close

Вход

Забыли?

вход по аккаунту

?

ЗАНЯТИЕ 12 Исследование почвенных микроорганизмов почвенные грибы почвенные дрожжи

код для вставкиСкачать
Тема 6: Микроорганизмы и почвообразование.
ЗАНЯТИЕ 12
Тема: Исследование почвенных организмов: почвенные грибы, почвенные
дрожжи
Цель занятия: изучить методы
исследование
почвенных грибов,
почвенных дрожжей.
Материалы и оборудование: Набор бумажных индикаторных дисков,
сулема,
фенол,
предметные
стекла,
бактериологическая
петля,
дистиллированная вода, растворы красок, этиловый спирт 96%, посевы с
чистыми культурами, иммерсионное масло, фильтровальная бумага.
Вопросы к обсуждению:
1. Почвенные грибы.
2. Методы наблюдения за почвенными грибами в чистых культурах.
3. Почвенные дрожжи.
Контрольные вопросы:
1. Какой метод применяют для дифференцированного учёта спор и
мицелия?.
2. Какие среды используют для культивирования грибов?
3. Какую жидкость используют для приготовления микробиологических
препаратов грибов?
4. Какая среда является наиболее широко используемой для выделения
дрожжей?
ИНФОРМАЦИОННЫЙ МАТЕРИАЛ
І. Почвенные грибы
Грибы относятся к царству Fungi (Mycetes, Mycota). Это гетеротрофные
одноклеточные
или
многоклеточные
(нитчатые,
мицелярные)
нефотосинтезирующие (бесхлорофильные) эукариотические микроорганизмы с
клеточной стенкой.
Мицелий грибов в почве достигает общей длины от сотен до десятков
тысяч метров, а биомасса - 1-2 т/га. Очень много грибов в лесных подстилках.
Грибы играют особую роль в разложении органического вещества почв.
Соприкасаясь с субстратом клеточной оболочкой, они выделяют через неё во
внешнюю среду ферменты и поглощают питательные вещества абсорбционным
путём. Все почвенные грибы - аэробные организмы. Среди них есть паразиты и
симбиотрофы, хищники и сапрофиты, развивающиеся на мертвых остатках
растений и животных.
Грибы являются гетеротрофами, но в зависимости от набора ферментов,
которыми они располагают, выделяют экологические группы, отличающиеся
по своим пищевым потребностям и возможностям освоения субстратов.
Так называемые сахарные грибы используют легкодоступные углеводы,
крахмал, гемицеллюлозу. Более медленно растут целлюлозоразрушающие
грибы, не выдерживающие конкуренции с сахарными грибами за
легкодоступные субстраты.
1
В группу разлагателей лигнина входят грибы, которые начинают
развиваться, когда все легкодоступные субстраты уже использованы. По мере
разложения растительных остатков начинают развиваться грибы, способные
разлагать гумусовые вещества.
Многие почвенные грибы синтезируют черные пигменты - меланины.
После отмирания мицелия меланины накапливаются в почве и входят в состав
почвенного гумуса. Мицелий грибов агрегирует почвенные частицы,
структурируя почву. Грибы выделяют в среду многие органические кислоты,
растворяют труднодоступные для растений фосфаты. Они способны
осуществлять процесс гетеротрофной нитрификации. За 1 сутки грибы
разлагают в 2-7 раз больше органического вещества, чем потребляют.
Строение. Грибы имеют ядро с ядерной оболочкой, цитоплазму с
органеллами, цитоплазматическую мембрану и многослойную, ригидную
клеточную стенку, состоящую из нескольких типов полисахаридов, а также
белка, липидов и др. Некоторые грибы образуют капсулу. Цитоплазматическая
мембрана содержит гликопротеины, фосфолипиды и эргостеролы. Грибы
являются грамположительными микроорганизмами. По наличию в обмене
мочевины, в оболочке клеток — хитина, запасного продукта — гликогена, а не
крахмала — они приближаются к животным. С другой стороны, способом
питания (путём всасывания, а не заглатывания пищи), неограниченным ростом
они напоминают растения.
