 3,5
on a utilise un systeme de tampon a l'formic acid et de p H
3,7 A 5,5 on a utilise un systeme de tampon a l'acetate.
La fig 14 montre l'activite en fonction de la
texoerature de la preparation de SPS-ase KRF 68.
La fig 15 montre la stabilite thermique de la
preparation de SPS-ase KRF 68.
PARTIE 10
DETERMINATION DE L'ACTIVITE ENZYMATIQUE.
Le tableau repris ci-dessous donne un apcrcu des differentes
determinations de l'activite enzymatique relevant de la presente
invention Definition de l'unite d'activite
et description de la determination de
l'activite enzymatique Genre d'activite,ixiblique Decrit plus
designationment loin dans ce Erzye abregee disponible memoire
Reference SPS-ase SPS-ase X Solubi 1 RU x lisantla VR J_ _ _ _ _ _ _ _
_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ r a r- aenc e,_'_' SRU ':120 x Protease HUT x
Ce lulase C x 2 PU x 3
?GE x 4.
Pectirase UPTE x 5 pt.'X 6 U 7.-icellu VHCU x 7 lase Il Les references
indiquees dans la derniere colonne du tableau susmentionne sont
detaillees dans' le tableau suivant Ref l Identification de la N,
Irefeerence -Les -r Ceferences peuven t etre obtienues
de NOVO IN-
DUSTRI A/S
N.OVO Alle,
2880 Bags-
voe rd, Danemark
de Schwei-
zerische Fornment AG Bale, Suisse
Analytical Biochemis-
try, 84, 522 A 532 'C tnai ytical mnethod 149/6-o GB du 25-05-1981 x
TDetermination of Pec-
tinase Activity with 3 J Citr-us Pectin (PU)X 1 du 23-03-1976
\Viskosiretrische Po-
4 lygalacturonase-Be-
stirrr (PG-E 7)du X
Bestiz 7-ung der Pectin-
transelimir ase (UPTE/ x lg) du 24-09-19715 Determ-ination of the
6 Pectinesterase acti-
6 vity(non date)portant ' les initiales 'ij A/c-, lnalvt ical method i
F 156/1-G 13 c
En ce qui concerne la determination de l'activi-
te-de cellulase, il est a noter que l'analyse a 'ete effec-
tuee co:rune indique dans AF 149/6-GB et que les principes
de deteritination sont expliques dans Analytical Biochemis-
try. Io 5 dans une
bibi io-
theque p ARTIE l a DE-TIMINATION ENZYMATIQUE DE SPS-ASE La
determination enzymatique de SPS-ase est effectuee en deux etapes,
c'est-a-dire un essai qualitatif sur plaque d'agar et une
determination quantitative de D l'activite SPS-ase, basee sur la
mesure de la quantite totale de sugars liberee Si l'essai qualitatif
sur plaque d'agar est negatif, l'activite SPS-ase est nulle quelle:
que soit la valeur provenant de la determination quanti-
tative de l'activite en SPS-ase Si l'essai qualitatif sur plaque
d'agar est positif, l'activite en SPS-ase est egale a la valeur
provenant de la determination quantitative de
l'activite en SPS-ase.
I Essai qualitatif sur plaque d'agar.
On a prepare une plaque de SPS-agar de la maniere suivante On a
prepare un tampon (B) en amenant de l'acetic acid 0,3 M a p H 4,5 au
moyen de Na OH 1 N. On dissout 1 g de SPS dans 20 ml de B On melange 1
g d'agarose (HSB Litex) avec 80 ml de B et on chauffe
jusqu'au point d'ebullition en agitant Lorsque l'aga-
rose est dissoutela solution de SPS est lentement ajoutee La solution
qui en resulte a 1 %de SPS-agarose est disposee dans un bain d'water a
60 C Les plaques sont ensuite coulees en versant 15 ml de la solution
a 1 % de SPS-agarose sur une plaque en verre horizontale ayant les
dimensions de 10 cm x 10 cm Ensuite on esta z me 9 "puits" dans la
couche solidifiee de SPS-agarose a une distance de 2,5 cm Dans chaque
puits on introduit 10 ul d'une solution a 1 % de la pro-
teine enzymatique tester en ce qui concerne l'activite en SPS-ase On
fait incuber la plaque pendant 18 heures a C et a une humidite
relative de 100 % Ensuite le SPS
ren encore deccr cse est precipite par une solution a parts -
egales en volumes d'ethanol et d'acetone L'essai de la SPS-ase sur
laplaque d'agar est positif pour un echantillon place dans un puits
specifique si une zone
annulaire claire apparait autour de ce puits.
II DETERMINATION QUANTITATIVE DE L'ACTIVITE DE SPS-as A Le but de cet
essai est de determiner les activites enzymatiques qui sont capables
de decomposer le SPS d'une telle facon que les produits de decompo-
sition presentent une affinite a l'adsorption ou a la liaison de
protein de soja fortement reduite ou ne presentent pas d'affinite, a
l'adsorption ou a la liaison de protein de soja Des essais ont montre
que la partie des produits de decomposition de SPS qui n'est cas
precipitee par le melange de parts egales en volume S
d'water et d'ethanol ne presente aucune affinite a l'ad-
sorption ou a la liaison a la protein de soja.
La determination de la SPS-ase est basee sur une 515 hydrolyse du SPS
dans des conditions standard suivie par une precipitation de la partie
de SPS qui n'a pas ete hydrolysee par l'ethanol Apres la
precipitation, la teneur en carbohydrate qui n'est pas precipitee est
determinee par une analyse quantitative pour le sugar total (suivant
AF 169/1, disponible chez NOVO
INDUSTRIE A/S, 2880 Bagsvoerd (Danemark).
Les conditions standard sont: Temperature: 50 C p H: 4,5 Temps de
reaction: controle pendant 210 minutes uniquement avec le substrat,
suivi par 2 minutes
l'enzyme etant additionnee.
Temps de reaction: valeur principale 212 minutes L'_cuiuement comprend
Bain d'water agite thermostatise a 50 C.
Agitateur de type Whirlimixer Centrifugeuse
Un bain d'water glace.
Les reactifs comprenncrit: Tampon: acetic acid 0,6 M dans l'
water
demineralisee (a) et Na OH 1,0 M (b).
Substrat:la valeux du p H de 50 ml de a est reglee a 4,5 au moyen de
b, ensuite on ajoute 4,0 g de SPS et apres dissolution de celui-ci, le
p est regle une nouvelle fois a 4,5 et le volume est porte a 100 ml au
moyen d'water desioniaee.
