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[5][_]
Physical
(41/ 65)
[6][_]
20 % de
(6)
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3 N
(5)
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600 g
(4)
[9][_]
10 % de
(4)
[10][_]
50 %
(3)
[11][_]
5 % de
(3)
[12][_]
1 min
(2)
[13][_]
10 -4 M
(2)
[14][_]
10 M
(2)
[15][_]
5 min
(2)
[16][_]
2 s
(2)
[17][_]
20 pg/ml
(1)
[18][_]
83 %
(1)
[19][_]
de 55 %
(1)
[20][_]
28 %
(1)
[21][_]
de 3 %
(1)
[22][_]
67 %
(1)
[23][_]
88 %
(1)
[24][_]
de 39 %
(1)
[25][_]
61 %
(1)
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50 ml
(1)
[27][_]
1 ml
(1)
[28][_]
10 ml
(1)
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2 min
(1)
[30][_]
55 ml
(1)
[31][_]
1 %
(1)
[32][_]
0,5 % de
(1)
[33][_]
1 m
(1)
[34][_]
de 0,1 ml
(1)
[35][_]
103 M
(1)
[36][_]
de 0,5 ml
(1)
[37][_]
de 0,5 pg/ml
(1)
[38][_]
0,5 ml
(1)
[39][_]
30 min
(1)
[40][_]
-60 ml
(1)
[41][_]
50 % de
(1)
[42][_]
de 2 ml
(1)
[43][_]
101 h
(1)
[44][_]
2 N
(1)
[45][_]
1,5 mg/ml
(1)
[46][_]
de 60 mg/ml
(1)
[47][_]
Disease
(11/ 47)
[48][_]
SPAZ
(23)
[49][_]
Grippe
(10)
[50][_]
Tic
(3)
[51][_]
Cytomegalo
(2)
[52][_]
Varicella
(2)
[53][_]
Zoster
(2)
[54][_]
Ascitic
(1)
[55][_]
Cancer
(1)
[56][_]
Herpes Simplex
(1)
[57][_]
Hepatite
(1)
[58][_]
Rubella
(1)
[59][_]
Gene Or Protein
(14/ 41)
[60][_]
Etre
(14)
[61][_]
SP-2
(13)
[62][_]
Est-a
(3)
[63][_]
DANS
(1)
[64][_]
Evi
(1)
[65][_]
Ner
(1)
[66][_]
Phosphoribosyltransferase
(1)
[67][_]
Seu
(1)
[68][_]
Tif
(1)
[69][_]
Neuraminidase
(1)
[70][_]
Apte
(1)
[71][_]
Nucleoprotein
(1)
[72][_]
Lcor
(1)
[73][_]
Protein A
(1)
[74][_]
Molecule
(16/ 36)
[75][_]
8-azaguanine
(8)
[76][_]
hypoxanthine
(5)
[77][_]
aminopterin
(4)
[78][_]
thymidine
(4)
[79][_]
cyclosporine A
(3)
[80][_]
Isopaque
(2)
[81][_]
DES
(1)
[82][_]
p 1439
(1)
[83][_]
acetylcholine
(1)
[84][_]
suspen
(1)
[85][_]
pyruvate
(1)
[86][_]
oxal
(1)
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bicarbonate
(1)
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1,2-phenylenedihydrochloride
(1)
[89][_]
nitrogen
(1)
[90][_]
sucrose
(1)
[91][_]
Organism
(5/ 25)
[92][_]
virus
(19)
[93][_]
rats
(3)
[94][_]
thera
(1)
[95][_]
mycoplasma
(1)
[96][_]
Human
(1)
[97][_]
Polymer
(7/ 10)
[98][_]
Ficoll
(2)
[99][_]
PEG 4000
(2)
[100][_]
Polyethyleneglycol
(2)
[101][_]
Polyethylene
(1)
[102][_]
PEG 1500
(1)
[103][_]
Heparin
(1)
[104][_]
PEG 6000
(1)
[105][_]
Generic
(5/ 5)
[106][_]
glycol
(1)
[107][_]
tricyclics
(1)
[108][_]
barbiturates
(1)
[109][_]
acid
(1)
[110][_]
diamine
(1)
[111][_]
Chemical Role
(3/ 3)
[112][_]
poisons
(1)
[113][_]
antidotes
(1)
[114][_]
Hormones
(1)
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Publication
_________________________________________________________________
Number FR2522679A1
Family ID 29245133
Probable Assignee Novartis Ag
Publication Year 1983
Title
_________________________________________________________________
FR Title PROCEDE POUR LA PRODUCTION D'ANTICORPS MONOCLONAUX HUMAINS
Abstract
_________________________________________________________________
L'INVENTION CONCERNE UNE LIGNEE DE CELLULES D'HYBRIDOME CONSISTANT EN
UNE CELLULE D'IMMORTALISATION FUSIONNEE AVEC UNE CELLULE PRODUISANT
UNE SUBSTANCE PREDETERMINEE, SA FABRICATION ET SON APPLICATION.
LA LIGNEE SELON L'INVENTION EST CARACTERISEE EN CE QUE LA CELLULE
D'IMMORTALISATION EST UNE CELLULE D'HYBRIDOME XENOGENETIQUE ET EN CE
QUE LA CELLULE PRODUISANT LA SUBSTANCE EST GENETIQUEMENT COMPATIBLE
AVEC LE PARTENAIRE NON TRANSFORME DANS L'HYBRIDOME XENOGENETIQUE.
APPLICATIONS: PRODUCTION EN MASSE DE SUBSTANCES PREDETERMINEES, PAR
EXEMPLE DES ANTICORPS MONOCLONAUX HUMAINS.
Description
_________________________________________________________________
La presente invention concerne des lignees d'hybri-
domes et leur procede de production, ainsi que leur utilisation pour
la production de substances particulieres, par exemple des anticorps.