Грибы состоят из длинных тонких нитей (гиф), сплетающихся в
грибницу, или мицелий. Гифы низших грибов – фикомицетов – не имеют
перегородок. У высших грибов – эумицетов – гифы разделены перегородками;
их мицелий многоклеточный.
Различают гифальные и дрожжевые формы грибов
Гифальные (плесневые) грибы образуют ветвящиеся тонкие нити (гифы),
сплетающиеся в грибницу, или мицелий (плесень). Гифы, врастающие в
питательный субстрат, называются вегетативными гифами (отвечают за
питание гриба), а растущие над поверхностью субстрата – воздушными или
репродуктивными гифами (отвечают за бесполое размножение).
Гифы низших грибов не имеют перегородок. Они представлены
многоядерными клетками и называются ценоцитными.
Гифы высших грибов разделены перегородками, или септами с
отверстиями.
Дрожжевые грибы (дрожжи), в основном, имеют вид отдельных
овальных клеток (одноклеточные грибы). По типу полового размножения они
распределены среди высших грибов – аскомицет и базидиомицет. При
бесполом размножении дрожжи образуют почки или делятся, что приводит к
одноклеточному росту. Могут образовывать псевдогифы и ложный мицелий
(псевдомицелий) в виде цепочек удлиненных клеток – «сарделек». Грибы,
аналогичные дрожжам, но не имеющие полового способа размножения,
называют дрожжеподобными. Они размножаются только бесполым способом –
почкованием или делением.
2
Размножение. Грибы размножаются спорами половым и бесполым
способами, а также вегетативным путем (почкование или фрагментация гиф).
Грибы, размножающиеся половым и бесполым путем, относятся к
совершенным. Несовершенными называют грибы, у которых отсутствует или
еще не описан половой путь размножения. Бесполое размножение
осуществляется у грибов с помощью эндогенных спор, созревающих внутри
круглой структуры – спорангия, и экзогенных спор – конидий, формирующихся
на кончиках плодоносящих гиф.
Половое размножение грибов происходит с образованием гамет, половых
спор и других половых форм. Половые формы называются телеоморфами.
Бесполое (вегетативное) размножение грибов происходит с образованием
соответствующих форм, называемых анаморфами.
Типы грибов. Выделяют 3 типа грибов, имеющих половой способ
размножения (так называемые совершенные грибы): зигомицеты (Zygomycota),
аскомицеты (Ascomycota) и базидиомицеты (Basidiomycota). Отдельно
выделяют условный, формальный тип/группу грибов – дейтеромицеты
(Deiteromycota), у которых имеется только бесполый способ размножения (так
называемые несовершенные грибы).
Грибы по типу питания — гетеротрофы, по отношению к кислороду —
аэробы и факультативные анаэробы. Растут в широких диапазонах температур
(оптимальная температура 25—30 °С). Поэтому грибы широко распространены
в окружающей среде, особенно в почве. Грибы вместе с сине-зелеными
водорослями образуют симбиоз в виде лишайника. В этом симбиозе грибы
поглощают воду и растворимые в ней вещества, а сине-зеленые водоросли
поставляют грибам органические соединения. Другой вид взаимоотношений —
микориза — симбиоз грибов и корней высших растений.
Грибы культивируют в течение нескольких суток на сусло-агаре или
жидком сусле, среде Сабуро, Чапека, Ван-Интерстена и др.
Некоторые грибы обладают диморфизмом, т. е. способностью
образовывать нитчатые и дрожжевые формы в зависимости от условий роста.
І.І. Методы выявления и учёта почвенных грибов.