Reactif u'arret:Ethanol absolu.
Unre unite d'activite SPS-ase (SAE ou SP Su) est definie ccnmo
l'activite SPS-ase qui libere une carbohydrate soluble dans de
l'ethanol a 50 % equivalente a 1 mole de galactose par
minute, dans les conditions standard susmentionnees.
ieme si la partie initiale de la courbe standard de l'enzyme est une
ligne droite, il faut noter qu'elle
n'iniersecte pas le point ( 0,0).
PARTIE 10 B DETERMINATION ENZY-Tic DE L ACTIVITE SOLUBILISANT
LA REAINCE EXRIMEE EN SRUM 120.
Princioe.
Dans le procede pour la determination de l'acti-
vite d'hydrolyse, la artie insoluble de la farine de soja degraissee,
deproteinisee et decortiquee est hydrolysee dans des conditions
standard La reaction de l'enzyme est arretee avec un reactif d'arret
et la fraction insoluble est separee par filtration La quantite de
polysaccarides dissous est determinee par spectrophotometrie apres une
hydrolyse acidsuivant AF 169/1, disponible chez Novo Industri A/S,
2880
Bagsvoe rd (Danemark).
Les carbohydrases presentant une activite endo ainsi que celles
presentant une activite exo sont
determinees suivant le procede.
Le substrat faisant partie de cette determina-
tion enzymatique est identique au substrat de la remanence decrit pour
la methode SRU Le substrat est dissous sous forme d'une solution a 3 %
dans le talmon au citrate indique ci-dessous: Tarpon au
citrate-phosphate 0,1 i N de p H 4,5 K,2 Aq d'citric acid monohydrate
(Plerck Art 244) 8,12 g d'hydrogen-phosphate disodium bihydrate (Merck
Art 6580) Amnene a 1 litre par de l'water demineralisee p H 4,5 + 0,05
Stable pendant 14 jours.
Le reactif ld'arret presente la composition suivante: ml de Na Ol 0,5
N' ml d'ethanol a 96 % A garder dans un refrigerateur jusqu'au moment
de l'utilisation. Conditions standard: Temperature: 50 "C pli: 4,5
Temps de reaction, echantillon:120 minutes a blanc: 5 minutes
Definition de l'unite: Une unite d'activite solubilisante la remanence
de soja (SRU:S) 120 (M pour manuel) correspond a la quantite d'enzyme
qui, dans les conditions de reaction donnees, libere, par minute, des
polysaccharides solubilises
equivalant a une micro-mole de galactose.
DETEP R::;ATION ENZYM:A 'Tic DE L'ACTIVITE PROTEOLYTIQUE
_SU E 'HUT
Procede pour la determination de la proteinase dans un
milieu acide.
Le procede est base sur la digestion d'hemoglo-
bine denaturee par l'enzyme a 40 C, a pli 3,2, pendant 30 minutes
L'hemoglobin non digeree est precipitee au moyen d'trichloroacetic
acid a 14 % (poids/volume). Tous les echantillons d'enzymes sont
prepares en dissolvant celles-ci dans un tampond'acetate 0,1 M,
p H 3,2.
Le substrat d'hemoglobin est prepare en utili-
sant 5,0 g de poudre d'hemoglobin bovine lyophilisee, conservee avec
du Thicrersalate a 1 % et 100 ml d'water demineralisee qui est agitee
pendant 10 minutes, avant de regler le p H a 1,7 au moyen de IIC 1
0,33 N. Apres une agitation ulterieure de 10 minutes, on regle le p H
a 3,2 au moyen de Na OH 1 N Le volume de cette solution est porte a
200 ml au moyen d'un tampon acetate 0,2 M Ce substrat d'hemoglobin
doit etre
* refroidi pour etre garde pendant 5 jours.
Le substrat d'hemoglobin est porte a termperature
ambiante Au temps zero, 5 ml du substrat sont intro-
Nuits dans une eprouvette contenant 1 ml d'enzyme Apres agitation
d'une seconde, l'eprouvette est mise dans un bain d'water a 40 C
pendant 30 minutes Apres exactement minutes, on ajoute 5 ml
d'acidtrichloroacetiquea 14 % dans l'eprouvette qui est ensuite agitee
et
portee a temperature ambiante pendant 40 minutes.
Pour l'essai a blanc, le substrat d'hemoglobin est porte a temperature
ambiante Au temps zero, on ajoute 5 ml du substrat dans une eprouvette
contenant 1 ml d'enzyme Apres une agitation d'une seconde,
l'eprouvette est mise dans un bain d'water a 40 C pendant 5 minutes
-Apres exactement 5 minutes, on ajoute 5 ml d'trichloroacetic acid a
14 % dans l'eprouvette qui est ensuite a Jit( et lJ 3 rtce a
temperature ambiante
pendant 40 minutes.
Apres 40 minutes, les essais a blanc et les echantillons sont agite 5
s, filtres une ou deux fois a travers un filtre de type Berzelius N 0,
et disposes dans un spectrophotometre L'echantillon est lu par rapport
a
l'essai a blanc a 275 nm en ajutant le spectrophoto-
metre par rapport a de l'water.
Etant donne que l'absorbance de la tyrosine a 275 nm est un facteur
connu, il n'est pas necessaire d' etablir une courbe standard de
tyrosine a moins
qu'il ne soit necessaire de controler le spectrophoto-
metre de Beckman.
Calculs:' 1 HUT est la quantite d'enzyme qui forme, en une minute, un
hydrolisat equivalent en ce qui concerne
l'absorbance a 275 nm a une solution de 1,10 micro-
gramme/ml de tyrosine dans du HC 1 0,006 N Cette valeur de
l'absorbance est de 0,0084 La reaction s'effectue
A 40 C, a p H 3,2 et pendant 30 minutes.
HUT = Lchantillon a blanc x Volume en ml
0,0084 termps de reaction en mn.
E-chantillon a blanc 1 1 HUT = -cantillon= ( E-B) x 43,65
0,0084 30
HUT/g enzyme = DUB) x 43,65 g enzyme dans 1 ml Un essai pour
determiner la dependance de la stabilite du p H de la protease dansle
KRF 68, effectue 0 au moyen d'une analyse HUT avec des valeurs de p H
de 2,0 a 8, 0,a montre que la protease a p H
superieur a 8,0 etait tres faible, cfr fig 16.
Dans le but d'illustrer la presente invention,on se reftrera aux
exemples suivant 1 a 10, dans lesquels l'exemple 1 illustre la
preparation de SPSase et dans lesquels les exemples 2 a 10 illustrent
l'application
de la SPS-ase.