Le terme"hybridome" s'applique a des cellules formees
par fusion d'une cellule non transformee "immortalisante"(en parti-
culier,une cellule de myelome) avec une cellule "normale" ordinai-
rement choisie pour son aptitude a produire une substance particu-
liere (par exempleun lymphocyte pour produire des anticorps) pour for-
mer un hybride Ces hybrides peuvent etre selectionnes et clones pour
obtenir des lignees de cellules produisant des substances ayant une
structure et/ou une propriete uniques En particulier, ces hybri-
domes formes avec des lymphocytes peuvent etre utilises pour pro-
duire des anticorps monoclonaux.
Le developpement de la technologie des hybridones ces dernieres annees
a ete dirige vers l'obtention de lignees de
cellules qui sont a la fois stables et produisent avec un rende-
ment eleve et de maniere specifique une substance particuliere que
l'on desire obtenir Il y a eu diverses approches de ce probleme
qui, en raison de leur origine historique, ont ete largement con-
centrees dans le domaine des immunoglobulines/anticorps.
Une etude d'activites prealables dans ce domaine donne une vue
d'ensemble des types de problemes rencontres et des
diverses solutions tentees jusqu'a present.
L'impulsion initiale pour la recherche dans les lignees de cellules
hybrides fabriquant des produits monoclonaux est venue du domaine de
l'immunobiologie, les produits etant des
anticorps monoclonaux.
Les antiserums classiques contiennent ordinairement un tres grand
nombre d'anticorps qui different structurellement par le site de
fixation de l'antigene, mais se fixent chacun sur le meme antigene
avec un plus ou moins grand degre d'avidite et/ou de
specificite En outre, les antiserume classiques contiennent egale-
ment un grand nombre d'anticorps diriges contre d'autres antigenes et
reflechissant les reactions de defense prealables de l'individu
recepteur a partir duquel on a obtenu l'antiserum Bien que ces anti-
serums "larges" soient suffisants pour la plupart des applications, on
a estime qu'une plus grande specificite et une reproductibilite
accrue marqueraient un progres notable et fourniraient un instru-
ment scientifique au potentiel considerable, en particulier dans le
domaine du diagnostic et de la therapie.
La premiere solution maintenant classique a ete celle decrite par
Kdhler et Milstein lNature, 256, pager 495-497 ( 1975)l, qui ont
reussi a fusionner des cellules de rate de souris preimmunisees avec
des cellules de myelome de souris sensibles
au "medicament" On a pu faire pousser in vitro les cellules fusion-
nees ainsi immortalisees et les cloner a partir du stade de la cel-
lule unique pour produire une population de cellules homogene pro-
duisant une population d'anticorps homogene (anticorps monoclonaux).
Par selection entre les nombreuses cellules uniques et reclonage
selectif, il a ete possible d'obtenir et de faire pousser des cel-
lules qui produisent des anticorps ayant la specificite desiree vis-
a-vis de l'antigene.
Les anticorps de souris produits de cette maniere se sont reveles
utiles pour des applications en recherche et en
diagnostic et certains d'entre eux ont meme ete utilises en thera-
peutique chez l'homme On realiserait cependant un progres conside-
rable dans la therapie humaine par l'immunoglobuline si l'on pou-
vait obtenir de cette maniere des anticorps humains de specificite et
de reproductibilite semblables Ceci reduirait egalement le
risque de sensibilisation Plusieurs approches du probleme de pro-
duction de ces anticorps humains in vitro ont ete tentees,mais
ont jusqu'a present largement echoue.
Elles comprennent: (i) La transformation de lymphocytes humains
normaux par le virus d'Epstein-Barr (EBV) Cette methode a rencontre
peu de succes, car les cellules de ce type necessitent un procede long
et fastidieux pour leur etablissement et sont extremement
difficiles a cloner et a selectionner.
(ii) La fusion de lymphocytes (humains) normaux avec des cellules
de myelome humain Cette methode represente une analogie evi-
dente avec l'approche souris-hybridome de souris, mais ren-
contre le probleme quedans le systeme humain, on n'a dispose que d'une
lignee de cellulesde myelome et on a trouve que celle-ci etait
contaminee par du mycoplasma qui empeche la
reussite des fusions.
(iii) La fusion de lymphocytes humains normaux avec une lignee de de
cellules de lymphoblastolde B humain transforme par EBV. Bien que
cette methode soit probablement la plus fiable et la plus
reproductible decrite jusqu'a present, elle presente l'inconvenient de
base in vitro rencontre avec les cellules de lymphoblastoide: elles
sont extremement difficiles a cloner et, comme elles representent un
stade anterieur dans la.ligne de differenciation de cellules B, leur
capacite a produire et secreter des anticorps est environ dix fois
plus
faible que celle des myelomes vrais.
(iv) La fusion de lymphocytes humains avec des cellules de myelome de
souris Cette methode produit des cellules ayant les memes excellentes
caracteristiques in vitro que les hybridomes souris-souris, mais avec
le gros inconvenient que ces hybrides
ont une instabilite genetique intrinseque Un resultat parti-
culierement genant de ceci est qu'elles expulsent le chromo-
some humain sur lequel est situe le genome pour la formation
de la chaine kappa legere de l'immunoglobuline.
En resume, le procede (i) est donc trop fastidieux et inefficace pour
pouvoir etre mis en oeuvre; le procede (ii) n'a pas encore un
importance pratique; le procede (iii) est le meilleur de ceux
actuellement disponibles; et le procede (iv), bien qu'il soit viable,
ne peut pas mainten Ir la productivite, meme avec des procedes
extremement fastidieux de clonage.
Bien que la discussion ci-dessus et la plupart des
travaux effectues jusqu'a present dient ete concentres sur la pro-
duction d'anticorps, il est clair que la cellule "productrice" peut
etre selectionnee pour la secretion d'une substance particuliere que
l'on desire obtenir et fusionnee avec la lignee de cellules
conferant l'immortalite ou "immortalisantes".
