close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

ЗАНЯТИЕ 11 Санитарно-бактериологическое изучение природных биоценозов

код для вставкиСкачать
ОСНОВЫ САНИТАРНОЙ МИКРОБИОЛОГИИ
ЗАНЯТИЕ № 7
Тема: Санитарно-бактериологическое изучение природных биоценозов.
Цель занятия: Обучить санитарно-бактериологическим методам исследования природных биоценозов.
Материалы и оборудование: Расплавленный МПА, чашки Петри со средой
Эндо, стерильные чашки Петри, стерильные градуированные пипетки, чашки
Петри с МПА, чашки Петри с кровяным агаром, почвенная болтушка в
разведении 1: 10.
Демонстрация:
Аппарат Кротова для определения наличия гемолитического стафилококка в
воздухе, колба Бунсена, фильтр Зейтца.
Вопросы для обсуждения:
1. Микрофлора воды
2. Микрофлора воздуха
3. Микрофлора почвы
4. Методы количественного определения микробов в исследуемых
объектах
Контрольные воросы:
1. Свойства микроорганизмов, определяющие их повсеместное распространение в природе.
2. Сапробность и микробное число воды.
3. Оценка степени загрязнения воды бактериями группы кишечной палочки (БГКП). Понятия Coli-титра и Coli-индекса.
4. Микрофлора воздуха. Общая бактериальная обсемененность воздуха.
5. Методы определения санитарно-бактериологического состояния воздуха: аспирационный, седиментационный.
6. Микрофлора
почвы:
методы
определения
санитарнобактериологического состояния почвы. Классификация почв по степени
загрязнения.
ИНФОРМАЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ
Практическая
санитарная
микробиология
устанавливает
состав
микрофлоры внешней среды – воздуха, почвы, воды, пищевых продуктов,
кормов и др. с целью их гигиенической характеристики. Оценка этих
показателей связана не только с обнаружением в этих объектах патогенных
бактерий, но и в значительной степени с присутствием санитарнопоказательных микроорганизмов.
Санитарно-показательными (или индикаторными) микроорганизмами называют некоторые условно патогенные микробы – представители
облигатной нормальной микрофлоры животных и человека. Обнаружение этих
микроорганизмов во внешней среде свидетельствует о фекальном или
воздушно-капельном загрязнении выделениями животных или человека.
1
Чем больше санитарно-показательных организмов во внешней среде, тем
более вероятно присутствие также и специфических возбудителей
инфекционных заболеваний.
В
настоящее
время
в
категорию
санитарно-показательных
(индикаторных) микроорганизмов включены представители кишечной
микрофлоры человека: бактерии группы кишечной палочки (БГКП), фекальные
кишечные палочки (ФКП), к которым в основном относятся E.coli, бактерии
группы протея, клостридии (C.perfringens Клостридиум перфрингенс), Е. faecalis Энтерококкус
фекалис – фекальный энтерококк, колифаги.
Показателями биологического загрязнения воздуха помещений являются
стрептококки и стафилококки.
Общие принципы санитарно-биологической оценки исследуемых объектов
(продуктов) сводится к следующему:
1. Отбор проб для исследования.
2. Общий количественный учет микроорганизмов в определенных
объемных или весовых единицах исследуемых объектов (продуктов).
3.Определение санитарно-показательных микроорганизмов в исследуемых
объектах (продуктах).
4. В исключительных случаях объекты внешней среды исследуют на
присутствие и патогенных микроорганизмов.
I. Микрофлора воды
Количественный и качественный состав микробиоценозов зависит от
физико-химического состояния, температуры, рН, от концентрации
минеральных и органических веществ, кислорода, углекислого газа, скорости
движения воды, от массивности поступления ливневых и сточных вод.
С экологической точки зрения всю микрофлору водоемов образуют две
группы микроорганизмов:
-автохтонная микрофлора, постоянно живущая и размножающаяся в
воде (к ним относятся аэробные кокки: микрококки, сарцины; бактерии рода
ProteusПротеус,
рода
PseudomonasПсевдомонас;
представители
рода
LeptospiraЛептоспира. Анаэробных бактерий в чистых незагрязненных водоемах
мало.). Они выполняют роль мусорщиков, расщепляют клетчатку, органические
отходы.