On a effectue a l'echelle du laboratoire, de nombreuses iron-
mantations avec les souches Asn aculeatus et Asp japonicus indiquees
ici Ainsi on a obtenu des preparations qui contenaient la SPS-ase
suivant les essais de SPS-ase indiques ci-dessus Cependant, etant
donne qu'on a besoin de quantites assez importantes de SPS-ase afin
d'executer les essais, on a effectue des fermentations semblables a
l'echelle d'une installation pilote; cfr
exemple 1 suivant.
18570
Exemple i
Production d'une SPS-ase a l'echelle d'une
installation pilote.
On a prepare une SPS-ase par fermentation submergee d'Aspergillus
aculeatus CBS 101 43. On a prepare un substrat d'agar presentant la
composition suivante dans un flacon de Fernbach.
Peptone Difco 6 g Aminoline Ortana 4 g Glucose 1 g Extrait de levure
Difco 1 g Extrait de viande Difco 1,5 g KH 2 PO 4 Merck 20 g 2 2 g
Extrait de malt Evers 20 g H 20 demineralisee jusqu'a 1000 ml
On a regle le p H a une valeur entre 5,30 et 5,35.
Ensuite on a ajoute 40 g d'agar Difco et on a maintenu le melange dans
un autoclave pendant 20 minutes a 120 C (le substrat est denatme
E-agar) La souche CBS 101 43 a ete cultivee sur un plan incline de
E-agar ( 37 C) Les spores du plan incline ont ete mis en suspension
dans du lait ecreme sterilise et la suspension a ete lyophilisee dans
des fioles La teneur d'une fiole lyophilisee a ete transvasee dans un
flacon de Fernbach Le flacon a ensuite ete soumis a une incubation
pendant 13 jours a 30 C.
On a prepare un substrat ayant la composition
suivante dans un reservoir de fermentation de 500 litres-
Ca CO 3 1,2 kg Glucose 7,2 kg Rofec (matiere seche d'une liqueur de
mais) 3,6 kg Huile de soja 1,2 kg On a ajoute de l'water de robinet
jusqu'a unvolume total d'environ 240 litres On a regle le p H a
environ 5,5 avant d'ajouter du Ca CO 3 On a sterilise le substrat dans
le fermentateur a'inoculation pendant une heure a 1210 C. Le volume
final avant inoculation etait d'environ 300 litres. La suspension de
spores dans le flacon de Fernbach a ete transferee dans le
fermentateur d' inocula- tion Les conditions de fermentation de
l'inoculat etaient:
Type de fermentateur: Reservoir de fermen-
tation classique aere et agite presentant un rapport
hauteur/diametre d'environ 2,3.
Agitation: 300 tours/minute ( 2 helices de turbine) Aeration: 300
litres N d'air/minute Temperature:30 a 31 C Pression:0,5 atmospere
relative
Temps; Environ 28 heures.
Environ 28 heures apres l'inoculation, on a transfere 150 litres du
fermentateur d'inoculation Vers le
reservoir de fermentation principal.
On a prepare un substrat ayant la composition suivante dans un
reservoir de fermentation principal de 2500 litres: Farine de soja
grillee: 90 kg KH 2 PO 4: 20 kg Pluronic (nom commercial): 150 ml On a
ajoute de l'water de robinet a un volume total d'environ 900 1 La
farine de soja grille a ete mise en suspension dans l'water On a regle
le p H a 8,0 au moyen de Na OH et on a augmente la temperature a 50 C
Ensuite on a ajoute environ 925 unites Anson d'ALCALASE 0,6 L a la
suspension On a maintenu le melange pendant 4 heures a 50 C et a p Hli
8,0 (addition de Na 2 CO 3) sans aeration, sous une pression relative
de zero atmosphere relative et une agitation a raison de 100
tours/minute Ensuite on a ajoute les composants restants de substrat
et on a regle le p H a environ 6 au moyen d'phosphoric acid On a
sterilise le substrat dans le reservoir de fermentation
18570
principal pendant 1 1/2 heure a 123 C Le volume final
avant inoculation etait d'environ 1080 litres.
Ensuite on a ajoute 150 litres-de culture d'inoculation Les conditions
de fermentation sont:
Type de fermentateur:Reservoir de fermen-
tation classique aere et agite presentant un rapport
hauteur/diametre d'environ 2,7.
Agitation: 250 tours/minute ( 2 helices de turbine)
Aeration: 1200 1 N d'air/minute.
Temperature: 30 C Pression: 0,5 atmosphere relative
Temps: environ 151 heures.
A partir de 24 heures de fermentation jusqu'a environ 116 heures de
fermentation on a ajoute une solution
de pectine de maniere aseptique au reservoir de fermenta-
tion principal a raison d'une vitesse constante d'environ 8 litres par
heure La solution de pectine ayant la composition suivante a ete
preparee dans un reservoir de
dosage de 500 litres.
Pectin genu: 22 kg Acide phosporiquacid concentre: 6 kg Euronic (nanom
ccoercial): 50 ml x Genu pectin (du genre citrus NF de "The Copenhagen
pectin factory Ltd").
On a ajoute de l'water de robinet a un volume total d'environ 325
litres Le substrat a ete sterilise dans un reservoir de dosage pendant
1 heure a 121 C Le volume
final avant le debut du dosage etait d'environ 360 litres.
Lorsque cette partie a ete enuisee)on a nreDare une autre partie
similaire Le volume total de la solution de pectine pour
une fermentation etait d'environ 725 litres.
Apres environ 151 *heures de fermentation on a arrete le processus de
fermentation Le bouillon de culture d'environ 1850 litres a ete
refroidi a environ 5 C
et on a recupere les enzymes selon l technique suivante.
Le bouillon de culture a ete filtre sur un fiblre tambour sous vide
(Dorr Oliver), qui etait enrobe -'une terre de diatonees
Hy-flo-super-cel (adjuvant de filtration) Le filtrat a ete concentre
par evaporation a environ 15 % du volume du bouillon de culture Le
concentre a ete filtre sur une feuille de filtre Seitz (type supra
100) comportant 0,25 % de Hiyflo-super-cel a titre d'adjuvant de
filtration (denomme filtration I dans le tableau suivant) Le filtrat a
ete precipite au moyen de 561 g de(NH 4) 2 SO 4/l a un p H de 5,5 et
on a ajoute 4 % de terre de diataore Hy-flosuper-cel a titre
d'adjuvant de filtration Le precipite et l'adjuvant de filtration sont
separes par filtration sur un filtre a cadre Le * 15 gateau de filtre
est dissous dans de l'water et les fractions insolubles sont separees
par filtration sur un filtre a cadre Le filtrat est soumis a un essai
de filtration sur une feuille filtrante Seitz (de type supra 100) avec
0,25 % de Hy-flo-super-cel a titre d'adjuvant de filtra-
tion (denorme filtration II dans le tableau suivant) Le filtrat est
soumis a une diafiltration dans un appareil d'ultrafiltration Aores
diafiltration, le liquide est concentre jusqu'a une teneur en matiere
seche de 12,7 % (denommee, dans le tableau suivant, teneur en matiere
seche
du concentre).