La demanderesse a decouvert selon l'invention qu'en utilisant une
cellule d'hybridome xenogenetique comme-parent pour
la fusion ulterieure avec une autre cellule, il est possible d'obte-
nir un hybridome ayant une stabilite fortement amelioree.
L'invention a donc pour objet une lignee de cellules
d'hybridome comprenant une cellule conferant l'immortalite fusion-
nee avec une cellule produisant une substance predeterminee, carac-
terisee en ce que la cellule conferant l'immortalite est une cellule
d'hybridome xenogenetique et en ce que la cellule produc-
trice de la substance est genetiquement compatible avec le parte-
naire non transforme dans l'hybridome xenogenetique.
La stabilite de ces cellules reside dans leur apti-
tude, si elles sont correctement cultivees, a maintenir la produc-
tion d'une substance predeterminee telle qu'un anticorps.
Selon un aspect particulier de l'invention, l'hybri-
dome xenogenetique choisi comme cellule conferant l'immortalite
est un hybride de myelome qui a perdu son aptitude propre a pro-
duire l'immunoglobuline Un exemple de cette cellule d'hybridome
xenogenetique serait celle obtenue par fusion entre une cellule de
myelome et un lymphocyte Des exemples de cellules de myelomes
appropriees sont celles obtenues sur des-souris et des rats et de
preference ne produisent pas d'immunoglobuline Ces myelomes peuvent
etre eux-memes des hybrides (par exemplemyelome de souris/
lymphocyte de souris) qui sont en effet des myelomes Cette cel-
lule estpar exemple, la lignee de cellules de myelome SP-2 de souris
On la fusionne ensuite, par exemple, avec un lymphocyte
obtenu sur une autre espece, par exemple un lymphocyte humain.
Selon un mode de mise en oeuvre prefere, les hybri-
domes xenogenetiques resultant de ces fusions, qui ne produisent plus
d'immunoglobuline, sont choisis pour la fusion ulterieure avec
des cellules productrices de la substance.
Ces hybridomes xenogenetiques presentent un environ-
nement plus benin pour la stabilite ulterieure en ce qui concerne la
perte des chromosomes.
Les hybridomes xenogenetiques utilises pour l'immor-
talisation sont rendus resistants aux medicaments de maniere clas-
sique avant la fusion Une methode particuliere est la selection
pour la resistance a la 8-azaguanine.
Les hybridomes ainsi obtenus constituent des parents stables pour la
nouvelle fusion L'autre partenaire de fusion est
selectionne pour son aptitude a produire une substance predeterminee -
par exemple un lymphocyte pour produire un anticorps et il est
genetiquement compatible avec le partenaire non transforme dans
l'hybridome xenogenetique.
Pour obtenir le degre necessaire de specificite, il est souhaitable de
presensibiliser la cellule choisie pour produire la substance desiree
Ceci peut s'obtenir,par exemple dans le cas
des anticorps, par immunisation d'un hote (recepteur) avec un anti-
gene particulier et obtention ulterieure d'immunocytes (c'est-a-
dire des cellules qui sont immunologiquement competentes) qui
produisent les anticorps correspondants.
Ces cellules peuvent etre,par exemple, des cellules
de rate, de ganglion lymphatique ou des globules sanguins.
La fusion de la cellule mere d'hybridome xenogene-
tic avec la cellule productrice de la substance a lieu de maniere
classique Elle s'effectue ordinairement par incubation de quan-
tites comparables de chaque cellule dans un milieu convenable avec
une substance qui favorise la fusion (par exemple polyethylene-
glycol de poids moleculaire 1500, ou PEG 1500glycol) La selection des
hybrides desires est'a nouveau classique et peut etre effectuee dans
des milieux selectifs (par exemple,hypoxanthine/aminopterin/ thymidine
ou HAT si la cellule immortalisante ne contient pas
d'hypoxanthinephosphoribosyltransferase). Les lignees de cellules
resultantes sont stables
et produisent l'anticorps avec des rendements eleves.
Elles peuvent egalement etre clonees et reselectionnees
si necessaire ou si on le desire.
Llinvention concerne donc egalement un procede de production d'une
lignee stable de cellules d'hybridome, qui consiste a rendre
resistante aux medicaments une cellule mere d'hybridome xenogenetique
par fusion de celle-ci avec une cellule productrice de la substance
qui est genetiquement compatible avec le partenaire non transforme
dans l'hybridome xenogenetique et a selectionner un
hybride desire.
La production d'anticorps au moyen de ces cellules peut etre effectuee
selon des lignees classiques soit in vitro dans des milieux
convenables (contenant par exemple du serum de foetus de veau dilue),
soit in vivo par injection chez un hote (par exemple
souris ou rat athymiques) et recolte du liquide ascitic.
Selon la methode utilisee, une ou plusieurs etapes de purification
peuvent etre necessaires.
L'invention concerne egalement la production d'anti-
corps utilisant ces lignees de cellules. Bien qu'il soit clair que
l'on prefere, pour des raisons economiques, les lignees de cellules
d'hybridomes simples
ayant les proprietes desirees, il est egalement possible de fusion-
ner encore ces lignees de cellules,si on le desire ou si cela est
necessaire.
Un hybridome producteur d'anticorps caracteristique selon l'invention
serait un hybridome forme a partir d'un myelome de souris fusionne
avec un lymphocyte humain comme cellule mere et ensuite avec un
lymphocyte humain presensibilise comme producteur d'anticorps
N'importe lesquelles des cellules de myelome peuvent, si cela
convient, etre elles-memes des hybrides (par exemple dans
la lignee souris SP-2 qui est elle-meme un hybride souris/souris).