-аллохтонная микрофлора, попадающая при загрязнении из различных
источников (обитатели кишечника человека и животных кишечная палочка,
цитробактер, энтеробактер, энтерококки, клостридии) и возбудители кишечных
инфекций – брюшного тифа, паратифов, дизентерии, холеры, лептоспироза,
энтеровирусных инфекций и др.), поэтому вода является фактором передачи
многих инфекционных заболеваний. Некоторые возбудители могут даже
размножаться в воде (холерный вибрион, легионеллы). Микрофлора воды
делится по составу микробиоценозов на микрофлору подземных вод
(артезианской, ключевой), микрофлору поверхностных вод (рек, озер,
водохранилищ) и микрофлору питьевой воды.
2
Степень загрязнения водоемов органическими веществами и наличие в них
микроорганизмов соответствует определенным зонам сапробности:
1. Олигосапробная зона – зона чистой воды содержит мало органических
веществ и мало бактерий  от 10 до 1000 в 1 мл воды; E.coli встречается в
количестве нескольких клеток в 1 л воды.
2. Мезосапробная зона – зона умеренно загрязненной воды, где
происходит минерализация органических веществ с интенсивным окислением и
выраженной нитрификацией. Количество бактериальных клеток до 100 000 в 1
мл;
3. Полисапробная зона – зона сильного загрязнения: бедна кислородом,
богата органическими соединениями. Число бактерий в ней доходит до 1000000
и более в 1 мл. Преобладают E.coli и анаэробы, вызывающие процессы гниения
и брожения.
Наличие E.coli в воде является признаком свежего фикального загрязнения и наличия в воде патогенных микроорганизмов. При санитарнобактериологическом исследовании воды выделяют бактерии группы кишечной
палочки (БГКП), определяют колититр (Coli-T), колииндекс (Coli-Ind), общее
микробное число воды (ОМЧ воды) и другие показатели (табл. 7.1).
Общее микробное число - общее количество бактерий в 1 мл воды;
Коли-титр - наименьший объем воды в миллилитрах, в котором
обнаруживается 1 живая E.coli;
Коли-индекс - количество особей E.coli, которое находится в 1 литре
воды.
Кроме того, в воде определяют наличие патогенных и условно патогенных
микроорганизмов:
энтерококков,
сальмонелл,
холерного
вибриона,
энтеровирусов.
К БГКП относят Гр- микроорганизмы, не образующие спор, сбраживающие лактозу с образованием кислоты и газа и не обладающие оксидазной
активностью.
Таблица 7.1
Оценка эпидемиологической опасности воды по индикаторным
микроорганизмам
№ п/п
1
2
3
4
5
6
Показатели оценки
Термотолерантные колиформные бактерии(до 37оС)
Общие колиформные
бактерии
ОМЧ
Колифаги (индикатор
загрязнения воды вирусами)
Ед. измерения
Число бактерий в 100 мл
(ранее было 333)
Число бактерий в 100 мл
(ранее было 333)
Число образовавшихся
колоний в 1 мл
Число бляшкообр. Ед.
в 100 мл
Споры
Число спор в 20 мл
Должны
отсутствовать
в 100 мл
отсутствие
Цисты лямблий
Число цист в 50 мл
отсутствие
3
Норматив
отсутствие
отсутствие
50
І.І. Методы санитарно-бактериологического исследования воды.
1. Метод двухфазной бродильной пробы.
Сущность метода заключается в посеве заданного объема воды в среду
Эйкмана (глюкозо-пептонную среду). Общий объем воды открытых водоемов
111.1 мл ( 100, 10, 1, 0.1), а для водопроводной воды 333 мл ( 3 объема по 100
мл, 3 объема по 10 мл, и 3 объема по 1 мл). Посевы выдерживают в течение 24
часов в термостате при 43оС, при этой температуре развивается только
кишечная палочка теплокровных животных и человека, а другие
микроорганизмы угнетены. На вторые сутки все объемы воды проверяются,
отмечаются подозрительные на наличие E. coli (где обнаружены муть и газ в
поплавках). Затем производят отсев бактериологической петлей на среду Эндо
(или розоловый дифференциальный агар – РДА) и инкубируют при 37оС 18
часов. Затем из ярко-красных колоний с бронзовым отсветом делают мазки, окрашивают по Граму и осуществляют дифференциацию кишечной палочки.