При выявлении и учёте почвенных микромицетов из почвы методом
посева из разведений почвенных суспензий на плотные питательные среды
наиболее часто используют подкисленные 40% молочной кислотой (4 мл/л)
сусло – агар и синтетические среды с простыми углеводами, например, среду
Чапека. Кислая реакция среды подавляет развитие бактерий.
При выделении грибов, не развивающихся на кислых средах, для
подавления бактерий используют бенгальский розовый, кристаллический
фиолетовый, малахитовый зеленый. Применяют также комбинации из
красителей и антибиотиков. Например, используют бенгальский розовый со
стрептомицином. Для селективного выделения грибов из почвы применяют
3
следующие антибиотики: хлоромицетин, неомицин, полимиксин, пенициллин,
эндомицин.
Для выделения микромицетов, быстро усваивающих легкодоступные
углеводы, используют сусло-агар, среду Чапека, среду Мартина и др. Грибы, не
выдерживающие конкуренции за моносахара, выделяют на "голодные" среды –
водный агар, агар с почвенной вытяжкой, агар с разведенным в 8-10 раз
суслом. На этих средах микромицеты развиваются медленно, образуют мелкие
колонии.
При выделении микромицетов, разлагающих целлюлозу, лигнин,
гумусовые вещества и др., источник углерода добавляют к синтетической
минеральной среде или помещают на почву (метод приманок).
При учете почвенных грибов методом посева для десорбирования
(удаление адсорбированного вещества с поверхности адсорбента) мицелия и
спор с поверхности почвенных частиц не пользуются ультразвуком из-за того,
что крупные клетки грибов больше повреждаются ультразвуком, чем клетки
бактерий. Используют пропеллерную мешалку (микроизмельчитель тканей)
или растирание почвы, увлажненной до пастообразного состояния.
Засеянные почвенной суспензией чашки просматривают, начиная с 3-5 сут.
Окончательный учет производят на 6-10-ый день на средах с целлюлозой, с
лигнином – через 2-3 недели, на голодном и почвенном агаре – через 3-4
недели.
Для дифференцированного учета спор и мицелия применяют метод
мембранных фильтров. Количественный учет грибов в почве и расчет их
биомассы производят с помощью люминесцентного микроскопа
Методы наблюдения за почвенными грибами в чистых культурах.
Культуральные признаки грибов описывают на плотных питательных
средах в чашках Петри. Используют сусло-агар и синтетические среды. За
культурой наблюдают в течение нескольких дней и даже двух недель с
интервалом 3—4 дня. При описании культуральных признаков грибов
отмечают скорость роста колоний (быстро растущие или медленно растущие),
внешний вид колонии, текстуру колонии (бархатистая, пушистая, шерстистая,
шероховатая, войлочная), окраску колонии, окраску субстратного и воздушного
мицелия, диффузию пигмента в агар, окраску окружающей среды. Отмечают
складчатость колонии, наличие эксудата, его цвет, запах культуры.
Для характеристики морфологических признаков культуры грибов сначала
просматривают на чашках при малом увеличении микроскопа, а затем готовят
микроскопический препарат.
Для наблюдения за репродуктивными органами (рис. 12.1.) из колонии
вырезают блоки с помощью пробочного сверла, после их изъятия на чашках
остаются лунки, через 1—2 дня лунка зарастает мицелием, который можно
наблюдать под оптическим микроскопом. Спороношение наблюдают в
сканирующем электронном микроскопе
4
Развитие мицелия и спорогенез можно наблюдать на агаризованных
стеклах. Стерильной расплавленной средой покрывают предметные стекла и
помещают в чашку Петри и на П-образную стеклянную подставку. Посев гриба
производят штрихом по длинной стороне стекла. Штрихи покрывают
стерильными покровными стеклами так, чтобы под ними не оставалось
пузырьков воздуха и часть штриха была свободной. Во избежание пересыхания
агара в чашку наливают на дно стерильную воду. Через 6 - 8 дней инкубации
при 25° стекла вынимают и, очистив нижнюю сторону от агара,
микроскопируют.