Des exemples de references bibliographiques decrivant des techniques
classiques et des travaux recents sont les suivantes 1 I Chler, G et
Milstein, C Nature, 5 p 495-497 ( 1975) 2 Nadler, L M et coll, Cancer
Research, 40, p 3147-3154 ( 1980) 3 Cosimi, A B et coll,N Engl J Med,
305, p 308-314 ( 1981) 4 Zurawski, V R etcoll, Science, 199, p
1439-1441 ( 1978) Koskimies, S, Scand J Immunol, 11, p 73-77 ( 1980) 6
Steinitz, M et coll, Nature, 287, p 443-445 ( 1980) 7 Olsson, L et
Kaplan, H S, Proc Natl Acad Sci U S A, 77, p 5429-5431 ( 1980) 8
Croce, C M et coll, Nature, 288, p 488-489 ( 1980) 9 Nowinski, R et
coll, Science, 210, p 537-539 ( 1980) 10 Croce, C M et coll, Proc Natl
Acad Sci U S A, 76, p 3416-3419 ( 1979) 11 Galfre, G et coll, Nature
266, p 550, 1977 12 Miller, R A et coll, N Engi J Med 306, p 517, 1982
13 Sikora K, et coll, Lancet, ill, 1982 et, par exemple, le brevet des
E U A 4 172 124 et les demandes de brevets europeens publiees n 0043
718 et 0044 722,
et le livre recemment publie par McIntyre sur les anticorps mono-
clonaux. La presente invention, en utilisant une cellule mere de
fusion xenogenetique (qui a perdu sa capacite de produire des
substances predeterminees) permet d'obtenir des hybridomes qui sont
stables, poussent rapidement, sont facilement clonables et ont une
vitesse elevee de production de la substance desiree, par exemple
des anticorps humains.
Les anticorps humains produits selon l'invention peuvent etre utilises
de maniere classique pour ces anticorps Des exemples de ces domaines
d'application sont les suivants: Maladies infectieuses: virus
(cytomegalo, varicella zoster, herpes simplex, hepatite A et B,
rubella, etc) Bacteries (antitoxines,
anti-paroi cellulaire) Champignons (Candida).
Maladies malignes: anticorps contre toutes sortes de tumeurs
malignesavec et sans conjugaison avec des toxines.
Intoxication: anticorps anti-poisons (antidotes, digitale, opiacees,
anti-depresseurs tricyclics, barbiturates, etc).
Anti-idiotypes: anti-anticellule pancreatique P, anti-antirecepteur
d'acetylcholine, anti-facteur rhumatoide.
Antigenes de groupes sanguins: anti Rh.
Transplantation: anti-cellule T pour mattriser les rejets, anti-
corps facilitant la greffe pour reduire la capacite de stimulation
de la greffe.
Allergie: anticorps Ig G contre les allergenes, alternative a
l'hyposensibilisation.
Hormones: anticorps de gonadotropine chorionique pour l'utilisa-
tion comme contraceptif.
Les cellules d'hybridomes elles-memes peuvent egalement etre utili-
sees comme source d'AR Nm si l'on recherche le clonage des genes
d'immunoglobuline.
Selon un mode de mise en oeuvre particulier de l'inven-
tion, on utilise la lignee de cellules SP-2 qui a perdu sa capacite
a produire des anticorps, qui est elle-meme initialement un hybri-
dome entre la lignee P 3-X 63-Ag 8 et les cellules de rate de souris
qui produisent des anticorps contre les hematies de mouton (C F M.
Shulmann et coll, Nature 276, p 269, 1978).
On l'obtient, par exemple, au NIGMS Human Genetic Mutant Cell
Repository, Ref GM 35669 A (voir US DHHS 1982 Catalog of Cell Lines).
Cette lignee de cellules est rendue resistante aux medicaments et
ensuite fusionnee par des techniques classiques avec des lymphocytes
de sang peripherique humain normal lC F G Galfre et coll Nature 266, p
550 ( 1977) et R Nowinski et coll, Science
210, p 537 ( 1980)l.
On obtient un grand nombre d'hybrides et, apres envi-
ron 5 semaines, on selectionne 5 clones qui presentent une crois-
sance rapide et pas de production d'anticorps Ces cellules sont
selectionnees pour la resistance a la 8-azaguanine et il est pos-
sible avec trois de ces lignees d'obtenir des mutants qui sont
resistants a 20 pg/ml de 8-azaguanine Ces cellules sont en meme temps
sensibles au milieu HAT (hypoxanthine/aminopterin/thymidine), ce qui
montre qu'elles ont perdu leur capacite de produire de
l 'hypoxanthine-phosphoribosyltransferase.
On fusionne ensuite in vitro l'une de ces lignees (SPAZ 4) avec des
lymphocytes amygdaliens humains en utilisant 108
cellules amygdaliennes avec 2 107 cellules SPAZ 4 La fusion est effec-
tuee selon des techniques classiques A titre comparatif, on fusionne
egalement la lignee de cellules SP-2 Les populations de cellules
resultantes sont selectionnees dans le milieu HAT pour recuperer les
hybrides necessaires Des qua toutes les cellules ont ete tuees dans
les cultures de controle non fusionn 4 es, le milieu HAT
est remplace par un milieu de croissance non selectif normal.
Apres deux se maines de croissance, on effectue le test initial de
recherche de la production d'anticorps et on trouve
que les 47 cultures de chacune des fusions produisent toutes l'anti-
corps humain Par un nouvel essai apres encore quatre semaines, on
decouvre cependant que 83 % des hybridomes SPAZ-4 produisent encore
l'anticorps au lieu de 55 % des hybridomes SP/2 On trouve un taux
eleve de production chez 28 % des lignees SPAZ-4 au lieu de 3 % seu-
lement des lignees SP/2.
Compte tenu du fait qu'un facteur preponderant dans la perte de
production d'anticorps est la perte du genome de chaine
L, on effectue un essai specifique de la production de chaine legere.