Un traitement de base facultatif pour eliminer partiellement
l'protease peut etre effectue a cette etape Dans le cas d'un
traitement de base, celui-ci est effectue a un pli de 9,2 pendant une
heure, le p Hli etant
ensuite regle a 5,0.
Ensuite le-liquide est soumis a une filtration de controle et
filtredans le but d-'une reduction de germes et
le filtrat est lyophilise dans un equipement de lyophili-
sation de Stokes.
On a effectue quatre fermentations de la maniere
'18570
indiquee ci-dessous; la souche utilisee pour la fermen-
tation, l'utilisation facultative d'un traitement de base et d'autres
parametres variant, comme indique dans le
tableau suivant.
x Apres filtration de reduction des germes, le filtrat est concentre
par evaporation en un rapport de 1:2,3 Une
Paible partie du filtrat concentre a ete sechee par pul-
verisation et la partie restante a ete lyophilisee.
Afin de reduire encore plus l'protease, certaines preparations
indiquees ci-dessus sont traitees comme indique ci-dessous, en
n'utilisant qu'une des trois possibilites A, B, ou C. A On dissout 100
g de preparation de SPS-ase dans un litre d'water desionisee en
agitant a 10 C + 2 C On regle le p H a 9,1 au moyen de Na OH 4 N Ce
traitement de base est effectue pendant une heure On regle ensuite le
p H a 4,5 au moyen d'acetic acid glacial et on dialyse en
opposition a l'water desionisee froide a une conductivi-
te de 3 m Si Ensuite on effectue la congelation et la lyophilisation.
B On dissout une preparation de 500 y de SPS-
ase dans 4 litres d'water desionisee en agitant a 10 C + 2 C.
On regle le p H a 9,1 au moyen de Na O Hi 4 N 1 Ce traitement de base
est effectue pendant une heure On regle ensuite le p H a 5,0 au moyen
d'acetic acid glacial La
substance obtenue est lyophilisee.
Traitenrnt de Code Concentration ( 5) d 'leneur base de l'adjuvant de
filtraen rat Prepl tion r-ur: USche ration du icroorganisuti non uti
filt/-prc-ci filtra duemar
j concen T_.
lise iise tion I pitat ioni r es ticn tr CES 101 43A¦ i RF 68 0,5 5
0,2 k 28 l_ _ " __ A-CC 20236 x j}E 74 2,0 4 0,4 7,5 i.O 4 4 C 8j x
KRF 83 1,0 5 -0,25 12,4 _)_ CES 101 43 x KRF 92 0,25 4 0,25 12,7
18570
C On dissout 50 g d'une preparation de SPS-ase dans 400 ml d'water
desionisee en agitant a 10 C + 2 C On regle le p H a 9,1 au moyen de
Na OH 4 N Ce traitement de base est effectue pendant une heure Ensuite
on reduit le
p H a 5,7 au moyen d'acetic acid glacial La substance-
obtenue est lyophilisee. Preparation de SPS-ase Traitement de Code de
la en tant que substance base utilise preparation de depart pour le
trai teent de base B C KRF 68 x KRF 6 G Bl I KR? 63 x KRF 65 BIII KRF
92 x KRF 92 BI
Les preparations indiquees ci-dessus sont carac-
terisees par leur activite des enzymes selon la presente
invention dans le tableau suivant.
Activite enzymatique par g KRF 68 IERF 68 Bl I KPF 68 BIII KRF 74*KRF
83 KRF 92 KRFW 92 E 1 SAS, esade plaqw + + + + essai quantita 350 301
349 Q 168 476 430 t i f_ _ _ _ _ _ _ _ _ __ _ _ _ _
SRTJ 737 507 481 142 683 626 757
SRUM 120 2125 1560 1720 578 753 1640 1030
UT ph 3,2 67000 105 339 1630 12800 5960 397
C 80008044 9396 1320 8040 5700 3092
PU 1 E 3000009000000 880000,0 8400 '00 7500000 8400000 7600000
______________ 119400 72000 77700 4100 64600 60000 68800
UPTE 78100 83700 76900 15130 327000 44000 62400
PEE 840 910 770 370 690 1000 7190
Vlicu 16000003,100000 10000001 65000 2200000 1100000 742000 o. M'f vo
u n C 1, Exemple 2 (exemple d'application) Cet exemple decrit la
fabrication de p v p a partir de farine de soja degraissee et
decortiquee,
"Sojamel 13 " (disponible dans le conerce aupres de Aarhus Olie-
fabrik A/S) La teneur en matiere seche de cette farine etait de 94,0 %
et la teneur en (N x 6,25) sur la base des matieres seches etait de
58,7 % La farine de soja a ete traitee avec les preparatio rsde
SPS-ase KRF 68 Bl I (exemple 1) de la maniere suivante:
On a mis 85,2 g de la farine de soja en suspen-
sion et on a maintenu en agitation a 50 C dans 664,8 g d'water et on a
regle le p H a 4,5 au moyen de 7,5 ml de H Cl 6 N On y a ajoute 50 g
d'une solution contenant 4,00 g de ladite preparation de SPS-ase et on
a ensuite agite le melange reactionnel pendant 240 minutes a 50 C Le
meange a ensuite ete centrifuge dans une centrifugeuse de laboratoire
(modele Beckman J-6 B) pendant 15 minutes a 3000 xg On a pese le
surnageant et on l'a analyse suivant la methode de
Kjeldahl afin de determiner l'nitrogen et les matieres seches.
La phase solide a ensuite ete lavee avec un volume d'water equivalent
a la masse de surnageant obtenue lors de la premiere centrifugation
Cette operation a ete effectuee deux fois La phase solide a ensuite
ete lyophilisee,
pesee et analysee suivant la methode de Kjeldablpour dater-
miner l'nitrogen et les matieres seches chez Qvist's Labora-
torium, Marselis Boulevard 169, 8000 Aarhus C, Danemark.