Мицелий со спороношениями удобно рассматривать, приготовив
препарат следующим образом: небольшой кусочек питательной среды
помещают на стерильное предметное стекло, инфицируют грибной культурой,
покрывают покровным стеклом и инкубируют 2—3 суток; затем снимают
покровное стекло, кладут его на предметное, закрывают новым покровным
стеклом и микроскопируют.
Для изготовления микроскопического препарата препаровальными
иглами вырезают небольшой участок колонии, помещают в каплю воды и
закрывают покровным стеклом. К воде добавляют этиловый спирт 1:1 или
концентрированную уксусную кислоту, поскольку споры грибов не
смачиваются водой.
Для прижизненной окраски грибов используют краски генциановый
фиолетовый, метиленовый синий, сафранин, нейтральный красный,
метиленовый фиолетовый, эритрозин в концентрации 1:500, 1:1000, 1:10000.
Диагностика и идентификация грибов проводятся на основании
строения и способов формирования репродуктивных органов, имеют значение
морфологические и культуральные признаки. Для некоторых представителей
требуется проследить весь цикл развития организма. Принадлежность к классу
и роду устанавливают по Атласу родов почвенных грибов. Видовая
идентификация проводится по специальным определителям для отдельных
родов.
Рис. 12.1. Органы полового размножения у сумчатых грибов: 1 –
аскоспоры, 2 – сумки со спорами, 3- стерильные гифы, 4,5,6 – плодовые тела: 4
– перитеции, 5 – клейстотеции, 6 – апотеции.
5
ІІ. Почвенные дрожжи
Дрожжи можно выделить практически из любых природных сред,
включая верхние и более глубокие почвенные горизонты, поверхность
растений, растительные остатки, природные воды, воздух. Обычно
численность дрожжей в большинстве таких местообитаний невысока. Роль
дрожжей здесь значительно ниже по сравнению с ролью мицелиальных
грибов и бактерий за исключением, может быть, живых частей растений.
Многие виды аскомицетовых дрожжей, интенсивно развивающиеся в
специфических сахаросодержащих субстратах, спорадически выделяются
также из почв и с поверхности растений. Тем не менее, известны десятки
видов дрожжевых грибов, для которых почвы, растения и растительные
остатки являются основным местообитанием. Многие из таких видов
представляют
собой
дрожжеподобные
грибы
базидиомицетового
аффинитета, для цикла развития которых характерны дрожжевая
анаморфная и мицелиальная телеоморфная стадии. За немногими
исключениями базидиомицетовые дрожжи не способны бродить и в среднем
усваивают более широкий спектр соединений. Приуроченность таких
дрожжей к местообитаниям с высоким содержанием свободных сахаров
выражена слабее.
Методом посева из природных субстратов эти виды чаще выделяются
в виде дрожжевых анаморф. Не исключено, что телеоморфная стадия у
некоторых таких видов вообще утеряна в ходе эволюции. Типичными
примерами таких банальных форм служат анаморфные виды Cryptococcus
albidus,Cryptococcus laurentii,Trichosporon pullulans, Sporobolomyces roseus.
Отбор проб для посева. Образцы для посева отбирают не более чем за 1-2
дня до посева. Если такой возможности нет, то образцы необходимо сохранять
в холодильнике. Для посева образцы природных материалов обычно
нуждаются в предварительной подготовке. Листья растений, мелкие веточки и
корни измельчают стерильными ножницами. Со стволов, крупных ветвей и
крупных корней срезают поверхностный слой толщиной 2-3 мм, который затем
также измельчают. Почвенные образцы слегка растирают и удаляют из них
корни и крупные камни.
ІІ.І. Методы выявления и учета почвенных дрожжей.
Наиболее широко используемой средой для выделения дрожжей является
солодовое сусло. Из синтетических сред используются агар Сабуро,
называемый также глюкозопептонной средой. Для обогащения факторами
роста к этим средам добавляют иногда дрожжевой (0,2%) и мясной (0,3%)
экстракты и виноградный сок (3%).