On trouve que 67 % des lignees SPAZ-4 produisent des chaines kappa et
88 % des chaines lambda Les valeurs correspondantes pour les lignees
SP/2 sont de 39 % et 61 % respectivement (ces pourcentages sont
evidem-
ment comparables pour l'experience particuliere et l'immunoglobu-
line Ig utilisee) Les resultats obtenus sont rassembles dans le
tableau I ci-apres On notera que l'hybridome SPAZ-4 est dans tous les
cas superieur au SP/2, specialement en ce qui concerne les valeurs
pour la production'"forte", qui sont les plus importantes du point de
vue pratique Toutes ces experiences sont effectuees avec des cellules
non clonees afin de maximiser la pression contre les clones stables
(les clones stables portent davantage de materiau genetique et
poussent toujours moins bien que les cellules qui ont
reussi a expulser leurs chromosomes "inutiles").
On a cependant effectue des experiences pour cloner les cellules Les
resultats obtenus jusqu'a present indiquent que l'on n'a pas obtenu un
hybride SP/2 unique stable et producteur (c'est-a-dire pas de lignee
dans laquelle les cellules produisent l'anticorps) Dans les hybrides
SPAZ-4, par contre, il est possible
de deriver ces clones.
La presente invention permet d'obtenir des resultats sensiblement
meilleurs que les procedes connus jusqu'a present en resultant le
probleme de l'instabilite, dans lesquels il vaut la peine de
mentionner que meme les hybridomes souris-souris"elassiques" sont
instables et un sous-clonage est toujours necessaire, ilssont
cependant possibles a mettre en oeuvre Le degre d'instabilite
apparaissant avec les hybridomes SPAZ-4 est plus faible que pour les
hybridomes souris-souris et il est donc meme plus facile de les
mettre en oeuvre.
Les exemples suivants illustrent l'invention sans
toutefois en limiter la portee.
EXEMPLE 1
Production de la lignee SPAZ-4.
On isole des lymphocytes de sang peripherique (PBL)
du sang heparinise d'un donneur sain par centrifugation sur "Ficoll-
Isopaque" Apres lavage, on melange 108 PBL avec 5 107 cellules SP/2
dans 50 ml de milieu "Dulbeccos 1121 " ajuste a p H 8,0 On agglutine
les cellules ensemble a 600 g pendant 5 mirn, apres quoi on separe
avec soin le liquide surnageant En maintenant les cellules a 37 C, on
ajoute lentement, en 1 min, 1 ml de PEG 4000 A 50 % dans le "H 21 ".
On ajoute encore 10 ml de H 21 pendant 2 min On recueille les cel-
lules par centrifugation (agglomeration) et on les remet en suspen-
sion dans 55 ml de milieu HAT (milieu HAT: "Dulbeccos H 21 " avec 20 %
de serum de foetus de veau (FCS), 10 % de "NCTC 109 ", 1 %
d'aminoacides
non essentiels, 0,5 % de pyruvate, 0,2 U/ml d'insuline, acidoxal-
acetique 1 m M, hypoxanthine 10 -4 M, aminopterin 4 10 M et thymi-
dine 1,6 10 M) et on ensemence dans 528 cultures de 0,1 ml dans des
microplaques de culture de tissusa fond plat On donne aux cultures du
milieu HAT frais tous les 3-5 jours pendant 2 semaines, apres quoi on
remplace le milieu par un milieu HT ("Dulbeccos H 21 "
avec 10 % de FCS, hypoxanthine 10-4 M et thymidine 1,6 103 M).
Apres le 15 e jour, on preleve des echantillons pour la recherche de
l'anticorps humain On selectionne cinq cultures presentant une bonne
croissance et une production d'anticorps nulle Celles-ci
sont ensuite selectionnees pour la production de sous-lignees resis-
tantes a la 8-azaguanine.
Les cinq lignees de cellules sont ensemencees a 2.105 cellules/ml dans
le "Dulbeccos H 21 " avec 10 % de FCS et g/ml de 8-azaguanine A partir
de trois de ces cultures, il est
possible, apres deux semaines de recuperer des cellules en crois-
sance viables L'une de celles-ci est la SPAZ-4 qui est sensible
au HAT et qui est utilisee pour de nouveaux essais.
EXEMPLE 2
Fusion avec des lymphocytes amygdaliens.
On debarrasse des amygdales d'un enfant du tissu conjonctif et on les
fait passer a travers un tamis metallique a mailles finei pour donner
une preparation de cellules uniques Afin reduire le nombre d'hematies,
on fractionne toutes les cellules sur "Ficoll-Isopaque" Sur la
population de cellules resultante, on fusionne 108 cellules avec 27
cellules, soit SPAZ4, soit SP/2, par
un mode operatoire identique a celui decrit a l'exemple 1 Les cel-
lules sont ulterieurement ensemencees dans 47 cultures de 0,5 ml dans
un milieu HAT qui contient cette fois un supplement de 0,5 pg/ml de
cyclosporine A Apres 1 jour, on ajoute 0,5 ml de milieu HAT sans
cyclosporine A Au troisieme jour, deja, on remplace 50 % du milieu par
du milieu HT Ensuite, les cellules sont maintenues
dans le milieu HT avec des passages tous les 3-5 jours.
Essai de production d'immunoglobuline.
On utilise un systeme classique de dosage enzymo-
immunologique ("ELISA") On fixe de l'anti-immunoglobuline humaine de
lapin sur des plaques "Nunc EIA" a une dilution de 1:400 dans un
tampon au bicarbonate a p H 9,6 Apres lavage des plaques, on fait
incuber le liquide surnageant des cultures pendant 30 min a 37 "C.
Apres encore un lavage, on traite les milieux incubes par un reac-
tif Ig G, Ig M, Ig A anti-humaine de lapin conjugue a la peroxydase
(Societe Miles-Yeda) a la dilution 1:400 Apres lavage la reaction
enzymatique est effectuee avec le 1,2-phenylenedihydrochloride-
diamine et H 202.
L'essai de production de chaine legere est effectue exactement de la
meme maniere, sauf que l'on utilise le reactif lambda-anti-humain de
chevre ou le reactif kappa-anti-humain de
chevre (Tago) a la dilution 1:3000 au lieu d'Ig G, Ig M, Ig A anti-
humaine de lapin.