Ce laboratoire est agree par l'Etat pour les analyses d'aliments pour
betail et des produits laitiers Les resultats obtenus apparaissent
dans le tableau 2 1: 1 &#x003C; Tableau 2 1 Resultats obtenus Pe t
Renendement Composants Masse N x 6,25 Matiere en pro en matiere g % s
Ache, % teine A% seches, % Farine de soja 85,2 55,2 94,0 100 % 100 %
Preparation de
SPS ase 4,00 75,6 6,4 % -
1 Produit de centrigugation 66,6 1,50 5,04 21,2 % 42,0 % p.v p 44,5
87,5 95,7 82,7 % 53 2 % On a donc obtenu une p v p presentant une
purete de protein, c'est-a-dire N x 6,25 sur la base des matieres
seches, de 91,4 % et avec un rendement total en
protein
de 83 % -
Exemple 3 (exemple d'application) Cet exemple a ete effectue afin de
comparer les rendements en protein, la qualite nutritive et certaines
proprietes fonctionnelles de produits a base de protein de soja
prepares suivant les trois techniques suivantes: A: La precipitation
isoelectrique classique pour la preparation d'un isolat de protein de
soja B: Le lavage isoelectriqueclassique pour la
preparation de concentre de protein de soja.
C: Le lavage isoelectrique suivant l'invention
comportant une enzyme solubilisant la rema-
nence, pour la preparation d'une p v p. Afin de creer une comparaison
valable du procede
de l'invention (C) avec les procedes classiques de prepara-
tion de protein de soja (A et B), on a utilise la meme substance brute
dans les trois cas De meme, les essais ont ete effectues de telle
maniere que les temperatures correspondantes et les durees de
traitement soient les memes dans les trois cas Uniquement les valeurs
de p H etaient differentes etant donne les differences
fondamentales entre les trois essais.
A La precipitation isoelectrique classique pour la
preparation d'un isolat de protein de soja.
On a extrait 425,8 g de farine de soja (Sojamel 13 produit par Aarhus
Oliefabrik A/S) dans 3574,2 g d'water de robinet a 50 C On a regle le
p H a 8,0 avec 20,1 g de Na OH 4 N Apres une agitation d'1 heure, on a
centrifuge la suspension a 3000 x g pendant 15 minutes en utilisant
quatre bechers d'l 1 litre dans une centrifugeuse de laboratoire
(modele Beckman J-6 B) Le produit de centrifugation I et le precipite
I ont ete peses Le precipite I a ete soumis a une nouvelle extraction
avec de l'water jusqu'a atteindre un poids total de 4000 g On a
maintenu la temperature a 500 C, on a regle le p H a 8 au moyen de Na
OH 4 N et on a agite la suspension pendant 1 heure On a effectue la
centrifugation et le pesage du produit de
centrifugation II et du precipite II comme decrit ci-dessts.
On a retire des echantillons des produits de centrifugation I et II et
du precipite II pour les analyses suivant Kjeldahl et pour la mesure
des matieres seches Ensuite, les produits de centrifugation I et II
ont ete m Alangbs et maintenus a 50 C La protein a ensuite ete
precipitee isolelectriquement a p H 4,5 au moyen de 45 g de HC 1 6 N.
Apres une agitation d'l heure a 50 C, on a recupere la
protein par centrifugation a 3000 x g pendant 15 minutes.
Le produit de centrifugation III a ete pese et analyse pour les
determinations Kjeldahl-N et les mesures de matiere seche La phase
solide III a ete pesee et lavee a l'water en une quantite
correspondant au poids du produit de centrifugation I Le lavage a ete
effectue en agitant pendant 1 heure a 50 C La protein lavee a ete
recuperee par centrifugation a 3000 x g pendant 15 minutes Le produit
de centrifugation IV et la phase solide IV ont ete peses Le produit de
centrifugation IV a ete analyse pour la determination de Kjeldahl-N et
pour la mesure des matieres seches La phase solide a ete mise en
suspension dans 1550 g d'water a 50 C et on a regle le p H a-6,5 au
moyen de 17 g de Na OH 4 N Le melange a ete maintenu en agitation
pendant 1 heure et on a de nouveau regle le p H a 6,5, si necessaire
Finalement, le produit a ete lyophilise, pese et analyse pour la
determination suivant Kjeldahl-N et pour la mesure des matieres seches
Les calculs de bilan
massique sont representes au tableau 3 1.
Tableau 3 1:Calculs du bilan massique de la precipitation
isolelectrique classique pour la preparation
d'un isolat de protein de soja -
Operations etfractions Masse de Protine Matiere ndement Rendement
fraction % seche % pn pro en matiere 9 (Nx 6,25) teine % seche %
Extraction: Farine de soja 425,8 55,2 94,0 100,0 100,0 water 3574,2 O
O O O Na OH 4 N 20,1 O 16,0 O 0,8 1.Centrifugation:E 4020,1 5,9 10,0
100,9 100, 4 Centrifugat I 3141,0 4,4 6,9 58,8 54,1 Precipite I 805,0
Reextraction:
Precipite I 805,0 -
water 3195,0 O O O O 2.Centrifugation: Centrifugat II 3104,0 0,5 0,9
6,6 7, 0 Precipite II 820,0 9,1 17,2 31,7 35,2
Agitation et acidifica-
tioe ton / Centrifugats I+II 6245,0
HC 1 6 N 45,0 O 21,3 O 2,4
3.Centrifugation:i 6290,0 Centrifugat III 5650,0 0,3 1,9 7,2 26,8
Precipite III 308,0 Lavage: Precipite III 308,0 water 3141,0 O O O O
4. Centrifugation: Z 3449,0 Centrifugat IV 3113,0 0,04 0,1 O i 5 1,2
Precipite IV 291,0 Neutralisation: Precipite IV 291,0 water 1550,0 O O
O O Na OH 4 N 17,0 O 16,0 O 0,7 Sechage: poudre 128,0 93,8 96,3 51,1
30,8 B Lavage isoelectrique pour la preparation d'un concentre
de protein de soja.
On a lave 425,6 g de farine de soja (Sojamel 13 produit par Aarhus
Oliefabrik A/S) dans 3574 g d'water a 50 C On a regle le p H a 4,5 au
moyen de 44,8 g de HC 1 6 No On a effectue le lavage pendant 4 heures
en agitant La suspension a ensuite ete centrifugee a 3000 x g pendant
15 minutes dans une centrifugeuse de laboratoire (modele Beckman
J-6 B) utilisant 4 bechers d'l 1 Le produit de centrifuga-
tion I a ete pese et analyse pour la determination suivant Kjeldahl-N
et la mesure des matieres seches La phase solide I a ete pesee et
lavee une nouvelle fois a l'water jusqu'a un poids total de 4000 g Le
p H a de nouveau
ete regle a 4,5 au moyen de 1,7 g de HC 1 6 N et on a main-
tenu la suspension sous agitation pendant 30 minutes a 50 Co On a
effectue une centrifugation et une pesee du produit de
centrifugation II et des solides II comme precedemment.