Для подавления роста бактерий и актиномицетов среды для выделения
дрожжей подкисляют до рН 4,5 путем добавления минеральных или
органических кислот. Для синтетических сред используется соляная кислота,
для сусловых — молочная, лимонная или винная. Кислоты добавляют в
6
жидкую или расплавленную агаризованную среду после стерилизации
непосредственно перед засевом или перед разливкой в чашки Петри. Если
использовать 3% агара, то среда застывает даже при рН 4,8.
Используют антибиотики широкого спектра действия: стрептомицин,
пенициллин, левомицетин. Их добавляют в среду порознь и в комплексе, как и
при работе с грибами.
Для ограничения роста грибов в среду добавляют специфические
вещества: бычью желчь, теллурит калия, пропионат натрия или некоторые
красители: бенгальский розовый, кристаллический фиолетовый.
Три-четыре навески каждого образца, помещают в колбу со стерильной
водой, при этом масса навески и объем воды подбираются таким образом,
чтобы разведение составляло от 1:10 до 1:100 в зависимости от характера
образца. Образцы почв лучше сеять из разведения 1:10, подстилок и торфа 1:20, листьев, ветвей и корней - 1:50, образцы высокосахаристых субстратов,
разлагающихся сочных плодов - 1:100. Эти разведения подобраны опытным
путем и позволяют получить от нескольких десятков до нескольких сотен
дрожжевых колоний на чашке. Навеску обрабатывают при интенсивном
встряхивании, на роторном микроизмельчителе или на вортексе в течение 1-3
мин. С помощью стерильной пипетки каплю полученной суспензии наносят на
поверхность среды и растирают стерильным шпателем. Каждую навеску
желательно высевать не менее, чем на 2-3 чашки.
При выделении мезофильных дрожжей инкубацию производят при 20—
26—28°, при выделении психрофильных форм — при 5°. Сроки инкубации
зависят от температуры. При 28° — 4—5 дней, при 5° — не менее 14 суток. В
посевах из почвы, инкубируемых при низких температурах, удается учесть в
2—3 раза больше дрожжей, чем при 28°, так как росту дрожжевых колоний при
этом не мешают грибы.
Учет результатов посева проводят следующим образом. Сначала
необходимо внимательно рассмотреть колонии, выросшие на чашке и
попытаться выделить среди них основные типы по макроморфологическим
особенностям. Для выделения макроморфологических типов колоний
желательно использовать бинокулярную лупу. Как правило, количество типов
колоний, выросших на каждой чашке не превышает 5-10 типов. Желательно
просмотреть все выросшие колонии на чашке, и определить количество
колоний каждого типа. В зависимости от количества выросших на чашках
колоний, такой подсчет можно производить разными способами. Если их число
не превышает нескольких десятков, то возможно подсчитать количество
колоний каждого типа на всей чашке. Если количество выросших колоний
превышает несколько сотен, то целесообразно использовать бинокулярную
лупу и подсчитывать число колоний разных типов в 10-20 полях зрения, после
чего, зная площадь поля зрения и площадь чашки, определить среднее число
колоний каждого типа на чашке.
7
Представителей каждого типа колоний выделяют в чистую культуру, у
которых изучают необходимые признакии в дальнейшем идентифицируют,
пользуясь определителями.
Применение низкотемпературной инкубации для селективного
выделения дрожжей
Учету и выделению дрожжей из природных субстратов методом посева
сильно мешают мицелиальные грибы, присутствующие в изучаемом субстрате.
Колонии грибов маскируют более мелкие дрожжевые колонии и затрудняют их
изоляцию. Ограничить рост мицелиальных грибов химически невозможно: все
ингибиторы роста мицелиальных грибов действуют и на дрожжи. Однако, при
температуре около 5°С дрожжевые колонии в среднем развиваются быстрее.