Les resultats sont evalues sur un photometre "Titertek Multiscan" pour
ELISA et les valeurs " 4 " et " 7 " dans le tableau 1
concernent les lectures basse et hauterespectivement,sur ce photo-
metre.
EXEMPLE 3
Production d'anticorps monoclonaux contre l'inluenza (grippe) type A
et
type B (apres immunisation in vivo).
Le vaccin contre la grippe utilise est le "SANDOVAC" contenant de
l'hemaglutinine et de la neuraminidase de A/Bangkok, A/Bresil et
B/Singapour Trois volontaires sains sont immunises et saignees les 3
e, 7 e, 10 e, 14 e et 17 e jours On preleve chaque fois -60 ml de sang
de la veine cubitale dans des seringues contenant de l'heparin Les
lymphocytes sont isolees par centrifugation sur "Ficoli-Paque" (de la
Societe Pharmacia) et laves deux fois au
serum physiologique avec l'emploi.
Les parents de fusion sont a) SPAZ-4 (cf exemple 1) b) SP/2 (voir
cidessus) c) cellule de lymphoblastoide humain GM 1500 rendue
resistante a la 8-azaguanine au WISTAR INSTITUTE (produit de l'Ig G 2
kappa
humaine).
Les cellules SPAZ-4 et SP-2 sont fusionnees de maniere identique On
melange le myelome ( 107 cellules) et les lymphocytes humains (environ
3 10 cellules) dans un tube a essais en presence de milieu DMEM exempt
de serum a p H 8,0 On centrifuge les cellules ensemble a 600 g pendant
5 min On traite le bouton resultant avec du PEG 4000 A 50 % pendant 1
min, apres quoi on dilue lentement le PEG par le milieu Aprees un
lavage,on ensemence les cellules dans 176 cultures de l OO/pl dans le
milieu DMEM- HAT
contenant 20 % de serum de foetus de veau Les cellules sont culti-
vees a 370 C en atmosphere humide a 10 % de C 02, On melange les
cellules GM 1500 ( 107 cellules) avec les lymphocytes humains (environ
3 107 cellules) dans le milieu DMEM exempt de serum a p H 8,0 et on
centrifuge a 600 g pendant min On traite le bouton avec 50 % de PEG
6000 pendant 5 min en centrifugeant les cellules a 600 g Apres cette
duree, le PEG est dilue lentement par le milieu Apres un lavage, les
cellules sont ensemencees dans 176 cultures de 100 p 1 dans le milieu
RPMI 1640-HAT
contenant 20 % de serum de foetus de veau Les cellules sont culti-
vees a 37 C dans une atmosphere humide a 5 % de C 02.
On effectue un total de 35 fusions ( 15 fusions GM 1500; 14 fusions
sur SPAZ-4 et 6 fusions sur SP-2) comportant 6160 cultures ( 2640 avec
GM 1500; 2464 avec SPAZ-4; et 1056 avec
SP-2).
On change les milieux dans les cultures lorsque la proliferation
uniforme des cellules le lend necessaire, en general tous les trois a
cinq jours On recherche la presence d'anticorps anti-grippe dans les
liquides surnageants par la methode ELISA les antigenes de la grippe
correspondants sont fixes dans des puits de microplaques (Nunc), on
ajoute le liquide surnageant et on le laisse reagir avec l'antigene
Apres lavage, on ajoute dans les puits un conjugue d'Ig G, Ig A, Ig M
anti- humaine de lapin avec la peroxydase (Miles) Apres incubation, on
elimine par lavage le conjugue de peroxydase non fixe et on ajoute
dans les puits un substrat colore de l'enzyme La reaction est estimee
visuellement et evaluee avec un photometre a microplaques Titertek Les
cultures presentant des
resultats positifs sont clouees dans les conditions limites de dilu-
tion dans 88 nouveaux puits par ensemencement des cellules a une
cellule par culture dans 100 jil de DMEM + 20 % de serum de foetus de
veau avec des cellules "feeder" de thymocyte de souris (cellules
derivees de SPAZ-4 et SP-2) ou dans le RPMI 1640 + 20 % de serum de
foetus de veau sur des cellules "feeder" MRC-5 (cellules derivees de
GM 1500) On fait pousser les cellules productrices a grande echelle et
on les congele dans l'nitrogen liquide, On clone un total de 86
cultures ( 58 cultures a partir GM 1500; 26 a partir de SPAZ-4; 2 a
partir de SP-2) On applique des criteres tout afait larges pour
decider si une cellule doit etre clonee ou non, ce qui tient au faible
rendement en cellules vraiment positives apres clonage Ceci a ete fait
parce que lei GM 1500, par exemple, ne donnent pas de cellules a
production elevee A partir des cellules SPAZ-4, on identifie quatre
clones positifs, a partir des SP-2 un qui, cependant, n'est pas un
hybride mais plutot une cellule transformee par virus EB apparaissant
spontanement Il n'y a pas de
cellule productrice derivee des GM 1500.
Les resultats de la fusion sont rassembles dans le
tableau ci-dessous.
Jour GM 1500 SPAZ-4 SP-2 Cultures Cultures Cultures Cultures Cultures
Cultures fusion positives fusion positives fusion positives nees nees
___ _ nees
3 528 O 528 O 176 O
*7 528 O 352 2 176 O
528 O 528 1 176 O
14 528 O 528 O 354 1 *
17 528 O 528 1 176 O
Somme 2640 O 2464 4 1056 1
Cellule EBV spontanee.
Les cinq lignees de cellules positives-sont reclonees plusieurs fois
et on les fait pousser a grande echelle Ceci conduit a la mort de la
lignee EBV (il est bien connu que ces colonies de
cellules ne survivent pas a un clonage a faible densite).
Les quatre lignees de cellules d'hybridome SPAZ-4
positives sont identifiees comme C 15, C 28, C 29 et C 75.
EXEMPLE 4
Production d'hybridome anti-grippe (apres immunisation in vitro).