2. Метод глубинного посева.
Этим методом определяют общее микробное число микроорганизмов
воды. В стерильной чашке Петри исследуемую воду в объеме 1 мл заливают
расплавленным и остуженным до 45оС МПА (15 мл). Инкубируют посев в
термостате при 37оС в течение 48 часов и подсчитывают число колоний.
3. Метод мембранных фильтров.
Данным методом определяют Coli-T и Coli-Ind с помощью аппарата для
фильтрования воды (колбы Зейтца и фильтра Бунсена). Фильтры после
фильтрации переносят в чашку Петри со средой Эндо и помещают в термостат
при 37оС на 24 часа. Наличие ярко-красных колоний с бронзовым отсветом
будет свидетельствовать о подозрении наличия в данном объеме воды E.coli.
II. Микрофлора воздуха
В воздух микроорганизмы попадают с поверхности земли вместе с частицами пыли, из выделений живых организмов. Качественный и количественный состав микроорганизмов атмосферы зависит от: климатических
условий, времени года, степени урбанизации территории и других причин.
Микрофлору воздуха можно условно разделить на:
постоянную, часто встречающуюся,
переменную, представители которой, попадая в воздух из
свойственных им мест обитания, недолго сохраняют жизнеспособность.
Постоянно в воздухе обнаруживаются пигментообразующие кокки,
палочки, дрожжи, грибы, актиномицеты, спороносные бациллы и
клостридии и др., т.е. микроорганизмы, устойчивые к свету, высыханию.
В воздухе крупных городов количество микроорганизмов больше, чем в
сельской местности. Над лесами, морями воздух содержит мало микробов
(в 1 м3 – единицы микробных клеток). Дождь и снег способствуют
очищению воздуха от микробов.
Аэродисперсные системы, содержащие микроорганизмы, яйца гельминтов,
пыльцу растений называют биологическими аэрозолями.
4
Степень обсемененности воздуха микроорганизмами зависит от характера
объекта и места его расположения, загруженности помещения материалами
(сухие шкуры, шерсть и т. п.), животными (птицей), активности этих животных,
вида подстилки, воздухообмена (вентиляции) помещений, влажности воздуха,
от общего ветеринарно-санитарного состояния. В 1 м3
воздуха
животноводческих помещении может содержаться до 2 млн. и более
микробных тел, в том числе и патогенных.
При дыхании, чихании, кашле в воздух выбрасывается множество капелек
жидкости, внутри которых содержатся микроорганизмы. Мелкие капельки
образуют стойкие аэрозоли и могут часами удерживаться в воздухе во
взвешенном состоянии. Заражение бактериями в этом случае происходит
воздушно-капельным путем.
При заражении «пылевым» путем микроорганизмы находятся в
выделениях больных животных (мокроте, слизи) и окружены белковым
субстратом, поэтому они более устойчивы к высыханию. Когда такие капли
высыхают, они превращаются в бактериальную пыль, которая имеет диаметр от
1 до 100 мкм. У частиц диаметром более 100 мкм сила тяжести превышает
сопротивление воздуха, и они быстро оседают. Пылевой способ играет важную
роль в эпидемиологии туберкулеза, дифтерии, туляремии и др.
При санитарно-бактериологическом исследовании воздуха определяют
ОМЧ воздуха и наличие санитарно-показательных микроорганизмов, по
содержанию которых в воздухе можно судить о степени его чистоты. Такими
организмами являются гемолититческие (растворяющие эритроциты крови)
стрептококки, которые постоянно обитают в верхних дыхательных путях,
слизистой носа и ротовой полости человека, а также золотистый стафилококк и
Гр(-) синегнойные бактерии.