Кроме того, в почве, на растениях и растительных остатках значительную долю
могут составлять психрофильные дрожжи, не растущие при температуре выше
22-25°C. Поэтому при учете дрожжей в природных местообитаниях часто
применяют метод низкотемпературной инкубации посевов. (Рис. 12.2.)
Посев из образца лесной
подстилки, инкубация 3 сут.
при комнатной температуре
Посев из этого же образца, инкубация
14 сут. при 5°C
Рис. 12.2. Выделении дрожжей, метод низкотемпературной инкубации
посевов.
Учет липомицетов методом обрастания почвенных комочков
Клетки липомицетов в почве прочно адсорбированы на поверхности
почвенных агрегатов. Поэтому клетки липомицетов с трудом переходят в
водную суспензию, и даже после многократных отмываний почвенной
навески, они в основном остаются в осадке и, следовательно, не
обнаруживаются при стандартном посеве из разведений.
Для обнаружения и учета численности липомицетов применяют метод
почвенных комочков на среде Эшби. После стерилизации среду подкисляют
молочной кислотой до pH 4.0 для подавления роста бактерий, или добавляют
антибактериальные антибиотики.
Навеску около 0.1 г почвы раскладывают в виде 50-100 мелких комочков
на поверхности среды в чашке Петри. Инкубирование проводят при комнатной
температуре в течение 2-3 нед. Для предотвращения высыхания среды чашки
лучше инкубировать во влажной камере.
8
Липомицеты образуют характерные слизистые обрастания вокруг
комочков. Метод является полуколичественным: численность липомицетов
выражают относительным числом комочков со слизистыми обрастаниями (в
процентах от общего количества комочков).(Рис. 12.3)
Из обрастаний почвенных комочков липомицеты можно выделить в
чистую культуру. Для этого материал из обрастаний переносят петлей в чашку
с подкисленной средой и рассевают истощающим штрихом. Отдельные
колонии липомицетов пересевают в пробирки.
Рис. 12.3. Липомицеты образуют характерные слизистые обрастания вокруг
комочков почвы.
Метод отпечатков для исследования эпифитных дрожжей
Простой способ изучения эпифитных дрожжей - посев методом отпечатков
листьев. Для этого лист прижимается на некоторое время к поверхности
агаровой среды. Прилипшие к среде клетки дрожжей прорастают и после
инкубации на чашке появляется изображение листа из выросших колоний. На
фотографии видно, что наибольшее количество колоний расположено вдоль
проводящих жилок листа, так как именно в районе жилок в основном
происходит экссудация питательных веществ.(Рис. 12.4.)
Рис. 12.4. Отпечатки листьев на поверхности сусло-агара, образованные
выросшими колониями эпифитных дрожжей. Преобладающие черные колонии
- Aureobasidium pullulans.
Как правило, методом посева из суспензии измельченных листьев удается
выявить большее разнообразие дрожжей, чем методом отпечатков, что говорит
о том, что клетки эпифитных дрожжей могут быть плотно адсорбированы на
9
поверхности листьев, или даже расти внутри растительной ткани (эндофитные
дрожжи). С другой стороны, при измельчении листьев могут высвобождаться
фитонциды, ингибирующие рост дрожжей.
Ход работы:
І. Произвести выявлении и учёте почвенных микромицетов из почвы
методом посева из разведений почвенных суспензий на плотные питательные
среды.
ІІ. Произвести изучение эпифитных дрожжей методом отпечатков листьев.
Ключевые слова: Грибы, аскоспоры, сусло-агар, дрожжи, липомицеты.
10
11
Автор
ДонАгрА-З
Документ
Категория
Без категории
Просмотров
174
Размер файла
303 Кб
Теги
грибы, почвенные, дрожжин, микроорганизмов, исследование, занятие
1/--страниц
Пожаловаться на содержимое документа