La phase solide II a ete remise en suspension dans 1575 g de H 20 A 50
C et on a regle le p H a 6,5 au moyen de 34,5 g de Na OH 4 N; On a
maintenu le melange sous agitation a 50 C pendant une heure et on a de
nouveau regle le p H a 6,5, si necessaire Finalement le produit de
protein a ete lyophilise, pese et analyse suivant Kjeldahl-N et pour
la mesure des matieres seches Le bilan massique est
represente dans le tableau 3 2.
Tableau 3 2:Calculs du bilan massique du lavage isoilectri-que
pour la preparation d'um concentre de protein de soja.
Operations et Masse de protein Matiere Rende Rendement
fractions la frac 3 3,2 Solides II 863,0 Neutralisation: Solides II
863 O water 1575,0 O O O O Na OH 4 N 34,5 O 16,0 O 14 Sechage:poudre
281,0 72,5 98,4 86,7 69,1 C Lavage isoelectrique comprenant une enzyme
solubilisant la remanence, pour la preparation d'une p v p, On a lave
425,8 g de farine de soja (Sojamel 13 produit par Aarhus Oliefabrik
A/S) dans 3524,2 g d'water a 50 C On a regle le p H a 4,5 en utilisant
43, 7 g de H Cl 6 N On a dissous 24 g de la preparationde SPS-ase, KRF
68 BIII (exemple 1) dans 26 g d'water et on l'a ajouteeau melange de
lavage On a ensuite effectue le lavage pendant
4 heures sous agitation On a ensuite effectue la purifi-
cation comme decrit dans l'essai B, les quantite de HC 1 6 N, de Na OH
4 N et d'water pour la nouvelle suspension etant les seuls parametres
presentant des valeurs differentes Le
bilan massique est represente dans le tableau 3 3.
Tableau 3 3: Calcul du bilan massique du lavage isoelec-
tric comportant un enzyme solubilisant la remanence pour la
preparation d'une p v p. 1) Analyse par Bioteknisk Institut,
Holbersvej 10, DK-6000 Kolding, Danemark 2) Analyse par Qvist's
Laboratorium, Marselis B Oulevard 169, DK-8000, Aarhus C, Danemark
Proprietes nutritives Les compositions en amino acids des trois
produits de protein ont ete determinees, voir tableau 3 4 La teneur
totale en amino acids essentiels, la teneur chimique et l'indice
d'amino acids essentiels (EAAI) sont
calcules en utilisant le document de reference-FAO de 1957.
La teneur en inhibiteur de trypsine des trois produits a ete
determinee au moyen de la methode decrite dans A O C S Tentative
Method Ba 12-75 (A O C S est une
Rendement Rende-
Operations et Masse de protein Matiere en prote ment en fractions
Eraction %(N x 6,25 seche % ine, matiere _ % seche % Lavage farine de
soja 425,8 55,2 94,0 100,0 100,0 water 3540,2 O O O
HC 1 6 N 43,7 O 213 O 2,3
SPS-ase:KRF 68 BIII 24,0 75,3 96,0 7,7 5 8 1.Centrifugation: E 4043,7
Centrifugat I 3420, O 1,7 5 t 2 24,7 44,4 Solides I 620,0 Nouveau
lavage Solides I 620,0 _ water 3380,0 O 0 00 H Cl 6 N 1,3 O 21,3 0 0,1
2. Centrifugation: Z 4001,3 Centrifugat II 3400,0 0,2 0,6 2,9 5,1
Solides II 577,0 Neutralisation: Solides II 577,0 water 1700,0 O O 0 0
Na OH 4 N 25,3 O 16 A O O 1 '0 sechage: poudre 211,0 87 31) 96,71)
78,2 51,1
86,92) 97,02)
abreviation pour American Oil Chemists' Society) Les re-
sultats sont representes dans le tableau 3 5 qui comporte egalement
les rendements et le rapport protein/matiere
seche des trois produits.
Tableau 3 4: Conposition d'amino acids et evaluation nutritive des
trois produits de protein A, B, et C 1)aas = teneur en amino acids
(aminoacid score) basee
sur 11 document de reference FAO de 1957.
A.Isolat de pro B Concentre de C Isolat de pro-
teine de soja protein de soj teine de soja
amino acid g/16 g N (P P-
Acide_ _ ___g/16 g N _ aas 1 g/16 g N aas C/16 g N aas 1
Non-essentiel:
acidasparti 12,4 11,3 11,9 -
que
Serine 4,'62 4,69 4,81 -
Acie olutamic e 21,3 18,2 17,7 -
Proline 6,07 5,19 4,76 -
Glycine 4,13 4,26 4,33 -
Alanine 3,54 4,27 4,55 -
Histidine 2,83 2,78 2,50 -
Arginine 8,09 7,57 7,04 -
Essentiel: Isoleucine 4,87 &#x003E; 100 4,97 &#x003E; 100 5,19) 100
Leucine 7,80 &#x003E; 100 7,98 &#x003E; 100 8,09 &#x003E; 100 -
Lysine 6,24 &#x003E; 100 6,09 &#x003E; 100 5,57 &#x003E; 100
Phenylalanine 5,47 &#x003E; 100 10 5,35 &#x003E; 10 ' 5,17 100
&#x003E; 10 Tyrosine 3,38 &#x003E; 0100 J3,88 &#x003E; 10 J 4,44 001 J
Cystine 1,29 64 IA 1,32 6662 1,44 72,0 Mthioni N e 1,0 49, 1 1 9,
Methionine 1,08 1,21 55,0) 1,31 5 Threonine 3,10 &#x003E; 100 3,60
&#x003E; 100 3,97 &#x003E; 100 Tryptophane 1,06 75,7 1,37 97,9 1,32
94,3
Valine 4,90 &#x003E; 100 5,23 &#x003E; 100 5,57 &#x003E; 100 -
T'eneur totale I en acidsam i, 38,36 41,31 42,21 nes essentiels%
Teneur chimique 56,4 % 60,2 % 65,5 %
EAAI 86,7 % 90,2 % 91,3 %
Tableau 3 5: Caracteristiques du processus et teneur en inhibiteur de
trypsine des trois produits de protein A, B et C Proprietes
fonctionnelles L'indice de nitrogen (NSI: Nitrogen solubility index) a
ete determine respectivement, dans une dispersion de protein a 1 % a p
H 7,-0 dans Na Cl 0,2 M et dans l'water distillee Apres avoir agite
pendant 45 minutes au moyen d'un agitateur magnetique, on a centrifuge
la suspension a 4000 x g pendant 30 minutes et on a analyse le
surnageant pour determiner l'nitrogen La nitrogen a ete calculee comme
le rapport: % N soluble/ % N total Les resultats de cette evaluation
effectuee
sur les trois produits sont representes dans le tableau 3 6.