On ensemence des cellules de rate humaine a 106 cellules/ml dans des
portions aliquotes de 2 ml dans des tubes "Falcon 2051 "; on utilise
un total de 34 10 cellules On ajoute une quantite optimale de virus
A/Bangkok purifie par gradient de sucrose et on maintient les cultures
dans le milieu "RPMI 1640 'i avec 5 % de plasma humain inactive par la
chaleur pendant 101 h a 370 C en atmosphere d'air a 5 % de C 2 O On
fusionne les
6 2
9.10 cellules recuperees avec un nombre semblable de cellules SPAZ-4
comme decrit a l'exemple 3 Les cellules sont ensemencees dans 176
cultures et on les fait pousser-dans le MEM de Dulbecco contenant 20 %
de serum de foetus de veau, du HAT et lpg/ml de cyclosporine A Apres 2
jours, le milieu HAT est progressivement
deplace par le milieu HT et change ensuite a intervalles de 4-5 jours.
On selectionne les cultures pour les anticorps anti-grippe les
lie et 19 e jours apres la fusion et l'on clone les cultures
positives.
On obtient un clone positif (identifie comme B 2) qui est apte
a la croissance a grande echelle et a l'utilisation pour la prepa-
ration in vitro de quantites "chimiques" d'anticorps pur.
EXEMPLE 5
Caracterisation d'anticorps monoclonaux anti-grippe humains. a)
Anticorps/C 15 L'anticorps appartient a la classe Ig G 1 et possede
une chaine legere kappa L'anticorps reagit avec tous les virus
essayes du type grippe A (Hl Nl, H 2 N 2, H 3 N 2), il est tres
probable-
ment dirige contre la nucleoprotein du virus L'anticorps n'a pas
d'activite neutralisante in vitro et pas d'effet protecteur in vivo.
b) Ant Lcor 2 s IC 28.
L'anticorps appartient a la classe Ig G 1 et possede une chaine legere
lambda L'anticorps reagit seulement sur le virus de grippe du type H 3
N 2, il est tres probablement dirige contre l'hemagglutinine du virus
L'anticorps a un fort effet neutralisant in vitro et une activite
protectrice considerable in vivo Il peut neutraliser tous les virus H
3 N 2 essayes, c'est-a-dire les virus
des annees 1968, 1969, 1973, 1974, 1975, 1977, 1979 et 1980.
Dans l'essai avec 1973 A/Port Chalmers sur des cellules MDCK, on
trouve qu'une preparation d'anticorps contenant
1,5 mg/ml d'anticorps pur a un titre de neutralisation de 12800.
Dans la meme experience, on trouve qu'une preparation d'immunoglo-
buline humaine classique (Sandoglobulin) a une concentration de 60
mg/ml a un titre de neutralisation de 50 Ceci signifie que l'anticorps
monoclonal C 98 a un niveau equivalent en protein a un pouvoir 10240
fois plus eleve que l'immunoglobuline normale Il convient de noter a
ce sujet que l'anticorps antigrippe est l'un des composants
predominants dans une preparation d'immunoglobuline normale, ce qui
signifie qu'avec les anticorps de mime pouvoir de neutralisation de C
28-mais diriges,par exemple, contre le virus cytomegalo ou le virus
varicella-zoster, o le niveau d'anticorps dans les preparations
d'immunoglobuline normale est assez faible,
le pouvoir relatif peut atteindre des valeurs beaucoup plus ele-
vees.
c) Anticorps/C_ 29.
L'anticorps appartient a la classe Ig G 1 et possede une chaine legere
lambda L'anticorps reagit avec le virus de grippe type B/Singapour, il
n'a pas ete essaye contre un autre virus de type B Il n'a pas
d'activite contre le virus de type A.
d) Anticor 2 s/CZ 5.
L'anticorps appartient a la classe Ig G 3 et possede une chaine legere
kappa L'anticorps reagit seulement sur les virus du type H 3 N 2, il
est tres probablement dirige contre l'hemagglutinine du virus Il n'a
pas d'activite neutralisante in vitro et pas d'effet
protecteur in vivo.
e) Anticorps/b 2.
L'anticorps appartient a la classe Ig G 1 et possede une chaine legere
kappa Il reagit seulement sur les virus du type H 3 N 2 et il est tres
probablement dirige contre l'hemagglutinine du virus L'anticorps n'a
pas d'effet neutralisant in vitro, on n'a
pas recherche la protection in vivo.
TABLEAU 1
Il est entendu que l'invention n'est pas limitee
aux modes de realisation preferes decrits ci-dessus a titre d'illus-
tration et que l'homme de l'art peut y apporter diverses modifica-
tions et divers changements sans toutefois s'ecarter du cadre et de
l'esprit de l'invention.