На предприятиях мясной промышленности проводят анализ воздуха холодильных камер на выявление загрязнений плесневыми грибами. Отбор проб
осуществляют с помощью прибора Кротова.
Для очистки воздуха от микроорганизмов используют:
- дезинфекцию  использование веществ, которые вызывают быструю
гибель микробов;
- применение антисептиков, например триэтиленгликоля;
- использование УФО.
ІІ.І. Методы санитарно-бактериологического исследования воздуха:
1. Аспирационный метод с помощью аппарата Кротова.
Предназначен для исследования воздуха на присутствие гемолитического
стрептококка. Для этого метода чашку Кротова с 5%-ным кровяным агаром
помещают в аппарат Кротова и пропускают 250 литров воздуха. Посев
инкубируют в термостате при температуре 37оС в течение 48 часов. При
наличии в воздухе α- или β-гемолитического стрептококка на среде вырастают
колонии, окруженные зоной гемолиза.
2. Седиментационный метод по Коху.
5
С помощью данного метода определяют общее микробное число воздуха.
Общее микробное число воздуха рассчитывают по формуле Омелянского,
который опытным путем доказал, что за 5 минут на площадь в 100 см 2 оседают
микробы, содержащиеся в 10 литрах воздуха:
Х = 5 ·А· 100 · 1000
С · 10 · S
Где: Х– количество микробов в 1 м3 воздуха – микробное число; А – количество колоний в чашке Петри; S – площадь чашки Петри (если d = 8, то S = 50;
d = 9, S = 63; d = 10, S = 78, 5 см 2); С – экспозиция посева.
III. Микрофлора почвы
Качественный и количественный состав микроорганизмов почвы зависит
от: химического состава почвы, физических свойств, рН, влагоёмкости, степени
аэрации,
климатических
условий,
времени
года,
способов
сельскохозяйственной обработки, характера растительного покрова. Неодинаково распространение микроорганизмов по горизонтам почвы.
Микрофлора
почвы
характеризуется
разнообразием
микроорганизмов,
которые
принимают
участие
в
процессах
самоочищения почвы, круговорота в природе азота, углерода, серы,
железа и других элементов. В почве обитают бактерии, грибы, лишайники
(симбиоз грибов с цианобактериями) вирусы и простейшие. Количество
микробов в 1 г почвы измеряется сотнями, тысячами и миллионами
клеток.
Самый поверхностный тонкий слой почвы содержит мало микроорганизмов, так как они погибают под влиянием солнечных лучей и
высушивания. Наиболее обильна микрофлора почвы на глубине 10-20 см, а в
более глубоких слоях количество микробов уменьшается (на глубине 4-5 м они
практически отсутствуют).
Состав микрофлоры почвы меняется в зависимости от типа и
состояния почвы, состава растительности, температуры, влажности.
Большинство микроорганизмов почвы способны развиваться при
нейтральном рН, высокой относительной влажности, при температуре от
25 до 45С.
Значение микрофлоры почвы велико для круговорота веществ в природе.
Первая группа – микробы, осуществляющие разложение и
минерализацию органических животных и растительных остатков, попадающих
в почву, процесс очищения её от нечистот и отбросов. К ним относятся
бактерии, способные усваивать молекулярный азот (азотфиксирующие),
нитрифицирующие бактерии (Nitrosomonas и Nitrobacter), способные окислять
аммиак до азотной кислоты, образуя нитриты; бактерии-аммонификаторы,
которые вызывают гниение остатков растений, трупов животных, разложение
6
мочевины; бактерии, расщепляющие клетчатку, вызывающие различные виды
брожений (молочнокислое, маслянокислое, уксуснокислое и др.).
Среди патогенных микробов имеются такие, для которых почва является
постоянным местом обитания. Это возбудители ботулизма, актиномицеты,
грибы - возбудители микозов и т.д.
Вторая группа - это спорообразующие бациллы и клостридии, которые
попадают в почву с выделениями человека и животных и могут длительно здесь
сохраняться в виде спор. Это бациллы сибирской язвы, клостридии ботулизма,
столбняка и газовой анаэробной инфекции.