La capacite d'emulsification a ete determinee trois fois sur chaque
produit par un titrage de Swift legerement modifie 4,0 g de (N x 6,25)
du produit ont ete melangesdans 250 ml de Na Cl 0,5 M au moyen
d'unagitateur Sorval Omnimixer a vitesse lente On a transfere 50 ml de
la suspension dans un recipient melangeur en verre et on y a ajoute 50
ml d'huile de soja Le melange total a ensuite ete pese Le melange
huile-eau a ensuite ete homogeneise A Isolat de B Concentre C Isolat
de protein de protein Eproteine de de soja de soja soja (p v p C
aracteris protein dans matiere seche 97,4 % 73,7 % 90,0 % tic du _
processus Rendement en protein 51,1 % 86,7 % 78,2 % Inhibiteurs de
trypsine34 000 21 000 9 000 TUI/g protein TUI/g 36 250 28 970 21 810 A
10 000 tours/minute, le recipient etant dispose dans un bain de glace
On a ajoute une quantite supplementaire d'huile de soja a une vitesse
de 0,3 ml par seconde jusqu'a ce que l'emulsion s'effondre La quantite
totale d'huile ajoutee avant le "point final" a ete determinee par
pes Ae.
La capacite d'emulsification est calculee comme le nombre de ml
d'huile par gramme de protein (N x 6,25) La densite de l'huile a ete
supposee egale a
0,9 g/ml.
Les resultats moyens de la determination de la
capacite d'emulsification des trois produits sont represen-
tes au tableau 3 6.
L'expansion au fouettement a ete determtinee dans une solution de
protein a 3 %,a p H 6,5 On a fouette 250 ml d'une dispersion aqueuse
des Ecbantilions de
protein a la vitesse III pendant 4 minutes dans un agita-
teur Hobart (modele N-50) comportant un fouet en forme de fil
L'expansionau fouettement a ete calculee selon la formule Expansion au
fouettement = V 250 x 100 %
dans laquelle V represente le volume de fouettement final.
en ml.
La valeur V est mesuree en remplissant le re-
cipient melangeur avec de l'water On a double les essais de chacun des
trois echantillons Les resultats moyens
sont representes au tableau 3 6.
La stabilite de la mousse est determinee en tant que rapport entre la
quantite de mousse abandonnee apres egouttage pendant 30 minutes et la
quantite de mousse a l'origine Un gramme de mousse produitepar le
procede precedent a ete introduit dans un cylindre en plastique
(diametre 7 cm, hauteur 9 cm) comportant un filet a mailles de 1 mm x
lmmo Le cylindre a ete dispose au-dessus d'un entonnoir monte sur un
cylindre en verre et le poids (B) du liquide egoutte dans le cylindre
en-verre est mesure La stabilite de la mousse FS (foam stability) est
determinee par l'equation A -B FS A A x 100 % Les resultats de la
mesure sont representes au
tableau 3 6.
La resistance du gel est definie dans cette
description en tant que la viscosite de Brookfield mesuree
au moyen de mandrins T sur un statif de Brookfield Helipath Les gels
sont produits par traitement thermique de suspensions de protein a 12
% dans du Na Cl 0,5 M Le traitement thermique a ete effectue dans des
bidons fermes ayant un diametre de 7,3 cm et une hauteur de 5,0 cm,
plonges dans un bain d'water, maintenu P Pn et 1000 C, pendant
N mn chacun Les bidons ont ete refroidis et thermostati-
ses a 20 C avant de les ouvrir et avant d'effectuer ies mesures Les
resultats de ces mesures sont representes
dans le tableau 3 6.
Tableau 3 6: Propriete fonctionnelles des trois substances de protein
A, B, et C Proprietes A Isolat de B Concentre de C Isolat-de
fonctionnelles protein de protein de protein soja so O ja de soja(pvp)
% NSI dans Na Cl 0,2 M 39,5 20,3 25,6 % NSI dans l'water 53,9 25,1
28,6
Capacite d' ermulsifi-
cation: mi huile/g 218 182 354 (N x 6,25) Expansion au fouette 120 120
340
120 ' 340
mnnt % Stabilite de la 50 50 20 musse % 50 50 20 mousse % Resistance
du gel 3 4 2 C (Na Cl 0,5 M) 1,7 x 10 1,2 x 104 3,3 x 104 1000 C (Na
Cl 0,5 M) 2,0 x 10 4,0 x 10 1,3 x 10 ii Noi _ __ Exemple 4 (exemple
d'application) On a produit une p v p suivant le processus decrit a
l'exemple 3 C sauf que l'cellulase etait partiellement derivee de
Trichoderma reseei La preparation de cette cellulase commerciale
CELLUCLAST, produite par Novo Industri A/S, a ete traitee au moyen
d'une base a faible temperature, de lamaniere suivante Le p H d'une
solution a 10 % de CELLUCLAST dans l'water a ete regle a 9,2 au moyen
de Na OH, et la solution resultante a ete refroidie a 5 C Apres sejour
d'une heure a ce p H et a -cette temperature, on a regle le p H a 4,7
au moyen d'acetic acid a 20 % Cette solution a ete maintenue a 5 C
pendant la nuit et ensuite ete filtree de maniere sterile.
Le produit de filtration a ete lyophilise On a ajoute 4 g du produit
lyophilise a la preparationde SPS-ase, KRF 68 BIII (exemple 1) Les
deux enzymes ont ete dissoutes dans 172 g d'water avant d'etre
ajoutees au melange de lavage Les determinations du-bilan massique de
cet
exemple sont representees dans le tableau 4 1.