Cel Immunoglobuline % Kappa % Lambda % lule Jour 4 7 4 7
SPAZ-4 4 83 28
SP/2 4 55 3
SPAZ-4 5 67 25 88 46
SP/2 5 39 13 61 17
SPAZ-4 6 36 9
SP/2 6 25 2
Claims
_________________________________________________________________
R E V E N D I C A T I O N S1 Lignee de cellules d'hybridomes
consistant en une cellule d'immortalisation fusionnee avec une cellule
produisant une substance predeterminee, caracterisee en ce que la
cellule d'immortalisation est une cellule d'hybridome xenogenetique et
ence que la cellule produisant la substance est genetiquement
compa-tible avec le partenaire non transforme dans l'hybridome
xenogene-tic. 2 Lignee d'hybridome selon la revendication 1,
caracterisee en ce que la cellule produisant la substance est de la
meme espece que le partenaire non transforme dans la cellulemere
d'hybridome xenogenetique.3 Lignee d'hybridome selon la revendication
2, caracterisee en ce que la cellule produisant la substance et
lepartenaire non transforme dans la cellule mere d'hybridome
xeno-genetique sont d'origine humaine.4 Lignee d'hybridome selon l'une
quelconque desrevendications 1 a 3, caracterisee en ce que la
substance produiteest un anticorps.5 Lignee d'hybridome selon la
revendication 4,caracterisee en ce que la cellule produisant la
substance est pre-sensibilisee,soit in vitro, soit in vivopour
produire la substance predeterminee. 6 Lignee d'hybridome selon l'une
quelconque des revendication 1 a 5, caracterisee en ce que la cellule
produisantla substance est un lymphocyte.7 Lignee d'hybridome selon la
revendication 6,caracterisee en ce que le lymphocyte est d'origine
humaine.8 Lignee d'hybridome selon la revendication 6 ou 7,
caracterisee en ce que le lymphocyte a ete presensibilise,soit invivo,
soit in vitropour la production d'anticorps.9 Lignee d'hybridome selon
l'une quelconque desrevendications 1 a 8, caracterisee en ce que le
myelome dans lacellule d'hybridome xenogenetique est un myelome murin
qui ne pro-duit pas d'immunoglobuline.2522679.Lignee d'hybridome selon
la revendication 9,caracterisee en ce que le myelome murin est un
myelome de souris.11 Lignee d'hybridome selon la revendication LO,
caracterisee en ce que le myelome de souris est fourni par la lignee
SP-2. 12 Lignee d'hybridome selon l'une quelconque desrevendications 1
a 11, caracterisee en ce que la cellule mered'hybridome xenogenetique
a perdu son aptitude ou est autrementincapable de produire une
substance predeterminee.13 Lignee d'hybridome selon l'une quelconque
desrevendications 1 a 12, caracterisee en ce qu'elle comprend
unecellule d'hybridome xenogenetique formee par fusion d'une cellule
de myelome de souris avec un lymphocyte comme cellule mere et un
lymphocyte humain presensibilise producteur d'anticorps commecellule
produisant la substance.14 Procede pour produire une lignee
d'hybridome stable, caracterise en ce que l'on rend resistante aux
medicaments une cellule d'hybridome xenogenetique en la fusionnant
avec unecellule productrice d'une substance qui est genetiquement
compa-tible avec le partenaire non transforme dans l'hybridome
xenogene-tic et on selectionne un hybride desire.Procede selon la
revendication 14, caracterise en ce que les partenaires de fusion
utilises sont choisis parmiceux decrits dans l'une quelconque des
revendications 1 a 13.2 ' 16 Procede selon la revendication 14 ou 15,
carac-terise-en ce que la resistance aux medicaments est obtenue
parselection de cellules resistantes a la 8-azaguanine.17 Procede
selon l'une quelconque des revendica-tions 14 a 16, caracterise en ce
que la fusion a lieu en presenced'une substance activante qui facilite
celle-ci.18 Procede selon la revendication 17, caracteriseen ce que la
substance activante est un polyethyleneglycol.19 Procede selon l'une
quelconque des revendica-tions 14 a 18, caracterise en ce que la
selection d'un hybride desire s'effectue sur la base de l'absence de
sensibilite au milieuhypoxanthine-aminopterin-thymidine (HAT) et la
recherche de l'apti-tude a produire la substance predeterminee.Systeme
de fusion cellulaire, caracterise en ce qu'il consiste en une cellule
mere d'hybridome xenogenetique et une cellule productrice de la
substance dans un milieu nutritif, avec un agent qui facilite la
fusion desdites cellules, 21 Systeme de fusion cellulaire selon la
revendication 20, caracterise en ce que les partenaires cellulaires
sontceux decrits dans l'une quelconque des revendications 1 a 13.22
Systeme de fusion cellulaire selon la revendica-tion 20 ou 21,
caracterise en ce que l'agent qui facilite la fusionest un
polyethyleneglycol.23 Procede pour la production d'une substance
pre-determinee, caracterise en ce qu'il consiste a cultiver une
ligneede cellules d'hybridomes selon l'une quelconque des
revendications1 A 13, ou telle que produite selon l'une quelconque des
revendica-tions 14 a 19,dans un milieu de culture in vitro ou in vivo
pourladite culture et a isoler ensuite la substance dudit milieu.24
Procede selon la revendication 23, caracteriseen ce que la substance
obtenue est un anticorps.Procede selon la revendication 23 ou 24,
carac-terise en ce que la culture in vivo est effectuee sur une
sourisou un rat athymique.26 Substance predeterminee, caracterisee en
cequ'elle est produite selon l'une quelconque des revendications 23A
25. 27 Lignee de cellules d'hybridomes xenogenetiqueselon l'une
quelconque des revendications 9 a 13, pour l'utilisa-tion comme
partenaire dans la fusion cellulaire pour obtenir unelignee de
cellules d'hybridomes.28 Lignee de cellules d'hybridomes
souris/humain/humain.29 Lignee de cellules d'hybridomes stable souris/
humain/humain, caracterisee en ce qu'elle est capable de produiredes
anticorps humains d'une specificite predeterminee.Lignee de cellules
d'hybridomes selon la reven-dication 28 ou 29, caracterisee en ce que
la cellule de souris estelle-meme un hybridome souris/souris.31
Procede pour la fabrication de lignees cellu-laires qui produisent des
anticorps humains pandant une duree pro-longee, caracterise en ce
qu'il consiste a produire des hybridomessouris/humain resistants
aim"medicaments", qui ont perdu leur capa-cite de produire des
anticorps et a construire ainsi une cellule de myelome de souris
"humanifiee" qui presente un environnement plus favorable pour de
nouveaux chromosomes humains et une stabiliteplus elevee pour
entretenir la production d'anticorps.32 Procede selon la revendication
31, caracterise en ce que l'on fusionne de maniere classique une
lignee de cellules SP-2 avec des lymphocytes humains normaux, on
selectionne parmi les hybrides obtenus des clones presentant une
croissance rapide sansproduction d'anticorps, on selectionne encore
ceux-ci pour la resis-tance a la 8-azaguanine, on fusionne ensuite
ceux-ci a nouveau avec des lymphocytes humains et on selectionne la
population cellulaireainsi obtenue dans le milieu HAT.
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