К третьей группе относятся неспорообразующие бактерии и вирусы,
которые попадают в почву с выделениями человека и животных, сохраняются
здесь в течение нескольких дней и месяцев. Это бактерии - возбудители
брюшного тифа и дизентерии, палочки туберкулеза, лептоспиры, вирусы.
Значение почвы как фактора передачи при этих инфекциях относительно
невелико.
Микробиологическое исследование почвы имеет значение при
строительстве жилищ, животноводческих помещений, водохранилищ. Пробы
почвы берут из глубины.
Определяют микробное число - общее количество микроорганизмов в 1 г
почвы и наличие санитарно-показательных микроорганизмов. Присутствие
в почве Escherichia coli и Streptococcus faecalis указывает на свежее фекальное
загрязнение, бактерий рода Citrobacter и Enterobacter - на несвежее, a
Clostridium perfringens - на давнее.
При санитарной оценке почвы критерием служит титр кишечной палочки
и количество сапрофитных бактерий (табл.7.2).
Таблица 7.2
Оценка санитарного состояния почвы по микробиологическим
показателям
Категория
почв
Чистая
Загрязнённая
Сильно
загрязнённая
E. coli
1и>
0,01
<0,01
Нитрифицирующие
0,1 и >
До 0,1
<0,01
Cl.perfingens
0,1 и >
До 0,1
<0,01
термофилы
100-1000
1001-10 000
10 000
ІІІ.І. Методы санитарно-бактериологического исследования почвы:
1. Бактериологический метод. Данный метод позволяет определить микробное число почвы с помощью посева почвенной суспензии на МПА. При
определении ОМЧ почвы подсчитывают число выросших колоний и делают
перерасчет на 1 г почвы (число колоний умножают на коэффициент
разведения).
2. Определение Coli-титра и перфингенс-титра почвы.
7
IV. Методы количественного определения микробов в исследуемых
объектах
Одним из способов определения общего микробного числа в исследуемых
объектах является метод посева определённого объёма или навески такого
материала на плотные питательные среды. После культивирования посевов
приступают к подсчёту выросших колоний, по количеству которых судят о
степени загрязнённости исследуемых объектов.
Количественному учёту подлежат все колонии, независимо от их
величины, окраски, формы и т.п., принимая каждую колонию за одну
бактериальную клетку.
В зависимости от количества выросших колоний при подсчёте их
поступают различно. Если их число при ориентировочной оценке не превышает
50, то прибегают к фронтальному (сплошному) подсчёту. Для этого, повернув
чашку вверх дном, при помощи лупы, считают все колонии, отмечая каждую
сосчитанную колонию чернилами или восковым карандашом на дне чашки.
Для подсчёта колоний при большом их количестве применяют метод
выборочного подсчёта, пользуясь специальными приёмами.
1. Со стороны дна площадь чашки делят восковым карандашом на равное
число секторов (на 4, или 6, или 8). Число колоний подсчитывают в одном из
секторов. Полученное количество колоний умножают на число секторов. Таким
образом вычисляют общее количество колоний, выросших на всей площади
чашки.
2. Тем или иным приёмом определяют среднее число колоний, которое
выросло на площади 1 см2. Предварительно вычисляют площадь чашки по
формуле S=πR2. Стандартная чашка имеет радиус 5 см, следовательно, ее
площадь равна 3,14 х 25 = 78 см2 .
Среднее число колоний, выросших на площади 1 см 2, умножают на
площадь чашки. Полученное число выражает общее количество колоний,
которое выросло на всей поверхности чашки.
а) использование трафарета (шаблона).
Со стороны дна чашки накладывают трафарет, который имеет пять окон,
площадь каждого из них составляет 1 см2. Подсчёт колоний осуществляется в
пяти окнах, после чего общее количество колоний делят на пять, получая
среднее число колоний, выросших на площади в 1 см2.
б) использование счётной камеры.