L'essai prouve que cette preparation particu-
liere de SPS-ase contient deja une cellulase efficace etant donne
qu'une addition de CELLUCLAST ne semble pas affecter le rapport
protein/matiere seche Cependant, d'autres preparations de SPS-ase
peuvent contenir moins de cellulase, par exemple KRF 92, voir le
tableau precedant immediatement l'exemple 2:
Tableau 4 1:
* Calculs du bilan massique du lavage isoelec-
tric comportant une preparation de SPS-ase et du CELLUCLAST pour
la'production du p v p. Operations et Massede E protein Matiere
endement Rendement fractions fraction % seche en enmatiere ___ granmes
(Nx 6,25) % iroteine% seche % Lavage: Farine de soja 425,8 55,2 94,0
100,0 100,0 water 3546,2 O O O O H Cl 6 N 43,1 O 21,3 O 2,3
SPS-ase:KRF 68-BIII 24,0 75,3 96 7,7 5,8
CELLUCLAST 4,0 43,6 96 0,7 1,0
Centrifugation: u 4043,1 Centrifugat I 3382,0 1,9 5,5 27,3 46,5
Solides I 661,0 Nouveau lavage: Solides I 661,0 water 3339,0 O O O O
HC 1 6 N O O O O O
2 e Centrifugation:Z 000,0 Centrifugat II 3414,0 0,2 0,7 2,9 6,0
Solides II 582,0 Neutralisation: Solides II 582,0 water 1691,0 O O O O
O Na OH 4 N 25,3 O 16,0 O 1,0 Sechage: Poudre 206,0 88,8 98,9 7718
5-09 Exemple 5 (exemple d'application) On a produit une p v p. suivant
le procede decrit dans l'exemple 3 C sauf que toutes les masses ont
ete divisees par un facteur de 5 et que le melange reactionnel a ete
refroidi a environ 5 C avant la centrifugation Sur base des resultats
analytiques en rapport avec les produits de centrifugation, on obtient
un rendement theorique en
protein precipitee, comme montre dans le tableau 5 1.
Tableau 5 1: Rendements theoriques en protein obtenus lors de la
production d'une p v p. a Moyenne de 87,5 (Bioteknisk Institut) et
86,9 (Qvist's
Laboratorium); la teneur en matiere seche est respective-
ment de 97,6 et 98,0 %.
b Calcule en tant que masse totale de protein perte en
protein dans les produits de centrifuqations.
Exemple 6: (exemple d'application) D Amonstration de la liaison
Droteique du SPS On a dissous 40 g de (Nx 6,25) d'un isolat de protein
de soja commercial (Purina 500 E de Ralston Purina) dans 680 g d'water
On a chauffe le melange dans un bain d'water a 50 C et on a regle le p
H a 4,50 au moyen de H Cl 6 N On a transfere 90 g de ce melange dans 5
flacons d'Erlenmeyersde 250 ml et on y a ajoute 10 g de solution
aqueuse contenant respectivement O g, 0,2 g, 0,4 g 0,8 g et 1,6 g du
SPS prepare comme decrit precedemment dans ce memoire maintenus sous
agitation au moyen d'un aimant dans-un bain
d'water a 50 C pendant 240 minutes.
On a ensuite centrifuge les suspensions a 3000 x g Masse protein
Rendement Exemple 3 Fractions g (Nx 6,25)en pro protein Rendement %
teine % (Nx 6,25) en rotine Farine de soja 85,2 55,2 10055,2 100
SPS-ase KRF-68 BIII 4,8 75,3 7,7 75,3 7,7 lere centrifugation639 0,99
13,5 1,7 24, 7 2 e centrifugation595 0,13 1,6 0,2 2,9 p.v p 87,2 a
92,6 b 87,1 801 b _______________________________________ ____________
_________________ ____________________ _ 8 O, 1 b__________ pendant 15
minutes et les produits de centrifugation I ont ete analyses suivant
Kjeldahl-N et pour la determination des matieres seches Les phases
solides-ont ete lavees a l'water a temperature ambiante et
centrifugees une nouvelle fois Cette etape a ete repetee Ensuite on a
disperse les solides dans 50 ml d'water et on a regle le p H a 6,50
par une addition goutte a goutte de Na OH 6 N Les produits neutralises
ont ete lyophilises et analyses suivant Kjeldahl- N et pour determiner
les matieres seches (MS) En se basant sur les analyses representees au
tableau 6 1, on a
calcule le pourcentage de protein recuperee et le pour-
centage de SPS qui a ete lie a la protein au moyen des
formules representees en relation au tableau 6 2.
Cet exemple demontre que le SPS est lie intime-
ment a la protein de telle sorte que le rapport protein/
matiere seche diminue pour une teneur croissante en SPS.
Le rapport protein/SPS present dans la farine de soja correspond a une
teneur en SPS comparable a environ 0,4 g
dans 10 g d'water, ajoute a 5 g d'isolat de protein.
Le pourcentage de liaison du SPS est une valeur calculee Le
pourcentage de liaison du SPS diminue a cause de la saturation de la
protein en SPS aux faiblesrapports proteins/SPS. Tableau 6 1: Mesures
suivant l'exemple 6 Rapport Produit de Precipite seche protein/
centrifugation I
SPS 62
% N %M 4 S % N % N x 6,25%MS % MS
0 0,068 20,62 13,2 82,5 93,1 88,6
0,045 0,49 13,4 83,8 97,3 86,1
12,5 0,038 0,45 13,0 81,3 97,9 83,0
6,25 0,031 0,45 12,6 78,8 98,1 80,3
3,125 0,026 0,61 11,8 73,8 97,9 75,3
: 2518570
Tableau 6 2: Recuperation de protein liaison du SPS et pourcentage de
Rapport Pourcentage de recupe % de liaison du SPS )2) protein/
peration de protein I) SPS
91,5 O
94,4 77
12,5 95,3 90
6,25 96, 1 70
3,125 96,8 60
Pourcentage de recuperation de protein = -l 1 NC 1 x 6,25 lx 100, o NC
1 = pourcentage d'nitrogen dans le produit de centrift gation I. 2)
pourcentage de liaison du SPS =
(% P/H) (% P/H)
x (% reurration protine) 5 x(% recuperation protine 100 1- l 5/
rapport de SPS J o, (% P/H) est le rapport protein/matiere seche dans
le precipite seche, et
(% P/H) se rapporte au precipite sans addition de SPS.
Exemple 7 (exemple d'application) Cet exemple decrit la preparation
d'une p v p.
en utilisant la preparation de SPS-ase KRF 92 B-I compor-
tant 5 % de matiere seche Le procede de preparation est le meme que
celui de l'exemple 3 C, sauf que toutes les masses sont divisees par
un facteur 5 La p v p a ete analysee comme decrit a l'exemple 2 Les
resultats obtenus
dans l'essai apparaissent dans le tableau 7 1.
Tableau 7 1: Resultats obtenus a l'exemple 7 a Analyse par Bi
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