Она представляет собой стеклянную пластинку, укреплённую на
деревянной подставке. Пластинка разделена на 144 квадрата, каждый из
которых равен 1 см2; квадраты, расположенные по диагонали, в свою очередь
разделены на 9 малых квадратов каждый.
Для подсчета колоний чашку помещают под стеклянную пластинку вверх
дном и подсчитывают число колоний в 10 квадратах (еcли колоний много,
считают в малых квадратах). Определив среднее число колоний на 1 см 2 среды,
8
умножают это число на площадь всей чашки и таким образом вычисляют число
колоний на всей поверхности среды.
в) использование аппарата для подсчета колоний.
Принцип подсчета в этом случае остается таким же, как и в счетной
камере. Вместе с тем аппарат имеет дополнительные приспособления,
позволяющие ускорить подсчет колоний. Для этого он имеет стационарную
лупу, подсветку со сменными светофильтрами, авторучку с датчиком;
одновременно с отметкой колоний количество их фиксируется на счетчике
(рис. 7.1).
Рис. 7.1. Аппарат для подсчёта колоний бактерий.
При обработке данных по определению количества бактерий в
исследуемых объектах принимают во внимание следующие положении;
1. Оценивают только те разведения, при посеве которых выросло на
чашках от 30 до 300 колоний.
2. Полученные результаты округляют: (Таблица 7.3)
Таблица 7.3
При количестве бактерий
1
От 1 до 100
От 101 до 1000
От 1001 до 10000
От 100001 до 1000000
Результат округляют
2
Полученное число
До 10
До 1000
До 10000
3. Для определения общего числа бактерий в исследуемых объектах (в
почве, в кормах... в 1 г, в воде в 1 мл) необходимо полученное число колоний
умножить на степень разведения исследуемого материала. Например, при
посеве 1 мл воды в разведении 1:10 на чашках выросло 120 колоний.
Содержание бактерий в 1 мл воды составляет: 120 • 10 = 1200 бактерий
Ход работы:
I. Отобрать пробы воды для изучения микрофлоры. В чистые стерильные
склянки (объем 400500 мл) взять с соблюдением стерильности пробы воды из
9
водопровода (предварительно водопроводный кран простерилизовать в
пламени спиртовки и пропустить воду в течение 1015 минут).
II. Для определения микробного числа воды произвести посев воды в
стерильные чашки Петри и залить расплавленным и остуженным до 4050оС
МПА. Вылитый агар слабым покачиванием равномерно смешать с исследуемой
водой. Посевы подписать и поместить в термостат при 37оС на 2448 часов.
III. Поставить опыты для определения ОМЧ почвы:
 Почвенную болтушку в разведении 1:10 взболтать и дать отстояться в
течение 510 минут. Из почвенной суспензии приготовить ряд последовательных
разведений (1:100, 1:1000 и т.д.);

 Из двух последних разведений по 1 мл почвенной взвеси внести в чашку
Петри и залить расплавленным и остуженным до 4550оС МПА. Вылитый агар
равномерно смешать с исследуемой суспензией. Посевы подписать и поставить
в термостат
при 37оС на 2448 часов.


IV. Поставить опыты для определения ОМЧ воздуха методом Коха:
 Чашки Петри с МПА открыть и выдержать открытыми в течение 510
минут. Чашки закрыть, подписать и поставить в термостат при 37оС на2448
часов;
V. Рассчитать микробное число воды, воздуха, почвы.
Тесты для проверки знаний:
1. Микробное число воздуха определяют: а) по методу Коха, б) на среде
Эндо, в) посевом на чашку с МПА в аппарате Кротова, г) с помощью формулы
Омелянского.
Ответ: а, в, г
2. Санитарно-бактериологическую оценку воды выводят исходя из: а)
цветности, б) микробного числа, в) Coli-титра, г) запаха, д) Coli-индекса.
Ответ: б, в, д
Ключевые слова: индикаторные микроорганизмы, микробное число, Coliтитр, Coli-индекс, перфингенс-титр, сапробность.
10
Автор
ДонАгрА-З
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
17
Размер файла
104 Кб
Теги
бактериологическое, биоценоз, изучения, санитарно, природных, занятие
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа